Bu çalışmanın amacı, Coptis chinensis'in temel aktif bileşenlerini belirlemek ve afinite ultrafiltrasyonu ile deneysel doğrulama yoluyla serebral palsi (CP) müdahalesindeki etkisini açıklamaktı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışmanın amacı, Coptis chinensis'in temel aktif bileşenlerini belirlemek ve afinite ultrafiltrasyonu ile deneysel doğrulama yoluyla serebral palsi (CP) müdahalesindeki etkisini açıklamaktı.
Bu çalışmanın amacı, Coptis chinensis'in temel aktif bileşenlerini belirlemek ve affinite ultrafiltrasyonu yoluyla serebral palsi (CP) müdahalesindeki etki mekanizmalarını açıklamaktı. Hedef olarak asetilkolinesteraz (AChE) kullanılarak, C . chinensis ekstraktından en güçlü bağlanma kapasitesine sahip bileşen olarak koptisin filtrelendi; bu bileşen %21,9 bağlanma oranı ve in vitro inhibitör aktivitede anlamlı (IC₅₀ = 3,24 μg/mL) gösterdi. Moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonları, koptisinin aktif AChE cebine kararlı şekilde bağlanabildiğini göstermiştir. Daha sonra, hipoksik-iskemik beyin hasarı (HIBD) için bir neonatal fare modelinde doğrulama deneyleri yapıldı. Sonuçlar, koptisin (10 mg/kg) müdahalesinin model hayvanlarda mekansal öğrenme ve hafıza eksikliklerini anlamlı şekilde iyileştirdiğini, yaralı yarımkürede beyin kan akışını artırdığını, beyin dokularının patolojik hasarını hafiflettiğini ve beyinde anormal AChE aktivasyonunu engellediğini gösterdi. Özetle, bu çalışma affinity ultrafiltrasyon teknolojisini birleştirdi ve C. chinensis ekstraktından tanımlanan koptizinin, AChE'yi inhibe edebildiğini, nöroprotektif etkiler ve beyin kan akışını iyileştiren etkiler gösterebileceğini doğruladı. C . chinensis'in CP benzeri nörolojik eksiklikleri hafifletmek için temel materyal temeli oluşturur ve böylece ilgili ilaçların geliştirilmesi için aday moleküller ve bilimsel kanıtlar sağlar.
Serebral palsi (CP), fetüslerin veya bebeklerin gelişmekte olan beyninde ilerlemeyen hasar nedeniyle oluşan kalıcı bir sendromdur ve esas olarak motor işlev bozukluğu ve duruş anormallikleriyle karakterize edilir. Şu anda CP için birden fazla klinik tedavi yöntemi mevcut olsa da, nörolojik eksiklikleri temel olarak minimal yan etkilerle onarabilecek ideal ilaçlar eksikliği hâlâ mevcuttur. Kimyasal olarak sentezlenen ilaçların aksine, genellikle tek hedeflere etki eden ve nispeten yüksek potansiyel toksisite taşıyan ilaçların aksine, geleneksel Çin ilaçları (TCM'ler), çok bileşenli, çok hedefli ve bütünsel düzenleme avantajları ile uzun vadeli klinik uygulamada gösterilen olumlu güvenlik profilleriyle yeni içgörüler ve karmaşık beyin hastalıklarının tedavisi için ilaç adaylarıdeposu sunar 1, 2,3,4,5,6. Bu nedenle, TCM'lerden alınan yüksek etkili ve düşük toksisite kimyasal bileşenlerin keşfedilmesi, önemli bilimsel öneme ve klinik değeresahiptir 7.
Serebral palsinin karmaşık patolojik mekanizmaları arasında kolinergik sinir sistemi disfonksiyonu kritik bir roloynar 8,9. Asetilkolinesteraz (AChE), nörotransmitter asetilkolini (ACh) hidrolize eden anahtar bir enzimdir. Bu enzimin aşırı yüksek aktivitesi ACh azalmasına yol açar, kolinergik sinyal iletimini zayıflar ve dolayısıyla motor kontrol ile bilişsel bozuklukları kötüleştirir. Bu nedenle, AChE, nöroprotektif ajanların geliştirilmesi için önemli ve köklü bir ilaç hedefi olarak ortaya çıkmıştır. Sinaptik yarıktaki ACh seviyelerini yükseltmek için AChE aktivitesinin inhibrelenmesi, CP ile ilişkili nörolojik eksiklikleri hafifletmek için etkili stratejilerden biri olarak kabul edilir. Hipoksik-iskemik beyin hasarı bağlamında, kolinerajik nörotransmisyonun bozulması nöron işlevsizliğini daha da kötüleştirebilir ve böylece CP ile ilgili motor ve bilişsel bozukluklara katkıda bulunabilir. Bu nedenle, AChE bu çalışmada sadece klasik nörofonksiyonel hedef olarak değil, aynı zamanda potansiyel anti-CP etkileri olan biyoaktif bileşiklerin taraması için mekanik olarak önemli bir giriş noktası olarak seçilmiştir.
