ZeLan özütü, DHEA ile indüklenmiş PCOS sıçanlarında endokrin ve metabolik fenotipleri iyileştirmiştir. Entegre 16S rRNA dizileme ve serum metabolomikleri; bağırsak mikrobiyal alfa çeşitliliğinin kısmen geri döndüğünü, mikrobiyal kompozisyonun değiştiğini ve steroid hormonları, safra asitleri ile kısa zincirli yağ asitlerini içeren metabolit değişikliklerini göstermiştir.
Araştırma makalesi
Lycopus lucidus Ekstraktı, Bağırsak Mikrobiyotası ve Metabolom Yeniden Şekillenmesi ile Deneysel Polikistik Over Sendromunu İyileştirir
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, ZeLan ekstraktının polikistik over sendromu (PKOS) üzerindeki terapötik etkilerini araştırmış ve bağırsak mikrobiyota-metabolom yeniden şekillenmesi ile olan ilişkisini değerlendirmiştir. Yirmi dört dişi Sprague-Dawley sıçanı rastgele Kontrol, dehidroepiandrosteron (DHEA) ile indüklenen PKOS Model ve ZeLan tedavi gruplarına (her biri n = 8) ayrılmıştır. 28 günlük müdahalenin ardından serum hormon seviyeleri ELISA ile ölçülmüş; bağırsak mikrobiyota kompozisyonu 16S rRNA gen sekanslaması kullanılarak analiz edilmiş ve serum metabolik profilleri UHPLC-Q-TOF-MS ile karakterize edilmiştir. Mikrobiyota-metabolom ilişkilerini keşfetmek için çoklu test kontrolü ile Spearman korelasyon analizi gerçekleştirilmiştir. ZeLan, Model grubuyla karşılaştırıldığında vücut ağırlığını, testosteronu (0.92'ye karşı 1.85 ng/mL, P < 0.05), LH/FSH oranını ve insülin seviyelerini düşürerek PKOS ile ilişkili fenotipleri anlamlı düzeyde iyileştirmiştir. Sekanslama, ZeLan'ın mikrobiyal alfa çeşitliliğini kısmen geri kazandırdığını (Shannon indeksi: 5.79'a karşı 4.19) ve Firmicutes-Bacteroidetes oranını azalttığını göstermiştir. ZeLan, Lactobacillus ve Ruminococcus zenginleşmesi ile Bacteroides, Prevotella ve Escherichia'nın daha düşük bolluğu ile ilişkilendirilmiştir. Metabolomik analizler, litoikolik asit gibi safra asitleri, bütirik asit gibi kısa zincirli yağ asitleri ve steroid hormonlarını içeren temel değişikliklerle birlikte, değişime uğramış 52 metabolit özelliği belirlemiştir. Bu bulgular, ZeLan'ın PKOS ile ilişkili endokrin ve metabolik bozuklukları iyileştirdiğini ve bağırsak mikrobiyal ve serum metabolik profillerinin yeniden şekillenmesi ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Giriş
Polikistik over sendromu (PKOS), kullanılan tanı kriterlerine bağlı olarak küresel prevalansı %6 ile %20 arasında tahmin edilen, üreme çağındaki kadınları etkileyen en yaygın endokrin bozukluklardan biridir1. Bu kompleks metabolik ve reprodüktif bozukluk; hiperandrojenizm, ovulatuvar disfonksiyon ve polikistik over morfolojisi dahil olmak üzere, toplu olarak önemli reprodüktif, metabolik ve psikolojik sonuçlara yol açan bir dizi klinik belirti ile karakterizedir2. Doğurganlık üzerindeki doğrudan etkisinin ötesinde PKOS; tip 2 diabetes mellitus, kardiyovasküler hastalık ve endometrial karsinom gibi uzun süreli sağlık komplikasyonlarıyla ilişkili sistemik bir durum olarak giderek daha fazla kabul edilmekte, bu durum dünya çapında hem bireysel hastalar hem de sağlık sistemleri üzerinde önemli yükler oluşturmaktadır3. PKOS'un patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamış olsa da, genel olarak etkilenen bireylerde gözlemlenen karakteristik hormonal ve metabolik bozukluklarla sonuçlanan genetik yatkınlık, çevresel faktörler ve yaşam tarzı belirleyicileri arasındaki karmaşık etkileşimleri içerdiği kabul edilmektedir4.
PKOS için güncel terapötik yaklaşımlar, öncelikle adet düzenlemesi için oral kontraseptifler, insülin duyarlılaştırması için metformin ve hirsutizm kontrolü için anti-androjenler dahil olmak üzere farmakolojik müdahaleler aracılığıyla semptomatik yönetime odaklanmaktadır5. Ancak, bu konvansiyonel tedaviler genellikle eksik semptom rahatlaması sağlar ve özellikle fertilite beklentisi olan kadınlarda uzun vadeli uygulanabilirliği sınırlayan yan etkilerle sıklıkla ilişkilendirilir6. Sonuç olarak, özellikle jinekolojik bozuklukların bütüncül düzenleyici mekanizmalar aracılığıyla tedavisinde yüzyıllardır süregelen ampirik deneyime sahip olan geleneksel Çin tıbbı (TCM) başta olmak üzere, tamamlayıcı ve alternatif tıp yaklaşımlarının araştırılmasına yönelik artan bir ilgi oluşmuştur7. PKOS yönetimi için incelenen çok sayıda botanik ilaç arasında, Lycopus lucidus Turcz. (Çin tıbbında yaygın olarak ZeLan olarak bilinir), kan dolaşımını artırma, stazı giderme ve adet düzenleme konusundaki geleneksel uygulamaları nedeniyle önemli ölçüde dikkat çekmiştir8. Yayınlanmış fitokimyasal çalışmalar, L. lucidus'un antioksidan ve antiinflamatuar aktiviteye sahip polifenoller ve flavonoid açısından zengin fraksiyonlar içerdiğini göstermektedir8,9. Bu nedenle, mikrobiyota ve metabolik düzenlemeden sorumlu spesifik aktif monomerlerin tanımlanması gelecekte hedefli fitokimyasal analiz gerektirse de, mevcut çalışmada ekstrakt için kimyasal kalite kontrol indeksi olarak standardize toplam flavonoid içeriği kullanılmıştır.
Bağırsak mikrobiyotası, PKOS dahil olmak üzere çeşitli metabolik bozuklukların patogenezindeki rolünü destekleyen artan kanıtlarla birlikte, konakçı metabolizmasının ve endokrin fonksiyonun kritik bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır10. Bağırsak-over aksı kavramı; mikrobiyal metabolitler, immün sinyalleme ve nöroendokrin yollar aracılığıyla bağırsak mikroorganizmaları ile over fonksiyonu arasındaki çift yönlü iletişimi tanımlamak için öne sürülmüştür11. PKOS'lu kadınların, azalmış mikrobiyal çeşitlilik, değişmiş Firmicutes/Bacteroidetes oranları ve Lactobacillus ile Bifidobacterium türleri gibi faydalı bakterilerin bolluğunda azalma ile karakterize bir bağırsak disbiyozu sergilediği tutarlı bir şekilde gösterilmiştir12. Bu mikrobiyal bozulmaların; artmış bağırsak geçirgenliği, sistemik düşük dereceli inflamasyon ile değişmiş safra asidi ve kısa zincirli yağ asidi (SCFA) metabolizması dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar aracılığıyla PKOS patofizyolojisine katkıda bulunduğu ve böylece insülin duyarlılığı ile androjen biyosentezini etkilediği düşünülmektedir13. Önemli bir nokta olarak, probiyotikler, prebiyotikler ve diyet modifikasyonlarını içeren bağırsak mikrobiyotasını hedef alan müdahaleler, PKOS semptomlarını hafifletmede gelecek vaat eden sonuçlar göstermiş ve böylece bağırsak-over aksının terapötik bir hedef olduğunu desteklemiştir14.
Biyolojik sistemlerdeki küçük moleküllü metabolitlerin kapsamlı analizi olan metabolomik, hastalık durumlarıyla ilişkili metabolik perturbasyonların karakterize edilmesi ve terapötik müdahalelerin biyokimyasal etkilerinin değerlendirilmesi için güçlü bir yaklaşım sunar15. Mikrobiyom profilleme için 16S rRNA gen dizilemesinin hedeflenmemiş metabolomik ile entegrasyonu, bağırsak mikrobiyal toplulukları ile konakçı metabolizması arasındaki ilişkilerin sistematik olarak incelenmesine olanak tanıyarak, hem hastalık patogenezine hem de tedavi yanıtlarına eşlik edebilen mikrobiyota-metabolom etkileşimlerine dair içgörüler sağlar. PCOS yönetiminde bağırsak-yumurtalık aksını hedeflemenin teorik gerekçelerine ve ZeLan'ın jinekolojik bozukluklar için geleneksel endikasyonlarına rağmen, bugüne kadar hiçbir çalışma ZeLan ekstraktının PCOS'ta bağırsak mikrobiyota-metabolom arayüzünü modüle edip etmediğini sistematik olarak incelememiştir. Bu bilgi eksikliği, ZeLan ile ilişkili biyolojik yanıtların anlaşılmasını sınırlamakta ve bu botanik müdahalenin PCOS tedavisi için rasyonel optimizasyonunu engellemektedir.
Bu çalışma, DHEA ile indüklenmiş bir rat PCOS modelinde ZeLan ekstraktının terapötik etkinliğini araştırmak ve entegre 16S rRNA dizileme ve hedefsiz metabolomik analiz yoluyla ilişkili bağırsak mikrobiyota-metabolom değişikliklerini değerlendirmek amacıyla tasarlanmıştır. Spesifik olarak; ZeLan ekstraktının vücut ağırlığı, serum testosteronu, luteinize edici hormonun folikül uyarıcı hormona oranı (LH/FSH) ve insülin seviyeleri dahil olmak üzere PCOS ile ilişkili fenotipler üzerindeki etkilerini değerlendirdik; ZeLan tedavisini takiben bağırsak mikrobiyota kompozisyonu ve alfa çeşitliliğindeki değişimleri karakterize ettik; ZeLan müdahalesiyle ilişkili diferansiyel serum metabolit özelliklerini ve zenginleşmiş metabolik yolakları tanımladık ve spesifik bağırsak mikrobiyal taksonları ile temel metabolitler arasındaki korelasyonları inceledik. Bu hedefleri ele alarak, PCOS'ta ZeLan ile ilişkili bağırsak-over aksı modülasyonu için ilişkisel multi-omik kanıtlar sağlamayı amaçladık.
Protokol
Bu çalışmadaki tüm deneysel prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No. IACUC-2023-0156).
Hayvanlar
Dişi Sprague-Dawley sıçanlar (n = 24, 6 haftalık, vücut ağırlığı 180–200 g), bağlı kurumun Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden temin edilmiş ve standart kemirgen yemi ile saf suya ad libitum erişim sağlanarak kontrollü çevresel koşullar altında (sıcaklık 22 ± 2°C, nem %50 ± 10, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü) barındırılmıştır. Bir haftalık alıştırma döneminin ardından hayvanlar rastgele üç deneysel gruba ayrılmıştır (grup başına n = 8): Kontrol, PCOS Modeli ve ZeLan tedavisi. Örneklem büyüklüğü, PCOS modellerindeki bağırsak mikrobiyotası değişikliklerini inceleyen önceki çalışmalara dayanarak belirlenmiş olup, güç analizi grup başına 8 hayvanın α = 0.05 düzeyinde alfa çeşitlilik indekslerinde 1,5 katlık bir farkı tespit etmek için %80 güç sağlayacağını göstermiştir.
PCOS model oluşturma ve tedavi protokolü
PCOS modeli, susam yağında çözünmüş dehidroepiandrosteronun (DHEA; Sigma-Aldrich, ABD), 21 gün boyunca ardışık olarak günlük 6 mg/100 g vücut ağırlığı dozunda dorsal boy bölgesine subkütan enjeksiyonunu içeren, iyi valide edilmiş bir protokol kullanılarak oluşturulmuştur. Kontrol hayvanlarına eş değer hacimlerde susam yağı taşıyıcı olarak verilmiştir. Tüm deneysel zaman çizelgesi, alıştırma süresini de kapsayacak şekilde 7 günlük alıştırma, 21 günlük model indüksiyonu ve 28 günlük müdahale ile 56. protokol gününde uç nokta örneklemesini içermektedir (Şekil 1). ZeLan ekstresi, kimlik doğrulaması yapılmış Lycopus lucidus Turcz. bitkisinin sulu ekstraksiyonu yoluyla hazırlanmış ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile toplam flavonoid içeriği en az %2,5 olacak şekilde standardize edilmiştir; bu durum botanik ekstrakt için kimyasal kalite kontrol kriteri olarak belirlenmiştir. DHEA ile indüklenen model oluşturma işleminin tamamlanmasının ardından, ZeLan grubundaki sıçanlara 28 gün boyunca ardışık olarak günlük 200 mg/kg vücut ağırlığında ZeLan ekstresi oral gavaj yoluyla verilmiş, Kontrol ve Model gruplarına ise eş değer hacimlerde distile su uygulanmıştır. 200 mg/kg dozu, botanik ekstraktlarla ilgili önceki hayvan kullanım deneyimleri ve ön tolerabilite değerlendirmelerine dayalı olarak keşif amaçlı bir farmakolojik doz olarak seçilmiştir; resmi bir doz-yanıt değerlendirmesi mevcut tasarımın parçası değildir. Vücut ağırlığı, deneysel süreç boyunca haftalık olarak kaydedilmiştir. Bu deneysel tasarımda, başarılı PCOS model oluşturma işlemi, DHEA indüksiyon protokolü ile birlikte vücut ağırlığı, serum testosteron, LH/FSH oranı ve açlık insülini dahil olmak üzere uç nokta endokrin ve metabolik fenotipleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Over histopatolojik incelemesi, folikül sayımı, korpus luteum kantifikasyonu ve seri östrus döngüsü izlemi model doğrulama uç noktaları olarak dahil edilmemiştir ve bu nedenle over disfonksiyonu yorumlaması, doğrudan doku düzeyindeki değerlendirmeden ziyade endokrin ve metabolik verileri temel almıştır.
Numune toplama ve işleme
Sonraki biyokimyasal, mikrobiyota ve metabolomik analizler için her üç gruptan da (grup başına n = 8) örnekler (serum ve dışkı) toplandı. Sirkadiyen ve beslenmeye bağlı değişkenliği azaltmak için nihai örneklemler, gece boyunca açlıktan sonra sabah saatlerinde gerçekleştirildi. Kan örnekleri, anestezi altında abdominal aortadan toplandı ve serum elde etmek için 4°C'de 15 dakika boyunca 3,000 × g hızında santrifüj edildi; elde edilen serumlar alikotlara ayrılarak hormon ve metabolomik analizlere kadar -80°C'de saklandı. Taze dışkı örnekleri, aseptik koşullar altında doğrudan sekumdan steril kriyotüplere toplandı, transfer sırasında kuru buz üzerinde tutuldu, toplandıktan sonraki 10 dakika içinde sıvı nitrojenle şoklandı ve 16S rRNA gen sekanslamasına kadar -80°C'de saklandı.
Serum hormon ölçümleri
Testosteron, luteinleştirici hormon (LH), folikül uyarıcı hormon (FSH) ve insülinin serum konsantrasyonları, üretici talimatlarına uygun olarak ticari olarak temin edilen enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kitleri (Cusabio Biotech, Wuhan, Çin) kullanılarak kantifiye edildi. LH/FSH oranı, PCOS için karakteristik olan gonadotropin dengesizliğinin kompozit bir indeksi olarak hesaplandı. Tüm örnekler çift paralel olarak analiz edildi ve varyasyon katsayıları %15'ten büyük olan ölçümler tekrarlandı. Kit içi ve kitler arası varyasyon katsayılarının sırasıyla %10 ve %15'in altında kalması şartı arandı. Potansiyel aykırı değerler, kaynak kayıtları ve assay performans bilgileriyle karşılaştırılarak tarandı ve belgelenmiş bir teknik neden olmaksızın hiçbir değer yalnızca istatistiksel gerekçelerle hariç tutulmadı.
16S rRNA gen dizileme ve biyoinformatik analiz
Toplam bakteriyel genomik DNA, üretici protokolü takip edilerek QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak sekum içeriğinden ekstrakte edildi. DNA kalitesi ve miktarı NanoDrop spektrofotometrisi ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak değerlendirildi ve DNA ekstraktları kütüphane kurulumundan önce -80°C'de saklandı. 16S rRNA geninin V3-V4 hiperdeğişken bölgeleri, Illumina adaptör dizilerine sahip evrensel primerler olan 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') ve 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') kullanılarak amplifiye edildi. Amplikon kütüphaneleri oluşturuldu, saflaştırıldı, miktarları belirlendi, eş molar konsantrasyonlarda havuzlandı ve Illumina NovaSeq 6000 platformunda (Novogene, Pekin, Çin) paired-end 250 bp okumalar kullanılarak dizilendi.
Ham sekanslama okumaları QIIME2 (versiyon 2022.2) hattı kullanılarak işlendi. Çift uçlu okumalar demültiplekslendi, birleştirildi, en az 20 Phred skor eşiği kullanılarak kalite filtresinden geçirildi ve kimera dizileri kaldırmak ve amplikon sekans varyantları (ASV'ler) oluşturmak için DADA2 ile işlendi. Taksonomik sınıflandırma, bir naive Bayes sınıflandırıcı kullanılarak SILVA 138 referans veri tabanına göre gerçekleştirildi. Örnek içi çeşitliliği ve zenginliği değerlendirmek için Shannon indeksi, Simpson indeksi ve Chao1 tahmincisi dahil olmak üzere alfa çeşitlilik metrikleri hesaplandı. Okuma özetleri, ASV bolluk tabloları, Good kapsamı ve seyreltme eğrisi dosyaları dahil olmak üzere sekanslama derinliği çıktıları, Veri Kullanılabilirliği bölümünde açıklanan mikrobiyom veri setinin bir parçası olarak değerlendirildi. Kontrol ve Model karşılaştırmasında hastalıkla ilişkili taksonları belirlemek için, 2.0'dan büyük bir LDA skor eşiği ve P < 0.05 kullanılarak doğrusal ayrıştırıcı analiz etki boyutu (LEfSe) uygulandı; ZeLan ile ilişkili geri dönüş, ZeLan grubundaki taksonomik bolluk kaymaları yönünün Model grubuna göre karşılaştırılmasıyla değerlendirildi.
Hedefsiz metabolomik analiz
Serum metabolomik profillemesi, kuadrupol uçuş süreli kütle spektrometrisi ile eşleşmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Serum örnekleri (100 μL), internal standartlar içeren 400 μL soğuk metanol:asetonitril (1:1, v/v) ile karıştırılmış, vortekslemiş ve proteinleri çöktürmek için -20°C'de 1 saat inkübe edilmiştir. 14.000 × g'de 15 dakika santrifüjasyonun ardından, süpernatantlar azot akımı altında kurutulmuş ve analiz için 100 μL asetonitril:su (1:1, v/v) içerisinde yeniden çözündürülmüştür. Kromatografik ayırım, 40°C'de tutulan bir ACQUITY UPLC HSS T3 kolonunda (2.1 × 100 mm, 1.8 μm); mobil faz A olarak %0.1 formik asit içeren su ve mobil faz B olarak %0.1 formik asit içeren asetonitril, 0.30 mL/min akış hızında kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Metabolit ayırımı için organik fazın %5'ten %95'e artırıldığı, ardından kolon yıkama ve yeniden dengeleme ile devam eden bir gradyan programı kullanılmıştır. Kütle spektrometrik veriler, m/z 50–1200 tarama aralığında, hem pozitif hem de negatif elektrospray iyonizasyon modlarında elde edilmiştir; kaynak parametreleri kapiler voltajı 3.5 kV, kurutma gazı akışı 10 L/min, kurutma gazı sıcaklığı 325°C, nebülizatör basıncı 35 psi ve fragmantör voltajı 120 V olarak belirlenmiştir.
Ham veri dosyaları mzXML formatına dönüştürüldü ve pik saptama, tutunma zamanı hizalama ve pik alanı entegrasyonu için R'daki XCMS paketi kullanılarak işlendi. Cihaz kararlılığını izlemek amacıyla, tüm serum ekstraktlarının eşit miktarlarda havuzlanmasıyla hazırlanan kalite kontrol örnekleri analitik sekans boyunca yerleştirildi. Aşırı eksiklik gösteren veya kalite kontrol tekrarlanabilirliği stabil olmayan özellikler, istatistiksel modelleme öncesinde çıkarıldı. Metabolit tanımlaması; doğru kütle, tutunma zamanı ve MS/MS fragmantasyon paternlerinin Human Metabolome Database (HMDB), METLIN ve kurum içi spektral kütüphanelerle eşleştirilmesi yoluyla gerçekleştirildi. Çok değişkenli istatistiksel analizler MetaboAnalyst 5.0 kullanılarak yapıldı. Sonraki raporlama için seçilen metabolit özellikleri; çok değişkenli ayırt edici katkı, kat değişimi (fold-change) yönü ve istatistiksel kanıtı içeren birleşik bir kriter kullanılarak önceliklendirildi; P değerleri, çoklu testleri hesaba katmak için Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak düzeltildi. 52 metabolit özelliğini içeren eksiksiz açıklama tablosu, Ek Tablo 1 olarak sunulmuştur. Yolculuk zenginleştirme analizi, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) veri tabanı kullanılarak gerçekleştirildi.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler SPSS sürüm 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) ve R yazılımı (sürüm 4.2.1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sürekli veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiş ve çıkarımsal testlerden önce Shapiro-Wilk testi ile normallikleri değerlendirilmiştir. Normal dağılım gösteren veriler için çoklu grup karşılaştırmalarında tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey post hoc testi kullanılmıştır; normal dağılım göstermeyen veriler için ise Dunn post hoc testi ile birlikte Kruskal-Wallis testi kullanılmıştır. Bağırsak mikrobiyal taksonları ile serum metabolitleri arasındaki korelasyonlar Spearman sıra korelasyon katsayısı kullanılarak değerlendirilmiş ve hiyerarşik olarak kümelenmiş ısı haritaları şeklinde görselleştirilmiştir. Korelasyon P-değerleri, Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak çoklu testler için düzeltilmiş ve yalnızca yön bakımından tutarlı ve istatistiksel olarak anlamlı olan korelasyonlar yorumlanmıştır. Düzeltilmiş bir P-değeri eşiği belirtilmediği sürece, iki yönlü P-değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlar
ZeLan ekstraktının PCOS klinik fenotipleri üzerindeki etkileri
Sıçanlarda DHEA uygulaması, Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında vücut ağırlığı, serum testosteron konsantrasyonu, LH/FSH oranı ve açlık insülin seviyelerinde meydana gelen anlamlı artışlarla kanıtlandığı üzere PCOS benzeri endokrin ve metabolik fenotipler oluşturmuştur (tüm P < 0.05). Shapiro-Wilk testi kullanılarak yapılan dağılım değerlendirmesi, Tablo 1'de özetlenen temel vücut ağırlığı ve hormon uç noktaları için parametrik analizi desteklemiştir. 28 gün boyunca ZeLan ekstraktı ile yapılan tedavi, bu metabolik ve hormonal bozuklukları anlamlı düzeyde iyileştirmiştir. Vücut ağırlığı, 7 günlük aklimatizasyon dönemi dahil olmak üzere protokolün 56. gününde, tedavi süresinin sonunda kaydedilmiştir. Tablo 1'de sunulduğu üzere, Model grubundaki vücut ağırlığı (291.12 ± 15.35 g), Kontrol grubundakinden (227.45 ± 10.12 g, P < 0.05) önemli ölçüde daha yüksekken, ZeLan tedavisi vücut ağırlığını anlamlı şekilde 245.25 ± 10.21 g'a düşürmüştür (Model grubuna kıyasla P < 0.05). PCOS model sıçanlarında serum testosteron seviyeleri, kontrollere (0.51 ± 0.05 ng/mL) kıyasla belirgin şekilde yüksek bulunmuş (1.85 ± 0.21 ng/mL) ve ZeLan müdahalesi testosteronu 0.92 ± 0.12 ng/mL'ye indirmiştir. LH/FSH oranı, Model grubunda Kontrole (1.25 ± 0.11) göre anlamlı düzeyde artmış (3.28 ± 0.25) ve ZeLan tedavisi ile kısmen normalize edilmiştir (1.85 ± 0.15). Açlık insülin seviyeleri model hayvanlarda yükselmiş (kontrollerde 12.55 ± 1.12 mIU/L'ye karşı 28.95 ± 2.35 mIU/L) ve ZeLan uygulamasının ardından anlamlı şekilde azalmıştır (18.82 ± 1.55 mIU/L) (Şekil 2). Bu bulgular, endokrin-metabolik PCOS benzeri bir fenotipin başarıyla oluşturulduğunu doğrulamıştır; ancak bu çalışmada ovaryen histopatoloji, folikül sayımları, korpus luteum analizi ve östrus döngüsü izlemi yapılmamıştır.
ZeLan ekstresi bağırsak mikrobiyota alfa çeşitliliğini geri kazandırdı
Alfa çeşitlilik indekslerinin analizi, PCOS ve tedavisi ile ilişkili olarak bağırsak mikrobiyal topluluk yapısında önemli değişiklikler olduğunu ortaya koymuştur. Tablo 2 ve Şekil 3'te gösterildiği üzere, Shannon çeşitlilik indeksi PCOS model sıçanlarda (4.19 ± 0.35), sağlıklı kontrollere (6.51 ± 0.28; P < 0.05) göre anlamlı derecede düşük bulunmuştur; bu durum hastalık durumunda mikrobiyal alfa çeşitliliğinin azaldığını göstermektedir. ZeLan tedavisi, Shannon indeksinin 5.79 ± 0.26'ya yükselmesiyle (Model grubuna kıyasla P < 0.05) mikrobiyal çeşitliliği kısmen geri kazandırmıştır. Simpson indeksi için de benzer sonuçlar gözlemlenmiş; bu indeks kontrollerde 0.98 ± 0.01 iken model hayvanlarda 0.82 ± 0.03'e düşmüş ve ZeLan müdahalesi sonrası 0.93 ± 0.02'ye yükselmiştir. Tür zenginliğini yansıtan Chao1 tahmincisi de benzer bir örüntü sergilemiştir: PCOS indüksiyonu Chao1 değerini 1215.3 ± 45.4'ten 665.8 ± 52.1'e önemli ölçüde düşürürken, ZeLan tedavisi zenginliği 963.5 ± 38.6'ya çıkarmıştır. Bu bulgular toplu olarak, PCOS'un azalmış alfa çeşitliliği ve zenginliği ile karakterize edilen bağırsak mikrobiyal disbiyozu ile ilişkili olduğunu ve ZeLan ekstraktının mikrobiyal topluluk yapısını kısmen Kontrol profiline doğru geri döndürebildiğini göstermektedir.
Bağırsak mikrobiyota kompozisyonundaki değişiklikler
Filum düzeyindeki taksonomik profilleme, deney grupları arasında belirgin kompozisyonel farklılıklar ortaya çıkarmıştır. Şekil 4'te gösterildiği üzere, Firmicutes ve Bacteroidetes tüm gruplarda baskın filumlar olup, toplam bakteri topluluğunun %85'inden fazlasını oluşturmuştur. Model grubu, Kontrol grubuna kıyasla (Firmicutes yaklaşık %40, Bacteroidetes yaklaşık %45), önemli ölçüde yüksek Firmicutes bolluğu (yaklaşık %75) ve buna eşlik eden düşük Bacteroidetes oranı (yaklaşık %15) sergilemiş; bu durum, metabolik disbiozun karakteristik özelliği olan belirgin şekilde artmış bir Firmicutes-Bacteroidetes (F/B) oranıyla sonuçlanmıştır. ZeLan tedavisi bu dengesizliği modüle ederek Firmicutes bolluğunu yaklaşık %52'ye indirmiş, Bacteroidetes oranını ise yaklaşık %35'e çıkarmış ve böylece F/B oranını kısmen kontrol seviyelerine doğru normalize etmiştir.
Kontrol ve Model gruplarını birbirinden ayıran ve böylece hastalıkla ilişkili mikrobiyal imzayı tanımlayan bakteriyel taksonları belirlemek için LEfSe analizi kullanılmıştır. Şekil 5'te gösterildiği üzere, cins düzeyinde, PCOS Model grubu, genel olarak daha önceden metabolik disfonksiyon ve inflamasyonla ilişkilendirilmiş olan Bacteroides (LDA skoru > 3.5), Prevotella (LDA skoru > 3.0) ve Escherichia (LDA skoru > 2.5) cinslerinde anlamlı derecede artmış bolluk göstermiştir. Buna karşılık, Kontrol grubu, her ikisi de bağırsak bariyer bütünlüğünün korunması ve kısa zincirli yağ asitleri gibi faydalı metabolitlerin üretilmesindeki rolleriyle bilinen Lactobacillus (LDA skoru > 3.0) ve Ruminococcus (LDA skoru > 2.5) dahil olmak üzere faydalı cinslerin zenginleşmesini sergilemiştir. ZeLan grubu, bu analiz hastalığı sağlıktan ayıran taksonlara odaklandığı için Şekil 5'te ayrı bir LEfSe sınıfı olarak gösterilmemiştir; ZeLan ile ilgili etkiler, Kontrol profiline doğru gerçekleşen bolluk kaymalarından ve mikrobiyom-metabolom korelasyonlarından yorumlanmıştır.
Metabolomik profilleme ve diferansiyel metabolit tanımlama
Hedeflenmemiş metabolomik analizi, PCOS ile ilişkili ve ZeLan ekstresi ile tedavisine bağlı önemli metabolik pertürbasyonları belirlemiştir. Şekil 6'daki volcano grafiği, Model ve Kontrol grupları arasındaki metabolit özelliklerinin dağılımını göstermekte olup, yukarı ve aşağı regüle olan özellikler kat değişimi yönü ve istatistiksel anlamlılık ile vurgulanmıştır. Model ve Kontrol karşılaştırması için eksiksiz metabolomik raporlama tablosunda toplam 52 adet tanımlanmış metabolit özelliği tutulmuştur. Metabolit adı, HMDB tanımlayıcısı, biyokimyasal sınıfı, log2 kat değişimi, P değeri ve regülasyon yönünü içeren tam liste Ek Tablo 1 olarak sunulmuştur. Tablo 3, PCOS ile biyolojik ilgisi yüksek olan temsili tanımlanmış metabolitleri sunmaktadır.
Tablo 3, yüksek VIP skorlarına sahip ve PCOS patofizyolojisi ile biyolojik ilgisi olan temsili temel diferansiyel metabolitleri özetlemektedir. Testosteron (VIP = 2.56, P < 0.001) ve androstenedion (VIP = 2.34, P < 0.001) dahil olmak üzere steroid hormonlar, bu durumun karakteristik özelliği olan hiperandrojenik durumla uyumlu olarak, PCOS model hayvanlarında anlamlı şekilde yükselmiştir. Palmitik asit (VIP = 2.12) ve araşidonik asidin (VIP = 1.89) anlamlı artışlar göstermesiyle yağ asidi metabolizması da bozulmuş, proinflamatuar lipid medyatörü prostaglandin E2 benzer şekilde yukarı regüle olmuştur (VIP = 2.05). Aksine, faydalı bağırsak mikrobiyal aktivitesi ile ilişkili metabolitler PCOS hayvanlarında azalmıştır: mikrobiyal biyotransformasyon yoluyla üretilen sekonder bir safra asidi olan litokolik asit (VIP = 2.45) ve kısa zincirli yağ asidi bütirik asit (VIP = 2.21) önemli ölçüde azalmıştır. Ek olarak, Model grubunda süksinik asit ve esansiyel amino asit L-tryptophan azalma göstermiş, bu durum mikrobiyal fermantasyonun bozulduğuna ve amino asit metabolizmasının değiştiğine işaret etmiştir.
KEGG yolak zenginleştirme analizi
KEGG veritabanı kullanılarak yapılan yol zenginleştirme analizi, PCOS'te belirgin şekilde bozulmuş ve ZeLan tedavisiyle modüle edilmiş birkaç serum metabolik yolunu ortaya çıkarmıştır. Şekil 7'de gösterildiği gibi, steroid hormon biyosentezi, PCOS'in hiperandrojenik fenotipiyle tutarlı olarak en belirgin şekilde zenginleşen yol olarak ortaya çıkmıştır (Rich Factor = 0.80, P < 0.01). Ovaryen steroidogenez yolu da benzer şekilde yüksek düzeyde zenginleşmiş olup (Rich Factor = 0.75, P < 0.01), bu durum ovaryen disfonksiyonda değişmiş androjen sentezinin rolünü yansıtmaktadır. Primer safra asidi biyosentezi belirgin bir zenginleşme göstermiş (Rich Factor = 0.62, P < 0.02), bu da bağırsak mikrobiyotasındaki değişikliklerle ilişkili olabilecek bozulmuş enterohepatik safra asidi dolaşımına işaret etmiştir. Araşidonik asit metabolizması (Rich Factor = 0.56, P < 0.03) ve insülin direnci yolu (Rich Factor = 0.40, P < 0.04) da belirgin şekilde zenginleşerek PCOS'in karakteristik özelliği olan enflamatuar ve metabolik bozuklukların varlığını desteklemiştir. Yağ asidi biyosentez yolu ise düşük düzeyde zenginleşme (Rich Factor = 0.30) göstermiş ve lipid metabolik disregülasyonunun etkili olduğunu düşündürmüştür.
Mikrobiyom-metabolom korelasyon analizi
Bağırsak mikrobiyota kompozisyonu ile metabolik değişimler arasındaki fonksiyonel ilişkileri değerlendirmek amacıyla, farklı bolluk gösteren bakteri cinsleri ile temel metabolitler arasında, yanlış keşif oranı (false-discovery rate) kontrollü Spearman korelasyon analizi gerçekleştirilmiştir. Hiyerarşik olarak kümelenmiş korelasyon ısı haritası, [burada] sunulmuştur. Şekil 8 mikrobiyota-metabolom ilişkilerinin belirgin kalıplarını ortaya koymaktadır. Lactobacillus ve Ruminococcus dahil olmak üzere yararlı bakteriler, litokolik asit (sırasıyla r = 0,72 ve 0,68) ve bütirik asit (sırasıyla r = 0,65 ve 0,60) ile güçlü pozitif korelasyonlar sergilerken; testosteron (r = -0,75 ve -0,80) ve androstenedion (r = -0,68 ve -0,72) ile negatif korelasyonlar göstermiştir. Bu bulgular, taksonomik analizde tanımlanan yararlı bakterilerin, androjenle ilişkili metabolitler ve SCFA ile ilişkili metabolik aktivite ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Aksine, PCOS ile ilişkili Bacteroides, Prevotella ve Escherichia cinsleri zıt korelasyon modelleri sergilemiştir. Bu bakterilerin testosteron (sırasıyla r = 0.85, 0.82 ve 0.60), androstenedion (r = 0.78, 0.75 ve 0.55) ve palmitik asit (r = 0.65, 0.60 ve 0.45) ile pozitif korelasyon gösterdiği, litokolik asit ve bütirik asit dahil olmak üzere faydalı metabolitlerle ise negatif korelasyon sergilediği görülmüştür. Bu korelasyon modelleri, belirli bağırsak mikrobiyal taksonları ile PCOS'un karakteristik metabolik bozuklukları arasındaki fonksiyonel ilişkileri desteklemektedir, ancak doğrudan bir nedensellik kurmamaktadır.
Veri Kullanılabilirliği:
Bu çalışma sırasında oluşturulan ve analiz edilen veri setleri; örnek meta verilerini, fenotip kaynak verilerini, 16S alfa-çeşitlilik indekslerini, filum düzeyindeki bolluk özetlerini, diferansiyel bakteriyel taksa sonuçlarını, metabolomik diferansiyel analiz tablolarını, temsili metabolit sonuçlarını, KEGG yolak zenginleştirme sonuçlarını ve mikrobiyota-metabolit korelasyon matrisini içermektedir. Bu temel kaynak veriler, beraberindeki Ek Dosya 1 olarak sunulmuştur. İşlenmiş diferansiyel metabolit veri seti ise Ek Tablo 1 olarak sunulmuştur.
Şekil 1: Deneysel tasarım ve tedavi zaman çizelgesi. 7 günlük alıştırma süresini, 21 günlük DHEA veya araç enjeksiyon süresini, 28 günlük ZeLan ekstresi veya araç tedavisini ve protokolün 56. gününde serum ve dışkı örneklerinin nihai toplamayı gösteren deneysel iş akışının şematik illüstrasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ZeLan ekstraktının endokrin ve metabolik parametreler üzerindeki etkileri. Müdahale dönemi sonrasında Kontrol, Model ve ZeLan tedavi gruplarındaki (A) serum testosteron konsantrasyonunu, (B) LH/FSH oranını ve (C) vücut ağırlığını gösteren kutu grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bağırsak mikrobiyota alfa çeşitliliği. Kontrol, Model ve ZeLan tedavi grupları arasındaki Shannon çeşitlilik indeksinin karşılaştırılması, bağırsak mikrobiyota alfa çeşitliliğindeki farklılıkları göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Filum düzeyinde bağırsak mikrobiyota kompozisyonu. Kontrol, Model ve ZeLan tedavi gruplarının bağırsak mikrobiyotasındaki baskın bakteriyel filumların göreceli bolluğunu gösteren yığılmış sütun grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: LEfSe analizi ile belirlenen farklı bakteriyel taksonlar. Kontrol ve Model gruplarını ayıran bakteriyel cinsleri belirleyen doğrusal diskriminant analizi etki büyüklüğü (LEfSe). LDA skorları, farklı bolluktaki taksonların etki büyüklüğünü göstermektedir. ZeLan ile ilişkili değişiklikler, Model grubuna göre bolluk kaymaları temel alınarak Sonuçlar bölümünde açıklanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6Diferansiyel metabolit profilleme. Model ve Kontrol grupları arasındaki diferansiyel metabolit özelliklerini gösteren volkan grafiği. Kırmızı ve mavi noktalar, kat değişimi (fold change) ve istatistiksel anlamlılığa bağlı olarak sırasıyla anlamlı düzeyde artmış ve azalmış metabolit özelliklerini temsil etmektedir. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 7KEGG yolak zenginleştirme analizi. Diferansiyel metabolitlerden belirlenen anlamlı düzeyde zenginleşmiş metabolik yolakları gösteren balon grafiği. Balon boyutu eşleşen metabolit sayısını, balon rengi ise yolak zenginleşmesinin istatistiksel anlamlılığını (P-değeri) temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Bağırsak mikrobiyotası ile serum metabolitleri arasındaki korelasyon. Diferansiyel bolluğa sahip bakteri cinsleri ile temsili serum metabolitleri arasındaki Spearman korelasyon katsayılarını gösteren hiyerarşik kümelenmiş ısı haritası. Kırmızı pozitif korelasyonları, mavi ise negatif korelasyonları göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Grup | N | Vücut Ağırlığı (g) | Testosteron (ng/mL) | LH/FSH Oranı | İnsülin (mIU/L) |
| Kontrol | 8 | 227.45 ± 10.12 | 0.51 ± 0.05 | 1.25 ± 0.11 | 12.55 ± 1.12 |
| Model | 8 | 291.12 ± 15.35a | 1.85 ± 0.21a | 3.28 ± 0.25a | 28.95 ± 2.35a |
| ZeLan | 8 | 245.25 ± 10.21b | 0.92 ± 0.12b | 1.85 ± 0.15b | 18.82 ± 1.55b |
| Not: Veriler Ortalama ± SD olarak sunulmuştur. a = p < Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 0,05; b = p < Model grubu ile karşılaştırıldığında 0,05. | |||||
Tablo 1: PKOS sıçanlarında endokrin ve metabolik parametreler. Kontrol, Model ve ZeLan tedavi gruplarında vücut ağırlığı, serum testosteron, LH/FSH oranı ve açlık insülin seviyeleri ölçülmüştür. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur.
| Grup | Shannon İndeksi | Simpson İndeksi | Chao1 Tahmincisi |
| Kontrol | 6.51 ± 0.28 | 0.98 ± 0.01 | 1215.3 ± 45.4 |
| Model | 4.19 ± 0.35a | 0.82 ± 0.03a | 665.8 ± 52.1a |
| ZeLan | 5.79 ± 0.26b | 0.93 ± 0.02b | 963.5 ± 38.6b |
| Not: Veriler Ortalama ± SD olarak sunulmuştur. a = p < Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 0,05; b = p < Model grubuyla karşılaştırıldığında 0,05. | |||
Tablo 2: Bağırsak mikrobiyota alfa çeşitlilik indeksleri. Kontrol, Model ve ZeLan tedavi grupları arasındaki Shannon indeksi, Simpson indeksi ve Chao1 tahmincisinin karşılaştırılması. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur.
| Metabolit Adı | HMDB Kimliği | Sınıf | Trend (Model ile Kontrol Karşılaştırması) | p-değeri | VIP Skoru |
| Testosteron | HMDB0000286 | Steroid | Yukarı ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstenedion | HMDB0000055 | Steroid | Yukarı ↑ | < 0.001 | 2.34 |
| Palmitik asit | HMDB0000220 | Yağ Asidi | Yukarı ↑ | < 0.001 | 2.12 |
| Araşidonik asit | HMDB0001043 | Yağ Asidi | Yukarı ↑ | 0.003 | 1.89 |
| Prostaglandin E2 | HMDB0001036 | Lipid | Yukarı ↑ | < 0.001 | 2.05 |
| Litokolik asit | HMDB0000752 | Safra Asidi | Aşağı ↓ | < 0.001 | 2.45 |
| Bütirik asit | HMDB0000039 | Kısa Zincirli Yağ Asitleri | Aşağı ↓ | < 0.001 | 2.21 |
| Süksinik asit | HMDB0000254 | Organik Asit | Aşağı ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Triptofan | HMDB0000929 | Amino Asit | Aşağı ↓ | 0.015 | 1.58 |
| Not: VIP = Projeksiyonda Değişken Önemi (Variable Importance in Projection) > 1 anlamlı kabul edildi). | |||||
Tablo 3: Temsili diferansiyel serum metabolitleri. HMDB tanımlayıcıları, metabolit sınıfı, regülasyon eğilimi, P-değeri ve VIP skorunu içeren, PCOS ile ilişkili ve ZeLan ekstresi tarafından regüle edilen temsili açıklanmış metabolitler. Açıklanmış 52 metabolit özelliğinin tam listesi Ek Tablo 1'de sunulmuştur.
Ek Tablo 1: Tam açıklanmış metabolit veri seti. Metabolit adı, HMDB tanımlayıcı, biyokimyasal sınıf, kat değişimi (fold change), P-değeri ve regülasyon yönü dahil olmak üzere, metabolomik raporlama için tutulan 52 açıklanmış metabolit özelliğinin tam listesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Deneysel, mikrobiyom ve metabolomik analizleri destekleyen kaynak veriler. Bu çalışma kitabı; makalede sunulan şekil ve tabloların oluşturulmasında kullanılan örnek bilgilerini, klinik fenotip ölçümlerini, 16S rRNA sekanslama çeşitlilik indekslerini, filum düzeyindeki mikrobiyal bağıl bolluğu, LEfSe diferansiyel takson analizini, metabolomik diferansiyel analizini, temsili metabolitleri, KEGG yolak zenginleştirme analizini, korelasyon matrisi verilerini ve veri doğrulama özetini içermektedir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Tartışma
Bu çalışma, ZeLan ekstraktının DHEA ile indüklenen bir sıçan modelinde PCOS ile ilişkili endokrin ve metabolik fenotipleri iyileştirdiğine ve bu etkilerin bağırsak mikrobiyota kompozisyonu ve serum metabolik profillerindeki olumlu değişikliklerle ilişkili olduğuna dair kanıtlar sunmaktadır. Entegre multi-omik yaklaşım, ZeLan tedavisinin hiperandrojenemiyi, yükselmiş LH/FSH oranını ve insülin direncini iyileştirdiğini; aynı zamanda bağırsak mikrobiyal alfa çeşitliliğini kısmen geri kazandırdığını, mikrobiyal kompozisyonu yeniden dengelediğini ve PCOS patofizyolojisinde rol oynayan çeşitli metabolik yolakları normalize ettiğini göstermiştir. Bu bulgular, geleneksel Çin bitkisel ilaçlarına verilen biyolojik yanıtlara ilişkin mevcut anlayışı genişletmekte ve PCOS müdahalesi için potansiyel bir hedef olarak bağırsak-yumurtalık ekseninin daha fazla araştırılmasını desteklemektedir.
ZeLan tedavisi sonrası serum testosteronunda ve LH/FSH oranında görülen azalma, flavonoidler ve fenolik bileşikler içeren botanik ekstraktların anti-androjenik özelliklerini gösteren önceki araştırmalarla uyumludur16. PCOS üzerinde bitkisel tıp uygulamalarına ilişkin klinik çalışmaların kapsamlı bir incelemesi, botanik müdahaleler genelindeki endokrin ve metabolik iyileşmeleri özetlemiştir17. ZeLan'ın androjen biyosentezini modüle etme mekanizması; over steroidojenik yollar üzerindeki doğrudan etkileri, sistemik anti-inflamatuar ve insülin duyarlılaştırıcı etkileri veya bağırsak mikrobiyal metabolitleri ile ilişkili dolaylı etkileri içerebilir ve mevcut tasarım bu olasılıkları tamamen birbirinden ayıramaz. LH/FSH oranındaki iyileşme, PCOS'ta yaygın olarak düzensiz olan hipotalamus-hipofiz-gonadal aks fonksiyonunun kısmen geri döndüğünü göstermektedir18. PCOS için geleneksel Çin tıbbı formülleri üzerine yapılan hayvan deneylerinin sistematik incelemeleri de reprodüktif ve endokrin indekslerde iyileşmeler bildirmiştir19. İnsülinle ilişkili indekslerdeki eş zamanlı iyileşme, ZeLan'ın endokrin düzenlemenin ötesinde, potansiyel olarak artan periferik insülin sinyali yoluyla veya insülin reseptör fonksiyonunu bozan inflamatuar medyatörlerin azalmasıyla metabolik faydalar sağlayabileceğini göstermektedir20.
ZeLan tedavisi sonrası bağırsak mikrobiyal alfa çeşitliliğinin geri kazanılması, mikrobiyomla ilişkili bir yanıtla tutarlıdır. PCOS model farelerinde gözlenen azalmış alfa çeşitliliği, hem deneysel PCOS modellerinde hem de klinik popülasyonlarda bağırsak disbiyozunu belgeleyen genişleyen literatürle uyumludur21. Insenser ve ark. ayrıca PCOS'taki bağırsak mikrobiyota profillerinin cinsiyet, seks hormonları ve obeziteden etkilendiğini bildirmiştir22. ZeLan tedavisinin Shannon indeksini 4.19'dan 5.79'a kısmen geri döndürdüğüne dair gözlemimiz, bu botanik ekstraktın mikrobiyal topluluk yapısını destekleyebileceğini göstermektedir. Potansiyel olarak patojenik taksonları baskılarken faydalı bakteri popülasyonlarını seçici olarak teşvik edebilen diğer polifenol açısından zengin bitki ekstraktları için de benzer çeşitlilik geri kazandırıcı etkiler bildirilmiştir23. Filum düzeyinde gözlenen taksonomik kaymalar, özellikle ZeLan tedavisi sonrası azalan Firmicutes/Bacteroidetes oranı; yüksek F/B oranları ile obezite ve insülin direnci dahil olmak üzere metabolik disfonksiyon arasındaki yerleşik ilişki göz önüne alındığında önem taşımaktadır24. Jobira ve ark.'nın PCOS'lu ergenler üzerindeki çalışması da dahil olmak üzere ek çalışmalar, gastrointestinal mikrobiyal biyodeşitliliğin değiştiğini bildirmiş ve mikrobiyal kompozisyonun konakçı metabolizmasıyla olan biyolojik ilişkisini desteklemiştir25.
PCOS ve ZeLan tedavisi ile farklı şekilde ilişkilendirilen spesifik bakteri cinslerinin tanımlanması, bu çalışmada gözlemlenen mikrobiyota-metabolom ilişkileri için biyolojik bir bağlam sağlamaktadır. Sağlıklı kontrollerde Lactobacillus ve Ruminococcus'un zenginleşmesi ve PCOS'lu hayvanlarda azalması, bu cinslerin koruyucu rollerini vurgulayan önceki raporlarla uyumludur26. Lactobacillus türleri, bağırsak bariyer bütünlüğünü koruyan ve patojenik bakterileri baskılayan laktik asit ve antimikrobiyal peptid üretimi ile bilinirken, Ruminococcus türleri diyet liflerinin fermantasyonu yoluyla kısa zincirli yağ asitlerinin önemli üreticileridir27. ZeLan tedavisi sonrası bu faydalı cinslerin geri kazanılması, metabolomik analizde gözlemlenen bütirik asit seviyelerindeki artışın da yansıttığı üzere, bağırsak bariyer fonksiyonunu iyileştirebilir ve SCFA ile ilişkili metabolik aktiviteyi artırabilir. Aksine, PCOS'lu hayvanlarda Bacteroides, Prevotella ve Escherichia bolluğunun artması, bu cinsleri inflamatuar ve metabolik bozukluklarla ilişkilendiren çalışmalarla örtüşmektedir28. Özellikle Escherichia coli olmak üzere Escherichia türleri, Toll-benzeri reseptör 4 sinyalleri aracılığıyla sistemik inflamasyonu ve insülin direncini tetikleyebilen lipopolisakkarit üretebilir; bu durum, bağırsak disbiyozu ile PCOS ile ilişkili metabolik disfonksiyon arasında makul bir bağlantıyı temsil etmektedir29.
Metabolomik bulgular, ZeLan tedavisine eşlik eden bağırsak mikrobiyotası-konakçı metabolik ilişkilerine dair kanıtlar sunmaktadır. Litokolik asit gibi sekonder safra asitlerindeki değişiklikler, bu metabolitlerin bakteriyel enzimatik aktivite yoluyla üretilmesi nedeniyle biyolojik olarak önem taşımaktadır30. Safra asitleri sadece lipid absorbsiyonunda değil, aynı zamanda farnesoid X reseptörü ve Takeda G proteini kenetli reseptör 5 aracılığıyla glukoz ve lipid metabolizmasını düzenleyen sinyal molekülleri olarak da görev yaparlar; bu durum, safra asidi profillerinin normalleşmesinin metabolik homeostazın iyileşmesine katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde, bütirik asit seviyelerinin yeniden düzenlenmesi; bağırsak bariyer fonksiyonunun geliştirilmesi, antiinflamatuar özellikler ve insülin duyarlılığının artırılması dahil olmak üzere çok sayıda faydalı etkisi göz önüne alındığında önem arz etmektedir. Yararlı bakteriler ile koruyucu metabolitler arasında gözlemlenen korelasyonların, patojenik bakteriler ile zararlı metabolitler arasındaki ilişkilerin aksine ortaya çıkması, doğrudan mekanistik doğrulama ihtiyacını vurgularken bağırsak-yumurtalık ekseni hipotezi için ilişkisel destek sağlamaktadır.
Bu bulguların klinik yansımaları, preklinik keşifsel tasarımın sınırları dahilinde yorumlanmalıdır. Sonuçlar, özellikle hem endokrin-metabolik indeksleri hem de bağırsak mikroçevresini etkileyebilecek botanik müdahaleler kapsamında, ZeLan ekstraktının PCOS yönetimi için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak daha fazla değerlendirilmesini desteklemektedir. Tedavi yanıtıyla ilişkili mikrobiyal ve metabolik biyobelirteçlerin belirlenmesi, gelecekteki mekanistik ve translasyonel çalışmalara yön vermeye yardımcı olabilir. Ayrıca, bağırsak-over aksı nihayetinde ZeLan'ın probiyotikler veya diyet modifikasyonları ile entegre edildiği kombinasyon stratejilerini destekleyebilir, ancak bu tür stratejiler klinik uygulama öncesinde kontrollü doğrulamalar gerektirmektedir.
Bu çalışmanın birkaç kısıtlamasının kabul edilmesi gerekmektedir. İlk olarak, DHEA ile indüklenen sıçan modeli insan PCOS'unun birçok özelliğini tekrarlasa da, zayıf, obez, insülinle dirençli ve inflamatuar alt tipler dahil olmak üzere insan PCOS fenotiplerinin heterojenliğini tam olarak yansıtmamaktadır; bu nedenle, klinik çeviri iyi karakterize edilmiş hasta popülasyonlarında doğrulama gerektirmektedir. İkinci olarak, çalışmada doz-yanıt gradyanı veya metformin gibi pozitif bir ilaç kontrolü olmaksızın tek bir ZeLan dozu kullanılmıştır, bu nedenle etkili doz aralığı, karşılaştırmalı etkinlik ve optimal uygulama döngüsü henüz belirlenmemiştir. Üçüncü olarak, örnekleme yalnızca bitiş noktasında yapılmış olup bu durum, müdahale süresince mikrobiyota, metabolitler ve hormon profillerindeki dinamik zamansal değişikliklerin yorumlanmasını sınırlamaktadır. Dördüncü olarak, yumurtalık histopatolojisi, folikül sayıları, korpus luteum kantifikasyonu ve seri östrus döngüsü izlemi bu deneysel tasarıma dahil edilmemiştir; dolayısıyla, ovaryen fonksiyonel iyileşme, doğrudan doku ve döngü düzeyindeki değerlendirmelerden ziyade endokrin ve metabolik indekslerden çıkarılmıştır. Beşinci olarak, çalışma mikrobiyal taksonlar ve metabolitler arasındaki korelasyonları belirlemiş ancak dışkı mikrobiyota transplantasyonu, germ-free hayvan deneyleri, hedeflenmiş metabolit takviyesi, inflamatuar marker analizleri veya CYP17A1, CYP19A1 ve StAR gibi ovaryen steroidojenik enzim ölçümlerine yer vermemiştir; sonuç olarak, mevcut verilerle nedensel mekanizmalar onaylanamaz. Altıncı olarak, hedeflenmemiş metabolomik keşif düzeyinde kanıt sağlar ve litokolik asit, bütirik asit ve testosteron gibi temel metabolitlerin hedeflenmiş kantitatif doğrulaması gelecek çalışmalarda gereklidir. Yedinci olarak, beta-çeşitlilik görselleştirmesi, mikrobiyal fonksiyonel öngörü ve entegre mikrobiyota-metabolit-gen yolak modellemesi mevcut gönderim için mevcut değildir ve bu durum eksiksiz bir düzenleyici ağ oluşturma yeteneğini sınırlamaktadır. Son olarak, ZeLan ekstraktı toplam flavonoid içeriğine göre standardize edilmiştir, ancak aktif monomerlerin kapsamlı kalitatif ve kantitatif fitokimyasal karakterizasyonu hala gereklidir.
Sonuç olarak, ZeLan ekstraktı bir sıçan modelinde PCOS ile ilişkili endokrin ve metabolik fenotipleri iyileştirmiş; bağırsak mikrobiyal alfa çeşitliliğinin kısmen geri kazanılması, mikrobiyal kompozisyonun değişmesi ve steroid hormon biyosentezi, safra asidi metabolizması ve kısa zincirli yağ asidi ile ilişkili metabolizma dahil olmak üzere serum metabolik yolaklarının modülasyonu ile ilişkilendirilmiştir. Yararlı bakteriler ile koruyucu metabolitler arasındaki gözlemlenen korelasyonlar, PCOS ile zenginleşmiş bakteriler ile zararlı metabolitler arasındaki ilişkilerin aksine, biyolojik olarak makul bir bağırsak-yumurtalık ekseni ilişkisini desteklemektedir. Bu bulgular, nedensel doğrulamaya ve daha geniş fitokimyasal karakterizasyona duyulan ihtiyacı vurgularken, PCOS yönetiminde ZeLan ekstraktının gelecekteki mekanistik ve translasyonel çalışmaları için bir temel oluşturmaktadır.
Açıklamalar
Yazarlar beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Hebei Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Yönetimi Bilimsel Araştırma Planlama Projesi (Hibe No. 2021316) tarafından finanse edilmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Asetonitril | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Optima LC-MS derecesi, 4 L; mobil faz ve numune yeniden çözme |
| ACQUITY UPLC HSS T3 kolonu | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm; UHPLC ayırımı |
| Agaroz jel elektroforez sistemi | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Mini-Sub Cell GT yatay elektroforez sistemi; DNA kalite değerlendirmesi |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | 6550 iFunnel Q-TOF MS'ye bağlı 1290 Infinity II UHPLC modül seti; serum hedef dışı metabolomik platformu |
| DADA2 algoritması | Bioconductor | Sürüm 1.24.0 | ASV üretimi ve kimera giderimi; R 4.2.1/Bioconductor 3.15 iş akışıyla uyumlu olduğu varsayılan sürüm |
| Dehidroepiandrosteron (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | PCOS model indüksiyonu; 6 mg/100 g vücut ağırlığı; CAS 53-43-0 |
| Distile su | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | UltraPure DNase/RNase-Free Distile Su; Kontrol ve Model gruplarında oral gavage için taşıyıcı |
| Formik asit | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Optima LC-MS derecesi, 50 mL; LC-MS mobil fazları için %0.1 katkı maddesi |
| Human Metabolome Database | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Metabolit anotasyon veri tabanı |
| Illumina NovaSeq 6000 platformu | Illumina | 20012850 | Paired-end 250 bp 16S rRNA sekanslaması için sekanslama servis sağlayıcısı tarafından kullanılan sekanslama sistemi |
| Lycopus lucidus Turcz. ottu | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Parti ZL-20230315 | ZeLan sulu ekstraktı için doğrulanmış botanik hammadde |
| Metanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Optima LC-MS derecesi, 4 L; serum metabolomikleri için protein çöktürme |
| METLIN veri tabanı | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Metabolit kütle-spektral anotasyon veri tabanı |
| NanoDrop spektrofotometresi | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | NanoDrop One mikro hacimli UV-Vis spektrofotometresi; DNA miktar ve saflık değerlendirmesi |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Sekal içeriklerinden DNA ekstraksiyonu; 50-hazırlıklı dışkı DNA kiti |
| QIIME2 | QIIME2 geliştirme ekibi | Sürüm 2022.2 | 16S rRNA sekans işleme |
| R yazılımı | R Foundation | Sürüm 4.2.1 | İstatistiksel analiz ve XCMS işleme |
| Testosteron, LH, FSH ve insülin için serum ELISA kitleri | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Serum hormon ve insülin kantifikasyonu için sıçan testosteron, LH, FSH ve insülin ELISA kitleri |
| Susam yağı | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | DHEA enjeksiyonu için taşıyıcı |
| Sodyum pentobarbital | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestezi; 50 mg/kg intraperitonal |
| SPSS yazılımı | IBM Corporation | Sürüm 26.0 | İstatistiksel analiz |
| Evrensel 16S rRNA primerleri 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Özel sentez: 338F/806R | V3-V4 bölgelerinin amplifikasyonu; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| XCMS paketi | Bioconductor / R | Sürüm 3.18.0 | Pik saptama, retansiyon zamanı hizalama ve entegrasyon |
| ZeLan ekstraktı | Kurum içi sulu ekstrakt | Parti ZLE-20230402 | Oral gavage tedavisi; standardize toplam flavonoidler ≥2.5% |
Kaynaklar
- Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
- Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
- Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
- Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
- Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
- Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
- Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
- Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
- Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
- Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
- He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
- Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
- Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
- Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
- Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
- Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
- Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
- McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
- Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
- Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
- Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
- Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
- Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
- Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
- Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
- Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
- Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
- He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
- Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
- Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste