Escherichia coli'den hidrofobin SC16'nın Rekombinant Üretimi ve Arındırılması ile floresan testleriyle kendi kendine montajının izlenmesi

Özet

Bu protokol, Escherichia coli'den hidrofobin SC16'nın rekombinant üretimi ve arıtmasını tanımlar ve kendi kendini montajını izlemek için floresan tabanlı testler sağlar.

Özet

Hidrofobinler, hidrofobik-hidrofilik arayüzlerde kendiliğinden birikerek mantar sporları üzerinde stabil su geçirmez kaplamalar oluşturan küçük amfipatik proteinlerdir. Sınıf I hidrofobinler, yüzeyleri kaplayan düzenli amiloid benzeri yapılara sahip özellikle kararlı "rodletler" oluşturur. Bu sıra dışı yüzey kimyası, ilaç dağıtımı, köpük stabilizasyonu, emülsifikasyon ve yüzey modifikasyonu gibi alanlarda potansiyel uygulamalar sunar. Hidrofobinler üretmek için, basit ifade sistemlerinden kapsamlı ve yüksek verimli protokollere ihtiyaç vardır. Ayrıca, rekombinant üretim ve arıtma sonrası hidrofobin fonksiyonunu karakterize etmek için kolay yöntemler sunulmalıdır. Burada, Schizophyllum commune mantarı tarafından üretilen ve Escherichia coli'de rekombinant olarak ifade edilebilen ve ardından indirgenmeyen, doğal koşullarda saflaştırılan SC16 sınıfı hidrofobinin olan SC16'nın üretimi ve karakterizasyonu protokollerini açıklıyoruz. Bu, SC16 kodlayan bir ekspresyon plazmidinin N-terminal füzyon proteinine birleşerek E. coli'ye dönüştürülmesini, protein ekspresyonunun indüksiyonunu, doğal koşullarda hücre lizisini, afinite kromatografisini ve hidrofobini ≥5 mg verimde izole etmek için proteaz parçalanmasını içerir. SC16'nın kendi kendine montajı, tioflavin T kullanılarak uç nokta veya kinetik floresans tabanlı testlerle izlenebilir. Her iki test, hava-su arayüzlerinde kendi kendine montajı teşvik etmek için SC16'nın uzun süreli karıştırmasıyla kuluçka yapılmasını içerir ve floresan ölçümleriyle izlenir. Bu yaklaşımlar birlikte, SC16'nın saflaştırılması ve kendi kendine montajını izlemek için basitleştirilmiş protokoller sağlar ve benzer protein kendi kendine montajını içeren diğer sistemlere de genişletilebilir.

Giriş

Hidrofobinler, mantarlar tarafından salgılanan yüzey aktif amfipatik proteinlerdir ve hidrofobik-hidrofilik arayüzlerde (örneğin, mantar yapılarındaki hava-su arayüzleri) kendiliğinden oluşurlar. Doğada rolleri sporları ve meyve cisimlerini^kaplamak, onları suya dayanıklı kılmak, hava kanallarının su birikmesini önlemek ve yayılmayı^{kolaylaştırmaktır 1}. Alışılmadık yüzey kimyaları nedeniyle, hidrofobinler implantların ve protezlerin biyouyumlulukunu artıran^{kaplamalar (3,4,5}), ilaç teslimatı ve tıbbi tedaviler için biyouyumlu yüzeyaktif^{maddeler (}6,7,8,9,10) ve nanoplastik yakalama adayları (¹¹) dahil olmak üzere çeşitli endüstriyel uygulamalara sahiptir.

Hidrofobinler, hava-su, yağ-su 12,13,14 ve plastik-su 15,16,17 arayüzlerinde hidrofobik-hidrofilik arayüzlerde kendiliğinden biriktirilen sınıf I ve sınıf II'ye ayrılabilir. Sınıf I hidrofobinlerin tanımlayıcı özelliği, arayüzlerde oldukça kararlı "rodlet" yapılar oluşturmalarıdır ve düzenli amiloid benzeri (β tabaka açısından zengin) özellikler^{içerirler ve} bu da onları özellikle yüzey modifikasyonu veya koruma uygulamaları için uygundur. Buna karşılık, sınıf II hidrofobinler amiloid benzeri yapılar oluşturmaz, bunun yerine kolayca ayrılabilen filmler^{oluşturur 1,18}. İlginç bir şekilde, üçüncü bir hidrofobin sınıfı da vardır; yapısal özellikleri sınıf I ve sınıf^II 18,19'dan korunmuştur. Bu farklılıklar nedeniyle, hidrofobinin kendi kendine montajını izlemek, sınıflandırma ve rekombinle üretilen hidrofobinlerin doğru katlanma ve işlevini değerlendirmek için önemlidir.

Hidrofobinlerin kendi kendine montajı, amiloidler arasında bulunan çapraz β yapılara bağlanan thioflavin T (ThT) gibi amiloid bağlayıcı boyalar kullanılarak florometrik yöntemlerle kolayca izlenebilir²⁰. ThT, normalde serbestçe dönen iki aromatik halkayı ayıran tek bir kovalent bağ içerir. Çapraz β yapılara bağlandığında, bu dönme kısıtlanır ve^{floresans 20} oluşur. Seçici floresansı nedeniyle, ThT hava-su arayüzlerinde hidrofobinin kendi kendine montajını^{izlemek için yaygın olarak kullanılır 21,22,23,24,25,26,27,28}. ThT testleri, hidrofobin kendi kendine montaj^(23,27,28) üzerine zamana bağlı kinetik bilgi sağlar ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve temas açısı ölçümleri gibi tekniklere göre avantajlar sunar; çünkü bu teknikler daha düşük verimliliğe sahiptir ve zamana bağlı analizler için daha az uygundur. Ayrıca, ThT, çapraz β yapılara bağlanırken güçlü floresans artışı gösterir ve serbest formunda minimal^{floresans içerir 20}. Bu özellikler, ThT testlerini hidrofobinin kendi kendine montajını izlemek için basit ve hassas yöntemler haline getirir; bu yöntemler daha yoğun yapısal tekniklerle tamamlanabilir.

Hidrofobinlerin çeşitli uygulamaları göz önüne alındığında, kendi kendine montaj süreçlerini izlemek için erişilebilir protokollere ihtiyaç vardır. Özellikle, mevcut protokol rekombinant hidrofobinlerin arındırılması ve işlevsel karakterizasyonunu optimize etmek için bir çerçeve sunmaktadır. Daha önce, Morris ve Sunde (2013) Escherichia coli'de rekombinant ekspresyon, arındırma ve hidrofobin kendi kendine montaj^21'in ThT tabanlı izlenmesi protokollerini ortaya koymuşlardır. Bu çalışma, hidrofobin SC16'nın saflaştırılması için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlayarak bu yöntemleri genişletmektedir. SC16, E. coli'den kolayca arındırılabilir ve disülfür bağlarının denatürasyonu, indirgemesi veya reoksitlenmesi gerektirmeden E. coli'den kolayca arındırılabilen bir sınıf hidrofobindir. Ortaya çıkan SC16 proteini, çubuk oluşumunu izleyen son nokta ve kinetik ThT tabanlı kendi kendine montaj testleriyle gösterildiği gibi işlevseldir. Bu makalenin amacı, sınıf IB hidrofobin SC16'nın rekombinant üretimi, arındırılması ve fonksiyonel ThT tabanlı testleri için kapsamlı ve sade bir protokolü detaylandırmaktır.

Protokol

Bu çalışma insan katılımcıları, omurgalı hayvanlar veya doku örneklerini içermemektedir. Bu nedenle, etik onay gerekmiyordu.

1. E. coli'de Hidrofobin SC16'nın İfadesi

1. T7 Express E. coli hücrelerini, 42°C'de ısı şoku ile 45 saniye boyunca dönüştürün; pET-21 ekspresyon plazmidini kodlayan ve SC16 (H-GB1-SC16) ile birleşmiş protein G proteininin B1 oranını kodlayan bir plazmid.
   NOT: SHuffle T7 Express hücreleri, doğru disülfüd bağ^{oluşumunu teşvik etme yetenekleri nedeniyle seçilmiştir 29}. H-GB1-SC16 plazmidi, daha önce tanımlandığı gibi krestriksiyon enzimi klonlamasıyla^{üretilebilir 30}.
2. 100 μg mL⁻¹ ampisilin içeren 2 mL lizogeni suyu (LB) tek bir koloni ile aşılayın. Gece boyunca 37°C'de sarsıntı ile kuluçka yapın.
3. 1 L LB'yi (2.8 L'lik şaşırtılmış yuvarlak tabanlı bir şişe) gece kültüründen 1 mL ile aşılayın. Kültürü 37°C'de sallama ile (~120–135 rpm, 19 mm dairesel yörünge) büyütün, 600 nm'de optik yoğunluk 0.6 ± 0.1'e ulaşana kadar.
4. H-GB1-SC16 ekspresyonunu oluşturmak için izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranosid ile 0,5 mM nihai konsantrasyon ekleyin. Gece boyunca 20°C'de sallayarak kuluçka yapın.
   NOT: Bu sıcaklık, dahil etme vücut oluşumu ve yanlış katlanma^{riskini azaltmak için seçilmiştir 31}.
5. Hücreleri 4000 × gr'de 20 dakika boyunca santrifüjle hasat edin. Üst yüzeyi dök.
   DURAKLAMA NOKTASI: Hücre pelletini −20°C'de 3 haftaya kadar saklayıp ardından arıtmaya geçin. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının.

2. Hidrofobin SC16'nın Arındırılması

1. Hücre pelletini 30 mL lizis tamponu (20 mM tris(hidroksimetil)aminometan [Tris], pH 8, 250 mM NaCl) içinde yeniden askıya alın.
2. Hücreleri, süspansiyonu 80°C su banyosunda 15 dakika boyunca kuluçka altına alın. İnkubasyon sırasında her 5 dakikada bir nazikçe karıştırın.
   NOT: Bu adım SC16 ısı stabilitesine dayanır ve diğer proteinler için uygun olmayabilir.
   DIKKAT: 80°C'de tüpleri ve su banyolarını tutarken ısıya dayanıklı eldivenler kullanın. Karıştırma ve tüp çıkarırken sıcak sıvı sıçratmaktan kaçının.
3. Hücre lizatını 25.000 × g sıcaklığında 4°C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Üstyerçekimi 2–3 mL Ni²⁺ yüklü immobilize metal affinite kromatografisi (IMAC) reçinesi içeren bir yerçekimi kolonuna yükleyin.
4. Kolon, 30 mM imidazol içeren liz tamponu ile yıkayın. 300 mM imidazol içeren 10 mL liz tamponu kullanarak proteini elüte edin.
5. Elutlanmış fraksiyonu, Tris (pH 8; 20 mM) ve NaCl (50 mM) içeren 1 L tampon ile 3 saat boyunca diyaalize edilir; 3500 kDa moleküler ağırlıklı kesim diyaliz borusu kullanılarak 100 rpm'de karıştırılır.
   NOT: Diyaliz sırasında karıştırma hızı, kuruluma (örneğin, boru hacmi ve beaker geometrisi) bağlı olarak değişebilir. Diyaliz torbasının nazik bir dönüşünü sağlamak için gerekli olan en düşük devirde karıştırın.
6. Trombin proteazı (20 U mg⁻¹ füzyon proteini) doğrudan diyaliz torbasına (toplam 10 mL reaksiyon hacmi) ekleyin ve füzyon proteini parçalanın. Tamponu değiştir.
   DURAKLAMA NOKTASI: Proteaz ekleme ve tampon değişiminden sonra, diyaliz gece boyunca 4°C'de devam edilir. Ertesi gün arınmaya devam et. SDS-PAGE ile bölünme tamamlanmasını doğrulayın (~18 kDa bandının kaybolması ve ~10 ile ~8 kDa bantlarının ortaya çıkması beklen).
7. Diyalizlenmiş örneği Ni²⁺ yüklü IMAC kolonuna yeniden yükleyin. Yaklaşık 12 mL tampon ile yıkama ve elyut ile sırasıyla 30 mM ve 300 mM imidazol içerir.
8. Toplanan fraksiyonları, indirgeme koşullarında (yükleme tamponunda β-merkaptoetanol kullanılarak) sodyum dodesilsülfat–poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilir. SC16'yı beklenen moleküler ağırlıkta (~10 kDa) yıkama fraksiyonunda bir bant bulunmasıyla tanımlayın. SC16 içeren yıkama fraksiyonunu tamamen Tris (pH 8; 20 mM) ve NaCl (50 mM) içeren 1 L tampon ile 3 saat diyaliz ederek kalıntı imidazol çıkarılır.
   NOT: SC16 genellikle yıkama fraksiyonunda tespit edilirken, H-GB1 genellikle eluatta zenginleştirilir. Eluatta az miktarda kalıntı SC16 da bulunabilir.
9. SC16'yı tercih ettiğiniz bir yöntemle (örneğin, yüksek performanslı sıvı kromatografi ile amino asit analizi, Bradford testi veya 280 nm'de absorbans) nicelikle ölçün. Bu yöntemle, kültür litresi başına ≥5 mg SC16 verimi beklenmektedir.
   NOT: Grubumuz, SC16'yı 280 nm'de soğurmaya göre rutin olarak nicelikleşir; tahmini yok olma katsayısı 3480 M^{−1 cm−1 32 Sadeliği} nedeniyle SC16 nicelendirme için tercih edilen yöntemdir.
10. SDS-PAGE analizi için arıtma boyunca örnekler toplayın.

3. SC16 Kendi Kendine Montajının Son Nokta Floresans Testi

1. 50 μg mL⁻¹ SC16, 50 mM NaCl ve 20 mM her biri 2-(N-morfolino)etansülfonik asit (MES), Tris ve sodyum fosfat içeren üçlü reaksiyon karışımları hazırlanır. Konsantre HCl veya 1 M NaOH damla-damla eklenerek MES, Tris ve sodyum fosfatı 6.5'e ayarlanmış bir stok tamponu önceden hazırlanın. Teste başlamadan hemen önce protein ve NaCl ekleyin.
   NOT: Bu aşamada kontroller hazırlanabilir. Örneğin, uç-uç dönüş geçirmeyen SC16 içeren pozitif kontroller ve sadece tampon içeren negatif kontroller ekleyin. SC16 konsantrasyonları 25–100 μg mL⁻¹ arasında test edilmiş olup, sonuçlar en tutarlı şekilde 50 μg mL⁻¹ olarak gerçekleşmiştir. Bu parametri gerektiğinde optimize edin.
2. Karışımları 2–5 mL tüplere aktarın.
   NOT: Numune tüpünün %50 kapasiteye kadar doldurulduğundan emin olun ki ters çevirme sırasında doğru karıştırma sağlansın.
3. Tüpleri 20 rpm'de 2 saat boyunca uç başı döndür. Her örnekten 100 μL, yuvarlak, baca tarzı kuyulara sahip opak tabanlı siyah 96 kuyu plakasına aktarın.
4. Tüm örneklere 20 μM nihai konsantrasyona filtrelenmiş ThT ekleyin.
5. Mikroplaka okuyucusunu ThT^{floresansı 33,34,35,36} için uygun aralıkta uyarılma ve emisyon dalga boylarına ayarlayın. Kazancı 55 ve entegrasyon süresini 20 μs olarak ayarlayın. 2 saatlik dönme döneminden hemen sonra her örnek için floresans yoğunluğunu ölçün.
   NOT: Bildirilen ThT uyarılma ve emisyon maksimumları sırasıyla 450 nm ve 490 nm^37'dir. Bu deney, optik filtre kullanılabilirliğine göre sırasıyla 438 ve 494 nm emisyon değerleri kullandı. Uç-uç dönüş, fabrika bir döner cihazı kullanılarak gerçekleştirildi.

4. SC16 Kendi Montajının Kinetik Flüoresans Testi

1. Siyah 96 kuyu plakasında 100 μL reaksiyon karışımlarını üçlü olarak hazırlayın.
2. 50 μg mL⁻¹ SC16, 50 mM NaCl, 20 μM filtrelenmiş ThT ve 20 mM MES, Tris ve sodyum fosfat içerir. Sadece ThT içeren ve tampon içeren negatif kontroller hazırlanın (SC16 olmadan).
3. Tamponun pH'ını (Tris, MES ve sodyum fosfat içeren) konsantre HCl veya 1 M NaOH kullanarak SC16 ve ThT eklenmeden önce 5.5, 6.5, 7.5 veya 8.5'e ayarlayın. Karışık tampon sistemi, tampon kimliğini değiştirmeden pH ayarlamasına olanak tanır.
4. Plakayı mikroplaka okuyucuya yerleştirin.
5. ThT^{floresansı 33,34,35,36} için uyarma ve emisyon dalga boylarını uygun aralık içinde ayarlayın.
6. Okuyucuyu her 70 saniyede bir döngüsel ölçümler için programlayın.
7. 432 rpm'de 60 saniyelik yörüngesel sallanma ve ardından her döngü başına 10 saniyelik dinlenme süresi ekleyin.
8. Entegrasyon süresini 20 μs ve kazanç 55 olarak ayarlayın.
9. Testi 120 döngü boyunca çalıştırın, 2 saatlik sallanma boyunca floresans değişikliklerini izleyin.
   NOT: Yörünge sarsıntısının seçildiğinden emin olun; Doğrusal sallanma, tutarsız veya optimal olmayan kendi kendine montaj sonuçları verebilir.

Sonuçlar

Şekil 1, SC16'nın arındırılmasını izleyen Coomassie boyalı SDS-PAGE jeli sunmaktadır. Kodlar, işaretleyici (M), indüksiyondan önce (B), indüksiyondan sonra (A), çözünür fraksiyonu (S), akış geçişi (F), yıkama (W), eluat (E) ve diyalizlenmiş (D) olarak temsil edilir. İlk IMAC elüatında, tahmini moleküler ağırlığı ~18 kDa olan bir bant, trombin bölünmesinden önceki H-GB1-SC16 proteinine karşılık gelir. Trombinle bölündükten sonra, ikinci IMAC akış fraksiyonunda protein yoktur ve yıkamada SC16'ya karşılık gelen ~10 kDa bir bant vardır. İkinci IMAC eluatında, biraz kalıntı SC16 ve H-GB1'e karşılık gelen daha küçük ~8 kDa bir protein bulunur. Saflaştırılmış SC16, daha sonra uç noktası ve kinetik kendi kendine montaj testleri için kullanıldı. Bu sonuçlar, beklenen moleküler ağırlık bandının varlığı ve trombin bölünmesinden sonra H-GB1 füzyon partnerinin ayrılmasıyla SC16'nın başarılı saflaştırılmasını doğrulamaktadır.

Şekil 1. SC16'nın ilk (trombin bölünmesinden önce) ve ikinci (trombin bölünmesinden sonra) IMAC ayrılmaları için temizlenmesinin SDS-PAGE analizi. Moleküler ağırlık belirteci (M) gösterilir; indüksiyondan (B), indüksiyondan (A) sonra toplanan örnekler, hücre lizisi süpernatantı (S), akış (F), yıkama (W) ve eluat (E) fraksiyonları ile diyalizlenmiş örnek (D) gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1'de sunulan SC16 kendi kendine montajının son nokta ThT testi, 2 saat tezgah yüzeyi döndürmesinden sonra ThT floresans yoğunluğunda, döndürülmeyen protein içeren kontrollere kıyasla 11 kat artış göstermektedir. Benzer şekilde, tampon örneklerinin döndürülmesiyle floresans yoğunluğunda anlamlı bir değişiklik gözlemlemedik. SC16'nın karıştırılması sırasında ThT floresansındaki bu artış, SC16'nın kendi kendine montaj ^24,25'e işaret eden amiloid benzeri β-tabakaların oluşumunu temsil eder. Bu sonuçlar, tanımlanan floresan tabanlı testin, test edilen koşullar altında SC16'nın kendi kendini montajını etkili bir şekilde izlediğini göstermektedir.

Örnek	ThT Floresansı (SD ± Sayı)
Rotasyon olmadan SC16	2679 ± 177
Rotasyon sonrası SC16	30315 ± 2141
Dönüş sonrası tampon	665 ± 888

Tablo 1. SC16 örneklerinin uçtan uca dönmesinden sonra toplanan ThT floresans ölçümleri. SC16 (50 μg mL⁻¹) örnekleri ya çalkalanmadan kuluçka edildi ya da 2 saat boyunca rotasyona maruz bırakıldı. Floresans ölçümlerinden önce ThT (20 μM) eklenmiştir. Flüoresans sırasıyla 438 ve 494 nm uyarılma ve emisyon dalga boylarında ölçüldü ve ham sayılar olarak bildirildi. Değerler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur.

SC16'nın çeşitli tamponlarda birkaç saat boyunca çalkalanmış kinetik kendiliğinden montaj testi Şekil 2'de sunulmaktadır. Amiloid fibrilasyon için tipik S-şekilli kinetik kendiliğinden montaj eğrileri karakteristik gecikme, büyüme ve plato^{periyotları 38'i} içerir. SC16 için ilk ölçümlerde önemli bir gecikme dönemi gözlemlenmemiştir, ancak bu davranış EAS^21,23 gibi diğer hidrofobinler için belgelenmiş olmuştur. Her pH için kendi kendine montaj eğrileri karşılaştırılabilir ve rodlet oluşumuna karşılık gelen güçlü, pozitif eğimlere sahiptir. Yaklaşık 20 dakikalık bir hareketlendirmeden sonra, floresans yoğunluğu sabitlenir ve yavaş yavaş azalır. SC16 içermeyen kontrol örneklerinde, deney boyunca floresansda önemli değişiklikler yoktur.

Şekil 2. SC16'nın kendi kendine montaj eğrileri, kinetik ThT floresans testi kullanılarak ölçüldü. SC16, 20 μM ThT, 50 mM NaCl, 20 mM sodyum fosfat, 20 mM MES ve 20 mM Tris içeren çok bileşenli bir tamponda 50 μg mL⁻¹ ile hazırlandı. Ölçümler, 60 saniyelik yörünge sallanması ve 10 saniyelik dinlenme döneminden sonra alındı. x ekseni sarsma süresini (toplam 2 saat) temsil eder. Flüoresans sırasıyla 438 nm ve 494 nm uyarılma ve emisyon dalga boyları kullanılarak ölçülmüş ve 10⁻³ × olarak rapor edilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (n = 3). Paneller pH 5.5 (sol üst), 6.5 (sağ üst), 7.5 (alt sol) ve 8.5 (sağ alt) değerindedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 , kinetik kendi-montaj testi için optimal olmayan sonuçlara örnek vermektedir. Bu durumda, analiz protokol bölümünde açıklandığı gibi tamamlandı, ancak "yörüngesel" sarsma ayarı yerine "doğrusal" bir sarsma ayarı kullanıldı.

Şekil 3. Kinetik ThT floresans testi kullanılarak elde edilen SC16'nın optimal olmayan kinetik kendi kendine montaj verilerine örnek. Bu durumda, sallama yörüngesel sarsıntı yerine doğrusal bir ayarla gerçekleştirilmiştir. Örnekler, Şekil 2 için açıklandığı şekilde hazırlanmıştır. Ölçümler, 60 saniyelik doğrusal sallanma ve 10 saniyelik dinlenme süresi sonrası alındı. x ekseni sarsma süresini (toplam 2 saat) temsil eder. Floresans sırasıyla 438 nm ve 494 nm uyarılma ve emisyon dalga boyları kullanılarak ölçülmüş ve 10⁻³ × olarak rapor edilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, hidrofobin SC16'nın ekspresyonu ve saflaştırılması ile SC16'nın kendi kendine montajının düşük ve yüksek verimli floresan testleri için protokolleri özetlemekte; her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Bu iş akışları, proteinin kendi kendine montajını izlemek için ilgili sistemlere uygulanabilir. Bu protokolde, SC16 arındırmasından önce hücreleri lizlemek için ısı kullanılır; çoğu protokol E. coli'yi daha geleneksel yöntemlerle lizize eder. H-GB1-SC16'nın 80°C'ye kadar çözünür ve ısıya dayanıklı olduğunu ve ısı lizatın³⁹ içindeki ısıya dayanıklı proteazlar ve diğer kirletici proteinlerin çökelmesiyle ilk örnek temizleme adımı olarak hizmet ettiğini bulduk. Ancak SC16 özel bir durumu temsil eder; hidrofobinler genellikle dahil edici^cisimler 12,21,40'ta çözülemez şekilde ifade edilir. Dahil edici cisimler olarak ifade edildiğinde, genellikle denatürleme koşulları gereklidir ve ardından yerleşik^{protokoller kullanılarak yeniden katlama yapılır (21,40,41}).

Bu protokolde, SDS-PAGE her adımda SC16 saflaştırmasını değerlendirmek için kullanılır; bu aşamada hücre pelleti, hücre lizisinden sonra çözünür fraksiyon ve sonraki tüm kolon fraksiyonları dahildir. Bu, Şekil 1'de gösterilmiştir; ancak H-GB1 ile karşılaştırıldığında, SC16'ya karşılık gelen bant nispeten zayıftır. SC16 dahil birçok hidrofobin için tutarlı ve yoğun Coomassie boyama elde etmenin zor olduğunu gördük. SC16 genellikle β-merkaptoetanol indirgeme ajanı olarak kullanıldığında orta yoğunluklu bir bant olarak görülür (Şekil 1). Bazı durumlarda, hidrofobinleri daha net görselleştirmek için gümüş boyama gerekebilir.

Son nokta ve kinetik floresans testleri, SC16'nın kendi kendine montajını izlemek için kullanılabilir. End-point ThT testi, kendi kendine montajın hızlı ve basit bir değerlendirmesini sağladığı için avantajlıdır. Tezgah yüzeyi dönmesinin 2 saatlik süresinden sonra floresansın artmasının yanı sıra, kendi kendine montaj genellikle reaksiyon tüpünde görünür beyaz bulanıklık ile birlikte olur. Bu test, mikroplaka okuyucu bileşenlerindeki aşınmayı en aza indiren basit bir tezgah üstü rotatör karışımı kullanır. Deneyimimize göre, bu test, mikroplaka okuyucudaki sallanma ayarları gibi enstrümantal parametrelere karşı nispeten duyarsızdır.

Kinetik ThT testi, kendi kendine montaj hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar. Örneğin, SC16 kendi kendine montajı, tampon^{koşullarına 24} önemli ölçüde bağlı değildir, ancak daha yüksek pH değerlerinde replikalar arasında daha büyük bir varyasyon gözlemlenir. Ancak, bu davranış hidrofobinler arasında evrensel değildir ve tuz konsantrasyonu, pH 24,27,42 ve katkı maddeleri (örneğin, deterjanlar veya alkoller) gibi faktörlerin hidrofobinin kendi kendine montajını ^{etkilediği bilinmektedir 27,28}. Örneğin, hidrofobin SLH4, düşük iyon dayanıklılığı ve düşük pH^24'te daha verimli kendi kendine montaj gösterirken, HFBII'nin kendi kendine montajının pH ve elektrolit^{konsantrasyonu 42'den} bağımsız olduğu bildirilmiştir; bu da SC16'ya benzer şekilde. Diğer çalışmalar, katkı maddelerinin rodlet oluşumu üzerindeki etkilerini yüzey gerilimindeki^{değişikliklerle ilişkilendirmiştir 27,28}. Bu farklılıklar göz önüne alındığında, her sistem için tampon bileşimi ve pH dikkate alınmak, gecikme fazı, büyüme ve plato bölgeleri dahil olmak üzere kendi kendine montaj eğrisi üzerindeki etkilerini izlemek önemlidir.

Önemli bir sınırlama, kinetik ThT testinin mikroplaka okuyucunun enstrümantal parametrelerine karşı son derece hassas olması ve cihazlar arasında değişebilmesidir. Örneğin, SC16 kendi kendine montajında yörüngesel (dairesel hareket) ve doğrusal (ileri geri hareketli) sarsıntı ayarları arasında önemli bir fark gözlemlenmektedir (sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3). ThT tabanlı testler, hidrofobin kendi kendini montaj modellemek için etkili bir yöntem sunarken, değişken seçiciliği nedeniyle doğasında olan sınırlamaları vardır ve bu da yanlış-pozitif veya yanlış negatif sinyallere yol açabilir⁴³. Ayrıca, hidrofobin agregalarından gelen ışık saçılması, ölçülen floresans^{yoğunluğunu 44} etkileyebilir ve ölçüm doğruluğunu düşürebilir. Örnek seyreltilmesi ve yol uzunluğunun azalması bu etkileri azaltmaya yardımcı olabilir.

Burada özetlenen protokoller, SC16'nın kendi kendine montajını temizlemek ve izlemek için etkili yöntemler sunar. Son nokta testi basittir ve enstrümantasyona daha az bağımlıdır; kinetik test ise ayrıntılı zaman çözümlü bilgi sağlar ancak enstrümantal parametrelere daha duyarlıdır. Bu protokol, SC16'yı saflaştırmak için basit bir yaklaşım sunar ve E. coli'de ifade edilen diğer doğru katlanmış hidrofobinlere de uygulanabilir. Tanımlanan ThT testlerinin doğasında sınırlamalar olsa da, yalnızca AFM veya temas açısı ölçümleri gibi tekniklere kıyasla zamana bağlı kendi kendine montaj bilgisi sağlarlar. Bu iş akışları, ilgili proteinler için uyarlanabilir ve özellikle biyomalzeme geliştirme, ilaç teslimatı ve proteinin kendi kendini birleştirmesinin önemli olduğu diğer alanlarda geçerlidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	145224-94-8	Kendiliğinden birleşim testleri için tampon bileşeni
5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüp	Falcon	352054	Düşük verimli kendiliğinden birleşim testlerinde kullanılır
96 kuyuluk siyah polistiren mikroplate	Grenier	655076	Mikroplate okuyucuda floresan ölçümlerinde kullanılır
Akrilamid/Bis-akrilamid (29:1) çözeltisi (40%)	BioShop	ACR004.500	SDS-PAGE jelleri hazırlamak için kullanılır
Agar	BioShop	AGR002.1	Ampisilin dirençli LB plakaları yapmak için kullanılan agar
Ampisilin	IBI Scientific	IB02040	LB-agar plakalarında kullanılan antibiyotik
Kargaşalı 2.8 L Fernbach şişeleri	Fisher Scientific	955239	Büyük hacimli bakteri kültürü büyümesi için kullanılır
β-merkaptoetanol	TCI Chemicals	60-24-2	SDS-PAGE örnek hazırlamasında kullanılan indirgeyici ajan
Kolon (1.5 cm çaplı yerçekimi kolon)	Bio-Rad	7371522	Nikel afinite arıtması için kullanılır
Diyaliz tüpü (3500 kDa MWCO)	BioDesign	D302	Arıtma sırasında tampon değişimi için kullanılır
Emiş filtresi	Edmund Optics	84080	ThT testleri için kullanılır (494 nm, 20 nm bant geçişi)
Uyarım filtresi	Edmund Optics	67012	ThT testleri için kullanılır (438 nm, 24 nm bant geçişi)
Floresan mikroplate okuyucu	Tecan	Infinite F200 Pro	ThT floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılır
Sıcak plaka	Lab Fish	HS5C	Sıcaklık izlemeli su banyosu kurulumu için kullanılır
Hydroklorik asit (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Tamponların pH ayarında kullanılır
İmidazol	TCI Chemicals	288-32-4	IMAC arıtmasında kullanılır (yıkama ve elüsyon tamponları)
Izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozid (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1	E. coli'de protein ekspresyonunu uyarır
LB besi maddesi (Lennox)	BioShop	LBL405.5	Bakteryal kültür için büyüme ortamı
Düşük hızlı soğutmalı santrifüj	Beckman Coulter	360291	Depolama öncesi hücreleri peletlemek için kullanılır
Nikel NTA agaroz boncukları	GoldBio	H-350-50	His-etiketli proteinlerin afinite arıtımında kullanılan reçine
SC16 plazmiti	BioBasic	N/A	H-GB1-SC16 füzyon proteinini kodlayan özel DNA yapısı
SHuffle T7 Express kompetent E. coli	New England Biolabs	C3029J	Rekombinant protein ekspresyonu için kullanılan ana suş
Sodyum klorür (NaCl)	BioShop	SOD001.5	Tampon bileşeni ve iyonik kuvvet düzenleyici
Sodyum hidroksit (NaOH)	Fisher Chemical	SS255-1	Tamponların pH ayarında kullanılır
Sodyum fosfat	BioShop	SPD579.1	pH'ı korumak için tampon bileşeni
Spektrofotometre	Pharmacia Biotech	5096	SC16'nın kantitatif analizi için kullanılır
Tiyoflavin T (ThT)	Acros Organics	2390-54-7	Protein kendiliğinden birleşimini izlemek için kullanılan floresan boya
Trombin proteaz	Sigma-Aldrich	04-04-9002	H-GB1-SC16 füzyon proteininin parçalanması için kullanılır
Tris(hidroksimetil)aminometan (Tris)	BioShop	TRS001.5	Arıtma ve analiz çözeltilerinde kullanılan tampon
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj	Sorvall	46915	Hücre lizisinden sonra lizatı temizlemek için kullanılır
SDS-PAGE kurulumu	Bio-Rad	1658000EDU	SDS-PAGE jellerini hazırlamak ve çalıştırmak için kullanılır