Bir şekil analizi algoritması, fenotiplerin yeni nicelenmesi için 2D'den 3B hücre kültürüne uzamsal morfolojisini ve bağlamını niceliklendirir

Summary

Bu makale, hücrelerde ve organoidlerdeki yeni morfolojik özelliklerin, geleneksel metriklerin (alan, hacim ve yüzey alanı) gibi özellikleri yakalayamayan bir uzamsal algoritma olan lineerize sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü kullanılarak nasıl nicelendirilebileceğini açıklar. Şekil yöneltmesi ve hizalama için en iyi uygulamalar tartışılır.

Abstract

Birçok çalışma, bir hücrenin veya organoidin morfolojik fenotipinin kanser karşıtı ajanlara karşı duyarlılığıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Ancak, fenotipi ölçme yöntemleri alan, hacm, çevre ve sinyal yoğunluğu gibi mekansal metriklere dayanır; bunlar çalışır ancak sınırlıdır. Bu yaklaşımlar, sol ve sağ elliliğin bir özelliği olan kiralite gibi mekansal bağlamın birçok kritik özelliğini ölçemez. Sol ve sağ ayakkabılar aynı hacme sahip olduğu için kiraliteyi kaydetmek için hacim kullanılamaz. Kiralite, yerçekimi yönü ve polarite ekseni şeklinde mekansal bağlam insanlar için sezgisel olsa da, hücre biyologları, patologları, radyologlar ve makine öğrenimi uygulayıcıları tarafından bugüne kadar kullanılan geleneksel metrikler bu temel kavramları yakalayamıyor. Doğrusal sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü, diğer hiçbir metrikten farklı olarak mekansal bağlamı yakalayabilen yeni bir algoritmadır. LCPC dönüşümü, kontur ile ızgara çizgileri arasındaki kesişim noktalarını takip eden bir ızgara sistemini üste bindirerek iki boyutlu (2D) bir konturu ayrık sinüzoidal dalgaya dönüştürür. Konturu, bağımsız koordinat (x-koordinat) ise 2B uzaydaki ardışık konumlara karşılık gelen ayrık koordinat çiftlerinden oluşan bir diziye dönüştürür. Her bağımlı koordinat (y-koordinat), kontur ve ızgara çizgisinin kesişimi arasındaki mesafeden izgara sisteminin orijin veya baz çizgisine kadar olan mesafeyi içerir. Diskret sinüzoid dalgası biçiminde, Hızlı Fourier Dönüşümü verilere uygulanır. Bu şekilde, 2D ve 3D hücre kültüründeki hücrelerin şekilleri sistematik ve çok boyutlu olarak temsil edilir; bu da tedaviye dirençle ilgili içgörüler ortaya çıkaracak sağlam nicel stratifikasyonu mümkün kılar.

Introduction

Üç boyutlu (3D) organoid kültür, in vivo biyoloji ^1,2'yi taklit ederek iki boyutlu (2D) hücre kültürüne göre üstün olduğu kanıtlanmıştır. Organoidler, etkili tedaviler için tarama ve hastalık ilerlemesi hakkında bilgi kazanmak için kanser araştırmalarında vazgeçilmez ^{hale gelmiştir} 3,4,5,6. Kanser biyolojisinde morfolojideki ayrımların hücrelerin ve dokuların belirgin biyolojik davranışlarıyla ilişkili olduğu iyi bilinse de, alan sınırlı kapsama sahip geleneksel şekil metriklerine dayanır. Bu çalışma, alan, hacim ve yüzey alanı gibi geleneksel yaklaşımları aşarak eşi benzeri görülmemiş bir hassasiyetle ince morfolojik özellikleri nesnel olarak niceleyen yeni bir uzamsal algoritmayı tanımlar.

Doğrusal sıkıştırılmış kutup koordinatları (LCPC) dönüşümü, doku histopatolojisinde gözlemlenen karmaşık morfolojileri objektif ve nicel olarak tanımlamak için icat edilmiştir ve kolon^{poliplerinin derecelendirmesini artırmayı amaçlamaktadır 7}. Bu yaklaşımı bipolar bozukluk ve Alzheimer hastalığı gibi beyin patolojilerinde makroskobik MR tabanlı mekansal özellikleri yakalamak için genişletme arzusu, bu yaklaşımı daha da güçlendiren iyileştirmelere yol açtı. Bu çalışma, LCPC dönüşümünün iki versiyonunun adım adım uygulanmasını ve en iyi uygulamalarını açıklar; paralel ızgara sistemi ve radyal ızgara sistemi; her ikisi de açık kaynak betikleri ve eğitim videolarına sahiptir.

Geleneksel geometrik yöntemlerin yanı sıra, hücrelerin ve organların karmaşık şekillerini ölçmek için etkili olan birçok soyutlama da mevcuttur. Bunlar arasında eksantriklik, eğrilik, kontrast ve kurtoz ölçümü ile dairesellik, asimetri, kenar düzensizliği ve küresel kontur^{yapısı 8,9,10} yakalamak için Zernike anları yer alır. Fraktal analiz, karmaşık konturları skaler değerlere indirgemek için de faydalı olmuştur; örneğin Fraktal Boyut, konturun ne kadar düzensiz olduğunu ölçür ve boşluklar, konturda heterojen düzensiz^{boşlukların nasıl göründüğünü ölçer; 11,12}. Doku ölçümü için Gri Seviye Birlikte Oluş Matrisi (GLCM) yöntemi, kontrast, enerji, homojenlik, korelasyon ve entropi^13,14 ölçümlerinde popülerdir. Tüm bu yöntemler faydalı olsa da, hiçbiri yerçekimi yönü, sol ve sağ elini veya şekil değişimini etkileyen merkezi destek yapısının konumu gibi mekansal bağlamı yakalamak için tasarlanmamıştır. Ayrıca, birçoğu mekânsal bilgiyi temsil etmek için tek bir skaler değer veya sadece birkaç skaler değer üretir; bu nedenle alıntılanan çalışmalar genellikle karmaşık şekilleri değerlendirmek için bunları birlikte kullanır.

LCPC dönüşümü, tek bir ölçümden birçok özellik üretecek ve şekle mekansal bağlamı kodlayan yerçekim yönü gibi mekansal işaretleyicilerin eklenmesine olanak tanıyacak şekilde tasarlandı. LCPC^{dönüşümü 7'ye} en yakın yöntem,^15'ten bir yıl sonra yayımlandı ve aynı temel fikri paylaşan başlangıç noktası olarak paylaşıldı: Fourier dönüşümünü hücre konturlarına uygulayarak şekli frekans spektrumu şeklinde ölçmek. Ancak, LCPC dönüşümü, ölçülen şeklin dışındaki mekansal bağlam bilgisiyle birlikte kullanılmak üzere tasarlanmış farklı ızgara sistemleri aracılığıyla bağımsız olarak geliştirilmiştir. Ayrıca, LCPC dönüşümünün mucidi bu el yazmasında ortaya çıkan frekans spektrumunun büyük miktarda gizli mekansal bilgi içerdiğini açıklar. Ek Dosya 1, kaynak gösterilen yöntemler kullanılırken sıklıkla göz ardı edilen biyolojiye uzamsal bağlamlar ve LCPC dönüşümünün bu bağlamı yakalamak için nasıl uygulanabileceği üzerine kapsamlı bir tartışma içerir. Şekil verileri kontrol ve deneysel gruplar arasında fark göstermeyen, gözlerinin şekillerde fark görüp görmediği ya da şekil verileri çok az fark gösteren okuyucular için, daha büyük bir fark olması gerektiğini düşünseler bile, LCPC dönüşümünü denemeleri gerekir.