Modern araştırmalar, tıbbi bitkilerin farmakolojik aktivite açısından geniş bir yelpazede sahip olduğunu göstermiştir. Sıcaklığı temizlemek ve nemi kurutmak için klasik geleneksel Çin tıbbı olan Coptis chinensis, çeşitli izokinolin alkaloidlerde bolca bulunan karmaşık bir sistem oluşturur. Bilinen berberine ek olarak, koptisin, epiberberin, palmatin ve jatrorhizine10 gibi benzer yapılara ve çeşitli farmakolojik aktivitelere sahip bir dizi bileşen de içerir. Bu alkaloidler topluca C. chinensis'in farmakolojik etkilerinin maddi temelini oluşturur. Önceki çalışmalar, C. chinensis ve alkaloidlerinin anti-inflamatuar, antioksidan ve potansiyel nöroprotektif özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, böylesine karmaşık bir bileşen sistemi göz önüne alındığında, geleneksel araştırma yöntemlerinin AChE'yi doğrudan hedef alan temel aktif bileşenleri hızlı ve doğru şekilde tanımlaması zordur; bu da C. chinensis'in beyin hasarı üzerindeki etkilerinin altında yatan mekanizmaların derinlemesine açıklanmasınıbüyük ölçüde sınırlar.
Genellikle tekrarlanan fraksiyonlama, biyoaktivite testi ve arındırma gerektiren ve düşük bolluklu ancak yüksek affiniteli bileşiklerin kaybına veya ihmal edilmesine yol açabilen geleneksel aktivite odaklı izolasyona kıyasla, affinite ultrafiltrasyonu karmaşık karışımlardan hedef bağlayıcı ligandların hızlı taramasını sağlar. Bu teknik, TCM'lerin çok bileşenli ham ekstraktlarından doğrudan belirli hedeflere (örneğin, AChE) bağlanan aktif ligandların verimli ve hızlı "avlanması"nı sağlar. Özellikle C. chinensis gibi birden fazla alkaloid bileşenli sistemler için uygundur; bu da karmaşık karışımdan hedefle doğrudan etkileşime giren etkili bileşenlerin doğru tanımlanmasınısağlar 12. Moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonları gibi hesaplamalı yaklaşımlarla birleştiğinde, atomik düzeyde bileşenler ile hedef proteinler arasındaki bağlanma modunu, etkileşim türlerini ve karmaşık kararlılığı sezgisel olarak tahmin edebilir; böylece deneysel tarama sonuçları için sağlam teorik kanıtlar ve mekanik açıklamalar sağlar13.
Yukarıdaki arka plana dayanarak, bu çalışma şu bilimsel hipotezi önerir: C. chinensis'te bulunan çeşitli alkaloidler arasında, özellikle AChE'yi engelleyebilen aktif bileşenler vardır ve bu bileşenler, potansiyel anti-serebral palsi etkilerinin maddi temelini oluşturur. Bu hipotezi doğrulamak için modern tarama tekniklerini farmakolojik doğrulama yöntemleriyle entegre ettik: önce AChE hedef alınarak, C. chinensis'in çoklu alkaloid ekstraktından potansiyel inhibitörleri hızlıca taramak için affinite ultrafiltrasyon teknolojisi kullanıldı; Ayrıca, atomik düzeyde bağlanma mekanizmasını netleştirmek için moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonları kullanıldı; son olarak, CP olan farelerin davranışları, beyin dokusu patolojisi ve AChE aktivitesi üzerindeki paranlaşan etkilerini doğrulamak için in vivo hayvan deneyleri yapıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm hayvan refahı ve deneysel prosedürler, Zunyi İlk Halk Hastanesi'nin Laboratuvar Hayvan Refahı Etik Komitesi tarafından onaylandı (Etik No. 2025-2-362). Modelleme ve tedavi sürecinde, hayvan vücudu durumu ve hayatta kalma günlük olarak kaydedilmiştir.
