Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Escherichia coli'den Membrana Bağlı Proteaz FtsH ve Adaptör LapB ile LpxC Bozunması İçin Vitro Testi

165 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

22 Haziran 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Escherichia coli , lipopolisakkarit (LPS) biyosentezini öncelikle LPS sentezinin ilk belirlenmiş adımını katalize eden deasetilaz olan LpxC'nin bozulmasını kontrol ederek düzenler. Bu protokolün amacı, proteoliposomlarda yeniden oluşturulmuş AAA+ proteaz FtsH ve adaptör LapB kullanılarak LpxC için hassas, nicel bir in vitro bozulma testi oluşturmaktır.

Özet

Bu protokol, proteoliposomlarda yeniden oluşturulmuş AAA+ (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPaz) proteaz FtsH ve adaptör LapB kullanılarak hassas ve nicel in vitro LpxC bozulma testi sunmaktadır. AAA+ proteazlar, protein homeostazını koruyan ve sitoplazmada veya hücre zarlarında çeşitli hücresel süreçleri düzenleyen ATP'ye bağımlı moleküler makinelerdir. Sitoplazmik muadillerine kıyasla, membrana bağlı AAA+ proteazlar, in vitro aktivitelerinin yeniden oluşturulması ve ölçülmesindeki teknik zorluklar nedeniyle kötü karakterize edilmemiştir. Burada, proteolipozomlarda floresans tabanlı bir bozulma testi geliştirmek için model olarak FtsH–LapB–LpxC sistemini kullanıyoruz. FtsH ve LapB, doğal membran ortamını taklit etmek için proteoliposomlara yeniden oluşturulur ve LpxC, floresan boya Atto488 ile kovalent olarak etiketlenir. Bozulma, proteoliposomların etiketli LpxC ve ATP ile birleştirilmesiyle başlar ve trikloroasetik asit (TCA) ile sonlandırılır. Başarılı bir test, TCA çökelmesinden sonra çözünür süpernatan fraksiyonunda zamana bağlı bir floresans artışıyla tanımlanır; bu, LpxC proteoliziyle üretilen floresan peptid parçalarının salınmasına karşılık gelir. Bu sinyal, tanımlanmış koşullar altında başlangıç bozulma oranlarının doğrudan nicelendirilmesini sağlar. Geleneksel sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) bazlı testlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem önemli ölçüde daha iyi hassasiyet sağlar ve nicel kinetik analizi mümkün kılar. Ayrıca, proteolipozom sistemi, adaptörler ve anti-adaptörler gibi protein bileşenlerinin ve lipid bileşiminin LpxC bozulmasını nasıl etkilediğine dair sistematik bir incelemeye olanak tanır. FtsH–LapB–LpxC sistemi için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu test diğer membrana bağlı AAA+ proteazlar ve substratlara kolayca uyarlanabilir ve in vitro membranla ilişkili proteolizi incelemek için genel bir platform sağlar.

Giriş

AAA+ proteazlar, protein kalite kontrolü ve düzenleyici proteolizde merkezi roller oynayan, korunan, ATP'ye bağımlı molekülermakineler 1,2. Bu makineler, ATP'yi hidrolize eden, tanımayı, açılan ve substratları parçalanma için bölmesel proteaz alanına dönüştüren AAA+ ATPazlar domeninden oluşan heksamerik bir halka içerir. ClpXP3 ve Lon4 gibi sitoplazmik AAA+ proteazlar, iyi kurulmuş in vitro testlerle kapsamlı şekilde karakterize edilmiş olsa da, membrana bağlı AAA+ proteazlar nispeten az anlaşılmaktadır. Bu boşluk, membran proteinlerinin tanımlanmış lipid ortamlarına yeniden oluşturulması ve proteolitik aktivitelerinin in vitro olarak nicel olarak ölçülmesiyle ilgili teknik zorlukları büyük ölçüde yansıtmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, membrana bağlı proteazların proteolitik aktivitesini araştırmak için hassas, nicel testler oluşturmaktır.

FtsH, Escherichia coli'de tek temel AAA+ proteazdır ve prototipik bir zar bağlanmış AAA+ proteaz 5,6,7 olarak hizmet eder. İç zara N-terminal transmembran helisleri ile sabitlenen FtsH, çeşitli sitoplazmik ve membranla ilişkili substratlar setini bozur ve böylece membran protein kalite kontrolü, stres yanıtları ve lipidhomeostazı 8,9,10,11 düzenler. En iyi karakterize edilen substratlarından biri, lipopolisakkarit (LPS) biyosentezinin ilk belirlenmiş adımını katalize eden çözünür bir deasetilazolan LpxC'dir. 12,13. FtsH ile LpxC'nin verimli şekilde parçalanması için membran proteini LapB'yi gerektirir; bu protein, LpxC'yi özel olarak tanıyan veproteaz 14,15,16,17,18'e iletmek için bir adaptör olarak işlev görür.

Fizyolojik önemine rağmen, FtsH aracılı proteolizin in vitro nicel analizi, özellikle LpxC gibi sitoplazmik substratlar için sınırlı olmuştur. Geleneksel in vitro bozulma testlerinde, zar sabitlenmiş proteaz için membran ortamı sağlamayan deterjanmiselleri 13,19'da saflaştırılmış FtsH kullanılır. Ayrıca, bozulma testleri genellikle SDS–PAGE tabanlı substratkayboluşu 13 tespitine dayanır; bu da emek yoğun olabilir, düşük verimliliğe sahip ve kinetik analizler için yeterince hassas olmayabilir. Daha yakın zamanda, FtsH'nin bisel haline yeniden yapılandırılması, Heedeok Hong'un grubu20'nin öncüllüğünde membran substratlarının bozulmasını incelemek için kullanılmıştır; ancak sitoplazmik substratların analizi için benzer bir sistem hâlâ eksik olarak bulunmamaktadır. Burada, Heedeok Hong'un bicelle yeniden yapılanmasını, membran ortamını taklit edecek şekilde proteoliposom yeniden yapılandırılmasına uyarlıyoruz. Bunun yanı sıra, suda çözüneýän alt tabaka LpxC floresans etiketiyle işaretlenmiştir; bu da LpxC'nin in vitro olarak FtsH/LapB-e bağlı parçalanma kinetiklerinin hassas ve nicel ölçümünü sağlar.

Bu yöntem, araştırmacıların suya çözünen substratların FtsH aracılı proteolizini nicel olarak ölçmesi gerektiğinde kullanılmalıdır. Mevcut yaklaşımlara göre çeşitli avantajlar sağlar. Birincisi, proteolitik ürünlerin floresans tabanlı tespiti, substrat kaybı yerine, hassasiyeti ve dinamik aralığı önemli ölçüde iyileştirir ve proteolitik aktivitenin nicel karşılaştırmalarını kolaylaştırır. İkinci olarak, proteoliposomların kullanımı, FtsH fonksiyonu için gereken membran bağlamını korur ve protein ile lipid bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlar18. Son olarak, FtsH–LapB–LpxC sistemi kullanılarak geliştirilmiş olmasına rağmen, bu protokol zarla ilişkili bozunma mekanizması gerektiren diğer membrana bağlı AAA+ proteazlar ve onların sitoplazmik substratlarına kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. LpxC'nin Atto488 ile Etiketlenmesi