LCPC dönüşümü, şekilleri birden fazla boyutta temsil ettiği için mekânsal bilginin ölçülmesinde eşi benzeri görülmemiş bir hassasiyet sağlar. Alan ve hacim gibi geleneksel yöntemlerin aksine, her şekil için yalnızca bir skaler değer verir (yani 25 cm²), LCPC dönüşümünün sonuçları birden fazla indeks verebilir ve her biri şeklin farklı morfolojik yönleriyle (örneğin, köşelerin yuvarlaklığı ve keskinliği, kenarların pürüzsüzlüğü vs. keskinliği) ilişkilidir. LCPC dönüşümü, konturunu kesişen düz çizgilerden oluşan bir ızgara üzerine bindirerek 2D bir şekli tanımlar. Her ızgara sisteminin doğrusal mesafeyi ölçmek için bir orijin (Şekil 1) veya bir temel çizgisi (Şekil 2) vardır. Algoritmayı tanımlayan basitleştirilmiş akış şemaları için Şekil 1B ve 2B'ye bakınız. Şebekâr çizgileri ile şeklin konturu arasındaki her kesişim noktası tespit edilir. Her kesişimin mesafesi daha sonra bir baz çizgisine veya başlangıç çizgisine göre hesaplanır. Bu şekilde, LCPC dönüşümü 2B şekilleri ardışık x-y koordinat çiftlerine dönüştürür. x-koordinatı ızgara çizgisinin sıfırdan sonsuza konumunu gösterirken, y-koordinatı kesişimin temel çizgiye veya orijina olan mesafesini temsil eder. Bu formda, yani ayrık bir sinüzoid dalga olan bu şekilde, Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) uygulanarak veri "konum alanından" frekans alanına dönüştürülür. Eğer x-koordinatı zamanı temsil ediyorsa, "konum alanı" FFT'nin standart uygulamalarında "zaman alanı" ile eşdeğer olurdu.

Radyal ızgara sistemi, radyal ızgaranın başlangıcından her kesişimin mesafesini ölçerken, paralel ızgara sistemi her zaman kesişim mesafesini şeklin solundaki hayali bir çizgiye referans olarak ölçer (Şekil 2A). Açık kaynak betik, bu hayali çizginin konumunu konturun en soldaki pikselini bulup ardından bu konumun 10 pikselini sola hareket ettirerek belirler. Burada, bu konumun x-koordinatı tüm kesişimlerin hesaplandığı referans çizgisi olur. Bu 10 piksel kuralı keyfidir, ancak bu yüzden paralel ızgara sistemi için açık kaynak betikiyle analiz edilen tüm konturların dört tarafında en az 15 piksel beyaz alan olması gerekir.

Katlı veya birden fazla katmanlı 2B şekillerde, ızgara çizgileri konturu birden fazla kez kesişebilir. Bu durumda, bir ızgara çizgisi boyunca tüm kesişimlerin mesafeleri tek bir değere toplanır. Bu nedenle, her ızgara çizgisinin yalnızca bir x koordinatı ve bir y-koordinatı vardır. Bu özet, LCPC dönüşümü adında "sıkıştırılmış" terimiyle temsil edilir. Doğrusal olmayan bir 2B şeklin ayrık sinüzoid dalgaya dönüştürülmesi, algoritmanın adında "linearized" terimiyle temsil edilir. Son olarak, algoritmanın adında "kutup koordinatları" terimi yer alır çünkü ilk kavramsallaştırılan ızgara sistemi, kutup^{koordinatları 7'den} oluşan 180 derecelik radyal bir ızgaradır. Polar ve Kartezyen koordinatların birbirinin yerine geçebileceği fark edildikten sonra bile, algoritmanın adı olduğu gibi kaldı. Teşekkürler bölümü, LCPC dönüşümünün icat edilmesini ve geliştirilmesini motive eden kişisel nedenleri açıklar.

Protokol 1, Şekil 3B'de gösterilen verilerin elde edilmesi için kullanılan dizidirken, Protokol 2 ise Şekil 3C–D'de gösterilen verilerin elde edilmesi için kullanılan dizidir. Bu protokollerdeki adımlar, GitHub deposunda bulunan "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"^16'da bulunan bireysel Python betiklerinde uygulanmıştır. Protokol 1, LCPC dönüşümü için "saf şekil" türetilmesi için yapılan ön işlem adımlarına bir örnektir. Protokol 2, şekilleri "ölçekte" ölçmek için ön işleme adımlarına örnektir; yani birbirlerine göre orijinal ölçeklerinde.

Segmentasyon, Mac'in Preview veya Microsoft'un Paint gibi görüntü işleme yazılımlarında manuel olarak veya eşik tabanlı yöntemlerle yapılabilir. Manuel olarak yapılırsa, aşağıdaki dört renkten biri seçilmelidir: mavi, yeşil, pembe/magenta veya kırmızı. "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ adlı GitHub deposunda "color extraction scripts" adlı bir klasör bulunur. Bu klasörde, bahsedilen dört rengi çıkaran ve beyaz zeminde mavi maskelere dönüştüren dört Jupyter Notebook dosyası içerir. Bu işlem, Fiji/ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında kontur renginin eşik olarak belirlenmesiyle de gerçekleştirilebilir. Sınırları birbirine değen veya üst üste binen kenarları olan konturlar içeren görüntüler için (örneğin, Venn diyagramı), görüntü işleme yazılımı kullanılarak ayrılmaları gerekir; böylece birden fazla organoid kontur içeren bileşik maske görüntüsünde bağımsız nesneler haline gelirler. Bu, sadece bir organoid veya birbirine dokunmayan birden fazla organoid içeren görüntüler için geçerli değildir.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan birincil insan hücreleri, etik onaylar ve bilgilendirilmiş onay prosedürleri kapsamında alınmış ve kültürlenmiştir; daha önce^{bildirilen 17}. Burada sunulan görüntüler, onaylanmış hücre kültürlerinden oluşturulmuş ve ilk kez yayımlanmıştır. Doku örnekleri, daha önce tanımlandığı gibi, dokularının araştırma kullanımı için bilgilendirilmiş onay veren hastalardan Brigham and Women's Hastanesi ve Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco'da Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokoller kapsamında^{toplanmıştır 17}. Bu çalışma için ek insan örneği toplama yapılmadı.

1. LCPC dönüşümü için 2D organoid konturların saf şeklinin çıkarılması

1. Microsoft'un Paint, MacOS'un Önizlemesi veya Fiji/ImageJ gibi herhangi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak her organoidin dış kenarını segmentlere ayırın.
2. Organoidlerin konturlarını, beyaz zemin üzerinde mavi çizgiler şeklinde açık maskeler olarak çıkarın.
3. Her mavi konturu kendi beyaz tuvale izole edin.
   NOT: Bu adım yalnızca bir görüntünün birden fazla kontur içermesi durumunda gereklidir.
4. Her konturu kırpın, mavi nesnenin dört tarafında bir piksellik bir kenar bırakın.
5. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin.
6. Nesneleri en uzun iç uzunluk yatay olacak şekilde döndürün.
   NOT: Bu adım, her nesne içindeki en uzun iç çizgiyi nesnenin genişliğine dönüştürür. Bu amaçla iki senaryo mevcuttur. Kapalı şekiller için, "Döndür KAPALI KAPALI Nesneyi Yatay En Uzun İç Length_v2.ipynb" adlı Jupyter Defteri kullanın. Açık şekiller veya birden fazla bileşenli şekiller için, "Rotate Green Line_v3.ipynb" adlı Jupyter Notebook'u kullanın. Rotate Green Line aracı, .ipynb dosyasıyla aynı klasörde bulunan ReadMe dosyasında bağlantılı bir video eğitimi sunuyor.
7. Her görüntüyü, mavi nesnenin dört tarafında bir piksel kenarı olacak şekilde kırpın.
   NOT: Bu, Adım 1.4 ile aynı. Ancak bu kez kesmenin amacı, sonraki boyut değiştirme adımının sadece içindeki mavi nesneyi değil, tüm tuvali boyutlandırmasıdır. Bu nedenle, mavi nesneyi tuvalin kendisiyle neredeyse aynı genişlik ve yüksekliğe getirerek, tuvalin boyutunu 400 piksel genişliğine düşürürken, nesneyi neredeyse 400 piksel genişliğine kadar yeniden boyutlandırır. "Trim margin to 1-pixel border.ipynb" adlı bir Jupyter Notebook var.
8. Her görselin tuval genişliğini 400 piksel genişliğine dönüştürürken en-boy oranını da kısıtlayabilirsiniz.
   NOT: Bu adım, her nesnenin aynı genişliğe sahip olmasını sağlar. Boy oranını sınırlamak, boyutlandırma sırasında nesneyin eğilmesini önler. "Genişliği 400 piksele yeniden boyutlandır ama en-boy oranını kısıtla.ipynb" adlı bir Jupyter Notebook var.
9. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin.
10. Her görüntüyü 90 derece saat yönünde veya saat yönünün tersine döndürerek en uzun iç uzunluk dikey olur ve tüm görüntüler için seçimle tutarlıdır.
    NOT: Yukarıdaki dizide, saf şekil 1.6, 1.7, 1.8 ve 1.9. adımların ardışık uygulanmasıyla elde edilir. Step 1.9'da kenar alanı eklemek, LCPC dönüşüm betiklerinde yapılacak hataları önlemek için gereklidir, ancak saf şeklin çıkarılmasında bu hatalar yer almaya gerek değildir. Şekilleri "ölçekte" ölçmek isteyen kullanıcılar, yukarıdaki dizide 1.6, 1.7 ve 1.8. adımları gerçekleştirmek zorunda değildir, ancak LCPC dönüşümünü uygulamadan önce en iyi yönelime ulaşmak için maske görüntülerini önceden işlemeleri gerekir.
11. Her konturda LCPC dönüşümünü gerçekleştirin. Radyal ızgara^{yöntemi 18} veya paralel ızgara^{yöntemi 19} için sağlanan Python betiklerini kullanın.