C. chinensis özünün hazırlanması
Bu çalışmada, C. chinensis tıbbi maddelerinden n-butanol fraksiyonunun hızlandırılmış ekstraksiyonu için Hızlandırılmış Çözücü Ekstraktörü kullanılmıştır. Toplam 1 g kurutulmuş C. chinensis tozu doğru şekilde tartıldı ve sırasıyla 40 mL ekstraksiyon hücrelerine yerleştirildi. Metal contalar ve cam fiber filtre membranları, ekstraksiyon hücresinin üstüne ve altına sıralı olarak yerleştirilerek numune filtrelendi ve örnek kuvars kumuyla sarıldı. Ekstraksiyon sürecinde, sıcaklık ve basınç sırasıyla 90 °C ve 100 bar olarak ayarlandı. Hızlandırılmış özet toplandı ve ekstraksiyon çözücüsü, farklı kutup fraksiyonlarından kurutulmuş özetler elde etmek için döner evaporatör kullanılarak kuruyana kadar buharlaştırıldı. Metanol:su (50:50, v/v) yeniden yapılandırma çözücüsü olarak seçildi. Ekstrakt, 0,45 μm mikrogözenekli bir membrandan süzülerek 4 °C'de saklandı. Numune tespitinden önce, AChE üzerindeki boş yeniden yapılandırma çözücüsünün inhibitör aktivitesi araştırıldı. Sonuçlar, inhibitör etkisinin önemsiz olduğunu gösterdi ve bu deneyde yeniden yapılandırılan çözücünün seçilmesinin deneysel sonuçları etkilemeyeceğini gösterdi.
Asetilkolinesteraz inhibisyon testi
Deney, 96 kuyuyla bir plakada gerçekleştirildi. İlk olarak PBS eklendi, ardından sırayla AChE (0.1 U/mL) ve C. chinensis örnekleri geldi. 37 °C'de 10 dakika kuluçka sonrası 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) kromojenik çözeltisi (2,5 mmol/mL) ve ATChI substratı (10 mmol/mL) eklendi. Karışım 37 °C'de 10 dakika daha kuluçka alındı ve reaksiyon %1 sodyum dodesil sülfat (SDS) eklenerek sonlandırıldı. Soğurma 405 nm olarak ölçüldü. Her C. chinensis örneği 4 grupla oluşturuldu: Kontrol grubu a: PBS (120 μL), AChE çözeltisi (20 μL), DTNB çözeltisi (40 μL), ATChI çözeltisi (40 μL) ve SDS çözeltisi (60 μL) sıralı olarak eklendi; Boş kontrol grubu b: PBS (120 μL), DTNB çözeltisi (40 μL), ATChI çözeltisi (40 μL) ve SDS çözeltisi (80 μL); Örnek grubu c: PBS (80 μL), C. chinensis ekstraktı (20 μL), AChE çözeltisi (20 μL), DTNB çözeltisi (40 μL), ATChI çözeltisi (40 μL) ve SDS çözeltisi (60 μL); Örnek boş grubu d: PBS (100 μL), C. chinensis ekstraktı (20 μL), DTNB çözeltisi (40 μL), ATChI çözeltisi (40 μL) ve SDS çözeltisi (60 μL). Huperzine A, yaklaşık 2,5 mg/mL başlangıç konsantrasyonu ile pozitif kontrol olarak kullanıldı. n-butanol fraksiyon ekstraktının başlangıç konsantrasyonu yaklaşık 1 mg/mL idi. Hem huperzin A hem de örnekler %60 gradyanla seyreltildi. Inhibisyon oranı şu formülle hesaplandı: Inhibisyon oranı (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × %100, burada a, b, c ve d sırasıyla kontrol grubu a, boş kontrol grubu b, örnek grubu c ve örnek boş grup d emilimi değerlerini temsil eder.
Her test edilen konsantrasyondaki inhibitör oran yukarıda açıklanan formül kullanılarak hesaplandı. Daha sonra konsantrasyon–inhibisyon eğrileri, bileşik konsantrasyonunun logaritmasına karşı inhibitör oranın çizilmesiyle oluşturuldu. IC20, IC50 ve IC80 değerleri, GraphPad Prism yazılımı kullanılarak uyumlu konsantrasyon-yanıt eğrilerine dayanarak doğrusal olmayan regresyon uyumuyla hesaplandı ve sırasıyla AChE aktivitesinin %20, %50 ve %80 inhibisyonu için gereken konsantrasyonlar olarak tanımlandı.
Afinite ultrafiltrasyon testi
C. chinensis ekstraktından alınan AChE bağlayıcı bileşikleri taramak için affinity ultrafiltrasyonu gerçekleştirildi. Kısaca, aktif enzim olarak AChE çözeltisi (PBS'de 0.1 U/mL, pH 7.4) kullanıldı. İnaktive edilmiş enzim kontrolü, aynı AChE çözeltisi kaynar su banyosunda 10 dakika ısıtarak hazırlandı. Her reaksiyon için, 200 μL C. chinensis ekstrakt çözeltisi 200 μL aktif veya inaktive edilmiş AChE çözeltisi ile karıştırıldı ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka edildi. İnkubasyondan sonra, karışım 30 kDa'lık bir ultrafiltrasyon santrifüj tüpüne aktarıldı ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Tutulan enzim-ligand kompleksi, aynı santrifüj koşullarında 200 μL PBS ile üç kez yıkanarak bağlanmamış bileşenleri çıkardı. Daha sonra, AChE'ye bağlı ligandları ayırmak ve elüasyon etmek için %90 metanol 200 μL eklendi, ardından 10 dakika inkubasyon ve 10 dakika boyunca 12.000 × g santrifüjasyon yapıldı. Eluat toplandı, filtrelendi ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edildi. İnaktif enzim grubunda inaktive edilmiş enzim kontrolüne göre zenginleştirilmiş bileşikler, potansiyel AChE-bağlanan bileşenlerolarak kabul edildi 14.
Başlıca alkaloid metabolitlerinin HPLC analizi
Kromatografik analiz, dördüncü pompa, otosampler, kolon fırını ve ultraviyole görünür (UV-Vis) dedektörüyle donatılmış bir HPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Ayrılma, 25 °C'de tutulan bir C18 kromatografik kolonunda (250 × 4,6 mm, 5 μm) sağlandı. Mobil faz, asetonitril (A) ve %0,7 amonyak ve %0,25 trietilamin (B) içeren asetonitril (A) ve 30 mmol/L amonyum bikarbonat çözeltisi içeriyordu ve 1,0 mL/dakika akış hızıyla verildi. Gradyan elüsyon programı şöyleydi: 0–15 dakika, %90–%75 B; 15–25 dk, %75–%70 B; 25–50 dk, %70–%55 B. Enjeksiyon hacmi 5 μL idi ve UV algısı 270 nm'de gerçekleştirildi.
C. chinensis'teki başlıca alkaloidlerin nicel analizi için, her örnek (0,02 g) doğru şekilde tartıldı ve 30 dakika boyunca 10 mL hidroklorik asit–metanol çözeltisi (1:100, v/v) ile ultrasonik olarak çıkarıldı. Filtreleme sonrası kilo kaybı aynı ekstraksiyon çözücüsiyle orijinal ağırlığına kadar telafi edildi ve nihai çözelti HPLC analizinden önce 0,45 μm bir membrandan süzüldü. Magnoflorin, glaucin, jatrorrhizine, kolumbamin, epiberberin, koptin, palmatin ve berberin dahil olmak üzere sekiz otantik referans standardı aynı kromatografik koşullar altında analiz edildi. Bu analizler için referans çözeltiler kullanılarak kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Sekiz alkaloidin bolluk seviyeleri ve detektör yanıtları önemli ölçüde farklılaştığından, her analitin kalibrasyon aralığı, tüm bileşiklere aynı katlama seyreltme şeması uygulanmak yerine, literatür raporları ve ön deneyler temelinde bireysel olarak optimize edildi. Bu nedenle, lineer aralıkların yüksek-düşük konsantrasyon oranlarının sekiz analit arasında aynı olması beklenmiyordu. Tespit sınırları (LOD) ve nicelendirme sınırları (LOQ) sırasıyla yaklaşık 3 ve 10 sinyal-gürültü oranlarında tahmin edilmiştir.
