Plasenta Kaynaklı Ekzozomlar, SASH1 Aracılığıyla Hipoksi Kaynaklı Trofoblast Apoptosunu ve İnflamatuar İlerlemeyi Hafifletir

Özet

SAM ve SH3 domaini içeren protein 1 (SASH1), preeklampside (PE) trofoblast apoptozu ve inflamasyonun temel bir düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. Plasenta kaynaklı ekzozomlar (P-EXOS), SASH1 ekspresyonunu baskılayarak hipoksi kaynaklı hasarı hafifletir. Bu bulgular, PE patogenezinin altında yatan yeni bir mekanizmayı ortaya çıkarmakta ve SASH1'in potansiyel bir terapötik hedef olduğunu önermektedir.

Özet

SASH1, hücre büyümesi, apoptoz ve bağışıklık düzenlemesinde rol oynayan bir sinyal adaptör proteinidir ve tümör ile bağışıklık hücrelerinde giderek daha fazla çalışılmaktadır. Ortaya çıkan kanıtlar, SASH1'in PE gelişimi ile yakından ilişkili olan süreçler olan inflamatuar yanıtlar ve hücresel homeostazda önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, SASH1'in PE'deki trofoblast apoptozuna ve inflamatuar yanıtlara katkıda bulunup bulunmadığını ve P-EXOS'un SASH1 düzenlemesi yoluyla koruyucu etkiler gösterip göstermediğini belirlemeyi amaçlamıştır. Bu çalışmada, ortak farklı şekilde eksprese edilen genleri (DEG'ler) belirlemek için üç PE ile ilişkili transkriptomik veri seti (GSE75010, GSE10588 ve GSE60438) analiz edilmiş, ardından Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yapılmıştır. Temel aday genleri taramak için makine öğrenimi algoritmaları uygulanmış ve plasenta dokusundaki hücresel heterojenliği karakterize etmek ve hücre tipine özgü ekspresyon modellerini belirlemek için tek hücreli RNA dizileme verileri kullanılmıştır. SASH1, konsensüs aday gen olarak tanımlanmış ve PE örneklerinden alınan trofoblast hücrelerinde anlamlı şekilde yukarı regüle edilmiştir. In vitro, hipoksi uygulanan bir HTR-8/SVneo trofoblast hücre modeli oluşturulmuş ve bu model SASH1 nakavtı, SASH1 aşırı ekspresyonu ve P-EXOS ile ko-kültür ile birleştirilmiştir. Fonksiyonel deneyler, SASH1 nakavtının hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu anlamlı şekilde baskıladığını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin sekresyonunu azalttığını; buna karşın SASH1 aşırı ekspresyonunun apoptozu ve inflamatuar yanıtları teşvik ettiğini göstermiştir. Ek olarak, P-EXOS tedavisi, SASH1 ekspresyonunu hem mRNA hem de protein seviyelerinde belirgin şekilde azaltmış ve hipoksi kaynaklı trofoblast hasarını hafifletmiş; ancak SASH1 aşırı ekspresyonu bu koruyucu etkileri büyük ölçüde ortadan kaldırmıştır. Bir bütün olarak bu bulgular, SASH1'in PE'deki trofoblast apoptozunda ve inflamatuar yanıtlarda kritik bir rol oynadığını göstermektedir. P-EXOS, SASH1 ekspresyonunu baskılayarak hipoksi kaynaklı trofoblastik hasarı hafifletebilir ve böylece PE için moleküler mekanizmalara ve potansiyel terapötik hedeflere dair yeni bakış açıları sunabilir.

Giriş

PE, genellikle gebeliğin 20. haftasından sonra ortaya çıkan ve klinik olarak hipertansiyon, proteinüri ve çoklu organ disfonksiyonu ile karakterize, gebeliğe özgü multisistemik bir bozukluktur. Dünya genelinde maternal ve perinatal morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir¹. Klinik yönetimdeki sürekli ilerlemelere rağmen, PE'nin kesin tedavisi hâlâ plasentanın doğurtulmasıdır; bu durum, patogenezin henüz tam olarak anlaşılamadığını ve yeni moleküler ve hücresel mekanizmaların yanı sıra potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yönelik acil ihtiyacı vurgulamaktadır^2,3.

Yeterli trofoblast invazyonu ve normal plasental gelişimin desteklenmesi, PE patogenezinin temelini oluşturan kritik mekanizmalardır⁴. Normal gebelik sırasında trofoblast hücreleri, düşük dirençli ve yüksek kapasiteli bir dolaşım kurmak için uterus decidua'sını istila eder ve spiral arterleri yeniden şekillendirir. Trofoblast hücrelerinin invazyon ve migrasyonunun bozulması, plasental perfüzyonun azalmasına yol açarak kalıcı bir hipoksik ve oksidatif stres ortamı oluşturur. Hipoksi, hücresel apoptozu doğrudan etkiler ve proinflamatuar medyatörlerin anormal salınımı maternal-fetal arayüzdeki homeostazı bozarak plasental disfonksiyonu daha da kötüleştirir⁵. İnflamasyon da PE'nin önemli bir itici gücüdür. PE hastalarının plasentasında ve periferik kanında IL-17, IL-6 ve TNF-α düzeylerinin belirgin şekilde arttığı saptanmıştır⁶. Hipoksi ve inflamasyon birbirini karşılıklı olarak besleyerek sistemik inflamasyonu artıran, endotel hasarına yol açan ve plasental anomalilere katkıda bulunan kısır bir döngü oluşturur. Trofoblast apoptozunu ve inflamatuar yanıtları yöneten temel moleküler ağlar büyük ölçüde bilinmemektedir.

SASH1, bir sinyal adaptörü olarak görev yapan hücre içi iskelet proteinlerin SLy/SASH1 ailesinin bir üyesidir⁷. SASH1, temel olarak CRKL ve PI3K-Akt-mTOR yolu gibi sinyal ortaklarıyla etkileşimler yoluyla epitel-mezenkimal geçişi (EMT), hücre göçünü ve invazyonu inhibe eden bir tümör baskılayıcı olarak tanımlanmıştır^8,9. Tümör baskılayıcı rollerinin ötesinde, yeni kanıtlar SASH1'in inflamatuar sinyalleşme ve bağışıklık düzenlemesinde yer aldığını göstermektedir⁷. Ancak, SASH1'in plasentadaki ekspresyonu ve fonksiyonu, özellikle trofoblast biyolojisi ve PE bağlamında henüz araştırılmamıştır.

Ekzosomlar, önemli hücresel aracılar olarak ortaya çıkmışlardır ve gebelik bağlamında giderek daha fazla incelenmektedirler¹⁰. Ekzosomlar, alıcı hücre fonksiyonunu modüle etmek için proteinler, lipidler ve kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif kargolar taşırlar. Artan kanıtlar, P-EXOS'ların gebelik sırasında immün regülasyonda kritik bir rol oynadığını ve bunların aktivitesinin ve kargosunun PE'de önemli ölçüde değişerek potansiyel olarak inflamatuar durumu şiddetlendirdiğini göstermektedir¹¹. Ekzosomların oksidatif stresin¹² ve anjiyogenezin¹³ düzenlenmesinde de rol oynadığı ve gebelikle ilişkili komplikasyonlarda potansiyel olarak faydalı etkiler gösterdiği belirtilmiştir. Ancak, PE'deki moleküler hedefleri ve etki mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılamamıştır.

SASH1'in PE plasentasında düzensiz olduğu, trofoblast apoptozunun ve inflamatuar yanıtların temel bir sürücüsü olarak işlev gördüğü ve P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu modüle ederek trofoblast hasarına karşı koruyucu etkiler gösterebileceği hipotezi kurulmuştur. Bu hipotezi test etmek için, anahtar aday genleri belirlemek amacıyla birden fazla PE transkriptomik veri seti ve çoklu algoritmalı makine öğrenimi destekli tek hücreli RNA sekanslama verileri entegre edilmiştir. Hipoksi uygulanmış bir HTR-8/SVneo trofoblast hücre modeli ve eksozom tabanlı müdahale deneyleri kullanılarak, SASH1'in trofoblast disfonksiyonundaki fonksiyonel rolü ve P-EXOS'un PE'deki terapötik potansiyeli araştırılmıştır.

Protokol

Etik beyanı

Bu çalışma, Shijiazhuang Dördüncü Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 20200031). Örnek toplama işleminden önce tüm plasenta dokusu donörlerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu protokolde kullanılan reaktiflerin, sarf malzemelerinin, ekipmanların ve yazılımların tam listesi Materyal Tablosunda sunulmuştur.

Veri toplama

RNA-seq verileri GEO veri tabanından elde edilmiştir. Veri setleri arasında, 157 PE plasentası ve 173 non-PE plasentasından gelen gen ekspresyon verilerini içeren GSE75010 (N = 330) bulunmaktadır. GSE10588, 26 normal plasenta ve 17 şiddetli PE plasentasından alınan gen ekspresyon verilerini içermektedir (N = 43). GSE60438, preeklamptik hastalar ve normotansif gebeliklerden alınan decidua basalis'e ait transkriptom profilleme verilerini içermektedir (N = 125). Tek hücreli transkriptom verileri GEO veri seti GSE183338'den elde edilmiştir. Bu veri seti, PE ve sağlıklı gebeliklerin koryonik villus/maternal-fetal ara yüzeyinden alınan tek çekirdekli örnekleri içermektedir.

DEG analizi

PE ile ilişkili DEG'lerin bulunduğu GSE75010, GSE10588 ve GSE60438 veri setleri önce ön işleme tabi tutulmuş ve normalize edilmiştir. Ardından, örnek gruplandırma bilgilerine dayanarak R paketi “limma”¹⁴ kullanılarak diferansiyel analiz gerçekleştirilmiştir. p < 0.05 ve |log2FC| > 0.5 olan genler seçilmiştir. DEG'lerin yanardağ grafikleri (volcano plots) R paketi ggplot2 kullanılarak oluşturulmuştur. En üstteki 20 DEG'nin ısı haritaları R paketi pheatmap kullanılarak çizilmiştir. Sonrasında, üç veri setinden seçilen DEG'lerin kesişimi alınmış ve etkileşim skoru ≥0.15 olacak şekilde STRING çevrimiçi platformu kullanılarak aday genler için bir protein-protein etkileşim (PPI) ağı kurulmuştur. Bu PPI ağındaki en üstteki 20 hub gen, Cytoscape yazılımı kullanılarak sıralanan bağlantı derecelerine göre belirlenmiştir. PPI ağı sonuçları Cytoscape yazılımı veya STRING kullanılarak görselleştirilmiştir.

Zenginleştirme analizi

Gen zenginleştirme analizi, ClusterProfiler ve DOSE paketleri Metascape web sitesi ile kombinasyon halinde kullanılarak gerçekleştirildi. Veritabanları GO ve KEGG'den elde edildi. Zenginleştirme analizi “EnrichGO” fonksiyonu kullanılarak yürütüldü. p < 0.05 değerine sahip yolaklar anlamlı şekilde zenginleşmiş olarak kabul edildi. Zenginleştirme sonuçları “ggplot2” ve “ggpubr” paketleri kullanılarak görselleştirildi.

Makine öğrenimi

PE ile ilişkili, güçlü ve biyolojik olarak anlamlı DEG'leri belirlemek amacıyla, kamuya açık transkriptom veri seti GSE60438 (platform: GPL6884) temel alınarak çok modelli bir makine öğrenimi özellik seçimi analizi gerçekleştirilmiştir. Bu veri seti, sezaryen sırasında pre-eklamptik ve normotansif gebeliklerden toplanan decidua basalis örneklerinin ekspresyon profillerini içermektedir. Ön filtrelenmiş DEG'ler standardize edilmiş ve model yanlılığını azaltmak ve özellik seçiminin stabilitesini artırmak amacıyla ekspresyon matrisi, ilgili klinik gruplandırma bilgileriyle birlikte dört farklı makine öğrenimi algoritması için girdi olarak kullanılmıştır.

Dört algoritma, belirli bir sıra olmaksızın eş zamanlı olarak uygulanmıştır. Regresyon analizi yapmak ve önemli özellik genlerini seçmek için “glmnet” paketi kullanılarak LASSO uygulanmıştır. Kayıp fonksiyonuna, daha az önemli özelliklerin katsayılarını sıfıra indirgeyerek özellik seçimini sağlayan bir L1 regülarizasyon terimi eklenmiştir. Özyinelemeli özellik eleme ile bir destek vektör makinesi oluşturmak için “e1071” paketi kullanılarak SVM-RFE uygulanmıştır. İlk olarak SVM kullanılarak bir sınıflandırıcı eğitilmiş ve en az bilgi veren özellikler, özellik ağırlıklarına göre yinelemeli olarak kaldır 남아larak optimal bir özellik alt kümesi elde edilmiştir. Birden fazla karar ağacı oluşturmak için “xgboost” paketi kullanılarak XGBoost uygulanmıştır. Her ağaç, bir önceki ağacın artıklarını sığdırmış ve nihai tahmini elde etmek için ağırlıklı çıktılar biriktirilmiştir. “randomForest” paketi kullanılarak Boruta uygulanmış ve rastgele orman eğitiminde gerçek özelliklerle yarışan gölge özellikler oluşturulmuştur. Önem değerleri rastgele gürültüden anlamlı derecede yüksek olan özellikler tutulmuştur.

Tek hücreli transkriptom veri analizi

Tek hücreli transkriptom verileri GEO veritabanından elde edilmiş ve ham sayım matrisi GSE183338'den alınmıştır. Sayım matrisi, Seurat paketinin “Read10X” fonksiyonu kullanılarak içe aktarılmış ve dgCMatrix formatına dönüştürülmüştür. Münferit nesneler, “merge” fonksiyonu kullanılarak tek bir toplam nesne altında birleştirilmiş ve hücre etiketleri “RenameCells” ile benzersiz hale getirilmiştir. Düşük kaliteli hücreler şu kriterlere göre filtrelenmiştir: üçten az hücrede ifade edilen genler kaldırılmış ve 200'den az gen ifade eden hücreler hariç tutulmuştur. Kalite kontrolü yapılmış hücreler normalize edilmiş ve yüksek değişkenlik gösteren genler belirlenmiştir. “LogNormalize” (ölçek faktörü = 10.000) kullanılarak küresel ölçeklendirme normalizasyonu uygulanmış, “FindVariableFeatures” kullanılarak yüksek değişkenlik gösteren genler (n = 2.000) seçilmiş ve veriler “ScaleData” ile ölçeklendirilmiştir. Yüksek değişkenlik gösteren özellikler üzerinde temel bileşen analizi gerçekleştirilmiş ve ilk 30 temel bileşen tutulmuştur. Örnekler arasındaki grup etkileri (batch effects) Harmony yöntemi ile düzeltilmiştir. Hücreler UMAP kullanılarak görselleştirilmiş ve boyutları indirgenmiştir. Louvain algoritmasına dayalı olarak “FindNeighbors” ve “FindClusters” kullanılarak paylaşımlı en yakın komşu grafikleri oluşturulmuştur. “FindClusters” fonksiyonundaki çözünürlük (resolution) parametresi 0,1 ile 1 arasında optimize edilmiştir. Kümeleme ağacı “clustree” fonksiyonu ile görselleştirilmiş ve hücre kümelerini tanımlamak için 0,9 çözünürlük seçilmiştir. Olası dubletler Scrublet algoritması kullanılarak kaldırılmıştır. Hücre kümeleri, “FindAllMarkers” fonksiyonu kullanılarakle diferansiyel olarak ifade edilen marker genlerin belirlenmesiyle isimlendirilmiştir. Bonferroni düzeltmesi ile parametrik olmayan Wilcoxon sıra toplamı testi uygulanmıştır. Hücre kimlikleri; yüzey markerları, ilgili literatür ve Hücre Sınıflandırma Veritabanı'na¹⁵ göre atanmıştır.

Hücre kültürü

HTR-8/SVneo trofoblast hücre hattı hücreleri, %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 besiyerinde kültüre edildi. Hipoksik koşullar, hücrelerin 24 saat boyunca %1 O₂, %5 CO₂ ve %94 N₂ ortamında kültüre edilmesiyle oluşturuldu; normoksik kontroller ise %20 O₂ ve %5 CO₂ ortamında tutuldu¹⁶. Tüm hücre kültürü işlemleri, aseptik teknik kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Kültür besiyerleri, transfeksiyon reaktifleri ve hücre atıkları, kurumsal biyogüvenlik kılavuzlarına uygun olarak imha edilmelidir.

Hücre transfeksiyonu

sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ve OE-NC içeren plazmitler sentezlendi. HTR-8/SVneo hücreleri, altı kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda ekildi. Ardından hücreler, üretici talimatlarına uygun olarak bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak kuyucuk başına 2 µg sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 veya OE-NC plazmiti ile transfekte edildi. Kısaca; plazmit DNA ve P3000 Reaktifi Opti-MEM içinde seyreltildi, Opti-MEM içinde ayrı olarak seyreltilen Lipofectamine 3000 ile karıştırıldı, oda sıcaklığında 15 dk inkübe edildi ve %70–80 konfluense ulaşmış hücrelere eklendi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra SASH1 ekspresyonu RT-qPCR ve Western blot ile değerlendirildi. SASH1 nakavt (knockdown) için kullanılan shRNA hedef dizileri Ek Tablo 1'de listelenmiştir.

Gerçek zamanlı kantitatif PCR

Toplam RNA, HTR-8/SVneo hücrelerinden ekstre edildi ve bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak 42 °C'de 30 dk, ardından 85 °C'de 5 dk boyunca cDNA'ya ters transkribe edildi. Real-time kantitatif PCR (qPCR), aşağıdaki döngü koşullarıyla SYBR Green master mix kullanılarak gerçekleştirildi: 95 °C'de 10 dk, ardından 95 °C'de 15 s ve 60 °C'de 1 dk olmak üzere 40 döngü. Rölatif mRNA ekspresyonu, iç referans olarak β-actin kullanılarak ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Bu deneyde kullanılan primer dizileri Ek Tablo 2'de listelenmiştir.

Western blot analizi

Toplam protein, lize tamponu kullanılarak HTR-8/SVneo hücrelerinden ekstre edildi. Hücre lizatları toplandı, buz üzerinde inkübe edildi ve çözünmeyen kalıntıları uzaklaştırmak için 4 °C'de 30 dk boyunca 12,000 × g hızda santrifüj edildi. Protein konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanılarak belirlendi. Eşit miktardaki proteinler (50 µg) SDS-PAGE ile ayrıldı ve ardından PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar %5 yağsız süt ile bloke edildi ve primer antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi. Yıkama işleminin ardından membranlar ilgili sekonder antikorlarla inkübe edildi ve protein bantları gelişmiş bir kemilüminesans tespit sistemi kullanılarak görselleştirildi.

Protein tespiti için primer antikorlar olarak anti-SASH1 ve β-actin kullanıldı. Uygun horseradish peroxidase (HRP)-konjuge sekonder antikorlar —keçi anti-tavşan ve keçi anti-fare— kullanıldı. Eşit protein yüklemesini sağlamak amacıyla internal yükleme kontrolü olarak β-actin kullanıldı. Protein bantlarının yoğunluğu ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü ve nicelendirildi.

P-EXOSların İzolasyonu

P-EXOS, elektif sezaryenle doğum yapan sağlıklı kadınların term plasentalarından elde edilen plasental villöz dokulardan izole edilmiştir. Plasental villöz doku steril PBS ile iyice yıkanmış, yaklaşık 1 mm³ boyutundaki fragmanlar haline getirilmiş ve %10 eksozomdan arındırılmış FBS ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında 37 °C'de, %5 CO₂ altında 48 saat boyunca kültüre edilmiştir. Kondisyonlu ortam, şu şekilde diferansiyel santrifüjasyona tabi tutulmuştur: hücreleri ve doku kalıntılarını uzaklaştırmak için 300 × g'de 10 dakika; hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 2.000 × g'de 20 dakika ve mikrovezikülleri uzaklaştırmak için 10.000 × g'de 30 dakika (tüm işlemler 4 °C'de gerçekleştirilmiştir). Elde edilen süpernatant, eksozomları çöktürmek amacıyla 4 °C'de 120.000 × g'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjlenmiştir. Pelet bir kez PBS ile yıkanmış ve 4 °C'de 120.000 × g'de 70 dakika boyunca tekrar ultrasantrifüjlenmiştir. Nihai pelet PBS içinde yeniden süspanse edilmiştir. İzole edilen eksozomlar, eksozom belirteçleri (PLAP, CD63 ve TSG101; negatif kontrol olarak GM130) için Western blot analizi ile karakterize edilmiş ve morfolojik gözlem için transmisyon elektron mikroskobu ile daha ayrıntılı olarak incelenmiştir.

P-EXOS Hücresel Alım Deneyi

P-EXOS'ların hücresel internalizasyonunu doğrulamak için, eksozomlar üretici protokolüne uygun olarak lipofilik membran boyası PKH67 ile floresan şeklinde işaretlendi. Kısaca, P-EXOS'lar Diluent C içindeki PKH67 (4 µM) ile oda sıcaklığında 5 dk boyunca inkübe edildi ve reaksiyon, eşit hacimde %1 sığır serum albumini (BSA) ile durduruldu. Bağlanmamış boyayı uzaklaştırmak için işaretli eksozomlar ultrasantrifüjle (120,000 × g, 70 dk, 4 °C) yeniden izole edildi. Daha sonra PKH67 ile işaretlenmiş P-EXOS'lar (50 µg/mL), HTR-8/SVneo hücrelerine eklendi ve normoksik veya hipoksik (1% O₂) koşullar altında 24 sa boyunca birlikte inkübe edildi. Hücreler ardından PBS ile üç kez yıkandı, %4 paraformaldehit ile 15 dk boyunca fikse edildi ve çekirdekler DAPI (1 µg/mL) ile karşıt boyandı. PKH67 ile işaretlenmiş eksozomların internalizasyonu, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM; eksitasyon 490 nm, emisyon 502 nm) ile görselleştirildi. Fonksiyonel ko-kültür deneyleri için HTR-8/SVneo hücreleri, hipoksik koşullar (1% O₂) altında 24 sa boyunca, %10 eksozomdan arındırılmış FBS ile takviye edilmiş tam RPMI-1640 besiyerinde 50 µg/mL (protein eşdeğeri) konsantrasyonunda P-EXOS'lar ile muamele edildi.

Enzimle bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA)

Hücre kültürü süpernatanları toplandı ve IL-6, IL-1β ve TNF-α seviyeleri; üretici talimatlarına uygun olarak sırasıyla IL-6 ELISA kiti, IL-1β ELISA kiti ve TNF-α ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. 450 nm'deki absorbans bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü ve gerçek konsantrasyonlar standart eğrilerden hesaplandı.

TdT aracılı dUTP çentik-uç etiketlemesi (TUNEL)

Apoptotik hücreler, üreticinin talimatlarına uygun olarak TUNEL analiz kiti kullanılarak tespit edildi. Kısaca, hücreler oda sıcaklığında 15 dk boyunca %4 paraformaldehit ile fikse edildi, buz üzerinde 5 dk boyunca PBS içinde %0.1 Triton X-100 ile permeabilize edildi ve karanlıkta 37 °C'de 60 dk boyunca TUNEL reaksiyon karışımı ile inkube edildi. Çekirdekler DAPI ile karşıt boyama işlemine tabi tutuldu ve TUNEL-pozitif hücreler floresan mikroskop kullanılarak görselleştirildi; örnek başına rastgele seçilen en az beş alandaki TUNEL-pozitif hücrelerin yüzdesi sayılarak niceliksel olarak belirlendi.

İstatistiksel analiz

Tüm veriler R ve GraphPad Prism kullanılarak analiz edildi. Sürekli değişkenler ortalama ±SD olarak sunulmuştur. İki grup arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile gerçekleştirilirken, çoklu grup karşılaştırmaları tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak yapıldı. Kategorik değişkenler için istatistiksel anlamlılık, Ki-kare testi veya Fisher'ın kesin testi ile değerlendirildi. Aksi belirtilmedikçe, moleküller arasındaki korelasyonlar Spearman korelasyon analizi kullanılarak hesaplandı. Ekzosom karakterizasyon deneyleri, üç bağımsız plasenta donöründen izole edilen P-EXOS kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre bazlı deneyler, farklı pasajlardaki HTR-8/SVneo hücreleri kullanılarak farklı zamanlarda yürütülen bağımsız deneyleri temsil eden üç bağımsız biyolojik tekrar şeklinde yapıldı ve her tekrarda farklı bir plasental donörden izole edilen P-EXOS kullanıldı. p < 0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Sağlıklı ve PE hastalarının transkriptomik analizi

Normal grup ile PE hastaları arasındaki gen ekspresyon farkları için, birleştirilmiş veri setlerindekile diferansiyel ekspresyon R paketi limma kullanılarak analiz edilmiştir. GSE75010 için toplam 89 DEG (p < 0.05 ve |log₂FC| > 0.5); bunlardan 69'u yukarı regüle, 20'si aşağı regüle genlerdir (Şekil 1A). 2.097 diferansiyel eksprese gen bulunmaktadır ve bunların 1.121'i yukarı regüle, 976'sı aşağı regüledir (Şekil 1B). GSE60438 veri seti için 3.371 yukarı regüle ve 4.262 aşağı regüle gen olmak üzere toplam 7.633 DEG mevcuttur (Şekil 1C). Üç veri seti arasındaki DEG sayılarındaki önemli farklar muhtemelen örneklem büyüklüğündeki, doku kaynağındaki (plasental villuslar ile decidua basalis) ve PE şiddet sınıflandırmasındaki farklılıkları yansıtmaktadır; bu durum, sağlam ortak DEG'leri belirlemek için veri setleri arasındaki kesişimin alınmasının değerini daha da vurgulamaktadır.

DEG'lerin fonksiyonel zenginleştirme analizi

PE ile ilişkili temel DEG'lerin sistematik olarak tanımlanması için, GSE75010, GSE10588 ve GSE60438 PE veri setlerinden elde edilen DEG'ler üzerinde Venn analizi yapılmış ve sonuç olarak 56 ortak DEG belirlenmiştir (Şekil 2A). Bu 56 ortak DEG için STRING çevrimiçi platformu kullanılarak bir PPI ağı oluşturulmuş (etkileşim skoru ≥0.15) ve ağ içindeki bağlantı derecelerine göre Cytoscape yazılımı kullanılarak sıralanan en önemli 20 hub gen belirlenmiştir (Şekil 2B). Bu genlere dayanarak; BP, CC ve MF alanlarındaki potansiyel işlevsellikleri araştırmak için GO zenginleştirme analizi de gerçekleştirilmiştir (Şekil 2C). DEG'lerin en çok hormon salgılanması ve transmembran reseptör serin/treonin kinaz sinyallemesinin düzenlenmesi konularında zenginleştiği görülmüştür. Hücresel açıdan genler temel olarak fokal adezyonlar, hücre-substrat bağlantıları ve çeşitli vezikül ve lizozomla ilişkili genlerde lokalize olmuştur. Moleküler fonksiyonlar arasında zenginleşen terimler prolyl hidroksilaz aktivitesi, hormon aktivitesi ve lipidle ilişkili moleküllerin transmembran taşınımıdır. Bu sonuçlar, DEG'lerin plasental hücre sinyalleşmesi, hücre-matriks etkileşimi ve endokrinle ilişkili fonksiyonların sürdürülmesinde önemli roller oynayabileceğini göstermektedir. Aynı zamanda, KEGG yolak zenginleştirmesinin, DEG'lerin en çok sitokin-sitokin reseptör etkileşimi, hücre adezyon molekülü etkileşimi ile TGF-β ve HIF-1 sinyal yolaklarında zenginleştiğini ortaya koyduğu bulunmuştur (Şekil 2D). Belirli virüsle ilişkili terimlerin (örneğin, Hepatit virüsleri, Ebolavirüs) zenginleşmesi, PE ile doğrudan biyolojik bir ilişkiden ziyade, ortak immün-regülatör genlerle olan spesifik olmayan örtüşmeyi yansıtıyor olabilir; bu nedenle yorumlama odağı inflamasyon, adezyon ve hipoksiyle ilgili yolaklarda kalmıştır. Bu yolaklar inflamatuar yanıt, hücre adezyon aracılı ve hipoksiyle ilişkili sinyalleşme ile bağlantılıdır ve plasental mikroçevredeki immün-inflamatuar durumu ve hücre-hücre iletişimini değiştirerek PE progresyonu üzerinde etkili olabilirler.

Makine öğrenimi, PE'de kilit bir gen olarak SASH1'i tanımlıyor

Kilit prognostik genleri belirlemek için özellik seçimi amacıyla dört makine öğrenimi yöntemi uygulanmıştır. Çapraz doğrulama ile yapılan LASSO regresyonu, modelin log(λ.min) = -3.8075 değerinde minimum çapraz doğrulama hatasına ulaştığını göstermiştir. Bu λ değerinde sıfır olmayan katsayılara sahip genler, LASSO tarafından belirlenen kilit özellikler olarak seçilmiştir (Şekil 3A–B). Boruta algoritması, özellik önemini gölge özelliklerle karşılaştırarak değerlendirir. Önem değerleri shadowMax'ten yüksek olan genler "Onaylanmış" (Confirmed) olarak etiketlenmiş ve kilit aday genler olarak kabul edilmiş; önem değerleri shadowMin'den düşük olanlar ise "Reddedilmiş" (Rejected) olarak etiketlenmiş ve anlamlı bir katkısı olmadığı şeklinde değerlendirilmiştir. Bu iki eşik değer arasındaki genler, potansiyel ancak belirsiz bir öneme işaret eden "Geçici" (Tentative) olarak etiketlenmiştir (Şekil 3C). SVM-RFE analizi, 40–50 özellik korunduğunda çapraz doğrulama doğruluğunun en yüksek veya en yüksek seviyeye yakın düzeye ulaştığını göstermiş ve bu özellik ölçeğinde optimal öngörü performansı olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3D). Orta düzeydeki çapraz doğrulama doğruluğu (~0.6), bu veri seti için hiçbir tekil algoritmanın optimal performans sergilemediğini göstermiştir; bu nedenle özellik seçiminin sağlamlığını artırmak için çoklu algoritma kesişim stratejisi benimsenmiştir. XGBoost, Gain değerlerini kullanarak genlerin göreceli önemini nicelleştirmiş ve böylece model öngörüsüne daha yüksek katkı sağlayan özellikleri belirlemiştir (Şekil 3E). Dört yöntemden elde edilen sonuçların Venn kesişim analizi, örtüşen tek genin SASH1 olduğunu belirlemiştir. SASH1, Boruta algoritması tarafından "Geçici" olarak sınıflandırılmış olsa da, diğer üç algoritmanın tamamında tutarlı bir şekilde seçilmiş olması, konsensüs aday geni olarak tanımlanmasını desteklemektedir (Şekil 3F).

Tek hücre analizi

PE plasenta dokularındaki hücresel heterojenite ve moleküler süreçlar incelenmiştir. Hücreler; tespit edilen gen sayısı, RNA sayım sayısı ve mitokondriyal gen ekspresyon yüzdesine göre kalite filtresinden geçirilmiştir. Alt analizler için yüksek kaliteli bir tek hücre örneği elde etmek amacıyla, düşük kaliteli hücreler (200'den az tespit edilen gen veya %20'den fazla mitokondriyal gen içeriğine sahip olanlar) çıkarılmıştır. Kalite kontrol metrikleri ve yüksek değişkenlik gösteren genlerin tanımlanması Ek Şekil 1A–B'de gösterilmiştir. Normalizasyon ve yüksek değişkenlik gösteren genlerin belirlenmesinin ardından, en yüksek 2.000 değişken gen kullanılarak temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirilmiş ve JackStraw analizi ile ElbowPlot analizi kullanılarak anlamlı temel bileşenler belirlenmiştir (Ek Şekil 2A–B).

Temel bileşenlere dayanarak, boyut indirgeme ve denetimsiz kümeleme gerçekleştirmek için tekdüzeli manifold yaklaşıklığı ve projeksiyonu (UMAP) kullanılmış ve tüm hücreler 22 kümeye ayrılmıştır; bu durum, plasenta dokusundaki yüksek hücresel heterojenliği vurgulamaktadır (Şekil 4A). Kümeye özgü belirteç gen ekspresyonu incelenerek ve DEG'ler bir ısı haritasında görselleştirilerek (Şekil 4B), her küme kanonik bir belirtece göre adlandırılmış ve UMAP gömülmesine geri yansıtılmıştır (Şekil 4C). Bu temel plasenta hücre popülasyonlarına dayanarak B hücreleri/plazma hücreleri, endotel hücreler, fibroblastlar/stromal hücreler, makrofajlar/dendritik hücreler, doğal öldürücü hücreler, T hücreleri ve trofoblast hücreleri tanımlanmıştır. Kontrol ve PE grupları arasındaki karşılaştırmalar, birkaç hücre tipinin PE plasentalarında önemli bir göreceli dağılım sergilediğini ortaya koyarak plasenta mikroçevresinin yeniden şekillendiğini göstermektedir (Şekil 4D).

Dokuların kökeni ve hastalık durumu, doku kaynağına (desidüa ve villuslar) ve hastalık gruplandırmasına (kontrol ve PE) göre aynı UMAP gömülmesindeki hücreleri izlemek için kullanılmıştır (Şekil 4E). Hücre sayısı dağılımı doku kökenine göre kısmen ayrışırken, farklı hastalık gruplarından gelen hücreler yüksek düzeyde birbirine bağlıydı. Bu durum, PE'nin tüm transkriptomik yapıyı önemli ölçüde yeniden düzenlemediğini, ancak bireysel hücre popülasyonları veya belirli moleküler özellikler üzerinde etkileri olabileceğini göstermektedir. SASH1 ekspresyonu, plasental hücre popülasyonları arasındaki dağılımını araştırmak için UMAP üzerine eşlenmiştir (Şekil 4F–G). SASH1, desidüal ve villöz hücre popülasyonları arasında belirgin farklarla, güçlü hücre tipiye özgü bir ekspresyon göstermektedir. Farklı hücre tiplerinde PE ve kontrol grupları arasındaki SASH1 ekspresyonunun istatistiksel karşılaştırması (Wilcoxon sıra toplamı testi), birden fazla plasental hücre popülasyonunda anlamlı farklılıklar ortaya çıkarmış ve en belirgin artış PE örneklerinden alınan trofoblast hücrelerinde gözlemlenmiştir (Şekil 4H). Bu bulgu, SASH1 disregülasyonunun özellikle trofoblast kompartmanında belirgin olduğuna dair tek hücre düzeyinde kanıt sağlayarak, sonraki fonksiyonel deneyler için HTR-8/SVneo trofoblast hücre hattının kullanılmasını desteklemektedir.

SASH1 nakavtlaması, hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu ve enflamatuar yanıtları inhibe eder

Biyoenformatik tahminleri doğrulamak için, hipoksik koşullar altında (%1 O₂) PE ile ilişkili bir trofoblast hücre modeli oluşturuldu. SASH1 ekspresyonunu değerlendirmek için qPCR ve Western blot analizleri gerçekleştirildi (Şekil 5A–B). Normoksik HTR-8/SVneo hücrelerle karşılaştırıldığında, hipoksiye maruz bırakılan hücreler belirgin şekilde artmış SASH1 mRNA ve protein ekspresyon düzeyleri göstererek biyoenformatik sonuçların önsel deneysel doğrulamasını sağladı. SASH1 nakavtının PE ile ilişkili patolojik süreçler üzerindeki etkisini değerlendirmek için, hipoksiye maruz bırakılan HTR-8/SVneo hücrelerinde SASH1 susturuldu. Kantitatif PCR ve Western blot analizleri (Şekil 5C–D), tüm sh-SASH1 gruplarında SASH1 ekspresyonunun sh-NC grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldığını gösterdi. Bunlar arasında sh-SASH1#3 en yüksek nakavt verimliliğini sergiledi ve bu nedenle sonraki deneyler için seçildi. TUNEL boyaması ve ELISA üç koşul altında gerçekleştirildi: normoksik kontrol (Normal), negatif kontrol shRNA ile hipoksi (Hypoxia + sh-NC) ve SASH1 nakavtı ile hipoksi (Hypoxia + sh-SASH1). Normal grup ile karşılaştırıldığında, Hypoxia + sh-NC grubu anlamlı düzeyde artmış apoptoz ve yükselmiş pro-enflamatuar sitokinler IL-1β, IL-6 ve TNF-α sekresyonu sergileyerek hipoksi kaynaklı trofoblast hasarını doğruladı. SASH1 nakavtı bu etkileri belirgin şekilde hafifleterek apoptozu (Şekil 5E) ve sitokin düzeylerini (Şekil 5F) Normal grubunkilere yakın seviyelere indirdi; bu durum, SASH1 nakavtının hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu ve enflamatuar yanıtları büyük ölçüde kurtarabileceğini düşündürmektedir. SASH1'in nedensel rolünü daha fazla belirlemek için fonksiyon kazanım deneyleri gerçekleştirildi. qPCR ve Western blot, HTR-8/SVneo hücrelerinde başarılı SASH1 aşırı ekspresyonunu doğruladı (Şekil 5G–H). Normoksik koşullar altında, SASH1 aşırı ekspresyonu (OE-SASH1), OE-NC grubuna kıyasla trofoblast apoptozunu ve pro-enflamatuar sitokin sekresyonunu önemli ölçüde artırarak hipoksi kaynaklı fenotipi yeniden ortaya çıkardı (Şekil 5I–J). Toplu olarak değerlendirildiğinde, fonksiyon kaybı ve kazanımı verileri, SASH1'in trofoblast apoptozunu ve enflamatuar yanıtları tetiklemek için hem gerekli hem de yeterli olduğunu ortaya koyarak, PE ile ilişkili patolojideki nedensel rolünü doğrulamaktadır.

P-EXOS, SASH1'i modüle ederek hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu ve enflamatuar yanıtları baskılar

P-EXOS'un PE'de potansiyel terapötik değere sahip olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada, biyoinformatik analizler SASH1'in eksozomla ilişkili sinyal yolları ile ilişkili olduğunu göstermiş (GO ve KEGG zenginleştirmeleriyle belirtildiği üzere, Şekil 2C–D), bu da bizi P-EXOS'un SASH1'i düzenleyerek PE'de koruyucu bir etki gösterebileceği hipotezine yönlendirmiştir. Fonksiyonel çalışmalardan önce, izole edilen P-EXOS'lar karakterize edilmiştir. Western blot analizi, eksozom marker proteinleri PLAP, CD63 ve TSG101'in varlığını doğrulamış, Golgi markeri GM130'un ise tespit edilemez düzeyde olduğunu göstermiştir; bu durum izole edilen veziküllerin yüksek saflığına işaret etmektedir. Transmisyon elektron mikroskopisi ayrıca tipik çanak şeklinde veziküler yapıları ortaya çıkarmıştır (Şekil 6A–B). P-EXOS'un hedef hücreler tarafından etkili bir şekilde içselleştirilip içselleştirilmediğini doğrulamak için, P-EXOS'un hücresel alımını değerlendirmek amacıyla immunofloresan boyama yapılmıştır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, P-EXOS ilele tedavi edilen HTR-8/SVneo hücreleri, birleştirilmiş görüntülerde belirgin ko-lokalizasyon sinyalleri göstermiş ve bu durum P-EXOS'un HTR-8/SVneo hücreleri tarafından etkili bir şekilde içselleştirildiğini göstermiştir (Şekil 6C).

Ardından, HTR-8/SVneo hücreleri hipoksik koşullar altında P-EXOS ile birlikte kültürlenmiştir. Hem kantitatif PCR hem de Western blot analizleri, P-EXOS ilele tedavi edilen grupta SASH1 mRNA ve protein seviyelerinde kontrollere kıyasla belirgin bir azalma olduğunu göstermiş (Şekil 6D–E), bu da P-EXOS ile SASH1 arasında düzenleyici bir etkileşim olduğuna dair ilk kanıtları sağlamıştır. Bu moleküler değişikliklerle tutarlı olarak, TUNEL boyaması, P-EXOS tedavisinin ardından HTR-8/SVneo hücrelerinde hipoksi kaynaklı apoptozun önemli ölçüde azaldığını ortaya koymuştur (Şekil 6F). Aynı zamanda, ELISA analizleri IL-6, IL-1β ve TNF-α dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokin salınımının belirgin şekilde azaldığını göstermiştir (Şekil 6G).

P-EXOS'un koruyucu etkilerinin mekanistik olarak SASH1 baskılanmasına bağımlı olup olmadığını belirlemek için hipoksik koşullar altında bir kurtarma deneyi gerçekleştirilmiştir. SASH1 aşırı ifade eden hücreler (OE-SASH1 + P-EXOS), negatif kontrol hücreleri (OE-NC + P-EXOS) ile karşılaştırılmıştır. OE-NC + P-EXOS grubuyla karşılaştırıldığında, artan apoptoz (Şekil 6H>) ve yükselen pro-inflamatuar sitokin salgılamasıyla (Şekil 6I>) kanıtlandığı üzere, SASH1 aşırı ifadesi P-EXOS'un koruyucu etkilerini önemli ölçüde ortadan kaldırmıştır. Bu sonuçlar, P-EXOS'un koruyucu etkisinin paralel yollar yerine spesifik olarak SASH1'in baskılanması aracılığıyla gerçekleştiğini göstermekte ve P-EXOS'un PE'deki terapötik potansiyelini vurgulamaktadır.

VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veri setleri halka açıktır ve GSE75010, GSE10588, GSE60438 ve GSE183338 erişim numaraları ile Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanından (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) elde edilmiştir. Hücre tipi anotasyonu, Hücre Sınıflandırma Veri Tabanı (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/) referans alınarak gerçekleştirilmiştir. Kırpılmamış Western blot görüntüleri ve bu çalışmanın bulgularını destekleyen diğer tüm ham deneysel veriler Ek Ham Veriler klasöründe sunulmuştur.

Şekil 1: Üç bağımsız veri setinde PE plasental ve decidual dokularındaki DEG'lerin belirlenmesi. (A) Birleştirilmiş GSE75010 veri setindeki 157 PE plasental örneği ile 173 non-PE plasental örnek arasındaki DEG'lerin volcano grafiği. (B) GSE10588 veri setindeki ağır PE plasental örnekleri (n = 17) ile normal plasental örnekler (n = 26) arasındaki DEG'lerin volcano grafiği. (C) GSE60438 veri setindeki PE decidual örnekler ile normotansif kontrol decidual örnekler arasındaki DEG'lerin volcano grafiği. DEG'ler, p < 0.05 ve |log₂FC| > 0.5 kullanılarak belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Preeklampsi ile ilişkili ortak DEG'lerin fonksiyonel zenginleştirme ve PPI analizi. (A) GSE75010, GSE10588 ve GSE60438 PE ile ilişkili veri setlerinden belirlenen DEG'lerin Venn diyagramı. (B) 56 ortak DEG arasından bağlantı derecesine göre seçilen ve Cytoscape yazılımı kullanılarak sıralanan en üst 20 hub genin PPI ağı (STRING etkileşim skoru ≥0.15). (C) Ortak DEG'lerin GO ve KEGG zenginleştirme analizleri sütun grafikleri olarak sunulmuştur. (D) Ortak DEG'lerin GO ve KEGG zenginleştirme analizleri, koro diyagramları olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Preeklampsi ile ilişkili aday hub genlerin makine öğrenimi tabanlı taranması. (A) Aday genlerin katsayı profillerini gösteren LASSO regresyon analizi. (B) Çapraz doğrulama kullanılarak LASSO regresyonu ile optimal düzenleme parametresinin (λ) seçimi. (C) Boruta algoritması. (D) SVM-RFE analizi. (E) XGBoost algoritması. (F) LASSO, Boruta, SVM-RFE ve XGBoost algoritmaları tarafından belirlenen aday genlerin kesişimini gösteren Venn diyagramı. Kısaltmalar: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tek hücre transkriptomik analizi, preeklampside hücre tipine özgü SASH1 ekspresyon modellerini ortaya koymaktadır. (A) Tek hücre veri setinin UMAP kümelemesi. (B) PE tek hücre transkriptom veri seti GSE183338'in en üst beş marker anotasyon analizi. (C) Hücre alt popülasyonlarının anotasyonu. (D) Kontrol ve PE örneklerindeki hücre oranlarının dağılımını gösteren sütun grafiği. (E) Doku kaynağına (decidua ve villi) ve hastalık durumuna (kontrol ve PE) göre renklendirilmiş UMAP grafiği. (F) Doku kaynağına (decidua ve villi) göre gruplandırılmış plasental hücre popülasyonlarında SASH1 ekspresyonunu gösteren UMAP grafiği. (G) Hastalık durumuna (kontrol ve PE) göre gruplandırılmış plasental hücre popülasyonlarında SASH1 ekspresyonunu gösteren UMAP grafiği. (H) Farklı plasental hücre tipleri arasında SASH1 ekspresyon dağılımını gösteren keman grafiği. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Kısaltmalar: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: SASH1, hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu ve inflamasyonu düzenler. (A) Normal ve hipoksik koşullar altındaki HTR-8/SVneo hücrelerinde SASH1 mRNA ekspresyonunun qPCR analizi ve SASH1 protein seviyelerinin densitometrik kantifikasyonu. (B) (A)'da gösterilen densitometrik verilere karşılık gelen temsili Western blot görüntüleri. (C) sh-NC veya sh-SASH1 konstrüktları (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 ve sh-SASH1#3) ile transfekte edilmiş hipoksi uygulanmış HTR-8/SVneo hücrelerinde SASH1 mRNA ekspresyonunun qPCR analizi ve SASH1 protein seviyelerinin densitometrik kantifikasyonu. (D) (C)'de gösterilen densitometrik verilere karşılık gelen temsili Western blot görüntüleri. (E) Normal, Hipoksi + sh-NC ve Hipoksi + sh-SASH1(#3) gruplarındaki HTR-8/SVneo hücrelerinin TUNEL boyaması. Ölçek çubuğu = 20 µm. (F) Normal, Hipoksi + sh-NC ve Hipoksi + sh-SASH1(#3) gruplarında inflamatuar sitokinlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ELISA analizi. (G) OE-NC veya OE-SASH1 konstrüktları ile transfekte edilmiş HTR-8/SVneo hücrelerinde SASH1 mRNA ekspresyonunun qPCR analizi ve SASH1 protein seviyelerinin densitometrik kantifikasyonu. (H) (G)'de gösterilen densitometrik verilere karşılık gelen temsili Western blot görüntüleri. (I) Normal + OE-NC ve Normal + OE-SASH1 gruplarındaki HTR-8/SVneo hücrelerinin TUNEL boyaması. Ölçek çubuğu = 20 µm. (J) Normal + OE-NC ve Normal + OE-SASH1 gruplarında inflamatuar sitokinlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ELISA analizi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Veriler, üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: P-EXOS, SASH1'in baskılanması yoluyla hipoksi kaynaklı trofoblast hasarını hafifletir. (A) GM130'un negatif kontrol olarak kullanıldığı, P-EXOS marker proteinleri PLAP, CD63 ve TSG101'in Western blot analizi. (B) P-EXOS morfolojisinin transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) analizi. Ölçek çubuğu = 1.0 µm. (C) HTR-8/SVneo hücrelerinde (kırmızı) PKH67 ile işaretlenmiş P-EXOS'ların (yeşil) alınmasını gösteren konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Ölçek çubuğu = 20 µm. (D) Kontrol ve P-EXOS gruplarındaki HTR-8/SVneo hücrelerinde SASH1 mRNA ekspresyonunun qPCR analizi ve SASH1 protein seviyelerinin densitometrik kantifikasyonu. (E) (D)'de gösterilen densitometrik verilere karşılık gelen temsili Western blot görüntüleri. (F) Kontrol ve P-EXOS gruplarındaki HTR-8/SVneo hücrelerinin TUNEL boyaması. Ölçek çubuğu = 20 µm. (G) Kontrol ve P-EXOS gruplarındaki hipoksiye maruz bırakılmış HTR-8/SVneo hücrelerinde inflamatuar sitokinlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ELISA analizi. (H) OE-NC + P-EXOS ve OE-SASH1 + P-EXOS gruplarındaki HTR-8/SVneo hücrelerinin TUNEL boyaması. Ölçek çubuğu = 20 µm. (I) OE-NC + P-EXOS ve OE-SASH1 + P-EXOS gruplarındaki hipoksiye maruz bırakılmış HTR-8/SVneo hücrelerinde inflamatuar sitokinlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ELISA analizi. Kısaltmalar: P-EXOS = plasenta kaynaklı ekzosomlar; TEM = transmisyon elektron mikroskopisi; PLAP = plasental alkalen fosfataz; TSG101 = tümör duyarlılık geni 101. *p < 0.05; **p < 0.01. Veriler, üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) ortalama ±SD olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Tek hücreli RNA-seq verilerinin kalite kontrolü. (A) Kalite kontrolü sonrası gen ekspresyon seviyelerinin keman grafiği (violin plot). (B) Kalite kontrolü sonrası belirlenen yüksek değişkenli genleri gösteren değişken özellik grafiği.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Tek hücreli kümeleme için istatistiksel olarak anlamlı temel bileşenlerin belirlenmesi. (A) İstatistiksel olarak anlamlı temel bileşenleri belirlemek için kullanılan JackStraw nokta grafiği. (B) Temel bileşenler tarafından açıklanan varyansı gösteren dirsek (elbow) nokta grafiği.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: SASH1 nakavt için kullanılan shRNA hedef dizileri. Gen susturma için kullanılan negatif kontrol (sh-NC) ve üç SASH1 hedefli konstrüktün (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 ve sh-SASH1#3) shRNA hedef dizileri (5′–3′).Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Kantitatif PCR için kullanılan primer dizileri. qPCR analizinde SASH1 ve β-actin (iç referans kontrol) için kullanılan ileri ve geri primer dizileri (5′–3′).Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, PE için hedefli tedavilerin henüz mevcut olmadığı göz önüne alındığında özellikle anlamlı olan entegre transkriptomik analiz, tek hücreli sekanslama ve çoklu algoritmalı makine öğrenimi yaklaşımı aracılığıyla, SASH1'in PE'de düzensizliği saptanan kilit bir gen olduğu belirlenmiştir¹⁷. SASH1'in hipoksik trofoblast hücrelerinde anlamlı düzeyde artış gösterdiği ve tek hücre çözünürlüğünde PE plasentalarının trofoblast kompartmanında spesifik olarak yükseldiği gösterilmiştir. Fonksiyon kaybı ve kazanımı deneyleri aracılığıyla, SASH1'in trofoblast apoptozunu ve pro-inflamatuar sitokin salgılanmasını tetiklemek için hem gerekli hem de yeterli olduğu saptanmıştır. Ayrıca, P-EXOS tedavisi hipoksi kaynaklı trofoblast hasarını hafifletmiş ve bu koruyucu etki SASH1 aşırı ekspresyonu ile ortadan kalkmıştır; bu durum, P-EXOS aracılı sitoproteksiyonun mekanistik olarak SASH1 baskılanmasına bağımlı olduğunu doğrulamıştır.

Ayrıca, PE'de B hücreleri/plazma hücreleri, endotelyal hücreler, fibroblastlar/stromal hücreler, makrofajlar/dendritik hücreler, NK hücreleri, T hücreleri ve trofoblast hücreleri dahil olmak üzere birden fazla plasental hücre tipinin oranlarında değişiklikler gözlemlenmiştir. Bu bulgular, PE sırasında plasental mikroçevrenin önemli bir yeniden yapılanma sürecinden geçtiğini göstermektedir. Böyle bir inflamatuar mikroçevre, yalnızca trofoblast disfonksiyonunu şiddetlendirmekle kalmaz, aynı zamanda immün-hücre dışı matris etkileşimleri yoluyla hastalık ilerlemesini hızlandırabilir¹⁸. Dahası, nötrofil hücre dışı tuzaklarının (NETs) yakın zamanda PE'de plasental inflamasyonu şiddetlendirmede rol oynadığı belirtilmiştir¹⁹. SASH1'in, inflamatuar sinyalizasyon, hücre yapışması ve hipoksiyle ilişkili süreçlerdeki rolü aracılığıyla PE gelişiminde önemli bir görev üstlendiğine inanılmaktadır. Bu çalışmada, PE hastalarının ve normotansif gebeliklerin plasenta örneklerinden limma paketi kullanılarak gen ekspresyon profilleri çıkarılmış; özellik seçimi için LASSO regresyonu, SVM-RFE, XGBoost ve Boruta gibi birden fazla makine öğrenimi algoritması kullanılmıştır. Tüm algoritmalar genelinde SASH1, tutarlı bir konsensüs aday gen olarak ortaya çıkmıştır. Tek hücre düzeyinde SASH1, çeşitli plasental hücre popülasyonlarında hücre tipine özgü ekspresyon göstermiş ve PE örneklerinde yüksek ekspresyonunu korumuştur; en belirgin farkın trofoblast hücrelerinde gözlemlenmesi, SASH1'in farklı plasental hücre bağlamlarında farklı fonksiyonel etkiler gösterebileceğini düşündürmektedir.

SASH1; hücre göçü ve invazyonu, epitelyal-mezenşimal geçiş ve strese yanıt veren sinyal düzenlemesi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde yer aldığı raporlanmış bir sinyal adaptör proteinidir^8,9. SASH1'in PE ile ilişkili patolojideki fonksiyonel rolünü araştırmak için, HTR-8/SVneo hücreleri kullanılarak hipoksi kaynaklı bir trofoblast modeli oluşturulmuştur. Sonuçlarımız, hipoksik maruziyetin SASH1 ekspresyonunu anlamlı şekilde artırdığını, SASH1 nakavtunun (knockdown) ise hipoksi kaynaklı apoptozu belirgin şekilde hafiflettiğini ve IL-1β, IL-6 ve TNF-α dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin salınımını azalttığını göstermiştir. Tersine, normoksik koşullar altında SASH1'in aşırı ekspresyonu, hipoksi kaynaklı fenotipi yeniden oluşturmak için yeterli olmuş ve SASH1'in trofoblast hasarını tetiklemedeki nedensel rolü ortaya konmuştur. Bu bulgular, SASH1'in inflamatuar yanıtları modüle ederek trofoblast fonksiyonel durumunu negatif yönde düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Trofoblastların plasental inflamatuar medyatörlerin ana kaynağını oluşturduğu göz önüne alındığında²⁰, anormal SASH1 ekspresyonu, PE'de inflamasyon amplifikasyonu için kritik bir moleküler temel teşkil edebilir. Özellikle, trofoblast hücrelerinde gözlenen SASH1'in pro-apoptotik ve pro-inflamatuar fonksiyonları, genellikle EMT ve göçü inhibe ettiği kanser hücrelerindeki kanonik tümör baskılayıcı rolüyle tezat oluşturmaktadır^8,9. Bu bağlama bağlı fonksiyonel ikilik, SASH1 ile etkileşime giren partnerlerde ve aşağı akış (downstream) sinyal ağlarında hücre tipine özgü farklılıkları yansıtıyor olabilir ve daha detaylı araştırılmayı gerektirmektedir.

Ekzozomlar, hücreler arası iletişimin önemli aracıları olarak kabul edilmektedir ve preeklampsinin (PE) patogenezinde rol oynadıkları belirtilmiştir²¹. Özellikle, P-EXOS'lar, normal gebelik sırasında maternal-fetal immün toleransın sürdürülmesi gibi, PE'ye karşı koruma sağlayabilecek immün regülasyonda önemli bir rol oynayabilir²². Bu çalışmada, biyoinformatik analizler SASH1 ile ekzozomla ilişkili sinyal yolları arasında bir ilişki olduğunu ortaya koymuş ve P-EXOS'ların trofoblast fonksiyonlarını düzenlemedeki rolü üzerine daha fazla araştırma yapılmasını sağlamıştır. Ko-kültür deneyleri, P-EXOS tedavisinin hipoksi uygulanmış trofoblast hücrelerinde SASH1 mRNA ve protein seviyelerini önemli ölçüde azalttığını ve hipoksi kaynaklı apoptozu ve inflamatuar yanıtları belirgin şekilde hafiflettiğini göstermiştir. Önemli bir bulgu olarak, SASH1 aşırı ekspresyonu bu koruyucu etkileri ortadan kaldırmış ve P-EXOS aracılı sitoproteksiyonun, paralel yollar üzerinden değil, mekanik olarak SASH1 supresyonuna bağımlı olduğunu doğrulamıştır.

P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu baskılama mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır. P-EXOS'ların, alıcı hücrelerde gen ekspresyonunu modüle edebilen mikroRNA'lar, proteinler ve lipidler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif kargolar taşıdıkları bilinmektedir¹⁰. Bir olasılık, P-EXOS'ların SASH1'i doğrudan veya dolaylı olarak hedefleyen spesifik miRNA'lar taşıyor olmasıdır. Alternatif olarak, P-EXOS'lar NF-κB veya PI3K-Akt gibi SASH1 transkripsiyonel düzenlemesinde birleşen üst sinyal yolaklarını modüle edebilir. SASH1'in kanser hücrelerindeki PI3K-Akt-mTOR yolağına dahil olduğu göz önüne alındığında⁸, bu aksın ekzozom aracılı modülasyonunun trofoblast hücrelerinde SASH1 downregülasyonuna katkıda bulunması muhtemeldir. P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu düzenlediği kesin moleküler kaskadı çözümlemek için ekzozomal kargo sekanslama ve yolak spesifik inhibitörlerin kullanılacağı gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.

Bu çalışmada, PE'deki plasental dokudaki moleküler değişiklikleri araştırmak için transkriptomik profilleme, tek hücreli RNA dizileme ile entegre edilmiştir. SASH1'in hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozu ve inflamatuar yanıtlarda kilit bir rol oynadığı ve P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu baskılayarak koruyucu bir etki gösterebileceği gösterilmiş olup; bu durum PE'nin temelindeki moleküler mekanizmalara dair yeni bakış açıları sunmakta ve potansiyel bir terapötik strateji önermektedir. Bununla birlikte, bu çalışmanın birkaç kısıtlaması bulunmaktadır. Birincisi, fonksiyonel bulgular öncelikle HTR-8/SVneo ölümsüzleştirilmiş trofoblast hücre hattından elde edilmiştir; primer trofoblast hücrelerinde doğrulama yapılması gereklidir. İkincisi, SASH1 protein ekspresyonu klinik PE plasental dokularında immünohistokimya ile doğrulanmamıştır, bu durum bulguların translasyonel yorumlanmasını sınırlamakta olup gelecek çalışmalarda ele alınmalıdır. Üçüncüsü, SVM-RFE sınıflandırıcısı orta düzeyde bir çapraz doğrulama doğruluğu (~0,6) göstermiştir ki bu durum veri setinin doğal heterojenliğini yansıtmaktadır; daha sağlam tanı modelleri geliştirmek için daha büyük bağımsız kohortlar gerekecektir. Dördüncüsü, P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu baskıladığı kesin moleküler mekanizma henüz belirsizdir. Beşincisi, SASH1 Western blot saptamasında, suboptimal antikor özgüllüğünden kaynaklanabilecek spesifik olmayan boyama bantları gözlemlenmiştir. Bu deneyde kullanılan antikor poliklonal bir antikordur ve poliklonal antikorlar genellikle immünosaptamada monoklonal antikorlara kıyasla daha düşük özgüllük sergiler. Yine de, bu spesifik olmayan bantlar SASH1 protein bulgularını veya bu çalışmanın sonuçlarını etkilememektedir. P-EXOS-SASH1 ekseninin PE'deki fonksiyonel rolünü daha ayrıntılı açıklığa kavuşturmak ve translasyonel potansiyelini değerlendirmek için in vivo deneyleri, klinik örnek analizlerini ve ekzozomal kargo karakterizasyonunu içeren gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPMI-1640 Besiyeri	Gibco	11875085
Fetal Bovin Serum (FBS)	Gibco	16140071
Eksozomdan arındırılmış FBS	System Biosciences	EXO-FBS-50A-1
Penisilin/Streptomisin	Thermo Fisher Scientific, CN	15140122
Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktanı (P3000 Reaktanı ile birlikte)	Thermo Fisher Scientific, CN	L3000150
Opti-MEM Düşük Serumlu Besiyeri	Thermo Fisher Scientific, CN	31985070
SASH1 shRNA plazmidi (HuSH)	origene	TL301836
SASH1 ORF ekspresyon plazmidi	origene	RC218866
Boş vektör kontrolü	origene	PS100001
Ters Transkripsiyon Kiti	Thermo Fisher Scientific, CN	4368814
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific, CN	A46110
SASH1 primerleri	Sangon Biotech	Özel sentezleme
β-aktin primerleri	Sangon Biotech	Özel sentezleme
Hücre Lizis Tamponu	Beyotime	P0013B
NanoDrop Spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific, CN	NanoDrop Ultra
PVDF Membran	Thermo Fisher Scientific, CN	88518
Anti-SASH1 Antikoru	ABclonal	A15248
Anti-β-aktin Antikoru	Abcam	ab6276
HRP-konjuge Keçi Anti-Tavşan/Anti-Fare Sekonder Antikoru	Beyotime	A0208
ImageJ Yazılımı	NIH (kamu malı)	ImageJ
PKH67 Yeşil Floresan Hücre Bağlayıcı Kit (Dilüent C dahil)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	MINI67
Bovin Serum Albümin (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	10711454001
DAPI	Beyotime	C1002
Konfokal Lazer Taramalı Mikroskop (CLSM)	Leica	Leica TCS SP8
İnsan IL-6 Quantikine ELISA Kiti	R&D Systems	D6050B
İnsan IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY201
İnsan TNF-α Quantikine ELISA Kiti	R&D Systems	DTA00D
Mikroplaka Okuyucu	Thermo Scientific	Multiskan FC
In Situ Hücre Ölümü Tespit Kiti (TUNEL Analiz Kiti)	Roche	11684795910
Triton X-100	Beyotime	P0096
Paraformaldehit (%4)	Beyotime	P0099
Floresan Mikroskop	Olympus	BX53
Soğutmalı Santrifüj (12,000 × g kapasiteli)	Eppendorf	Eppendorf 5430 R
Ultrasantrifüj (120,000 × g kapasiteli)	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
R Yazılımı	The R Foundation	v4.2.1
GraphPad Prism	GraphPad Software	v10.0
Seurat (R paketi)	Satija Lab (açık kaynak)	v4.0.4
Harmony (R paketi, lot düzeltme)	Açık kaynak	v1.2.0
Scrublet (Python paketi, dublet tespiti)	Açık kaynak	v0.2.3
clustree (R paketi)	Açık kaynak	v0.5.1
glmnet (R paketi, LASSO)	Açık kaynak	v4.1.8
e1071 (R paketi, SVM-RFE)	Açık kaynak	v1.7-14
xgboost (R paketi)	Açık kaynak	v1.7.7.1
randomForest (R paketi, Boruta)	Açık kaynak	v4.7-1.1
Gene Expression Omnibus (GEO) Veritabanı	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
STRING Veritabanı	string-db.org	https://www.string-db.org/
Metascape	metascape.org	https://metascape.org/
Cytoscape Yazılımı	Cytoscape Consortium	v3.10.4
ggplot2 (R paketi)	Açık kaynak	v3.5.1
limma (R paketi)	Açık kaynak	v3.58.1
pheatmap (R paketi)	Açık kaynak	v1.0.12
ClusterProfiler (R paketi)	Açık kaynak	v4.8.3
DOSE (R paketi)	Açık kaynak	v3.28.2
ggpubr (R paketi)	Açık kaynak	v0.6.0