2. LCPC dönüşümü için 2D organoid konturlarının ölçekli şeklinin çıkarılması

NOT: Nesnelerin ölçekli şeklini adım adım çıkarma yöntemi, yukarıdaki Protokol 1'deki saf şekil çıkarma yöntemine benzer. Adımlar, eşleştirmeyi kolaylaştırmak için her iki protokolde de aynı şekilde adlandırılmıştır. Her adım için lütfen Protokol 1'deki notlara bakınız. Saf şekil ile ölçekli şekil arasındaki temel fark, ölçekli şekilin boyutlandırma adımları olan 1.6, 1.7 ve 1.8 adımlarını gerektirmemesidir.

1. Her organoidin dış kenarını segment edin. Hesaplamalı bir yaklaşım kullanın veya bunu Microsoft'un Paint, MacOS'un Önizlemesi veya Fiji/ImageJ gibi temel bir görüntü düzenleme yazılımı aracılığıyla manuel olarak yapın.
2. Organoidlerin konturlarını, beyaz bir tuval üzerinde mavi çizgiler şeklinde açık maskeler olarak çıkarın. Maskeleri çıkarmak için Fiji/ImageJ veya sağlanan Python betikini^{kullanın 16}.
3. Her mavi konturu kendi beyaz tuvale izole edin. Maskeleri çıkarmak için Fiji/ImageJ veya sağlanan Python betikini^{kullanın 16}.
4. Her konturu kırpın, mavi nesnenin dört tarafında bir piksellik bir kenar bırakın. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
5. Yeni kenarlar oluşturmak için dört tarafın her birine 100 piksel beyaz alan ekleyin. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
6. Her konturu en uzun iç çizgisi dikey olacak şekilde döndürün. Fiji/ImageJ veya Python scripti¹⁶ ile sağlanmıştır.
7. Her konturda LCPC dönüşümünü gerçekleştirin. Radyal ızgara^{yöntemi 18} veya paralel ızgara^{yöntemi 19} için sağlanan Python betiklerini kullanın.

Results

Meme kanseri organoidlerine uygulanan radyal ızgara LCPC dönüşümü

3D organoidler ve tümörler, geleneksel metrikler istatistiksel olarak önemsiz farklar verse de, bazıları insan gözünden açıkça farklı olan çeşitli şekiller alabilir. Öte yandan, organoidler insan gözüne heterojen ve dolayısıyla önemsiz görünen şekiller de gösterebilir; bu da farklı alt tipleri temsil eden tekrarlayan ince morfolojileri gizler. İnsan birincil meme organoidleri, hastalardan çıkarıldı ve daha önce yayımlanmış 17,20,21 protokolü uyarınca 3D olarak kültürlendi. Şekil 3A, görsel incelemeye dayanarak erişilebilen üç morfolojik kategoriyi göstermektedir: kistik fenotip, polikistik fenotip ve yoğun polikistik fenotip. Şekil 3B, bu organoidlerin dış konturlarının elle segmentlendiğini ve saf şekillerinin çıkarıldığını, bu da şekillere boyut etkisinin ortadan kalktığını göstermektedir. Konturlar dairesel olduğu için, saf şekillere radyal ızgara LCPC dönüşümü uygulandı, ardından PCA uygulandı. Şekil 3B'de üst üste binen konturlar, en uzun iç çizginin dikey olacak şekilde döndürüldüğünü unutmayın; bu da yönelimlerinin kaynak görüntülerdeki gibi olmadığını ifade eder. Şekil 3B, ilk iki ana bileşenin (PC) nokta grafikini gösterir ve K-ortalama kümeleme üç küme belirlemiştir: 0, 1 ve 2. Siluet Puanları (SS), 0 ile 1 (SS = 0.68) ve 1 ile 2 (SS = 0.69) arasında iki ayrı küme olasılığını doğrularken, 0 ile 2 arasındaki zayıf bir ayrım olduğunu belirtmiştir (SS = 0.27). 0 ve 2 kümeleri arasındaki zayıf Silüet Puanı olmasına rağmen, veri noktalarını her veri noktasının saf şekliyle etiketlemek, Küme 2'nin en belirgin fenotipi temsil ettiğini haklı çıkarır: son derece asimetrik, dairesel olmayan konturlar (bu durumda konturların kalınlığı önemli değildir).

Saf şekil, alan ve hacim ölçüldüğünde imkansız olan boyutun şekil üzerindeki etkisini ortadan kaldırırken, organoid konturlarının ölçekte ölçülmesi de ilginç içgörüler ortaya çıkarır. Şekil 3C , görüntülerden herhangi bir boyutlandırma değişikliği olmadan segmentlere ayrılarak konturlar üzerinde gerçekleştirilen radyal ızgara LCPC dönüşümünden elde edilen ilk üç PC'nin 3D nokta grafikini göstermektedir. Bu yaklaşım, LCPC dönüşümünün organoidlerin hem şeklini hem de boyutunu aynı anda ölçtüğü anlamına gelir. Şekil 3C , polisistik ve yoğun polikistik organoidlerin kistik organoidlere kıyasla daha az yoğun olduğunu göstermektedir. Bu genişlemeyi nicelikle ifade etmek için, Şekil 3D, her fenotipin paylaşılan PCA uzayındaki saçılmasını gösterir. Her fenotip için ortalama K-en yakın Komşu Mesafesi (KNND) hesaplanır; bu, kistik organoidlerden (KNND = 1.061) polikistik organoidlere (KNND = 1.575) ve yoğun polisistik organoidlere (KNND = 247) kadar azalan nokta yoğunluğunun görsel değerlendirmesini destekler; Bu azalmış nokta yoğunluğu, dış konturların artan morfolojik heterojenliği olarak da yorumlanabilir. Son olarak, LCPC dönüşümünün geleneksel alan metriğiyle karşılaştırılması için, Şekil 3E , kistik organoidlerin ve yoğun polikistik organoidlerin alanı arasında istatistiksel bir anlamlılık olduğunu göstermektedir (p = 0.016, Wilcoxon Rank-Sum Testi), ancak saf şekil LCPC analizinden sonra K-means Kümeleme ile tanımlanan fenotipler arasında üç farklı morfolojik grup olduğuna dair alan temelli bir gösterge yoktur (Şekil 3B) veya ölçekli LCPC analiziyle gösterildiği gibi morfolojik heterojenliğin arttığını (Şekil 3C–D) belirtir. Şekil 3E, veri noktalarının kistik organlardan polikistik ve yoğun polikistik organoidlere doğru azalan bir dağılımı göstermektedir; bu, ölçekli LCPC analizinde gözlemlenenin tam tersidir (Şekil 3C); bu da LCPC dönüşümü tarafından yakalanan mekansal bilginin yakaladığı alandan farklı olduğunu vurgular.