Afinite ultrafiltrasyon elyutlarının analizi için, ultrafiltrasyon sonrası AChE'den ayrılan ligandlar tekrarlanan deneylerden toplandı ve HPLC analizinden önce yeterli sinyal yoğunluğu sağlanarak konsantre edildi. Konsantre eluatlar, yukarıda açıklanan aynı HPLC koşulları kullanılarak analiz edildi. Eluatlardaki kromatografik zirveler, sekiz otantik referans standardıyla ve aynı analitik koşullar altında elde edilen C. chinensis ekstraktının kromatografik profiliyle hedefli karşılaştırma yoluyla atanmıştır. Bu nedenle, mevcut analiz bilinmeyen bileşiklerin de novo yapısal aydınlatılması için değil, C. chinensis'teki bilinen ana alkaloidlerin inaktive enzim kontrolüne göre aktif enzim eluatında zenginleşip zenginleşmediğinin hedefli belirlenmesi için yapılmıştır.
Moleküler kenetlenme testi
Mevcut çalışmada, koptisin affinite ultrafiltrasyonu ile en üst sırada AChE-bağlayıcı bileşen olarak belirlenmiş ve ana alkaloidler arasında en güçlü in vitro inhibitör aktiviteyi gösterdiği için koptisin üzerine odaklanmıştır. Protein kristalleri Protein Veri Bankası'ndan (PDB) alındı. Birlikte kristalleşmiş ligandlara sahip protein kristalleri nihai kenetlenme reseptörleri olarak seçildi ve tüm hedef protein kristalleri insanlardan türetildi. Reseptör dosyası PyMOL yazılımı kullanılarak açıldı ve reseptör ile ligand dosyaları ayrılıp kaydedildi; reseptör MGLTools yazılımıyla açıldı, ardından su molekülleri çıkarıldı, hidrojen atomları ve yükleri eklendi, polar dışı hidrojen atomları birleştirildi, yerel atomik yükler hesaplandı vb. ve ardından PDBQT formatında kaydedildi; ligand dosyası MGLTools yazılımıyla açıldı, hidrojen atomları ve yükleri eklendi ve PDBQT formatı dosyası olarak kaydedildi; ızgara kutusu açıldı, aralık 1.000'e ayarlandı, ızgara noktalarının sayısı belirlendi, kutunun merkezi nokta koordinatları birlikte kristalize edilmiş ligand'a göre seçildi ve GPFdosyası 15,16 olarak kaydedildi.
Kimyasal bileşen yapıları ilk olarak SciFinder veritabanından toplandı ve cdx formatında kaydedildi; her moleküler üç boyutlu yapı ChemBio3D Ultra modülü kullanılarak gösterildi, enerji optimizasyonu MM2 kuvvet alanı ile yapıldı, mol2 formatında kaydedildi ve yük parametreleri çıkarıldı. AutoDock kullanılarak, mol2 format dosyası MGLTools yazılımıyla açıldı, ligand'a hidrojen atomları ve yükler eklendi, dönebilir kimyasal bağlar gözlemlendi ve pdbqt formatlı dosya olarak kaydedildi. AutoDock Vina (sürüm 1.2.5) modeli, moleküler kenetlenme değerlendirmesi yapmak için uygulandı.
Moleküler dinamik simülasyon testi
Ligand yapısı optimizasyonu için Gaussian 16 ve GaussView 6 yazılımları kullanıldı. Ligand yapısının mol2 dosyası GaussView 6'ya aktarıldıktan sonra görev türü Optimizasyon olarak ayarlandı, hedef molekülün durumu Temel Durum olarak seçildi, hesaplama yöntemi yoğunluk fonksiyonel teorisi (DFT) oldu, spin çokluğu varsayılan olarak Varsayılan Spin olarak belirlendi, fonksiyonel B3LYP, çözücü modeli IEFPCM olarak belirlendi, ve çözücü suydu. Moleküler yapı optimizasyonu tamamlandıktan sonra, oluşturulan chk dosyasını fch dosyasına dönüştürmek için Gauss 16 kullanıldı; bu dosya Multiwfn yazılımına aktarıldı ve ligandın RESP yükü hesaplandı.
RESP yükü hesaplandıktan sonra, oluşturulan chg dosyası moleküler dinamik simülasyonu için gereken ligand topoloji dosyasını oluşturmak üzere sobtop_1.0 (dev5) yazılımına aktarıldı. Moleküler dinamik simülasyonu, AMBER99 kuvvet alanı ile GROMACS 2019.6 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Protein molekülü ve küçük molekülün yapı dosyaları yazılıma aktarıldı, periyodik sınırı 1.0 nm olan bir triklinik kutu oluşturuldu ve doldurma için TIP3P su modeli kullanıldı. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimleri hesaplamak için Parçacık Mesh Ewald (PME) yöntemi kullanıldı ve gmx geion komutu, tüm sistemin yükünü nötralize etmek için uygun sayıda sodyum iyonu ve klorür iyonu eklendi. Simülasyon, 298 K sabit sıcaklıkta ve 100 kPa standart atmosfer basıncında gerçekleştirildi. Enerji minimize etmek için en dik iniş yöntemi (dik) uygulandı. gmx grompp ve gmx mdrun komutları, NVT (izotermal-izokorik toplu) dengesi ve NPT (izotermal-izobarik topluluk) dengesinin 10.000 adımını gerçekleştirmek için kullanıldı; sıcaklık bağlanma sabiti ve basınç bağlanma sabiti, sırasıyla 0.1 ps ve 0.5 ps olarak ayarlandı ve denge simülasyonunun süresi 100 ps idi. Sistem dengeye geldikten sonra zaman adımı 2 fs olarak ayarlandı ve kompleks üzerinde 10 ns'lik bir moleküler dinamik simülasyonu yapıldı; her 2 ps'de bir yörünge verileri kaydedildi. 10 ns'lik üretim serisi, kenetlenmiş koptin–AChE kompleksinin kısa zaman ölçekli dinamik değerlendirmesini sağlamak için kapsamlı konformasyonel örnekleme yerine keşif amaçlı bir simülasyon uzunluğu olarak seçildi. Bu ayar, kenetlenmiş kompleksin zamanla nispeten stabil bir bağlanma modunu koruyup koruyamayacağını değerlendirmek için kullanıldı. gmx rms, gmx rmsf, gmx dönme ve gmx hbonds komutları, kök ortalama kare sapması (RMSD), kök ortalama kare dalgalanması (RMSF), proteinin dönme yarıçapı, hidrojen bağları ve çözücü erişimi yüzey alanını hesaplamak için de kullanıldı. Sonuç görselleştirmesi için QTgrace kullanıldı.
Hayvan deneyi doğrulaması
Her iki cinsten de 7 gün sonra, sağlıklı on sekiz yeni doğumlu Sprague-Dawley (SD) sıçan yavrusu seçildi. Tüm deney hayvanları, belirli bir patojensiz (SPF) hayvan deney tesisinde barındırıldı. Bu tesis, mikroorganizmaların ve parazitlerin istilasını etkili bir şekilde engelleyebilen sıkı bir bariyer sistemiyle donatılmıştı. Konut odasının çevresel parametreleri merkezi bir kontrol sistemi tarafından otomatik olarak izlenip düzenlendi: sıcaklık 22 ± 2 °C, bilgili nem %55 ± %10 ve ışık döngüsü 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü. Klasik Rice-Vannucci yöntemiyle modifiye edilen hipoksik-iskemik beyin hasarı (HIBD) adlı yeni doğunan bir fare modeli, CP'nin patolojik ve davranışsal özelliklerini simüle etmek için kullanıldı.
Kısaca, doğum sonrası 7. gün fare yavruları indüksiyon için %2–3 izofluran ve bakım için %1–2 izofluran ile anestezi edildi. Yeterli anestezi uygulandıktan sonra, orta çizgi servikal kesi yapıldı ve sol ortak karotis arter dikkatlice izole edilip kalıcı olarak bağlandı. Kesi daha sonra dikildi ve yavrular ısıtıcı pedde 1 saat boyunca iyileşmelerine izin verildi. Daha sonra, model ve koptisin gruplarındaki yavrular, %8 O₂ ile %92 N₂ dengelenmiş bir odada hipoksiye maruz kalarak 37 °C'de 2 saat boyunca hipoksik-iskemik beyin hasarı indüklediler. Sahte ameliyat edilen hayvanlar, karotis ligasyonu veya hipoksik tedavi olmadan aynı anestezi ve cerrahi maruziyete maruz kalmıştır. Hipoksi sonrası, yavrular annelerine geri getirildi ve deney dönemi boyunca genel durum, hayatta kalma ve beslenme davranışları için günlük olarak izlendi.
Deneysel fareler rastgele olarak 3 gruba ayrıldı: Sahte grup: sadece sol ortak karotis arter ligasyon veya hipoksi tedavisi olmadan ayrıldı ve ameliyat sonrası eşit miktarda çözücü verildi; Model grubu: hipoksik-iskemik beyin hasarı modelleme ameliyatı yapıldı ve ameliyat sonrası eşit miktarda çözücü verildi; Optisin grubu: modellemeden sonra koptisin (10 mg/kg) gaaj ile verildi. Koptisin dozu (10 mg/kg), daha önce rapor edilen vivo/farmakokinetik koptisin17 çalışmalarına dayanarak in vivo doz olarak seçildi. İlaçlar, 14 gün ardışık müdahale süresince günde bir kez belirli bir zamanda uygulandı.
Hayvan göstergelerinin tespiti
Morris su labirenti (MWM) test ekipmanı, havuz duvarında belirgin görsel işaretler bulunan büyük, dairesel bir su havuzundan (yaklaşık 150 cm çapında) oluşuyordu. Havuz suyu opak süt beyazına katmanlandı ve su sıcaklığı 23 ± 1 °C arasında kontrol edildi. Hedef kvadranına şeffaf bir platform yerleştirildi ve su yüzeyinin 1–2 cm altında suya battı. Eğitim günde 4 kez yapıldı: hayvanlar, havuz duvarındaki dört farklı giriş noktasından havuz duvarına bakan suya yerleştirildi ve hayvanların suya girişten sonra gizli platformu bulup üzerine tırmanmaları için gereken "kaçış gecikmesi" kaydedildi. Her eğitim seansı 60 saniye ile sınırlıydı. Hayvan platformu 60 saniye içinde bulursa, hafızası pekiştirmek için 15 saniye boyunca orada kalmasına izin veriliyordu. Bulunmazsa, hayvan nazikçe platforma yönlendirildi ve 15 saniye kalmasına izin verildi. 7 günlük eğitimden sonra gizli platform kaldırıldı. Hayvanlar, orijinal platformun karşısındaki giriş noktasından suya yerleştirildi ve 60 saniye boyunca serbestçe yüzmelerine izin verildi; hayvanların yüzme yörüngesi bir video sistemi tarafından kaydedildi. MWM testi sayesinde, ortalama kaçış gecikmesi, hedef çeyrekte geçirilen süre ve orijinal platform konumu üzerinden geçiş sayısı gibi göstergeler kaydedildi.
Lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) tespiti için: Anestezi sonrası fareler stereotaksik bir alete sabitlendi, kafatası açığa çıkarıldı ve nemli tutuldu. Lazer benekli kan akışı görüntüleme sistemi, kafatasının tam üzerinde 30 saniye boyunca sürekli olarak ham benek görüntüleri toplamak için kullanıldı. Mekansal olarak değişen nokta kontrastını beyin kan akışı perfüzyon birimi (PU) dağılım haritasına dönüştürmek için profesyonel yazılım kullanıldı. Nicel analiz için, her görüntüde reziz ipsilateral yarımküre içinde lezyon ile ilgili kortikal perfüzyon alanı ve görünür anatomik işaretlere göre manuel olarak belirlenmiş kortikal ROI seçildi ve bu ROI içindeki ortalama perfüzyon değeri gruplar arası karşılaştırma için kullanıldı.
Beyin dokuları toplandı ve ağırlık-hacim oranına göre önceden soğutulmuş PBS eklendi. Mekanik homojenizasyon buz üzerinde gerçekleştirildi, ardından 8000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10–15 dakika boyunca santrifüj yapıldı ve üst yüzey test için toplandı. Beyin dokuları, doku morfolojisini korumak için 24 saatten fazla fiksasyon için hızlıca %4 paraformaldehit içine alındı. Hematoksilin-eozin (HE) boyama, dehidrasyon, temizleme ve parafin gömme gibi işlemlerle gerçekleştirildi ve beyin hasarının derecesi optik mikroskop altında gözlemlendi.
AChE aktivite ölçümü için, yaralı (ipsilateral) yarımküreden beyin korteksi toplanıp üreticinin talimatlarına göre homojenleştirildi. Doku örnekleri ekstraksiyon tamponunda homojenize edilip 8000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve üst üst madde analiz için toplandı. AChE aktivitesi, ticari asetilkolinesteraz aktivite testi kiti (mikroplaka/kolorimetrik yöntem) kullanılarak belirlendi. Bu test, asetilkolinin AChE tarafından hidrolizlenmesine dayanır, ardından DTNB ile reaksiyon yoluyla kromojenik bir ürün üretilir ve enzim aktivitesinin hesaplanması için soğurma 412 nm olarak ölçülmüştür. Bu kit, geleneksel antijen-niceleyen enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kiti değil, enzim aktivite bazlı kolorimetrik bir test olduğundan, üretici standart bir tespit aralığı ve analitik hassasiyet sağlamamıştır. Mevcut çalışmada, kortikal dokuda ölçülen AChE aktivite değerleri yaklaşık 25–80 nmol/min/mg protein aralığındaydı.
İstatistiksel analiz
Tüm deneysel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi ve GraphPad Prism yazılımı kullanılarak analiz edildi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Morris su labirenti testi için, nihai eğitim sonucu ve prob deneme parametreleri tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlıolarak 18 olarak kabul edildi. ROI'deki beyin kan akışı perfüzyonu ile ipsilateral serebral korteksteki AChE aktivitesi arasındaki korelasyon, Pearson korelasyon analiziyle analiz edilmiştir. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
C. chinensis ekstraktındaki kimyasal bileşenlerin analizi
Alkaloidler, C. chinensis tıbbi maddelerinin ana birikmiş bileşenleri ve aynı zamanda başlıca aktif bileşenleridir. Bu çalışmada, C. chinensis'teki ana kimyasal bileşenleri analiz etmek için kromatografik teknoloji kullanılmıştır (Şekil 1A). Tablo 1'de gösterildiği gibi, tüm sekiz analit kendi kalibrasyon aralıklarında iyi doğrusal perfor...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şu anda, beyin hastalıklarının önlenmesi ve tedavisi için çeşitli yöntemler ve teknolojilergeliştirilmiştir 20,21,22. Bu çalışmada, HIBD tarafından indüklenen serebral palsi benzeri semptomları iyileştirmede C. chinensis'in maddi temelini ve çoklu hedef mekanizmasını sistematik olarak netleştirmek için in vitro tarama, hesaplamalı simülasyon ve in vivo doğrulama entegr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen hiçbir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.
Bu çalışma, Zunyi Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (Zunshi Kehe Destek HZ (2020) No. 110) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | CATO Research Chemicals Inc. | 416046844 | Asetilkolinesteraz inhibisyon tahlili |
| Asetilkolinesteraz (AChE) | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd | C1682 | Asetilkolinesteraz inhibisyon tahlili |
| Asetiltiokolin iyodür (ATChI) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 1037408 | Asetilkolinesteraz inhibisyon tahlili |
| Aetonitril | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162577 | Sıvı kromatografi mobil fazı |
| AutoDock Vina | AutoDock | Version 1.2.5 | |
| Berberin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | 110713-201814 | Kimyasal bileşim analizi |
| Kolumbamin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180712 | Kimyasal bileşim analizi |
| Koptisin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Kimyasal bileşim analizi |
| E-916 hızlandırılmış çözücü ekstraktor | Büchi Labortechnik AG, Switzerland | E916-008 | N-bütanol fraksiyonunun ekstraksiyonu |
| Epiberberin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Kimyasal bileşim analizi |
| Formik asit | Thermo Fisher Scientific Inc | 1270563 | Sıvı kromatografi mobil fazı |
| GaussView 6 | Gaussian | https://gaussian.com/gaussview6/ | |
| Glavin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180615 | Kimyasal bileşim analizi |
| Jatrorrhizin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180607 | Kimyasal bileşim analizi |
| Magnoflorin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180205 | Kimyasal bileşim analizi |
| Metanol | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162578 | Sıvı kromatografi mobil fazı |
| Mikro gözenekli membran | Millipore Filter Company | 2139547 | Ekstrelerin filtrasyonu |
| Palmatin standardı | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180226 | Kimyasal bileşim analizi |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| PyMOL | PyMOL | https://pymol.org/ | |
| Sodyum karbonat | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 15138805 | Asetilkolinesteraz inhibisyon tahlili |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 11019349 | Asetilkolinesteraz inhibisyon tahlili |