Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Özet

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Özet

Fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro fertilizasyon ve ardından embriyo kültürü ile birleştiğinde, belirlenmiş koşullar altında preimplantasyon embriyolarının üretilmesini mümkün kılar. Bu prosedürler, oositlerin olgunlaşması, döllenmesi ve erken embriyo gelişiminin altında yatan biyolojik fonksiyonların ve moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırır. Ancak, bu yaklaşımın başarılı uygulanması, oositlerin ve spermlerin dikkatli ele alınmasına, uygun kültür koşullarına ve her aşamada gelişimsel ilerlemenin doğru değerlendirilmesine bağlıdır. Burada, fare yumurtalıklarından olgun olmayan kümülüs–oosit komplekslerinin (COC) izole edilmesi, oositlerin in vitro olgunlaşması, in vitro fertilizasyon ve embriyoların blastosist evresine in vitro kültürü yöntemlerini açıklıyoruz. Bu prosedürler, ortam ve kültür tabaklarının hazırlanması ve dengelenmesi, yumurtalık diseksiyonundan sonra COC'ların izole edilmesi ve seçilmesi, spermin toplanıp kapasasyonla hale getirilmesi, standart koşullarda tohumlanma yapılması ve ardından embriyoların gelişimsel değerlendirme için kültürlenmesini içerir. Gelişimsel ilerleme, erkek ve dişi pronükleusların oluşumu, iki hücreli aşamaya bölünme ve blastosist oluşumu gibi morfolojik kriterlerle değerlendirilir. Bu protokol, oosit olgunlaşması ve anne faktörü fonksiyonu çalışmalarına entegre edilebilir ve memeli üreme biyolojisi temel araştırmaları için değerli bir araç sağlar.

Giriş

Oosit kalitesini ve gelişimsel yetkinliği anlamak, başarılı döllenme ve sonraki embriyonik gelişim için gereklidir ^1,2. Oosit olgunlaşması, sadece nükleer olgunlaşma sırasında doğru kromozom ayrımını değil, aynı zamanda organel yeniden dağılımı ve anne mRNA'ları ile proteinlerinin birikimini içeren sitoplazmik olgunlaşma da gerektirir³. Erken embriyonik gelişim, anne tarafından sağlanan mRNA'lar ve proteinlere dayanır ve oositteki anne depoları preimplantasyon gelişimini sürdürür. Ancak, memeli embriyogenezinin birçok anne düzenleyicisinin kimlikleri ve işlevleri hâlâ tam olarak^{anlaşılmamaktadır 4}. Bu nedenle, oositlerin olgunlaşması, döllenmesi ve embriyo gelişiminin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için daha fazla sistematik çalışmaya ihtiyaç vardır.

Fare, preimplantasyon embriyo gelişimini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir model sistemidir. In vitro olgunlaşma (IVM), yumurtalıktan olgunlaşmamış oositlerin toplanmasını ve bunların kontrollü laboratuvar koşullarında olgunlaşmasını^{ifade eder 5}. Sonrasında, in vitro fertilizasyon (IVF), olgun oositlerin kapasitasyonlu spermlerle birlikte kuluçka yoluyla inkübe edilip erken embriyonik gelişim çalışmaları için zigotlar üretmesini sağlar. Ancak, in vivo–olgunlaştırılmış oositlerin kullanıldığı geleneksel IVF ile karşılaştırıldığında, IVM kaynaklı oositler genellikle daha düşük olgunlaşma ve döllenme oranları ile düşük gelişimsel yetkinlik^{gösterir 6}. Bu sınırlamalar büyük ölçüde in vitro kültür koşullarında nükleer ve sitoplazmik olgunlaşma arasındaki asenkronizmeye bağlanır. Ayrıca, fare oositlerinde meiotik iğren stabilitesi, IVM sırasında pH ve sıcaklık değişikliklerine duyarlıdır ve iğren bozulması olgunlaşma^{durgunluğuna katkıda bulunabilir 7}. Sonuç olarak, IVM'den kaynaklanan oositlerin azalmış yetkinliği, gelişimsel ve mekanistik çalışmalar için verimli embriyo üretimini sınırlayan büyük bir engel olmaya devam etmektedir.

Fare preimplantasyon embriyoları, in vivo türeden türetilen zigotlar toplanarak ve in vitro (IVC) kültürlenerek de elde edilebilir. In vivo kaynaklı zigotlar, yumurta kanallarından toplanan zigotlar, döllenme sonrası olaylara odaklanan deneyler için nispeten senkronize bir başlangıç^{noktası sağlar 8}. Ancak, yumurta olgunlaşması ve anne faktörlerinin birikimi in vivo döllenmeden önce gerçekleşir; Bu nedenle, in vivo türevli zigotlar, olgunlaşma koşullarının veya anne depolarının sonraki embriyo gelişimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel manipülasyonuna daha az^{açıktır 4}. Bu nedenle, IVM ve IVF protokollerinin optimize edilmesi ve titiz kalite kontrollü standart işletme prosedürlerinin benimsenmesi (örneğin, sıcaklık, pH ve işlem uygulamalarının sıkı yönetimi) prosedürle ilgili değişkenliği en aza indirmek ve oosit ile embriyo gelişim yetkinliğini korumak için gereklidir.

Burada, medya hazırlığı, COC izolasyonu ve seçimi, IVM ve IVF prosedürleri ile in vitro embriyo kültürünü detaylandıran bir IVM–IVF–IVC protokolünü tanımlıyoruz (Şekil 1). Protokol, rutin kalite kontrolü için uygulamak, aşamaya özgü kontrol noktalarını içermektedir; bunlar arasında birinci kutup cisim (PB1) ekstrüzyonu, erkek ve dişi pronükleusların oluşumu (2PN), iki hücreli bölünme ve blastosist oluşumu yer almaktadır. Bu protokol, tanımlanmış koşullarda preimplantasyon embriyolarının tekrarlanabilir ve verimli üretilmesini sağlar, mekanik çalışmaları, kültür optimizasyonunu ve gelişimsel ve üreme biyolojisinde sonraki uygulamaları destekler.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Çin'deki Kuzeybatı A&F Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (izin numarası: 20230503).

1. Hayvan bakımı

1. Vahşi tip dişi C57BL/6 ve erkek DBA/2 fareleri temin eder ve onları belirli patojensiz (SPF) koşullarda, 12 saatlik ışık-karanlık döngüyle, 20–22 °C sıcaklıkta %55 ± %10 nem içinde tutarlar. Üreme diyeti ve libitum su sağla. Ev erkek fareleri tek tek (her kafeste bir erkek).

2. Medya Hazırlığı

1. 50 IU/mL PMSG çalışma çözeltisi hazırlamak için, 5.000 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) 100 mL steril fosfat-tamponlu tuzlu sönüm (PBS) içinde çözülür.
   NOT: Çözeltiyi 1 mL tek kullanımlık porsiyonlara ayırın ve –20 °C'de saklayın. Her bir aliquotu kullanmadan hemen önce oda sıcaklığında eritin.
2. IVM kültür ortamı hazırlamak için, Tablo 1'de listelenen malzemeleri 100 mL Medium 199 (M199) baz ortamına ekleyin. pH 7.3–7.4'e ayarlanır, ardından ortamı 0.22 μm filtreyle steril filtreyle steril orta ölçülü şişelere filtreleyin. Şişeyi baş harfler, yapım tarihi ve son kullanma tarihiyle "IVM" etiketiyle etiketleyin ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
3. %0,1 (w/v) hyaluronidase çözeltisi hazırlamak için, 10 mg hyaluronidase 10 mL M2 ortamında çözün.
   NOT: Tek kullanımlık 1 mL aliquotlarda –20 °C'de saklanın ve kullanımdan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.

3. Yemeklerin hazırlanması (Şekil 2)

NOT: IVM, IVF ve IVC damlalarının sayısını, beklenen COC ve embriyo sayısına göre ayarlayın; IVM ve IVF için 100 μL damlasında 20–30 COC ve embriyo kültürü için 100 μL düşüşte 20–30 embriyo kullanın.

1. Her biri 2 mL M2 ortamı içeren uygun sayıda 35 mm oosit toplama kapı hazırlayın; bu kaplar 0,2 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ile desteklenir. Bir tabak yumurtalık ponksiyonu ve COC toplama için kullanın (iki dişi için bir tabak için), diğeri ise COC yıkamak için kullanın. Bulaşıkları kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
2. IVM yemeklerini hazırla.
   1. 60 mm'lik bir tabakta, yıkama için beş damla 100 μL IVM ortamı hazırlayın (tabağı "IVM yıkama" olarak etiketleyin).
   2. Ayrı bir 60 mm tabada, olgunlaştırma için birden fazla 100 μL damlalı IVM ortamı hazırlayın (kabı "IVM" olarak etiketleyin).
   3. Damlaların üzerini kapatacak kadar mineral yağ dikkatlice ekleyin ve yumurta toplamaya başlamadan önce tabakları %5_CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de en az 2 saat dengeleyin.
3. IVF yemekleri hazırla.
   1. 60 mm'lik bir tabada, sperm salınımı ve kapasitasyonu için bir veya iki adet 300 μL önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamı damlası hazırlayın (tabağa "Sperm kapasitasyonu" olarak etiket verin).
      NOT: İkinci kapasitasyon damlası, ilk damladaki sperm hareketliliğinin yetersiz olduğu, yeni bir epididimal sperm örneği toplanıp kapasitasyon yapılması veya tohum konsantrasyonu döllenmeden önce ayarlanması gerektiği durumlar için yedek olarak hazırlanır.
   2. Her biri yıkama için beş damla 100 μL önceden dengelenmiş kültür ortamı içeren iki ayrı 60 mm tabak hazırlayın (tabağı "IVF yıkama" olarak etiketleyin).
      NOT: Bir "IVF yıkama" kabını kullanarak tohumlamadan önce IVM ile olgunlaşmış COC'ları yıkayın, diğer "IVF yıkama" kabını ise birlikte kuluçka sonrası varsayılan zigotları yıkamak için kullanın; kümülüs hücreleri ve kalıntı spermi çıkarmak.
   3. Ayrı bir 60 mm tabak içinde, tohumlama için önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamından birden fazla 100 μL damla hazırlayın (tabağı "IVF" olarak etiketleyin).
      NOT: Önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamı, sperm kapasitasyonu ve tohumlama için kullanılır; böylece sperm hazırlığı ve döllenme sırasında tutarlı koşullar sağlanır.
   4. Damlaları örtecek kadar mineral yağı dikkatlice ekleyin ve sperm kapasitasyonu işlemine başlamadan önce tabakları %5_CO2 kuluçka makinesinde en az 12 saat boyunca 37 °C'de dengeleyin.
4. IVC yemekleri hazırla.
   1. 60 mm'lik bir kabda, embriyoları yıkamak için beş adet 100 μL damla önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamı hazırlayın (kabı "IVC yıkama" olarak etiketleyin).
   2. Ayrı bir 60 mm tabak içinde, embriyo kültürü için önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamından birden fazla 100 μL damla hazırlayın (tabağı "IVC" olarak etiketleyin).
   3. Damlaları kapatacak kadar mineral yağı dikkatlice ekleyin ve embriyo kültürüne başlamadan önce tabakları %5_CO2 kuluçka makinesinde en az 12 saat boyunca 37 °C'de dengeleyin.

4. Yumurtalık koleksiyonu

1. 8–10 haftalık dişi C57BL/6 fareye intraperitoneal olarak 10 IU PMSG uygulanır.
2. PMSG enjeksiyonundan 48 saat sonra, fareyi servikal dislokasyon ile ötenazi yapın ve sırtüstü konumlandırın. Karın bölgesine %70 etanol sıkarak kürkü ıslatın ve karın boşluğuna girmesini önleyin.
3. İnce diseksiyon makası kullanarak, küçük bir alt karın deri kesisi yapın ve eldivenli ellerle cildi nazikçe açarak peritoneal zarı ortaya çıkarın.
4. Periton zarını açın ve bağırsakları nazikçe kenara çekin. Rahim boynuzunu bulun ve onu yumurtalığa doğru takip edin. Böbreğe yakın yumurtalığı belirleyin; genellikle bir yağ pediyle çevrili.
5. Yumurtalığı rahim boynuzundan ayırmak için ince diseksiya makası kullanın ve fazla bağ dokusu ile yağı kesin.
6. Hemen yumurtalıkları IBMX ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış M2 ortamına aktarın. Kontralateral yumurtalığı toplamak ve aynı tabağa aktarmak için işlemi tekrarlayın.
7. Kabı stereomikroskop altına yerleştirin ve folikül ponksiyonu ile COC toplama işlemlerine devam edin.

5. COC'ların toplanması ve kültürü

1. Stereomikroskop altında, görünür antral folikülleri steril bir şırınga iğneyle nazikçe delerek M2 ortamında COC'lar serbest bırakın.
   NOT: Fare GV evresi oositleri toplanırken, tercihen yumurtalık yüzeyinde belirgin şekilde büyük antral folikülleri delin; bunlar genellikle kabarık ve yarı saydam görünür, şeffaf antral boşluğu vardır.
2. İnce çekilmiş cam Pasteur pipeti kullanarak, serbest bırakılan COC'ları toplayın ve bunları IBMX ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış M2 ortamı içeren temiz 35 mm'lik bir kaba aktarın.
3. COC'ları 35 mm çanakta seri transferle temiz bir alana yıkamak için ayrılmış granulosa hücreleri ve doku kalıntılarını çıkarın; her transferde kalıntı bırakılır (Şekil 3).
   NOT: Sonraki adımlar için yalnızca üç veya daha fazla kompakt kümülüs hücre tabakası ve açık boşluklar olmayan uniform granüllü sitoplazmaya sahip^{COC'lar kullanın 9,10}. Denuded GV oositleri ve kısmen kümülüsle kapalı GV oositler bu protokole dahil edilmez. Deneysel koşullarımız altında, dişi fare başına ortalama 26 olgunlaşmamış COC elde edildi.
4. Döküntü temizlendikten sonra, COC'ları IVM yıkama kabına aktarın ve beş damla 100 μL IVM yıkama ortamı ile sıralı transferle yıkayınız.
   NOT: Transferler sırasında, damlalar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için taşıma hacmini en aza indirin.
5. Yıkanmış COC'ları 100 μL damlalık IVM ortamına (damla başına 20–30 COC) aktarın ve 37 °C'de %5 CO_2'de 14 saat kültür yapın.
   NOT: COC'ları en az gecikmeyle IVM ortamına toplayın, yıkayıp aktarın, böylece gelişim potansiyeli sürdürülür.
6. (İsteğe bağlı) IVM'den sonra, COC'ları kısa süreliğine 1 mg/mL hialuronidaza inkübe edin ve kümülüs hücreleri tamamen ayrılana kadar tekrar tekrar tekrar mikropipetle pipetleyin.
   NOT: Hyaluronidase maruziyeti 3 dakikadan fazla olmamakla sınırlayın, çünkü uzun süreli maruz kalma oositlere zarar verebilir.
7. (İsteğe bağlı) Denuded oositleri taze M2 ortamında ısıtılmış aşamada yıkayın, ardından oositlerin olgunlaşmasını stereomikroskop altında değerlendirin.
8. (İsteğe bağlı) Ekstrüziye sahip birinci kutup cisme sahip oositler olgun ve metafaz II (MII) aşamasında kabul edilir. Olgunlaşma hızını, ekstrüziye edilmiş birinci kutup cismine sahip yumurta sayısının toplam kültürlenen oosit sayısına bölünmesi olarak hesaplayın.
   NOT: 5.6–5.8. adımlar, IVM sonrası yumurta olgunlaşmasını, PB1 puanından önce belirlenmiş bir değerlendirme kohortunun denud'ı olarak değerlendirmek için kullanılır. Bu adımlar, doğrudan IVF'ye giden COC'lar için zorunlu değildir.

6. Sperm toplama ve hazırlama

NOT: Bu bölüm, taze spermin toplanmasını ve kapasitasyonunu açıklar. Döllenmeden önce, taze salınan spermler, kapasitasyonun sağlanması için 37 °C'de 1 saat boyunca önceden dengelenmiş embriyo kültür ortamında kuluçka yapılmalıdır.

1. Bir olgun erkek DBA/2 faresini (10–16 haftalık) ötenaze edin ve cauda epididimidlerini çıkarın, mümkün olduğunca fazla yağ, kan ve doku sıvısından kaçının (Şekil 4).
2. Her erkek için, her iki kauda epididimidi, sperm salınımı ve kapasitasyonu için 300 μL önceden dengelenmiş G-IVF ortamına aktarılır.
3. Kauda epididimini bir çift pensis ile immobilize edin, steril bir şırınga iğnesi ile kauda epididiminde beş ila yedi kesik açın ve dokunun yoğun spermi serbest bırakılması için dokunun nazikçe sıkılması.
   NOT: Sperm hareketliliğini değerlendirin ve sadece spermlerin çoğunluğu ilerleyici hareketlilik (PR) gösterdiğinde devam edin; bu hareket aktif ileri hareket olarak tanımlanır, progresif olmayan hareketlilik (NP) veya hareketsizlik¹¹ değil.
4. Kabı 37 °C'de, %5 CO₂ içinde 1 saat kuluçka altına alın, böylece sperm kapasitasyonu sağlanır.

7. In vitro fertilizasyon

1. 14 saat IVM'den sonra, COC'ları beş damla 100 μL tüp yıkama ortamından ardışık transferle yıkayın ve ardından yıkanan COC'ları tüp bebek tohumlama damlalarına aktarın (100 μL damlada 20–30 COC).
2. COC içeren döllenme kabını 37 °C'de %5_CO2 içinde 30 dakika önceden inkübe edin, ardından döllenme yapın.
3. Kapasitasyondan sonra, hemositometre kullanarak sperm konsantrasyonunu belirleyin.
4. Sperm konsantrasyonuna dayanarak, gerekli aşı hacmini hesaplayın ve her IVF damlasına kapasitasyona sahip sperm ekleyerek nihai konsantrasyon 4 × 10⁵ –1 × 10⁶ sperm/mL elde edilir.
   NOT: Sperm eklendikten sonra, her döllenme damlasında hareketli sperm bulunduğundan emin olun.
5. COC ve sperm içeren tüp bebek kaplarını %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de 4–6 saat boyunca kuluçka edin.

8. Embriyo kültürü

1. 4–6 saat kuluçkadan sonra, yumurtadan biraz daha büyük iç çapı olan, ince çekilmiş cam Pasteur pipeti kullanarak minimum hacimde muhtemel zigotları aspire edin ve bunları IVF yıkama damlalarına aktarın.
2. Varsayılan zigotları, beş tüp bebek yıkama damlası ile sıralı olarak yuyusun, her damlada nazikçe pipet ile fazla sperm ve kalıntıyı çıkarabilirsiniz (Şekil 5).
3. Yıkanmış varsayılan zigotları IVC yıkama kabına aktarın ve beş önceden ısıtılmış embriyo kültürü ortamı yıkama damlasından ardışık transferle yıkayarak tüp bebek ortamının taşınmasını en aza indirin.
4. Varsayılan zigotları embriyo kültürüne yerleştirin, ortam kültürü damlaları ve %5 CO₂ (100 μL damlasında 20–30 embriyo) 37 °C'de kültürleyin.
5. Döllenmeden 6–8 saat sonra, erkek ve dişi pronükleusların varlığını değerlendirerek stereomikroskop altında döllenmeyi değerlendirin ve sadece bir kutup cismi tutan ve görünür pronükleusları göstermeyen oositleri atın.
6. Döllenmeden 24 saat sonra, iki hücreli embriyoların sayısını sayın ve iki hücreli hızı (iki hücreli embriyolar / tohumlanmış oositler) olarak hesaplayın.
7. Saydıktan sonra, ayrılmamış embriyoları çıkarıp atın ve kalan bölünmüş embriyoların kültürüne devam edin.
   NOT: Bu aşamada embriyonlar vitrifikasyona geçirilebilir, alıcı kadınlara aktarılabilir veya blastosist evresine kadar kültürde tutulabilir.
8. Embriyoları, tohumlanma sonrası 96 saat (hpi) kadar aynı kuluçka koşullarında kültüre devam edin. Morfolojik kriterlere göre 96 hpi seviyesinde blastosist oluşumunu değerlendirin.
   NOT: Bu dönemde başka bir ortam değişikliği gerekmemektedir. Normal bir blastosist, görünür bir blastocoel boşluğu, belirgin bir iç hücre kütlesi ve sağlam bir trofektoderm tabakası ile tanımlanır.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, fare COC'ları in vitro olgunlaşma, in vitro döllenme ve ardından in vitro embriyo kültürü yoluyla sıralı olarak işlendi; bu da preimplantasyon embriyolarının tekrarlanabilir üretimi ve tanımlanan koşullar altında blastosist evresine gelişimi sağlandı. 14 saat IVM'den sonra, COC'lar genellikle kümülüs genişlemesi ve sağlam oosit morfolojisi göstermiştir. Oosit meiotik olgunlaşması, IVM sonrası belirlenmiş bir değerlendirme kohortunun de...

Tartışma

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro fertilizasyon ve olgunlaşmamış COC'lar kullanılarak in vitro kültür için standartlaştırılmış bir prosedür sunar; böylece tanımlanmış in vitro koşullarda blastosist aşamasında preimplantasyon embriyolarının tekrarlanabilir üretimi ve değerlendirilmesini sağlar. Birçok çalışmada, IVM sonuçları, laboratuvara özgü ortam, kuluçka süreleri ve kullanım farklılıklarına duyarlıdır; bu da IVM

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm Petri kabı	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri kabı	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovin Serum Albumini	Sigma-Aldrich	A8806
Üreme diyeti (kemirgen yetiştirici yemi)	Keao Xieli (Pekin, Çin)	N/A
CO2 inkübatörü	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glukoz	Sigma-Aldrich	G7021
Tek kullanımlık Pasteur Pipeti	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal büyüme faktörü	Gibco	PHG0313
İnce diseksiyon makası	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
İnce uçlu forseps	Rhino	SW14
Folikül uyarıcı hormon	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(ön dengelenmiş) embriyo kültür ortamı
Hemositometer	Millicell	MDH-4N1
Hiyalüronidaz	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-İzobütil-1-metilsantinin)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Değiştirici	Gibco	A3181501
L-Sistein	Sigma-Aldrich	C7352
Lüteinize edici hormon	Millipore	869003
M2 ortamı	Sigma-Aldrich	M7167
Ortam 199	Gibco	11150-059
Mikropipet	Gilson	F167350
Mineral yağ	Sigma-Aldrich	M8410
Fosfat tamponlu salin	Gibco	20012027
Hamile Aygır Serum Gonadotropini	Ningbo İkinci hormon fabrikası (Ningbo, Çin)	N/A
Sodyum pirüvat	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo mikroskop	Olympus	SZX10
Steril ortam şişeleri	Nalgene	46600-586
Steril şırınga iğnesi	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Şırınga Filtresi Ünitesi	Millipore	SLGP033R
Termo Plaka	Tokai Hit	TPi-SZX2X