Aynı yaklaşım, Şekil 3'te bireysel 2B şekiller için uygulanmıştır ve Ek Şekil 1 de 2B hücre kültüründeki hücrelerin konturuna uygulanır: tek hücreler (örneğin kırmızı kan hücreleri) veya hücre kümeleri (örneğin servikal Pap smear'larda). Bu vakaların her biri için pilot çalışmalar videolarda anlatılır: dış konturlarında farklı derecelerde katlanma gösteren beyin^{organoidlerinin şekil analizi 22}; Akciğer alveollerinin yer değiştirdiği şekil analizi, aynı prensipler 2B hücre kültürünün^{analizinde de uygulanabilir;} Pap smear'larından elde edilen servikal doku şekil analizi; burada hem çekirdek hem de hücre zarının konturu aynı anda radyal ızgara LCPC^{dönüşümü 24} ile nicelendirilir; sıtma ile enfekte olan kırmızı kan hücrelerinin ve enfekte hücrelere bitişik hücrelerin şekil analizi (enfekte olmamış^{) 25}; Orak Hücre Hastalığından etkilenen kırmızı kan hücrelerinin şekil^{analizi 26}.

Mekansal bilgi indeksi olarak yoğunluk veya dokuyu ölçmek için paralel ızgara sistemi

Mekânsal bilgi, doku ve yoğunluk gibi kavramları kapsadığı için karelik, yuvarlaklık ve eğrilik gibi olağan şekil kavramlarından daha fazlasını içerir. Kan damarları gibi karmaşık tübüler ağlar veya sitoskelet filamentleri gibi dallanan ağlar, şekil kavramına daireler ve çokgenler gibi geometriye dayalı şekil algımızla aynı anlamda uymaz. Ancak, yoğunluk ve doku, hücrelerin, organoidlerin ve tümörlerin yapısını ve işlevini anlamak için mekânsal bilgi kavramlarının çok faydalı kavramlarıdır. Floresans görüntülemede karmaşık ağların nicelendirilmesini ele alırken, hücre biyologları bir görüntüdeki ortalama sinyal yoğunluğu veya bir görüntünün toplam alanının sinyali içeren yüzdesi gibi özellikleri ölçürler. Bu yaklaşımlar, mekansal bilginin geometri motifleriyle tanımlanandan daha fazlası olduğunu kabul eder.

Bir çip üzerindeki dokular, tümörler ve organlar içindeki damar ağlarının deseni geleneksel geometri motifleriyle kolayca tanımlanamaz, ancak doku ve yoğunluk olarak yorumlanmasından faydalanır. Tümör gelişimi ve tedavi direncinde damar yeniden modellemesi kanserin iyi bilinen bir özelliğidir (^27'de incelenmiştir). 458 primer nöroblastik tümörün histopatolojik^{kesitleri 28} analiz edildi ve toplam kan damarlarının ve damar segmentlerinin yoğunluğu, büyüklüğü ve şekli karakterize edildi. Düşük prognostik faktörlere sahip hastaların tümörlerinde, kan damarlarının daha büyük, bol ve daha düzensiz şekilli olduğunu, olumlu kohortun tümörlerine kıyasla buldular. İlginç bir şekilde, "tümör kümelerini kapsülleyen damarlar" (VETC)²⁹ adlı bir terim, daha büyük hepatosellüler karsinom içinde küçük tümör kümelerini çevreleyen ve daha yüksek metastaz ile tekrarlanma oranlarıyla ilişkili olan kan damarlarının desenini tanımlamak için ortaya atılmıştır. Bu terimi ortaya atan aynı grup, VETC pozitif hepatosellüler karsinomun kinaz inhibitörü^{Sorafenib 30} ile tedaviye verilen olumlu yanıtla ilişkili olduğunu ortaya koydu. Bu nedenle, damar desenlerini nicelendirme yeteneği, prognoz ve direnç mekanizmalarını anlamak için hayati öneme sahiptir.

Yoğun tüpler, ada ve dallar ağlarını niceltmek için, LCPC dönüşümünün paralel ızgara sistemi, şekil yerine doku-yoğunluğu denebilecek bir şeyi ölçmek için faydalıdır. Paralel ızgara LCPC dönüşümünün bunu nasıl yapabileceğine bir örnek olarak, Şekil 4A , kalp damarları³¹ üzerinde yapılan bir çalışmadan kalp mikrovaskürün desenlerini göstermektedir: çıplak gözle, enfarktlı alanlar ile yaralanma bölgesinden uzak bir bölgedeki desenleri objektif ve nicel olarak ayırt etmek çok zordur. Kan damarlarının maskesi çıkarılarak (Şekil 4A Adım 1) ve paralel ızgara LCPC dönüşümü uygulanarak nicel farklılıklar gözlemlenebilir. İlk olarak, verinin temizliğini artırmak için, her görüntü düz çapta bir daire ile kesildi ve bu daire kare görüntünün ortasında (Şekil 4A Adım 2), böylece her görüntünün döndürülmesine fark etmeksizin aynı yükseklik ve genişliğe sahip olmasını sağlar. Sonrasında, kırpılan görüntüler ana ekseni ( Şekil 4A Adım 1'de kırmızı çift oklar) dikey olacak şekilde döndürülür (Şekil 4A Adım 3). Daha sonra, görüntünün çevresine mavi bir çizgi uygulanır; böylece seyrek damar desenlerine sahip görüntülerin bile mavi piksel açısından aynı çapa sahip olmasını sağlar (Şekil 4A Adım 4). 3. ve 4. adımlar Fiji/ImageJ yazılımı (v2.14.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Son olarak, paralel ızgara LCPC dönüşümü uygulanır (Şekil 4A Adım 5). Sonuçların PCA ile analiz edilmesi ve ilk üç PC'nin çizilmesi, enfarktlanmış bölgelerin uzak bölgelerden ayrı kümelendiğini ortaya koymaktadır (Şekil 4B). Çapta Mesafesi (CD) hesaplamaları, grafiklerin gösterdiği görsel desenleri nicelikle ifade eder. Yaralanmadan 1 gün sonra, enfarktlı bölge, bazal duruma (bazal vs. 1Day_infarct: CD = 83.89) zarar vermeyen bölgeye göre daha uzak bir vasküler desen gösterir (bazal vs 1Day_remote: CD = 53.95). Yaralanmadan 1 gün sonra, yaralanmamış uzak bölge, bazal duruma göre yaralanma yerine (1Day_remote vs 1Day_infarcxt: CD = 34.48) daha yakındır. Yaralanmadan 3 gün sonra, yaralanan bölgenin ve ilgili yaralanmamış uzak bölgenin damar desenleri bazal durumdan ve birbirinden ciddi sapmalar gösterir (bazal vs. 3Days_Infarct: CD = 240.63; Bazal vs. 3Days_Remote: CD = 67.28; 3Days_Remote vs. 3Days_Infarct: CD = 168.35). Çok ilginç bir şekilde, yaralanmadan 7 gün sonra, yaralanan bölgenin ve yaralanmamış uzak bölgenin damar desenleri, bazal duruma yaklaşık olarak dik konumda olan 3D bir alan kaplarken, yaralanma sonrası 1 güne göre daha yakın bir mesafede hizalanmıştır (7. gün için CD = 24.76, 1. gün için 34.48). Veriler iki şeyi gösteriyor: (1) iyileşme ilerledikçe, yaralı bölgenin ve yaralanmamış uzak bölgenin damar desenleri bazal durumdan farklı desenler benimser; (2) Yaralı bölgede aktif edilen yeniden yapılandırma programı, ilgili yaralanmamış uzak alanlarda benzer morfolojik değişiklikleri tetikler.