  1. LpxC hazırlığı
    1. Daha önce bildirildiği gibi LpxC proteinini eksprese edin vearındırın 18. Saflaştırılmış LpxC tamponunu Tris'ten 50 mM fosfat tamponuna, pH 7.6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) yüksek çözünürlüklü jel filtrasyon kolonu (örneğin, Superdex 200 Increase 10/300 GL kolonu) ile jel filtreleme ile değiştirin.
    2. LpxC'yi ultrafiltrasyon kolonu kullanarak 4 °C'de en az 5 mg/mL nihai konsantrasyona konsantrasyon elde edin.
  2. LpxC'nin Atto488 ile Etiketlenmesi
    1. 0,5 mg LpxC'yi 50 mM fosfat tamponunda (pH 7,6) son hacmi 225 μL olarak seyreldin. 25 μL 1 M sodyum bikarbonat ekleyin ve pH yaklaşık 8,3'e ayarlanır.
    2. 0,24 mg Atto488 reaktif boyasını 20 μL 0,1 M sodyum bikarbonat tamponunda çözünerek stok çözeltisi (0,012 mg/μL) hazırlanır. Stok çözeltisinin 2 μL'sini 18 μL 0,1 M sodyum bikarbonat tamponu ile seyreltileyerek çalışma çözeltisi hazırlanır ve nihai konsantrasyon 0,0012 mg/μL elde edilir.
    3. Hemen protein çözeltisine 4 μL Atto488 çalışma çözeltisi eklenin (LpxC'nin molyar oranına karşılık: Atto488 3:1). Tüpü alüminyum folyoyla sarın ve 4 °C'de 2 saat boyunca hafif bir çaltlama (18 rpm) inkübe yapın.
      NOT: Hem Atto488 stok hem de çalışan çözelti sıvı azotta flaş dondurulabilir ve -80 °C sıcaklıkta saklanabilir.
  3. LpxC–Atto488'in serbest boyadan ayrılması
    1. Bir PD-10 tuz arındırma kolonunu 10 mL ultra saf su ile dengeleyin, ardından 15 mL 50 mM fosfat tamponu (pH 7,6) eklenin.
    2. Etiketleme reaksiyon karışımını kolona uygulayın ve reçineye tamamen girmesine izin verin.
    3. 5 mL 50 mM fosfat tamponu ile elyut, pH 7.6. LpxC–Atto488 (birinci bant) ve serbest Atto488 boyası (ikinci bant) ile eşleşen iki ayrı bant görünür hale gelmelidir. Birinci banttan ~0.5 mL aliquotlarda kesirleri toplayın.
    4. SDS-PAGE ile elütlenmiş kesirleri analiz et. UV aydınlatması altında floresansı görselleştirin, ardından Coomassie Brilliant Blue (CBB) boyama yapılmasını yapın.
    5. LpxC–Atto488 içeren fraksiyonları biriktirin ve etiketlenmiş proteini yaklaşık 2 mg/mL olarak yoğunlaştırın.
    6. Protein konsantrasyonunu ve Atto488 konsantrasyonunu mikrohacim spektrofotometre kullanarak ölçülerek etiketleme verimliliğini tahmin edin.
      NOT: Atto488 konsantrasyonu (pmol/μL cinsinden) ile LpxC konsantrasyonu (mg/mL cinsinden) oranı 2–5 aralığında uygun bir etiketleme seviyesini gösterir. Bu, etiketlemeden sonra Atto488 ile LpxC arasında 1:15 ile 1:6 arasında molar oranına karşılık gelir.
    7. Aliquot LpxC–Atto488 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine alınır, sıvı azotta hızlı dondurulur ve -80 °C'de saklanır. Bu noktada protokol 3 aya kadar duraklatılabilir.
      DIKKAT: Sıvı azot son derece soğuktur; Uygun koruyucu ekipmanla (kriyo-eldiven, göz koruması) kullanın.

2. FtsH/LapB'nin proteoliposomlara yeniden yapılandırılması

  1. Lipozom hazırlığı
    1. 100 mg 1-Palmitoil-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) kloroformda cam bir test tüpüne aktarın. Çözücüyü hafif bir N₂ akışı altında buharlaştırın, ardından gece boyunca vakumda kuruttur.
      NOT: POPC'nin faz geçiş sıcaklığı ~-2 °C'dir ve zar biyofiziğinde, lipozom formülasyonlarında ve hücre model sistemlerinde yaygın olarak kullanılır.
      DIKKAT: Kloroform gözlere, cilde, karaciğere, böbreklere ve sinir sistemine zarar verebilir. Taşıma sırasında uygun koruyucu ekipman (eldiven, göz koruma, maske) gereklidir. Cam şırıngayla bir kapüşonda tutun.
    2. Kurutulmuş POPC filmine 1.315 μL tampon A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) ekleyin. Lipidleri, maksimum hızda 1 dakika su banyosu sonikasyonu ile 1 dakika vortexing arasında dönüşümlü olarak tekrar askıya alın, toplamda ~15 dakika veya tamamen dağınılana kadar. (nihai lipid konsantrasyonu: 100 mM).
      NOT: Lipid resüspansiyonunu artırmak için, su banyosu sonikatorunda cam test tüpünün daldırma derinliğini ayarlayarak tahrikasyonu en üst düzeye çıkarın. Yeniden askıya alınmış lipidler -20 °C'de depolanabilir. Bu noktada protokol 1 aya kadar duraklatılabilir.
    3. Lipozom süspansiyonunu 200 μL porsiyonlara ayırın ve -20 °C'de saklayın.
  2. Lipozom ekstrüzyonu
    1. 200 μL lipozom aliquotunu oda sıcaklığında su banyosunda eritin ve 800 μL tampon A ile son hacmi 1 mL'ye kadar seyreltirin.
    2. Lipozomları, oda sıcaklığında sıvı azot ve su banyosu arasında dönüşümlü olarak üç donma-erime döngüsüne tabi tutun.
    3. Durulama şırıngaları, iki filtre desteği ve 200 nm polikarbonat membran ile tampon A. Mini-ekstruderi monte edin ve lipozomları 20 kez ekstrüze edin.
      NOT: Lipozom süspansiyonu, ekstrüzyondan sonra şeffaf görünmelidir.
    4. 1 mL ekstrüze edilmiş lipozom süspansiyonunu üç tüpe (tüp başına 330 μL) bölün ve her birini 600 μL tampon A ile seyreltin.
  3. Triton X-100 şişme titrasyonu
    NOT: Triton X-100, düşük kritik misel konsantrasyonlu (CMC) bir deterjandır ve birçok durumda en başarılı olduğukanıtlanmış 21
    DIKKAT: Triton X-100 tehlikeli bir kimyasaldır ve yutulduğunda öncelikle ciddi göz hasarı, cilt tahrişi ve zararlı etkilere neden olur. Taşıma sırasında uygun koruyucu ekipman (eldiven, göz koruma) gereklidir.
    1. 100 μL Triton X-100 ile 900 μL ultrasaf su karıştırarak ve bir çalkalayıcıda kuluçka geçirerek Triton X-100'ü %100 (v/v) hazırlayın.
    2. Lipozomların 540 nm (A₅₄₀) soğurgunluğunu spektrofotometre kullanarak ölçün.
    3. %10 Triton X-100 içeren 5 μL aliquot ardışık ekleyin, her eklemeden sonra nazikçe karıştırın ve A₅₄₀ ölçün. Triton X-100'ü A₅₄₀ maksimuma ulaşana kadar eklemeye devam edin, ardından Triton X-100'ü 4–5 kez ek ekleyin ve absorbans yaklaşık %60'ına düşene kadar.
    4. Titrasyon eğrisine göre, lipozomları %10 10 Triton X-100 ekleyerek şişirin ve oda sıcaklığında 1 saat hafif çalkalama ile kuluçka yapın.
  4. FtsH/LapB'nin lipozomlara yeniden yapılandırılması
    1. Daha önce tarif edildiği gibi FtsH ve LapB proteinlerini eksprese edipsaflaştırmak 18.
    2. ~2 g polar olmayan polistiren adsorbentini (örneğin, Bio-Beads SM-2) bir kez 10 hacim metanol, bir kez 10 hacim etanol ile ve on kez 10 hacim ultra saf su ile yıkayın. Yıkanmış adsorbenti tampon A'da 4 °C'de sakla.
    3. Her Triton X-100–şişmiş lipozom tüpü için 3 μL 500 mM tris(2-karboksîtil)fosfin (TCEP), 22,5 μg FtsH ve 22,5 μg LapB ekleyin. Toplam hacmi tampon A ile 1 mL'ye ayarlayın ve RT'de hafif çalkalama ile 1 saat kuluçka yapın.
      NOT: Proteoliposomlarınyeniden yapılandırılması 21 sırasında rutin olarak 1:20 ile 1:200 (wt/wt) protein-lipid oranları kullanılmıştır. Burada 1:100 oranı kullanılır.
    4. Deterjanı polar olmayan polistiren adsorbentle sıralı inkubasyon yoluyla çıkarın: 40 mg RT'de 0,5 saat, ardından 40 mg RT'de 1 saat, ardından 40 mg 4 °C'de gece boyunca ve son olarak 40 mg 4 °C'de 1 saat boyunca.
    5. Kısa bir süreliğine santrifüj yaparak polar olmayan polistiren adsorbentini 4 °C'de (3 saniye boyunca 400 × g) pellet edin. Süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Kutup dışı polistiren adsorbenti 1 mL tampon A ile yıkayın ve yıkamayı üst örtü ile birleştirin. Nihai hacme ek tampon A ekleyin ~6 mL.
      NOT: Güvenlik için ultrasantrifüj tüpleri en az 6 mL sıvı içermelidir.
    6. Tüpleri dengeleyin ve ultrasantrifüjü 250.000 × g sıcaklığında 4 °C'de sabit açılı bir rotorda (örneğin MLA-80) 45 dakika boyunca pellet proteoliposomlara dönüştürün.
    7. Süpernatantı atıp proteolipozom pelletini 70 μL tampon A ile 1 mM TCEP takviyesinde yeniden askıya alın.
      NOT: Son proteoliposom hacmi yaklaşık 100 μL'dir.
    8. Proteoliposomları sıvı azotta ani dondurup -80 °C'de depolayın.
      NOT: Bu noktada, protokol 1 aya kadar duraklatılabilir.
  5. Proteoliposomların SDS-PAGE analizi
    1. Proteoliposomları iyice karıştırın ve 5 μL örnek ile 5 μL 2× SDS yükleme tamponu (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, %5 SDS, %20 gliserol, %0,01 bromofenol mavi, 200 mM DTT) birleştirin.
    2. Proteolipozom örnekleri %4–20 SDS-PAGE jeline 525 ng FtsH (20 μL'de 0,06 μM FtsH heksamerine karşılık) ile birlikte yükleyin.
    3. Jeli CBB ile boyayın.
    4. Jeli tarayın ve her örnek için FtsH bant yoğunluğunu niceleştirin. 525 ng FtsH'ye eşdeğer proteoliposom süspansiyon hacmini hesaplayın.

3. LpxC–Atto488'in in vitro degradasyonu

  1. Bozunma tamponu içinde FtsH/LapB proteolipozomları (0,06 μM FtsH'ye karşılık gelir) ve 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 içeren 20 μL reaksiyonunda in vitro bozulma testleri yapmak (50 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM Mg-asetat, 5 mM ATP, 25 μM Zn-asetat, 80 mM NaCl, 1.4 mM β-merkaptoetanol).
  2. Her bir substrat konsantrasyonunun ölçümü için 70 μL'lik bir reaksiyon hazırlanır.
    1. 20 μL bir fraksiyon alın ve hemen 48 μL %5 trikloroasetik asit (TCA) ile 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (0 dakika) karıştırarak söndürün. İkinci ve üçüncü fraksiyonları alıp sırasıyla 10 ve 20 dakikada söndürün.
    2. Paralel olarak, arka plan çıkarma için proteolipozom eksikliği olan ilgili kontrol reaksiyonları hazırlanır.
      NOT: Güvenilir sonuçlar elde etmek için üç tekrarlanmış ölçüm önerilir.
      LpxC–Atto488 ile çalışırken ışık maruziyetini en aza indirin.
      DIKKAT: TCA, soluma sırasında şiddetli cilt yanıklarına, kalıcı göz hasarına ve yoğun solunum tahrişine neden olan son derece aşındırıcı bir kimsaldır. Uygun koruyucu ekipmanlarla (eldiven, göz koruması, maske) kullanın.
  3. Örnekleri 37 °C'de 30 dakika kuluçka altına geçirerek proteinleri çökeltin, ardından 18.800 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj yapın.
  4. Örnekleri nötralize ederek 50 μL süpernatantı 60 μL 500 mM Tris-HCl içeren bir tüpte aktarın, pH 8.8. İyi karıştırın ve 100 μL sıvıyı siyah bir 96 kuyu plakaya aktarın. 498 nm uyarılma ve 520 nm emisyonlu bir plaka okuyucu ile floresansı ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vitro bozulma testinin hassasiyetini artırmak için, substrat LpxC floresan boya Atto488 ile etiketlendi. Atto488'in sukcinimidil ester grubu, hafif alkali koşullarda LpxC'nin birincil amino gruplarıyla verimli şekilde reaksiyona girer. Tris tamponu, bu reaksiyona müdahale eden birincil aminler içerdiğinden, Tris tamponunda saflaştırılan LpxC, etiketlemeden önce jel filtrasyonuyla fosfat tamponuna dönüştürülür. Etiketleme reaksiyonu için, orta derecede etiketleme sağlamak ve a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün ilk kritik adımı, LpxC'nin Atto488 etiketlenmesidir. Orta düzeyde bir etiketleme, in vitro bozulma aktivitesini doğru ölçüm için kritiktir. Optimizasyon deneylerimize dayanarak, 9:1 ile 3:1 arasında LpxC ile Atto488 arasında molyar bir oran en iyisidir. Aşırı Atto488 aşırı etiketlemeye yol açar ve bu muhtemelen LpxC'nin doğal durumunu bozar. Bu koşullar altında, LpxC–Atto488'in yalnızca FtsH ile FtsH/LapB ile FtsH/LapB arasındaki ayrışma farkı belirgin şekilde azal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Tüm araştırmalar Yale Üniversitesi'nde yürütüldü. W.M., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R01GM137068 ve RM1GM149406 numaralarıyla ve Richard ve Susan Smith Aile Vakfı tarafından Odyssey Ödülü ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEEv yapımı
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Nonpolar polistiren adsorptör 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Sabit açılı rotor 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944Yüksek çözünürlüklü jel filtrasyon kolon 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Kaynaklar

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FtsH ProteazLapB AdaptörüProteolipozom RekonstitüsyonuAAA+ ProteazFloresan AnaliziProtein HomeostazıKinetik Analiz

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.