Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
SAM ve SH3 domaini içeren protein 1 (SASH1), preeklampside (PE) trofoblast apoptozu ve inflamasyonun temel bir düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. Plasenta kaynaklı ekzozomlar (P-EXOS), SASH1 ekspresyonunu baskılayarak hipoksi kaynaklı hasarı hafifletir. Bu bulgular, PE patogenezinin altında yatan yeni bir mekanizmayı ortaya çıkarmakta ve SASH1'in potansiyel bir terapötik hedef olduğunu önermektedir.
SASH1, hücre büyümesi, apoptoz ve bağışıklık düzenlemesinde rol oynayan bir sinyal adaptör proteinidir ve tümör ile bağışıklık hücrelerinde giderek daha fazla çalışılmaktadır. Ortaya çıkan kanıtlar, SASH1'in PE gelişimi ile yakından ilişkili olan süreçler olan inflamatuar yanıtlar ve hücresel homeostazda önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, SASH1'in PE'deki trofoblast apoptozuna ve inflamatuar yanıtlara katkıda bulunup bulunmadığını ve P-EXOS'un SASH1 düzenlemesi yoluyla koruyucu etkiler gösterip göstermediğini belirlemeyi amaçlamıştır. Bu çalışmada, ortak farklı şekilde eksprese edilen genleri (DEG'ler) belirlemek için üç PE ile ilişkili transkriptomik veri seti (GSE75010, GSE10588 ve GSE60438) analiz edilmiş, ardından Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yapılmıştır. Temel aday genleri taramak için makine öğrenimi algoritmaları uygulanmış ve plasenta dokusundaki hücresel heterojenliği karakterize etmek ve hücre tipine özgü ekspresyon modellerini belirlemek için tek hücreli RNA dizileme verileri kullanılmıştır. SASH1, konsensüs aday gen olarak tanımlanmış ve PE örneklerinden alınan trofoblast hücrelerinde anlamlı şekilde yukarı regüle edilmiştir. In vitro, hipoksi uygulanan bir HTR-8/SVneo trofoblast hücre modeli oluşturulmuş ve bu model SASH1 nakavtı, SASH1 aşırı ekspresyonu ve P-EXOS ile ko-kültür ile birleştirilmiştir. Fonksiyonel deneyler, SASH1 nakavtının hipoksi kaynaklı trofoblast apoptozunu anlamlı şekilde baskıladığını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin sekresyonunu azalttığını; buna karşın SASH1 aşırı ekspresyonunun apoptozu ve inflamatuar yanıtları teşvik ettiğini göstermiştir. Ek olarak, P-EXOS tedavisi, SASH1 ekspresyonunu hem mRNA hem de protein seviyelerinde belirgin şekilde azaltmış ve hipoksi kaynaklı trofoblast hasarını hafifletmiş; ancak SASH1 aşırı ekspresyonu bu koruyucu etkileri büyük ölçüde ortadan kaldırmıştır. Bir bütün olarak bu bulgular, SASH1'in PE'deki trofoblast apoptozunda ve inflamatuar yanıtlarda kritik bir rol oynadığını göstermektedir. P-EXOS, SASH1 ekspresyonunu baskılayarak hipoksi kaynaklı trofoblastik hasarı hafifletebilir ve böylece PE için moleküler mekanizmalara ve potansiyel terapötik hedeflere dair yeni bakış açıları sunabilir.
PE, genellikle gebeliğin 20. haftasından sonra ortaya çıkan ve klinik olarak hipertansiyon, proteinüri ve çoklu organ disfonksiyonu ile karakterize, gebeliğe özgü multisistemik bir bozukluktur. Dünya genelinde maternal ve perinatal morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir1. Klinik yönetimdeki sürekli ilerlemelere rağmen, PE'nin kesin tedavisi hâlâ plasentanın doğurtulmasıdır; bu durum, patogenezin henüz tam olarak anlaşılamadığını ve yeni moleküler ve hücresel mekanizmaların yanı sıra potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yönelik acil ihtiyacı vurgulamaktadır2,3.
Yeterli trofoblast invazyonu ve normal plasental gelişimin desteklenmesi, PE patogenezinin temelini oluşturan kritik mekanizmalardır4. Normal gebelik sırasında trofoblast hücreleri, düşük dirençli ve yüksek kapasiteli bir dolaşım kurmak için uterus decidua'sını istila eder ve spiral arterleri yeniden şekillendirir. Trofoblast hücrelerinin invazyon ve migrasyonunun bozulması, plasental perfüzyonun azalmasına yol açarak kalıcı bir hipoksik ve oksidatif stres ortamı oluşturur. Hipoksi, hücresel apoptozu doğrudan etkiler ve proinflamatuar medyatörlerin anormal salınımı maternal-fetal arayüzdeki homeostazı bozarak plasental disfonksiyonu daha da kötüleştirir5. İnflamasyon da PE'nin önemli bir itici gücüdür. PE hastalarının plasentasında ve periferik kanında IL-17, IL-6 ve TNF-α düzeylerinin belirgin şekilde arttığı saptanmıştır6. Hipoksi ve inflamasyon birbirini karşılıklı olarak besleyerek sistemik inflamasyonu artıran, endotel hasarına yol açan ve plasental anomalilere katkıda bulunan kısır bir döngü oluşturur. Trofoblast apoptozunu ve inflamatuar yanıtları yöneten temel moleküler ağlar büyük ölçüde bilinmemektedir.
SASH1, bir sinyal adaptörü olarak görev yapan hücre içi iskelet proteinlerin SLy/SASH1 ailesinin bir üyesidir7. SASH1, temel olarak CRKL ve PI3K-Akt-mTOR yolu gibi sinyal ortaklarıyla etkileşimler yoluyla epitel-mezenkimal geçişi (EMT), hücre göçünü ve invazyonu inhibe eden bir tümör baskılayıcı olarak tanımlanmıştır8,9. Tümör baskılayıcı rollerinin ötesinde, yeni kanıtlar SASH1'in inflamatuar sinyalleşme ve bağışıklık düzenlemesinde yer aldığını göstermektedir7. Ancak, SASH1'in plasentadaki ekspresyonu ve fonksiyonu, özellikle trofoblast biyolojisi ve PE bağlamında henüz araştırılmamıştır.
Ekzosomlar, önemli hücresel aracılar olarak ortaya çıkmışlardır ve gebelik bağlamında giderek daha fazla incelenmektedirler10. Ekzosomlar, alıcı hücre fonksiyonunu modüle etmek için proteinler, lipidler ve kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif kargolar taşırlar. Artan kanıtlar, P-EXOS'ların gebelik sırasında immün regülasyonda kritik bir rol oynadığını ve bunların aktivitesinin ve kargosunun PE'de önemli ölçüde değişerek potansiyel olarak inflamatuar durumu şiddetlendirdiğini göstermektedir11. Ekzosomların oksidatif stresin12 ve anjiyogenezin13 düzenlenmesinde de rol oynadığı ve gebelikle ilişkili komplikasyonlarda potansiyel olarak faydalı etkiler gösterdiği belirtilmiştir. Ancak, PE'deki moleküler hedefleri ve etki mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılamamıştır.
SASH1'in PE plasentasında düzensiz olduğu, trofoblast apoptozunun ve inflamatuar yanıtların temel bir sürücüsü olarak işlev gördüğü ve P-EXOS'un SASH1 ekspresyonunu modüle ederek trofoblast hasarına karşı koruyucu etkiler gösterebileceği hipotezi kurulmuştur. Bu hipotezi test etmek için, anahtar aday genleri belirlemek amacıyla birden fazla PE transkriptomik veri seti ve çoklu algoritmalı makine öğrenimi destekli tek hücreli RNA sekanslama verileri entegre edilmiştir. Hipoksi uygulanmış bir HTR-8/SVneo trofoblast hücre modeli ve eksozom tabanlı müdahale deneyleri kullanılarak, SASH1'in trofoblast disfonksiyonundaki fonksiyonel rolü ve P-EXOS'un PE'deki terapötik potansiyeli araştırılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Etik beyanı
Bu çalışma, Shijiazhuang Dördüncü Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 20200031). Örnek toplama işleminden önce tüm plasenta dokusu donörlerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu protokolde kullanılan reaktiflerin, sarf malzemelerinin, ekipmanların ve yazılımların tam listesi Materyal Tablosunda sunulmuştur.
Veri toplama
RNA-seq verileri GEO veri tabanından elde edilmiştir. Veri setleri arasında, 157 PE plasentası ve 173 non-PE plasentasından gelen gen ekspresyon verilerini içeren GSE75010 (N = 330) bulunmaktadır. GSE10588, 26 normal plasenta ve 17 şiddetli PE plasentasından alınan gen ekspresyon verilerini içermektedir (N = 43). GSE60438, preeklamptik hastalar ve normotansif gebeliklerden alınan decidua basalis'e ait transkriptom profilleme verilerini içermektedir (N = 125). Tek hücreli transkriptom verileri GEO veri seti GSE183338'den elde edilmiştir. Bu veri seti, PE ve sağlıklı gebeliklerin koryonik villus/maternal-fetal ara yüzeyinden alınan tek çekirdekli örnekleri içermektedir.
DEG analizi
PE ile ilişkili DEG'lerin bulunduğu GSE75010, GSE10588 ve GSE60438 veri setleri önce ön işleme tabi tutulmuş ve normalize edilmiştir. Ardından, örnek gruplandırma bilgilerine dayanarak R paketi “limma”14 kullanılarak diferansiyel analiz gerçekleştirilmiştir. p < 0.05 ve |log2FC| > 0.5 olan genler seçilmiştir. DEG'lerin yanardağ grafikleri (volcano plots) R paketi ggplot2 kullanılarak oluşturulmuştur. En üstteki 20 DEG'nin ısı haritaları R paketi pheatmap kullanılarak çizilmiştir. Sonrasında, üç veri setinden seçilen DEG'lerin kesişimi alınmış ve etkileşim skoru ≥0.15 olacak şekilde STRING çevrimiçi platformu kullanılarak aday genler için bir protein-protein etkileşim (PPI) ağı kurulmuştur. Bu PPI ağındaki en üstteki 20 hub gen, Cytoscape yazılımı kullanılarak sıralanan bağlantı derecelerine göre belirlenmiştir. PPI ağı sonuçları Cytoscape yazılımı veya STRING kullanılarak görselleştirilmiştir.
Zenginleştirme analizi
Gen zenginleştirme analizi, ClusterProfiler ve DOSE paketleri Metascape web sitesi ile kombinasyon halinde kullanılarak gerçekleştirildi. Veritabanları GO ve KEGG'den elde edildi. Zenginleştirme analizi “EnrichGO” fonksiyonu kullanılarak yürütüldü. p < 0.05 değerine sahip yolaklar anlamlı şekilde zenginleşmiş olarak kabul edildi. Zenginleştirme sonuçları “ggplot2” ve “ggpubr” paketleri kullanılarak görselleştirildi.
Makine öğrenimi
PE ile ilişkili, güçlü ve biyolojik olarak anlamlı DEG'leri belirlemek amacıyla, kamuya açık transkriptom veri seti GSE60438 (platform: GPL6884) temel alınarak çok modelli bir makine öğrenimi özellik seçimi analizi gerçekleştirilmiştir. Bu veri seti, sezaryen sırasında pre-eklamptik ve normotansif gebeliklerden toplanan decidua basalis örneklerinin ekspresyon profillerini içermektedir. Ön filtrelenmiş DEG'ler standardize edilmiş ve model yanlılığını azaltmak ve özellik seçiminin stabilitesini artırmak amacıyla ekspresyon matrisi, ilgili klinik gruplandırma bilgileriyle birlikte dört farklı makine öğrenimi algoritması için girdi olarak kullanılmıştır.
Dört algoritma, belirli bir sıra olmaksızın eş zamanlı olarak uygulanmıştır. Regresyon analizi yapmak ve önemli özellik genlerini seçmek için “glmnet” paketi kullanılarak LASSO uygulanmıştır. Kayıp fonksiyonuna, daha az önemli özelliklerin katsayılarını sıfıra indirgeyerek özellik seçimini sağlayan bir L1 regülarizasyon terimi eklenmiştir. Özyinelemeli özellik eleme ile bir destek vektör makinesi oluşturmak için “e1071” paketi kullanılarak SVM-RFE uygulanmıştır. İlk olarak SVM kullanılarak bir sınıflandırıcı eğitilmiş ve en az bilgi veren özellikler, özellik ağırlıklarına göre yinelemeli olarak kaldır 남아larak optimal bir özellik alt kümesi elde edilmiştir. Birden fazla karar ağacı oluşturmak için “xgboost” paketi kullanılarak XGBoost uygulanmıştır. Her ağaç, bir önceki ağacın artıklarını sığdırmış ve nihai tahmini elde etmek için ağırlıklı çıktılar biriktirilmiştir. “randomForest” paketi kullanılarak Boruta uygulanmış ve rastgele orman eğitiminde gerçek özelliklerle yarışan gölge özellikler oluşturulmuştur. Önem değerleri rastgele gürültüden anlamlı derecede yüksek olan özellikler tutulmuştur.
Tek hücreli transkriptom veri analizi
Tek hücreli transkriptom verileri GEO veritabanından elde edilmiş ve ham sayım matrisi GSE183338'den alınmıştır. Sayım matrisi, Seurat paketinin “Read10X” fonksiyonu kullanılarak içe aktarılmış ve dgCMatrix formatına dönüştürülmüştür. Münferit nesneler, “merge” fonksiyonu kullanılarak tek bir toplam nesne altında birleştirilmiş ve hücre etiketleri “RenameCells” ile benzersiz hale getirilmiştir. Düşük kaliteli hücreler şu kriterlere göre filtrelenmiştir: üçten az hücrede ifade edilen genler kaldırılmış ve 200'den az gen ifade eden hücreler hariç tutulmuştur. Kalite kontrolü yapılmış hücreler normalize edilmiş ve yüksek değişkenlik gösteren genler belirlenmiştir. “LogNormalize” (ölçek faktörü = 10.000) kullanılarak küresel ölçeklendirme normalizasyonu uygulanmış, “FindVariableFeatures” kullanılarak yüksek değişkenlik gösteren genler (n = 2.000) seçilmiş ve veriler “ScaleData” ile ölçeklendirilmiştir. Yüksek değişkenlik gösteren özellikler üzerinde temel bileşen analizi gerçekleştirilmiş ve ilk 30 temel bileşen tutulmuştur. Örnekler arasındaki grup etkileri (batch effects) Harmony yöntemi ile düzeltilmiştir. Hücreler UMAP kullanılarak görselleştirilmiş ve boyutları indirgenmiştir. Louvain algoritmasına dayalı olarak “FindNeighbors” ve “FindClusters” kullanılarak paylaşımlı en yakın komşu grafikleri oluşturulmuştur. “FindClusters” fonksiyonundaki çözünürlük (resolution) parametresi 0,1 ile 1 arasında optimize edilmiştir. Kümeleme ağacı “clustree” fonksiyonu ile görselleştirilmiş ve hücre kümelerini tanımlamak için 0,9 çözünürlük seçilmiştir. Olası dubletler Scrublet algoritması kullanılarak kaldırılmıştır. Hücre kümeleri, “FindAllMarkers” fonksiyonu kullanılarakle diferansiyel olarak ifade edilen marker genlerin belirlenmesiyle isimlendirilmiştir. Bonferroni düzeltmesi ile parametrik olmayan Wilcoxon sıra toplamı testi uygulanmıştır. Hücre kimlikleri; yüzey markerları, ilgili literatür ve Hücre Sınıflandırma Veritabanı'na15 göre atanmıştır.
Hücre kültürü
HTR-8/SVneo trofoblast hücre hattı hücreleri, %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 besiyerinde kültüre edildi. Hipoksik koşullar, hücrelerin 24 saat boyunca %1 O₂, %5 CO₂ ve %94 N₂ ortamında kültüre edilmesiyle oluşturuldu; normoksik kontroller ise %20 O₂ ve %5 CO₂ ortamında tutuldu16. Tüm hücre kültürü işlemleri, aseptik teknik kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Kültür besiyerleri, transfeksiyon reaktifleri ve hücre atıkları, kurumsal biyogüvenlik kılavuzlarına uygun olarak imha edilmelidir.
Hücre transfeksiyonu
sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ve OE-NC içeren plazmitler sentezlendi. HTR-8/SVneo hücreleri, altı kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 5 × 105 hücre yoğunluğunda ekildi. Ardından hücreler, üretici talimatlarına uygun olarak bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak kuyucuk başına 2 µg sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 veya OE-NC plazmiti ile transfekte edildi. Kısaca; plazmit DNA ve P3000 Reaktifi Opti-MEM içinde seyreltildi, Opti-MEM içinde ayrı olarak seyreltilen Lipofectamine 3000 ile karıştırıldı, oda sıcaklığında 15 dk inkübe edildi ve %70–80 konfluense ulaşmış hücrelere eklendi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra SASH1 ekspresyonu RT-qPCR ve Western blot ile değerlendirildi. SASH1 nakavt (knockdown) için kullanılan shRNA hedef dizileri Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
Gerçek zamanlı kantitatif PCR
Toplam RNA, HTR-8/SVneo hücrelerinden ekstre edildi ve bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak 42 °C'de 30 dk, ardından 85 °C'de 5 dk boyunca cDNA'ya ters transkribe edildi. Real-time kantitatif PCR (qPCR), aşağıdaki döngü koşullarıyla SYBR Green master mix kullanılarak gerçekleştirildi: 95 °C'de 10 dk, ardından 95 °C'de 15 s ve 60 °C'de 1 dk olmak üzere 40 döngü. Rölatif mRNA ekspresyonu, iç referans olarak β-actin kullanılarak ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Bu deneyde kullanılan primer dizileri Ek Tablo 2'de listelenmiştir.
Western blot analizi
Toplam protein, lize tamponu kullanılarak HTR-8/SVneo hücrelerinden ekstre edildi. Hücre lizatları toplandı, buz üzerinde inkübe edildi ve çözünmeyen kalıntıları uzaklaştırmak için 4 °C'de 30 dk boyunca 12,000 × g hızda santrifüj edildi. Protein konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanılarak belirlendi. Eşit miktardaki proteinler (50 µg) SDS-PAGE ile ayrıldı ve ardından PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar %5 yağsız süt ile bloke edildi ve primer antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi. Yıkama işleminin ardından membranlar ilgili sekonder antikorlarla inkübe edildi ve protein bantları gelişmiş bir kemilüminesans tespit sistemi kullanılarak görselleştirildi.
Protein tespiti için primer antikorlar olarak anti-SASH1 ve β-actin kullanıldı. Uygun horseradish peroxidase (HRP)-konjuge sekonder antikorlar —keçi anti-tavşan ve keçi anti-fare— kullanıldı. Eşit protein yüklemesini sağlamak amacıyla internal yükleme kontrolü olarak β-actin kullanıldı. Protein bantlarının yoğunluğu ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü ve nicelendirildi.
P-EXOSların İzolasyonu
P-EXOS, elektif sezaryenle doğum yapan sağlıklı kadınların term plasentalarından elde edilen plasental villöz dokulardan izole edilmiştir. Plasental villöz doku steril PBS ile iyice yıkanmış, yaklaşık 1 mm3 boyutundaki fragmanlar haline getirilmiş ve %10 eksozomdan arındırılmış FBS ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında 37 °C'de, %5 CO2 altında 48 saat boyunca kültüre edilmiştir. Kondisyonlu ortam, şu şekilde diferansiyel santrifüjasyona tabi tutulmuştur: hücreleri ve doku kalıntılarını uzaklaştırmak için 300 × g'de 10 dakika; hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 2.000 × g'de 20 dakika ve mikrovezikülleri uzaklaştırmak için 10.000 × g'de 30 dakika (tüm işlemler 4 °C'de gerçekleştirilmiştir). Elde edilen süpernatant, eksozomları çöktürmek amacıyla 4 °C'de 120.000 × g'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjlenmiştir. Pelet bir kez PBS ile yıkanmış ve 4 °C'de 120.000 × g'de 70 dakika boyunca tekrar ultrasantrifüjlenmiştir. Nihai pelet PBS içinde yeniden süspanse edilmiştir. İzole edilen eksozomlar, eksozom belirteçleri (PLAP, CD63 ve TSG101; negatif kontrol olarak GM130) için Western blot analizi ile karakterize edilmiş ve morfolojik gözlem için transmisyon elektron mikroskobu ile daha ayrıntılı olarak incelenmiştir.
P-EXOS Hücresel Alım Deneyi
P-EXOS'ların hücresel internalizasyonunu doğrulamak için, eksozomlar üretici protokolüne uygun olarak lipofilik membran boyası PKH67 ile floresan şeklinde işaretlendi. Kısaca, P-EXOS'lar Diluent C içindeki PKH67 (4 µM) ile oda sıcaklığında 5 dk boyunca inkübe edildi ve reaksiyon, eşit hacimde %1 sığır serum albumini (BSA) ile durduruldu. Bağlanmamış boyayı uzaklaştırmak için işaretli eksozomlar ultrasantrifüjle (120,000 × g, 70 dk, 4 °C) yeniden izole edildi. Daha sonra PKH67 ile işaretlenmiş P-EXOS'lar (50 µg/mL), HTR-8/SVneo hücrelerine eklendi ve normoksik veya hipoksik (1% O₂) koşullar altında 24 sa boyunca birlikte inkübe edildi. Hücreler ardından PBS ile üç kez yıkandı, %4 paraformaldehit ile 15 dk boyunca fikse edildi ve çekirdekler DAPI (1 µg/mL) ile karşıt boyandı. PKH67 ile işaretlenmiş eksozomların internalizasyonu, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM; eksitasyon 490 nm, emisyon 502 nm) ile görselleştirildi. Fonksiyonel ko-kültür deneyleri için HTR-8/SVneo hücreleri, hipoksik koşullar (1% O₂) altında 24 sa boyunca, %10 eksozomdan arındırılmış FBS ile takviye edilmiş tam RPMI-1640 besiyerinde 50 µg/mL (protein eşdeğeri) konsantrasyonunda P-EXOS'lar ile muamele edildi.
Enzimle bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA)
Hücre kültürü süpernatanları toplandı ve IL-6, IL-1β ve TNF-α seviyeleri; üretici talimatlarına uygun olarak sırasıyla IL-6 ELISA kiti, IL-1β ELISA kiti ve TNF-α ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. 450 nm'deki absorbans bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü ve gerçek konsantrasyonlar standart eğrilerden hesaplandı.
TdT aracılı dUTP çentik-uç etiketlemesi (TUNEL)
Apoptotik hücreler, üreticinin talimatlarına uygun olarak TUNEL analiz kiti kullanılarak tespit edildi. Kısaca, hücreler oda sıcaklığında 15 dk boyunca %4 paraformaldehit ile fikse edildi, buz üzerinde 5 dk boyunca PBS içinde %0.1 Triton X-100 ile permeabilize edildi ve karanlıkta 37 °C'de 60 dk boyunca TUNEL reaksiyon karışımı ile inkube edildi. Çekirdekler DAPI ile karşıt boyama işlemine tabi tutuldu ve TUNEL-pozitif hücreler floresan mikroskop kullanılarak görselleştirildi; örnek başına rastgele seçilen en az beş alandaki TUNEL-pozitif hücrelerin yüzdesi sayılarak niceliksel olarak belirlendi.
İstatistiksel analiz
Tüm veriler R ve GraphPad Prism kullanılarak analiz edildi. Sürekli değişkenler ortalama ±SD olarak sunulmuştur. İki grup arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile gerçekleştirilirken, çoklu grup karşılaştırmaları tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak yapıldı. Kategorik değişkenler için istatistiksel anlamlılık, Ki-kare testi veya Fisher'ın kesin testi ile değerlendirildi. Aksi belirtilmedikçe, moleküller arasındaki korelasyonlar Spearman korelasyon analizi kullanılarak hesaplandı. Ekzosom karakterizasyon deneyleri, üç bağımsız plasenta donöründen izole edilen P-EXOS kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre bazlı deneyler, farklı pasajlardaki HTR-8/SVneo hücreleri kullanılarak farklı zamanlarda yürütülen bağımsız deneyleri temsil eden üç bağımsız biyolojik tekrar şeklinde yapıldı ve her tekrarda farklı bir plasental donörden izole edilen P-EXOS kullanıldı. p < 0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sağlıklı ve PE hastalarının transkriptomik analizi
Normal grup ile PE hastaları arasındaki gen ekspresyon farkları için, birleştirilmiş veri setlerindeki diferansiyel ekspresyon limma R paketi kullanılarak analiz edildi. GSE75010 için toplam 89 DEG (p < 0.05 ve |log2FC| > 0.5); bunların 69'u yukarı regüle, 20'si aşağı regüle genler olarak belirlendi (Şekil 1A). 2.097 diferansiyel eksprese gen bulunmaktadır ve bunların 1.1...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışmada, PE için hedefli tedavilerin henüz mevcut olmadığı göz önüne alındığında özellikle anlamlı olan entegre transkriptomik analiz, tek hücreli sekanslama ve çoklu algoritmalı makine öğrenimi yaklaşımı aracılığıyla, SASH1'in PE'de düzensizliği saptanan kilit bir gen olduğu belirlenmiştir17. SASH1'in hipoksik trofoblast hücrelerinde anlamlı düzeyde artış gösterdiği ve tek hücre çözünürlüğünde PE plasentalarının trofoblast kompartmanında spesifik olarak yükseldiği gösterilmiştir. Fonksiyon k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.
Bu çalışma, Çin Hebei Eyaleti Sağlık Komisyonu'nun Tıbbi Bilim Araştırmaları Temel Programı (No. 20210075) tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 Besiyeri | Gibco | 11875085 | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| Eksozomdan arındırılmış FBS | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penisilin/Streptomisin | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktanı (P3000 Reaktanı ile birlikte) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Opti-MEM Düşük Serumlu Besiyeri | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| SASH1 shRNA plazmidi (HuSH) | origene | TL301836 | |
| SASH1 ORF ekspresyon plazmidi | origene | RC218866 | |
| Boş vektör kontrolü | origene | PS100001 | |
| Ters Transkripsiyon Kiti | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| SASH1 primerleri | Sangon Biotech | Özel sentezleme | |
| β-aktin primerleri | Sangon Biotech | Özel sentezleme | |
| Hücre Lizis Tamponu | Beyotime | P0013B | |
| NanoDrop Spektrofotometre | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| PVDF Membran | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anti-SASH1 Antikoru | ABclonal | A15248 | |
| Anti-β-aktin Antikoru | Abcam | ab6276 | |
| HRP-konjuge Keçi Anti-Tavşan/Anti-Fare Sekonder Antikoru | Beyotime | A0208 | |
| ImageJ Yazılımı | NIH (kamu malı) | ImageJ | |
| PKH67 Yeşil Floresan Hücre Bağlayıcı Kit (Dilüent C dahil) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Bovin Serum Albümin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Konfokal Lazer Taramalı Mikroskop (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| İnsan IL-6 Quantikine ELISA Kiti | R&D Systems | D6050B | |
| İnsan IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY201 | |
| İnsan TNF-α Quantikine ELISA Kiti | R&D Systems | DTA00D | |
| Mikroplaka Okuyucu | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| In Situ Hücre Ölümü Tespit Kiti (TUNEL Analiz Kiti) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehit (%4) | Beyotime | P0099 | |
| Floresan Mikroskop | Olympus | BX53 | |
| Soğutmalı Santrifüj (12,000 × g kapasiteli) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultrasantrifüj (120,000 × g kapasiteli) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| R Yazılımı | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (R paketi) | Satija Lab (açık kaynak) | v4.0.4 | |
| Harmony (R paketi, lot düzeltme) | Açık kaynak | v1.2.0 | |
| Scrublet (Python paketi, dublet tespiti) | Açık kaynak | v0.2.3 | |
| clustree (R paketi) | Açık kaynak | v0.5.1 | |
| glmnet (R paketi, LASSO) | Açık kaynak | v4.1.8 | |
| e1071 (R paketi, SVM-RFE) | Açık kaynak | v1.7-14 | |
| xgboost (R paketi) | Açık kaynak | v1.7.7.1 | |
| randomForest (R paketi, Boruta) | Açık kaynak | v4.7-1.1 | |
| Gene Expression Omnibus (GEO) Veritabanı | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| STRING Veritabanı | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Cytoscape Yazılımı | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (R paketi) | Açık kaynak | v3.5.1 | |
| limma (R paketi) | Açık kaynak | v3.58.1 | |
| pheatmap (R paketi) | Açık kaynak | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (R paketi) | Açık kaynak | v4.8.3 | |
| DOSE (R paketi) | Açık kaynak | v3.28.2 | |
| ggpubr (R paketi) | Açık kaynak | v0.6.0 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.