LCPC dönüşümünün çok yönlülüğüne dair bir referans olarak, kan damarlarının yüzde alanı (Şekil 5A) ve toplam çevresi (Şekil 5B) gibi geleneksel ölçütler hesaplandı. Alan ve çevre, zaman akışındaki noktalar arasındaki değişiklikleri ortaya koysa da, gemide farklı mekansal düzenlemelerin tutarlı nicelenmesini sağlamazlar. Alan ve çevre, birçok farklı damar düzenini temsil edebilen soyutlamalardır ve bu nedenle damarların mekansal düzeninin tedavi koşulları ve zaman akışı boyunca nasıl değiştiği konusunda bilgilendirici değildir. Her grup için n = 3 olduğunda, t-testi ve Wilcoxon testi güvenilir değildir. Cliff'in Deltası parametrik değildir ve efekt boyutundaki bir kaymayı göstermek için iyi çalışır. Kan damarlarının yüzde alanını ölçürken ortaya çıkan en büyük fark, bazal durum ile 7 günlük zaman noktaları arasındadır; Kan damarlarının toplam çevresi için farklar bazal durum ile 1 günlük ile bazal durum ile 7 günlük durum arasındaki farklardır. Ancak, alan ve çevre, enfarktlanmış alanlar ile yaralanmamış uzak alanlar arasında fark olduğuna dair hiçbir gösterge vermiyor; bu durum, enfarktlanmış alanın kasıtlı olarak zarar gördüğü için oldukça şaşırtıcıdır. İşte burada LCPC dönüşümünün geleneksel metriklere kıyasla çok yönlülüğü ortaya çıkıyor. Her örnek için, LCPC dönüşümünün bir parçası olarak FFT sonuçları, bir frekans kümesiyle ilişkili büyüklük kümesi üretir. Her frekans kutusunun büyüklükleri ortalanıp tedavi grupları arasında karşılaştırılabilir (Ek Şekil 1). Bu, tedavi grupları arasında hangi frekans kutularının en büyük farklara sahip olduğunu basit bir değerlendirmeye olanak tanır. Şekil 5C, özellikle enfarktlanmış alanlar ile ilgili yaralanmamış uzak alanlar arasında çeşitli tedavi grupları arasında net bir etki boyutu farkı gösteren altı kutu göstermektedir; hangi alan ve çevrenin farkı olmadığını göstermektedir. Bu altı kutudaki bağımsız değerler, tedavi koşulları arasında nicel farklılıkları gösteren birden fazla endeks sağlar. İlginç bir şekilde, LCPC dönüşüm sonuçlarının Bin 1 için gruplar arasındaki desen, toplam çevre ölçümüyle elde edilen sonuca benzer. Ancak diğer endeksler hem alan hem de çevrede gizli olan nicel farklılıkları ortaya koymaktadır. Bazal duruma özgü indeksler: Bin 49, Bin 56, Bin 21. 1. Gün grupları arasında benzersiz endeksler: Bin 1, Bin 6, Bin 49. 3. Gün gruplarına özgü endeksler: Bin 6, Bin 112, Bin 49. 7. Gün gruplarına özgü endeksler: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Bu veriler, LCPC dönüşümünün alan ve çevre gibi geleneksel yaklaşımlara göre çok yönlülüğünü ve hassasiyetini vurgulamaktadır.

Şekil 1: LCPC dönüşümünün radyal ızgara sisteminin tanımı. (A) Adım 1: İlgi alanı şekli segmentlere ayrılır ve mavi bir maske olarak çıkarılır. Adım 2: Maske için bir sınırlayıcı kutu (yani nesnenin dört tarafını kaplayan ve dokunan en küçük dikdörtgen) belirlenir. Sınırlayıcı kutunun merkezinden başlayan radyal ızgara çizgilerinden oluşan bir sistem maskeye üst üste bindirilir. Orijin olarak nesnenin merkez noktası yerine sınırlayıcı kutunun merkezini seçme kararı keyfi bir karardı. Adım 3: Bir ızgara çizgisi ile şekil arasındaki her kesişim mesafesi, orijina göre hesaplanır. Birden fazla kesişimi olan ızgara çizgileri, tüm bu kesişim mesafelerini o ızgara çizgisi için tek bir değere toplar. Adım 4: FFT, 3. Adımdan gelen verileri frekans grafiğine, yani 1. Adımdaki şeklin statik çok boyutlu temsiline (Adım 5) dönüştürmek için uygulanır. Adım 6: Bir indeks aracılığıyla Adım 5'ten skaler bir değer oluşturulabilir. Hesaplanacak endeks türleri üzerine tartışma için Şekil 10'a bakınız. (B) Radyal ızgara sistemi için LCPC dönüşümünün adımlarının basitleştirilmiş bir açıklamasını gösteren bir akış şeması. (C) Radyal ızgara sisteminin optimal olduğu şekil temalarına örnek verilebilir. Şekiller Microsoft PowerPoint'te çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: LCPC dönüşümünün paralel ızgara sisteminin tanımı. (A) Adım 1: İlgi alanı şekili manuel olarak segmente edilip ikili bir maske olarak çıkarılır. Adım 2: Paralel bir ızgara sistemi şekilin üzerine konur ve şekil döndürülür, böylece taban yatay olur. Adım 3: Bir ızgara çizgisi ile şekil arasındaki her kesişimin mesafesi, temel çizgiye göre hesaplanır. Birden fazla kesişimi olan ızgara çizgileri, tüm bu kesişim mesafelerini o ızgara çizgisi için tek bir değere toplar. Adım 4: FFT, 3. Adımdan gelen verileri bir frekans grafikine, yani 1. Adımdaki şeklin statik çok boyutlu temsiline dönüştürmek için uygulanır. Adım 6: Bir indeks aracılığıyla Adım 5'ten skaler bir değer oluşturulabilir. Hesaplanacak endeks türleri üzerine tartışma için Şekil 10'a bakınız. (B) Paralel ızgara sistemi için LCPC dönüşüm adımlarının basitleştirilmiş bir tanımını sağlayan bir akış şeması. (C) Örnekler, paralel ızgara sisteminin optimal olduğu temaları şekillendirir. Şekiller Microsoft PowerPoint'te çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: LCPC dönüşümü, meme kanseri organoidlerinin morfolojik alt tiplerini objektif olarak tanımlar. (A) Birincil insan meme organoidleri, daha önce bildirildiği^gibi 17,20,21 ve Ek Dosya 1'de tanımlandığı gibi türetilmiştir. Üç fenotip gözlemlenip görsel incelemeye göre sınıflandırılabilir: kistik, polikistik ve yoğun polisistik. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Organoitlerin dış konturları manuel olarak segmentlere ayrıldı (Ek Şekil 2; Ek Dosya 1'de açıklanan kriterler) ve bu konturların saf şekli elde edildi. Diyagramdaki konturların hepsinin döndürüldüğünü, böylece en uzun iç çizgi dikey olarak döndürülmüştür; bu nedenle, orijinal yönelimleriyle uyuşmazlar. Radyal ızgara LCPC dönüşümü uygulandı ve sonuçlar PCA ile analiz edildi. K-Means Kümeleme üç küme (0, 1 ve 2) tanımladı ve Siluet Skorları (SS) varlığını doğrulamak için hesaplandı. Küme 0 vs 1, SS: 0.68; Küme 0 vs 2, SS: 0.27; Küme 1 vs 2, SS: 0.69. (C) Organoitlerin dış konturları, ölçekli şekillerinde, yani şekillerin birbirine göre göründüğü şeklinde, boyut değiştirmeden radyal ızgara LCPC dönüşümü kullanılarak ölçülmüştür. İç kısmı, kistik organoidlere kıyasla polikistik ve yoğun polikistik organoidlerin daha gevşek paketlenmesini göstermek için büyütülmüştür. B ve C için: Yeşil = kistik (kistik renk), Mor = polisistik, Sarı = yoğun (yoğun polisistik). (D) İlk üç PC değeri her fenotip için ayrı ayrı çizilir ve ortalama KNND, kistik fenotipin en yoğun şekilde paketlendiğini, polikistik ve yoğun polikistik fenotiplerin ise daha az yoğunluk (yani daha fazla heterojenlik) gösterdiğini göstermek için hesaplanır. Ayrı ayrı çizilmiş olsalar da, üç fenotip de aynı PCA alanını paylaşır. Kistik fenotip için, ortalama KNND sadece bu fenotipte bulunan istisnalar hesaplamayı çarpıttığı için giriş kısmından hesaplandı. Ortalama KNND'ler: Kistik 1.061; Polikistik 1.575; Yoğun Polikistik, 2.247. (E) Organoidlerin alanının kutu grafikleri, veri noktalarının kistik ve polikistik organoidlerden yoğun polikistik organoidlere kadar azalan bir saçılımını gösterir; bu, ölçekli LCPC analizinde gözlemlenenin tam tersidir (Şekil 3C); bu da LCPC dönüşümünde yakalanan mekansal bilginin alanın yakaladığından farklı olduğunu vurgular. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Paralel ızgara LCPC dönüşümü ile doku yoğunluğunun ölçülmesi. (A) Kalp dokusunda mikrovaskürün fotomikrografları daha önce farklı bir^{çalışmada alınmıştır 31,32}. Bu çalışmalardan görüntüler bu şekilde yeniden üretilmemiştir; aksine, Gkontra tarafından sağlanan ve³¹ numaralı rapor edilen aynı orijinal 3D görüntüleme veri setinden oluşturulan yeni görünümleri temsil ederler. Veri seti daha önce yayımlanmış olsa da, burada gösterilen özel görüntüler ilk kez yayımlanmıştır. Her zaman zaman yaralanmamış uzak alanlardan alınan görüntüler gösterilmemektedir. Adım 1: 2B bir maske oluşturulur ve kapların hizalanmasının genel ekseni belirlenir (kırmızı çift ok). Adım 2: Bir sonraki adımda görüntüler farklı derecelerde döndürüldükten sonra her görüntünün aynı yüksekliğe sahip olması için görüntünün orta noktasına merkezlenmiş dairesel bir bölge elde edilir (kare görüntüleri farklı derecelerde döndürmek, dönüş derecesine bağlı olarak görüntünün yüksekliğini değiştirir). Adım 3: Her görüntü, Adım 1'de belirlenen genel hizalama ekseni dikey olacak şekilde döndürülür. Adım 4: Her görüntünün etrafına eşit bir mavi kenar uygulanır, böylece her görüntünün aynı çapta olması sağlanır, çünkü seyrek yoğunluklara sahip görüntüler daha kısa olabilir (örneğin: bkz. "7 Gün Sonra, Miyokard İnfarktüsü" (3. Adım). Adım 5: Paralel ızgara LCPC dönüşümü uygulanır. (B) Paralel ızgara LCPC dönüşümünden çıkan çıktının ilk üç PC'sinin nokta grafikleri (Mor: bazal durum, Yeşil: enfarktlanmış site, Sarı: enfarktlanmış siteye uzak hasarsız alan). Üç koşul arasındaki her zaman noktasında Kama Mesafesi hesaplamaları için sonuçlar bölümüne bakınız. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: LCPC dönüşümü, bölge ve çevrede gizli olan özellikleri ölçür. Geleneksel şekil metrikleriyle karşılaştırmak için (A) yüzde alan ve (B) damar ağlarının toplam çevresi ölçüldü. (C) LCPC dönüşümünün sonucundan elde edilebilecek hassasiyeti göstermek için, FFT'den çıkan bireysel frekans kutularının değeri karşılaştırıldı (Ek Şekil 1). Tedavi grupları arasındaki farkları nesnel olarak nicele etmek için altı frekans kutusu endeks olarak seçildi. Tüm paneller için, her grubun sınırlı örneklem büyüklüğü (n = 3) nedeniyle, Wilcoxon Rank-Sum Testi'nden p-değeri yerine etki büyüklüğü için parametrik olmayan Cliff's Delta hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Temiz veri çıkarmak için şekillerin sistematik olarak yönlendirilmesinin önemi. (A) Birbirinin ayna görüntüsü olan aynı şekillere bir örnek ve paralel ızgara sisteminin onların farklı yönelimlerini nasıl belirlediği, böylece farklı sonuçlar vereceği. (B) Şekil 2'nin yatay olarak nasıl çevrileceğine dair bir örnek, böylece yönelimi artık Şekil 1 ile eşleşir ve Şekil 1 ile daha adil bir karşılaştırma olur. Bu konfigürasyonda, paralel ızgara LCPC dönüşümü hem Şekil 1 hem de Şekil 2 için aynı sonuçları verir. Bu yönelim değişikliği, yalnızca Şekil 2'nin değiştirilmemesi gerektiğini gösteren bir mekânsal bağlam yoksa yapılmalıdır. (C) "3" sayısına benzeyen dört farklı nesne örneği, bazıları yanlış yöne bakıyor. (D) Paralel ızgara LCPC dönüşümünden elde edilecek verilerin temizliğini maksimize edecek şekilde her nesnenin nasıl yönlendirileceğine dair bir örnek. (E) Panel D'deki aynı yönelim kurallarına dayanarak C Paneli'ndeki öğelerin daha geniş çıkıntısının ölçülmesine bir örnek. (F) Panel C'deki öğelerin büyük ampullerinin ölçülmesine rağmen hizalama bağlamlarını Panel D'deki gibi koruma örneği. Panel D'de hizalama kurallarının tutulmasının motivasyonu, daha geniş çıkıntıdaki mekansal bilginin bu kurallar içindeki dar çıkıntının katkısına kıyasla parçalamaktır. C–F ile ilişkili FFT spektrumları için Ek Şekil 3'e bakınız. A–B içindeki görseller Microsoft PowerPoint'ten alınan simgelerdir. C-F içindeki şekiller Microsoft PowerPoint ile çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Geleneksel şekil metriklerinin bariz bağlamı kaydedememesi. (A) Kontrol işaretleri dizisi aynı şekile sahiptir ancak soldan sağa doğru büyür. Bu seride, her kontrol işaretinin alanı farklıdır, şekil konsepti ise aynı kalır: yani, aynı kontrol işareti tarzı olarak kalır. (B) Bir kare, merkezinin etrafında 45 derece döndürülür ve şekil kavramı insanların elmas dediği şeye dönüşür. Bir karenin şekil kavramı elmasla çok farklı olsa da, aradaki dönüşler öznel olarak ya "eğimli kareler" ya da "eğimli elmaslar" olarak yorumlanır. LCPC dönüşümü, bu serideki her adımdaki farkı objektif ve hassas şekilde ölçebilir. Şekiller Microsoft PowerPoint'te çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Saf şekil ile ölçekli şeklin açıklaması. Nesneleri "Ölçekte" ölçmek, nesnelerin birbirine göre orijinal boyutlarına göre şekil ölçümü anlamına gelir. "Saf Şekil" ise, farklı nesnelerin şeklini benzer ölçekte ölçmek anlamına gelir ve bu da şekil üzerindeki boyut etkisini ortadan kaldırır. Karşılaştırılan nesneleri boyutlandırmak için nesnel bir yöntem bulmak önemlidir. En uzun iç hat genellikle en optimal seçimdir (Adım 1). Her iki nesne de en uzun iç çizgi yatay olacak şekilde döndürülür (Adım 2). Bu durumda, iki nesne de girintili tarafın aşağıya bakacak şekilde döndürülür. Sonra, her nesnenin genişliği, artık her nesnenin en uzun iç çizgisiyle aynı büyüklükte, 400 piksel genişliğinde olarak yeniden boyutlandırılır ve nesnelerin eğri olmasını önlemek için en-boy oranı da sınırlanır (Adım 3). Son olarak, LCPC dönüşümünü uygulamadan önce yeniden boyutlandırılmış nesneleri 90 derece (Adım 4) (bu durumda saat yönünün tersine) döndürmek isteğe bağlıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Kanser araştırmaları için mekânsal belirteçlere örnek. (A) Hücrelerin 2B kültürde lamellipodilerini göç yönünde genişleterek göç etmesinin varsayımsal bir örneği. Epitel hücrelerinin göç morfolojisi bağlamında, her hücrenin konturunu göç ekseniyle hizalanan en uzun iç çizginin dikey olacak şekilde yönlendirmesi, mekânsal bağlamı yakalamak için en mantıklı yöntemdir. (B) Şeklini değiştirmeyen bir örtü içinde büyüyen tümör veya kanser öncesi lezyonların varsayımsal örnekleri. Lezyon, merkezi destek yapısı olan bir saptan büyür. Lezyon büyüdükçe veya büzüştükçe, konturu örtünün iç duvarına doğru veya ondan uzaklaşır. Noktalı çizgiler, örtülen kısmın ne kadarının izlenmesi gerektiğini (turuncu çizgi) tanımlamanın rasyonel ve nesnel bir yolunu temsil eder; böylece çok az veya çok fazla ekstra bilgi eklenmez. (C) Seçenek 1, örtülenin bulunduğu bağlam olmadan lezyonların konturuna uygulanan paralel ızgara LCPC dönüşümünü gösterir. Seçenek 2 de aynı şeyi gösterir, ancak örtülen örtünün bulunduğu mekansal bağlamı da içerir. Örneğin, kırmızı noktalar ızgara çizgisi (siyah ok, yeşil çizgi) ile kontur arasındaki kesişimleri temsil eder. Seçenek 2, her ızgara çizgisinin Seçenek 1'de olmayan dördüncü bir kesişim oluşturmasını sağlar; bu da Seçenek 2'deki sonuca Seçenek 1'de tamamen olmayan mekânsal bağlam ekler. Şekiller Microsoft PowerPoint'te çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Varsayımsal FFT sonuçları ve bunlardan türetilebilecek ortak indeksler. (A) İki varsayımsal şeklin FFT'sinden çıkan frekans grafiki gösterilir. Bin 3 ve Bin 4'teki büyüklükler tam tersi eğilim gösterdiğinden, bu iki kutu arasındaki oran, bu iki şekil arasındaki farkı temsil eden iyi bir indeks olacaktır. Kırmızı ve yeşil noktalı çizgiler, iyi indeksler elde etmek için kullanılabilecek diğer frekans binlerini temsil eder. (B) FFT profilleri morfolojik farklılıklarının bir temsili olarak adım adım azalan bir eğilim gösteren iki varsayımsal şekilli histogram. (C) FFT profilleri en çok merkezi bölgede frekans kutuları aralığı boyunca farklılaşan iki varsayımsal şekilden oluşan bir histogram. (D) Varlıklarıyla ilişkili endeksler verebilecek varsayımsal morfolojik özelliklere örnekler. Şekiller Microsoft PowerPoint'te çizildi. Bu görseller yazarlar tarafından oluşturulmakta olup herhangi bir yayın lisansı veya telif hakkı izni gerektirmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Damar ağlarının LCPC dönüşüm sonuçları boyunca çeşitli frekans kutularının büyüklüklerini karşılaştıran kutu-bıyık grafikleri. Şekil 4 ve 5'te gösterilen damar ağlarının LCPC dönüşümü, her görüntüyü temsil eden bir dizi frekans binleri ve büyüklükleri elde eder. Her kutudaki büyüklüklerin kutu-bıyık grafikleri, tüm işlem gruplarını karşılaştırmak için kullanılır ve LCPC dönüşümü ile ölçülen doku yoğunluğu katmanında en iyi bir indeks olarak hangi binin hizmet ettiğini belirler. Her kutu-bıyık grafiki n = 3 bağımsız görüntüden oluşur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Segmentli meme tümörü organoidlerine örnek. Organoidler, rutin olarak kültürlenen ve mikroskopi altında inceleyen bir uzman tarafından manuel olarak segmentlere ayrılmıştır. Bu şekil, segmentli organoid kontur örneklerini göstermektedir. Tüm mikroskobik görüntüler için ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu çalışmada kullanılan birincil insan hücreleri etik onaylar ve bilgilendirilmiş onay prosedürleri kapsamında alındı ve^{kültürlendi; bildirilen 21}. Burada sunulan görüntüler onaylanmış hücre kültürlerinden alınmakta olup ilk kez yayımlanmıştır. Ek bir insan örneği toplama işlemi yapılmadı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Şekil 6'daki şekiller için FFT spektrumları. Şekil 6'daki şekiller için FFT'lerin sonuçları burada sunulmuştur; böylece okuyucular şekil yöneliminin değişmesinin mekansal bilgiler üzerindeki etkisini anlayabilirler. Grafiklerin sol sütununda değişmemiş y eksenleri bulunurken, sağ sütunda kısaltılmış eksenler bulunur ve küçük bin değerleri görselleştirilebilir. (A) Şekil 6C'deki dört şeklin paralel ızgara LCPC dönüşümünden elde edilen spektrumlar, yani yeniden yönlendirme yok. (B) Şekil 6D'deki şekillerin paralel ızgara LCPC dönüşümünden elde edilen spektrumlar, metinde açıklandığı gibi yeniden yönlendirilmiştir. (C) Şekil 6E'deki şekillerin paralel ızgara LCPC dönüşümünden spektrumlar. (D) Şekil 6F'deki şekillerin paralel ızgara LCPC dönüşümünden elde edilen spektrumlar, Şekil 6E'dekiyle karşılaştırma için. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: LCPC dönüşümü için en iyi uygulamalar hakkında kapsamlı bilgiler. Bu ek dosya, en iyi uygulamalar hakkında kapsamlı tartışmalar ve ek metodolojik notlar sunmaktadır. Belgenin özeti şöyledir: Bölüm 1 - Alanın, hacmin, çevrenin ve pürüzlülüğün yakalayamadığı mekânsal bağlam. Bölüm 2 - LCPC dönüşümünü kullanmak ve sonuçların yorumlanması için en iyi uygulamalar. Bölüm 3 - LCPC dönüşümünü en üst düzeye çıkarmak için doğanın doğuştan gelen kutuplarını anlayın. Bölüm 4 - LCPC dönüşümünden çıkan FFT spektrumlarının yorumlanması. Bölüm 5 - Şekilleri LCPC dönüşümü ile ölçmeden önce nasıl yönlendirilir. Bölüm 6 - "Saf Şekil" ile "Ölçekli Şekil" nedir? Bölüm 7 - İstatistiksel yöntemler üzerine metodolojik notlar. Bölüm 8 - Organoid kültürü ve segmentasyonu üzerine metodolojik notlar. Bölüm 9 - Kendi LCPC dönüşümünü kodlayanlar için FFT parametreleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Her hesaplama aracında olduğu gibi, çıktı kalitesi, girdilerin aracın tasarlandığı beklenen kurallara uyup uymadığına bağlıdır. Aşağıdaki kurallar, sağlanan Python betikleri kullanılırken kalite kontrol kontrolü olarak uygulanmalıdır. Öncelikle, açık maskelerin beyaz zeminde mavi çizgiler olduğundan emin olun. Mavi keyfi bir karardı ve önemi yoktu, ancak LCPC dönüşümünü gerçekleştiren betikler beyaz arka planda mavi pikselleri aramak için yazılmıştı. İkinci olarak, dört tarafında 10 pikselden az beyaz alan olan görüntülerde LCPC dönüşüm betiklerini çalıştırmayın. Nedenini açıklamak için bu videoya bakınız: "Marj Kalınlığı Parametresi - Şekil Taslakları Nasıl Hazırlanır"³³. Üçüncüsü, bu betik nesnenizin dış hatlarının beyaz bir arka plan üzerinde mavi pikseller olduğunu varsayar. Çizginin kalınlığı 5–10 piksel arasında olmalıdır. Nedenini açıklamak için bu videoya bakabilirsiniz: "Çizgi Kalınlığı Parametresi - Şekil Taslakları Nasıl Hazırlanır"³⁴. Dördüncüsü, LCPC dönüşüm betiklerini boş görsellerde çalıştırmayın. Bu betikte bir hata yaratır. Beşinci olarak, LCPC dönüşüm betiklerini sadece bir parça enkaz içeren görüntülerde çalıştırmayın. Bu bir hata oluşturur çünkü ızgara sistemi bu noktayı algılamayabilir ve böylece boş bir görüntüyü analiz etmeye çalışabilir. Altıncı olarak, istenmeyen kalıntı parçaları içeren görüntülerde LCPC dönüşüm betiklerini çalıştırmayın. Enkaz açık maske nesnesinin yüksekliğini ve genişliğini değiştirir ve böylece yanlış sonuçlara yol açar. Yedinci olarak, nesnelerinizin ölçeğini LCPC dönüşümü ile analiz etmeden önce onların ölçeğini anlamanın neden önemli olduğunu anlamak için şu videoya bakın: "Ölçek Parametresi - Şekil Taslakları Nasıl Hazırlanır"³⁵.

LCPC dönüşümünün en şaşırtıcı yönlerinden biri, mekânsal bağlamı yakalama yeteneğidir. Biyoloji, doğayı anlamak için hayati öneme sahip mekânsal bağlamla doludur. Örneğin, epitel hücrelerin apikal-bazal^{polaritesi 36,37,38,39} olarak görülür. Ayrıca, mikrogravitasyon koşullarında değişen yerçekimi yönü hem astronot fizyolojisi ^40,41 hem de kanser hücresi morfolojisi^42,43,44 üzerinde önemli etkiler yaratır. Son olarak, in situ preneoplasia ve neoplasia, kan dolaştırımına erişim sağlayan merkezi destek yapısı olarak hizmet veren bir sap aracılığıyla lümenlere dönüşebilir. Bu lezyonlar gerilediğinde, hem luminal boşluktan uzaklaşır hem de sapa^{doğru geri giderler 45,46}. Bunu yapmak için tasarlandığı için, LCPC dönüşümü mekânsal bağlama karşı son derece hassastır ve kullanıcı dikkatli olmazsa ekstra heterojenlik getirebilir. Şekil 6, LCPC dönüşümünü uygulamadan önce şekillerin sistematik olarak nasıl yönlendirileceğini açıklar. Şekil 7, geleneksel geometrinin insanlara açık olan şekil kavramlarını ölçemediğini açıklar. Şekil 8, saf şekil ile ölçekli şekil ölçme arasındaki farkı görselleştiren bir diyagram sunar. Şekil 9, 2D kültür, histoloji ve 3D görüntülemeden 2B dilimlerde şekillerin nicelendirilirken mekânsal bağlamın sıklıkla göz ardı edildiğini açıklar. Alan kısıtlamaları nedeniyle, Ek Dosya 1'in Bölüm 5'teki Şekil 6 ve Şekil 7'nin, Bölüm 6'daki Şekil 8 ve Şekil 9'un kapsamlı bir tartışmasını içerdiğini unutmayın.

FFT çok boyutlu spektral veri ürettiği için, kullanıcının spektrumlarda tekrarlayan desenlerden indeksler çıkarmaya alışması önemlidir. Bu el yazması, LCPC dönüşümünü FFT'nin uygulanması adımını içeriyor olarak belirtse de, gerçek LCPC dönüşümü FFT adımından önce gerçekleşir (Şekil 1A–B Adım 4, Şekil 2A–B Adım 3). Ancak FFT'nin uygulanması, LCPC dönüşümünün çıktısının frekans alanından nesnel ve sistematik içgörülerin ortaya çıktığını ortaya koyar. Bu nedenle, LCPC dönüşümü FFT son adım olmadan o kadar etkili olamazdı. LCPC dönüşümünde, FFT bir dizi bina ve büyüklükleri ortaya çıkarır; bunların hepsi Step 1'deki kontur girdisinin statik çok boyutlu bir temsilidir. Bilginin statik çok boyutlu temsili benzetmesi, Amerika Birleşik Devletleri'nde bir kişinin telefon iletişim kanalını temsil eden dokuz haneli telefon numarasıdır. Şekillerin skaler değer temsillerine (örneğin 85 cm uzunluk, 56 derece genişlik vb.) kıyasla zahmetli olsa da, çok boyutlu veriler içgörü çıkarmak için çok daha fazla bilgi barındırır. Şekil 10 , LCPC dönüşümü uygulanırken gözlemlenen birkaç spektral desenleri ve bunlardan indekslerin nasıl çıkarılacağını göstermektedir. Ek Dosya 1'in 4. bölümü, Şekil 10'u daha kapsamlı şekilde ele almaktadır.

LCPC dönüşümünün frekans alanı, çıplak gözle kolayca algılayamayacağı 2D bir şeklin nesnel ve nicel özelliklerini ortaya koyar. Eğrilik, keskinlik ve burkülülükteki çok ince farklılıklar sağlam bir şekilde ölçülebilir. Ancak, bu yöntemle morfolojik alt tipler belirlendiğinde, nicel farklılıklarla ilişkili görsel olarak farklı temalar gözlemlenebilir. Bu özellik, LCPC dönüşümünü makine öğrenimi (ML) modelleri için mekansal bilgi çıkarma yöntemi olarak yorumlanabilir hale getirir ve ortaya çıkan ML modellerinin kendisini daha yorumlanabilir hale getirir. Sinir ağları güçlü bir makine öğrenimi yöntemi olsa da, sonuçları genellikle insanlara yorumlanamaz; bu da tıbbi yapay zeka (YZE) alanında önemli bir sorundur. Doktorlar, modelin neden kötü kararlar verdiğini anlamadıkları takdirde klinik kararlar için makine öğrenimi modeli kullanmaya isteksizdirler. Ayrıca, bir modelin neden veya nasıl önyargılı bir karar verdiğini hiç anlamazsa, bunu düzeltmek zor hale gelir.

Doku yoğunluğu ölçümü tartışmasına (Şekil 4 ve 5) eklenmek gerekir ki, insan gözünün optik illüzyonlar veya düzensiz kalıplarla kolayca karıştırılabilir. Karmaşık desenlerin rastgele düzenlenmesi genellikle rastgele, ölçülemez veya ölçülmeye değmez olarak yorumlanır. LCPC dönüşümü, görünüşte rastgele olan desenlerde tekrarlanabilir, nesnel, nicel farklılıkları ölçebilir. Ancak, kullanıcı, doğadaki rastgelelik gibi görünen kaotik, düzensiz kalıplara yanıltmamak için eğitilmezse, bu düzensizliği ölçüp öngörülebilir kalıpları ortaya çıkarmak için hiçbir çaba gösterilmez. Öngörülebilir kalıplar, sistemin tamamen rastgele olmadığının açık bir göstergesidir. LCPC dönüşümü, çıplak gözle ince veya akıl almaz derecede farklı şekilleri ölçmek amacıyla icat edilmiştir. Doğadaki birçok morfoloji, öngörülebilir bozukluk alt tiplerinden ziyade anlamsız kaotik heterojenlik gibi görünen küçük farklılıklar sergilediği için – her biri farklı biyolojik fonksiyonlarla korelasyon gösteriyor – aşağıdaki "Dört Adım" kavramsal çerçevesi LCPC dönüşümü ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Öncelikle, karmaşık görünümlü bir sistemin rastgele olduğu düşüncesine karşı koyun. İkincisi, kaotik heterojenliğe "düzensizlik" diyebilir ve ardından rasyonel bir referans koşulu olarak hizmet edebilecek bir tür düzen bulur. Düzensizliğin referanstan saptığını varsayıl. Üçüncüsü, referans deseni nesnel olarak ölçmenin bir yolunu bulun, örneğin LCPC dönüşümü gibi. Dördüncüsü, aynı nesnel yöntemi sistemdeki düzensizlik olarak kabul edilenleri ölçmek için uygulayın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook