HEK-293 Hücre Tabanlı Sistemde STING Sıralamasını Araştırmak İçin Hücresiz COPII Vezikül Yeniden Yapılandırma Protokolünün Geliştirilmesi

Özet

Bu protokol, STING entegrasyonunun COPII veziküllerine yeniden oluşturulması için optimize edilmiş hücresiz bir sistemi tanımlar; bu sistem ER ihracatı sırasında kargo ayırtmasının kontrollü biyokimyasal analizini mümkün kılar.

Özet

cGAS–STING yolu, doğuştan gelen bağışıklığın merkezi bir bileşenidir. Aktivasyon üzerine, endoplazmik retikulum (ER) yerleşik protein STING COPII veziküllerine paketlenir ve aşağı akış sinyalini başlatmak için Golgi cihazına taşınır. Bu sürecin önemine rağmen, STING COPII veziküllerine ayırılmasını yöneten moleküler mekanizmalar hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır. Burada, yük seçiminin kontrollü analizini kolaylaştırmak için COPII veziküllerinin in vitro yeniden yapılandırılması için optimize edilmiş bir iş akışı sunulmaktadır. HEK-293F süspansiyon hücrelerinden yüksek konsantrasyonlu sitozol (30–40 mg/mL) hazırlamak için ölçeklenebilir bir yöntem tanımlanır ve yarı-geçirgenleştirilmiş HEK-293T hücrelerinin tanımlanmış bir membran kaynağı olarak üretilmesi için basit bir prosedür ile birleştirilir. Geleneksel yapışkan hücre tabanlı sistemlere kıyasla, bu yaklaşım ölçeklenebilirliği artırır, maliyeti azaltır ve tekrarlanabilirliği artırır. STING model yük olarak kullanılarak, COPII vezikül tomurcuklanması ve kargo birleştirilmesi Western blot analiziyle doğrulanır ve belirli koşullarda bazal paketleme verimliliği yaklaşık %20'dir. Bu sistem, nükleotid stimülasyonu da dahil olmak üzere biyokimyasal parametrelerin kontrollü manipülasyonuna olanak tanır ve kargo entegrasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirir. Bu protokol, COPII aracılı kargo ayırtmasını araştırmak için sağlam ve uyarlanabilir bir platform sağlar ve ER ihracatında yer alan ek transmembran proteinleri ve düzenleyici faktörleri incelemek üzere genişletilebilir.

Giriş

cGAS-STING sinyal yolu, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel bir mekanizması olarak hizmet eder ve sitozolik çift zincirli DNA'yı (dsDNA) algılayarak antiviral yanıt başlatır. dsDNA tespit edildiğinde, cGAS enzimi siklik dinükleotit cGAMP'ı üretir ve bu da STING ^1,2'ye bağlanan ikinci bir haberci olarak görev yapar. Önemli olarak, STING endoplazmik retikulumda (ER) sabit durum koşullarında inaktif dimer olarak^{bulunur 3}. Aktivasyonu, acil servis'ten Golgi cihazına hızlı ve yüksek kontrollü bir translokasyon gerektirir. STING, aşağı akış kinazları TBK1 ve IRF3'ü işe alır ve aktive eder; bu da tip I interferonlar ve pro-inflamatuar^{sitokinlerin üretimine yol açar 4}.

STING'in taşınması, ER^5'ten protein ihracatı için evrensel araçlar olan COPII kaplı veziküller aracılığıyla sağlanır. COPII kaplamasının montajı—küçük GTPaz Sar1, iç kaplama Sec23/24 kompleksi ve dış kaplama Sec13/31 kompleksinden oluşuyor—hem ER membranını veziküllere dönüştürmekten hem de^{kargo 6,7'yi} seçici olarak işe almaktan sorumludur. Sec22b, COPII^8'in Sec23/24 kompleksi tarafından tanınan yapısal bir epitop aracılığıyla COPII veziküllerine ayrılır. Diğer yükler arasında p24 ailesi ve ERGIC işaretleyicisi ERGIC-53 bulunur; her ikisi^{de 9'u} ayırmak için C-terminal dihidrofobik φC motifine dayanır. Buna karşılık, riboforin I (RPN1) gibi bazı ER-sabitli proteinler ER'de sınırlı kalır ve COPII vezikülleri¹⁰ aracılığıyla taşınmadıkları için sağlam ER yapılarının belirteci olarak hizmet eder. Sonuç olarak, hücresiz COPII vezikül yeniden yapılandırma deneylerinde, Sec22b ve p24 genellikle COPII kargoları olarak kabul edilirken, ribophorin vezikül preparatlarında ER kontaminasyonunu izlemek için bir işaretleyici olarak hizmet verir. COPII taşımasının genel mekanizması iyi tanımlanmış olsa da, bu veziküllere aktive edilmiş STING'in seçici olarak tutulmasını tetikleyen spesifik moleküler ipuçları hâlâ belirsizdir. Bu ayırma mekanizmalarını anlamak hayati öneme sahiptir, çünkü STING taşımacılığının düzensizliği, bebeklikte başlayan STING ile ilişkili vaskülopati (SAVI) ve COPA^{sendromu 11} gibi çeşitli otoimmün ve otoinflamatuar hastalıklarla bağlantılıdır. Ancak, sağlam hücrelerde bu geçici ve son derece dinamik olayları incelemek teknik olarak zordur.

Bu zorlukları gidermek için, COPII aracılı kargo sıralamasının moleküler gereksinimlerini sorgulamak için optimize edilmiş hücresiz yeniden yapılandırma sistemi geliştirildi. In vitro tomurcuklama testleri uzun süredir hücre biyolojisinin temel bir parçası^{olsa da}, yaygın olarak benimsenmesi genellikle yüksek kaliteli bileşenlerin hazırlanmasının yüksek maliyeti ve karmaşıklığı nedeniyle sınırlıdır. Bu çalışmada, HEK-293F süspansiyon hücrelerini aktif sitozol ve yarı permeabilize HEK-293T hücrelerinin sağlam bir membran bağışçısı olarak ekonomik bir kaynak olarak kullanan sadeleştirilmiş bir iş akışı tanıtıldı. Hücresiz COPII vezikül yeniden yapılandırma sisteminin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu sistemde, Sec22b kargo veziküllere dahil edilmesini doğrulamak için pozitif kontrol olarak kullanılırken, RPN1 ER membran kontaminasyonunu izlemek ve ekarte etmek için negatif kontrol olarak kullanıldı. STING'i bir kavram kargo kanıtı olarak kullanarak, bu çalışma sistemin STING ayırtmasının temel biyokimyasal yönlerini etkili bir şekilde modellediğini gösterdi. Bu platform, STING sıralamasını yöneten sitozolik faktörleri ve membran sinyallerini tanımlamak için çok yönlü ve ölçeklenebilir bir araç sağladı ve diğer veziküler taşıma yollarının geniş bir yelpazesinin incelenmesi için potansiyel uygulamalar sunuyordu.

Protokol

HEK-293F (RRID: CVCL_6642) ve HEK-293T (RRID: CVCL_0063) hücre hatları, Pekin Union Tıp Fakültesi Hücre Kaynak Merkezi'nden temin edilmiştir. Her iki hücre hattı da kısa tandem tekrar (STR) profilleme ile doğrulandı ve mikoplazma kontaminasyonundan arındırıldıkları doğrulandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Bu çalışmada insan veya omurgalı hayvan dahil edilmedi. Bu nedenle, etik onay gerekmiyordu. Tüm deneysel prosedürler kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. HEK-293F hücre sitozolünün hazırlanması

1. Tohum HEK-293F hücreleri, 100 mL tanımlanmış memeli kültür ortamında 1 × 10^{6 hücre/} mL yoğunlukta ve %1 penisillin-streptomisin takviye edilmiştir. Hücreleri 500 mL'lik konik bir şişede kültürleyin.
2. Süspansiyon kültürünü %5 CO₂ ile 37 °C'de, sallanma kuluçka içinde, 60 saat boyunca kuluçka edin.
3. Hücreleri 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle hasat edin. Otomatik hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin.
4. Hücre pelletini 50 mL buz soğukluğu fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) yıkayın. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun.
5. Hücre pelletini eşit hacimde buz gibi soğuk B88 tamponu (20 mM HEPES, pH 7.3; 250 mM sorbitol; 150 mM potasyum asetat; 5 mM magnezyum asetat) yeniden süspansiyona bırakın.
6. Hücreleri buz üzerindeki süspansiyon, 22 kalibre iğneyle donatılmış 5 mL şırıngadan geçirerek 100'den fazla darbe için liz yapın.
7. Hücre lizisini ışık mikroskopisiyle inceleyin. Hücre kalıntılarını 20.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle temizleyin.
8. Süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın. 100.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın.
   DIKKAT: Ekipman hasarını ve güvenlik tehlikelerini önlemek için ultrasantrifüj tüplerinin doğru şekilde dengelendiğinden emin olun.
9. Aydınlaştırılmış üst örtüyü topla. Numuneyi, 4.000 × g ve 4 °C'de 3 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) ultrafiltrasyon cihazı ile konsantre edin.
10. Protein konsantrasyonu bir bicinchoninic acid (BCA) testi kullanılarak ölçün. Konsantrasyonu 30–40 mg/mL olarak ayarlayın.
    DIKKAT: Sıvı azotu uygun koruyucu ekipmanla ele geçirerek kriyojenik hasarı önleyin.
11. Sitozol'u aliquot edin. Aliquotları sıvı azotta snap-dondurun ve −80 °C'de depolayın (Şekil 2A)
    DIKKAT: İkiden fazla donma–erime döngüsünden kaçının. Aliquotları −80 °C'de 6 aya kadar sakla.

2. Yarı permeabilize HEK-293T hücrelerinin hazırlanması

1. Plaka HEK-293T hücreleri, 15 cm tabak başına 3 × 10⁶ hücre yoğunluğunda, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilen 15 cm kaba başına 10 6 hücre yoğunluğunda insan STING'ini ifade etmektedir. %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
2. Hücreleri yaklaşık %60 birleşimde alın.
3. Ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
4. 2 ml %0,25 tripsin–EDTA ekleyin. Hücreleri ayırmak için oda sıcaklığında 2–3 dakika kuluçka yapın.
5. Tripsizasyonu durdurmak için 200 μL soya tripsin inhibitörü (1 mg/mL) ekleyin. Hücreleri 10 mL buz gibi soğuk KHM tamponunda (20 mM HEPES, pH 7.2; 110 mM potasyum asetat; 2 mM magnezyum asetat) yeniden askıya alın.
6. Hücreleri 250 × g ile 3 dakika boyunca santrifüjle geçirin. Üst yüzeyi at.
   DIKKAT: Digitonin toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir duman davlumbonunda tutun.
7. Hücreleri 6 mL buz gibi soğuk KHM tamponunda yeniden süzülür. 6 μL digitonin stok çözeltisi (DMSO'da 40 mg/mL) ekleyin.
8. Nazikçe ters çevirerek karıştırın. 5 dakika buzda kuluçka yapın.
9. Digitonini seyreltmek için 8 mL KHM tampon ekleyin. 250 × g sıcaklıkta 3 dakika boyunca santrifüj yapın, geçirgen hücreler toplanın.
10. Pelleti 14 mL buz gibi soğuk HEPES tamponunda (50 mM HEPES, pH 7.3; 90 mM potasyum asetat) yeniden süzülür. 10 dakika buzda kuluçka yapın.
11. Santrifüjde 250 × g'de 3 dakika kullanın. Pelleti 1 mL buz gibi soğuk KHM· Cl tamponu (20 mM HEPES, pH 7.3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. 10.000 × gr'de 15 saniye boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
13. Pelleti 50 μL KHM· içinde yeniden süzülür Cl buffer. Protein konsantrasyonunu BCA testiyle ölçün ve 5–7 mg/mL olarak ayarlayın.

3. Hücresiz COPII vezikülü yeniden yapılandırma deneyi

1. Malzeme Tablosu'nda listelenen tüm reaktifleri hazırlayın. Aliquot ve −80 °C'de sakla.
2. 110 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.2), 2 mM MgCl₂, proteaz inhibitörü kokteyli (1×), 0.2 mM GTP ve ATP rejenerasyon sistemi (40 mM kreatin fosfat, 0.2 mg/mL kreatin fosfokinaz, 1 mM ATP) içeren 50 μL reaksiyon karışımı hazırlayın.
3. cGAMP'ı son konsantrasyon 10 μM'e ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka edin.
4. 50 μg yarı permeabilize HEK-293T hücresi ekleyin. Nazikçe karıştır.
5. Vezikül oluşumunu başlatmak için 80 μg HEK-293F sitozol ekleyin. 37 °C'de 45 dakika kuluçka yapın.
6. Tomurcuklanmayı sonlandırmak için reaksiyonu buz üzerine koyun. 12.000 × g sıcaklıkta 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
7. Vezikülleri içeren süpernatantı toplayın. Organelleri içeren pelleti tutun.
8. Süpernatantı 100.000 × g sıcaklığında 1 saat boyunca 4 °C'de ultrasantrifüj yapın. Vezikül peletini 30 μL protein yükleme tamponunda yeniden askıya alın.
9. 95 °C'de 5 dakika boyunca ısı örnekleri alın. Çökeltmeleri çıkarmak için 20.000 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
10. SDS-PAGE uygulayın ve proteinleri PVDF membranlarına aktarın. Sec22b, STING ve RPN1'e karşı antikorlarla prob.

Sonuçlar

HEK-293F hücre sitozolünün hazırlanması sırasında, sitozol kalitesini değerlendirmek için iki parametre değerlendirildi. HEK-293F hücreleri yüksek yoğunlukta kültürlenerek yüksek protein konsantrasyonlarına sahip sitozolik özetler elde edildi. Ayrıca, şırınga bazlı liziz sonrası hücre bozulmasının boyutu ışık mikroskobi ile değerlendirilmiş ve uygulanan koşullarda verimli hücre lizisi doğrulanmış (Şekil 2B).

Yarı-permeabilize HEK-...

Tartışma

Temel biyokimyasal reaksiyonların in vitro yeniden yapılandırılması, hücresiz sistemlerin temelini atmış ve bu sistemler birçok önemli keşifte etkili olmuştur. Bunlar arasında cGAS'ın sitozolik DNA^{sensörü 14,15} olarak tanımlanması, sitokrom c'nin apoptozdaki rolünün açıklanması ve ilk histon demetilazının JHDM1^16,17 keşfi yer almaktadır. Bu tür tanımlanmış biyoki...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 mL steril şırıngalar	WEGO	V526273	Mekanik hücre lizisi için kullanılır
Adenosin 5&prim;-trifosfat (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM suda stok, pH 7.3, & eksis'te depolanmıştır; 80 ve derece; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Kavramsal illüstrasyonlar ve şematik diyagramlar oluşturmak için kullanılır
ATP yenileme sistemi (10×)	—	—	Kreatin fosfat, kreatin kinaz ve ATP içeren enerji yenileyici karışım
BCA Protein Test Kiti	Thermo Fisher	23227	Kolorimetrik protein testi
BioRender	BioRender	SCR_018361	Kavramsal illüstrasyonlar ve şematik diyagramlar oluşturmak için kullanılır
BSA	Biorigin	BN20815	Engelleyici reaktif
Karbondioksit sarsıntı kuluçka makinesi	ZhiChu	ZCZY-CS8	Sıcaklık, CO2 ve süspansiyon kültürü için çalkalama sağlar
CO2 kuluçka makinesi	Thermo Fisher	3110	Yapışkan kültür için sıcaklık ve CO2 korunur
Geleneksel mikroskop	Olympus	CX43	Hücre lizisi ve morfolojisini değerlendirmek için kullanılır
Kreatin kinaz	Roche	CKRO	20 mg/mL stok tamponda, &minus olarak depolanmıştır; 80 ve derece; C
Kreatin fosfat	Roche	CRPHO-RO	ATP yenileme sisteminin bileşeni
Masaüstü santrifüj	Eppendorf	5810R	Düşük hızlı santrifüjleme için kullanılır
Digitonin	Sigma	D5628	DMSO'da 40 mg/mL stok, & minus seviyesinde depolanmıştır; 20 derece ve derece; C
DMEM	Corning	10-013-CMR	HEK-293T hücreleri için büyüme ortamı
D-Sorbitol	Sangon	A100691	1 M stok çözeltisi suda, 4 derece sıcaklıkta saklanıyor; C
ECL tespit reaktifi	Biorigin	BN16009	Kemimilüminesans substrat
Elektroforez tankı	Bio-Rad	1658001	SDS-PAGE için Cihaz
Fetal sığır serumu (FBS)	Corning	35-015-CV	Serum takviyesi
Sabit açılı rotorlu (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Ultrasantrifüjasyon için rotor
FreeStyle 293-F hücreleri	Thermo Fisher	R79007	Sitozol hazırlığı için kullanılır
Keçi anti-fare IgG (H+L)	Invitrogen	31430	HRP ile konjuge ikincil antikor
Keçi anti-tavşan IgG (H+L)	Invitrogen	31460	HRP ile konjuge ikincil antikor
GraphPad Prizması	GraphPad Yazılımı	SCR_002798	Şekil 4D'de istatistiksel analiz (tek yönlü ANOVA) yapmak ve nicel çubuk grafik oluşturmak için kullanılır.
Guanozin 5&prim;-trifosfat (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM suda stok, pH 7.3, & minus olarak depolanmıştır; 80 ve derece; C
İnsan STING'ini ifade eden HEK-293T hücreleri	—	—	Şirket içinde üretilmiştir; Membran kaynağı olarak kullanılıyor
HEPES tamponu (1 M, pH 7.3)	Beyotime	C0215	Çözelti hazırlığı için tampon bileşeni
Görüntüleme sistemi	Bio-Rad	12003153	Sinyal algılama için kullanılır
Magnezyum asetat tetrahidrat	Hampton Araştırmaları	HR2-561	B88 hazırlığı için tampon bileşeni
Magnezyum klorür heksahidrat	Hampton Araştırmaları	HR2-559	Tampon bileşeni
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5420R	Orta hızlı santrifüjleme için kullanılır
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5420	Rutin santrifüj için kullanılır
NanoDrop spektrofotometresi	Thermo Fisher	840-317400	Protein niceliklendirme için kullanılır
OPM-CD Trans293 ortam	OPM	P82019	HEK-293F süspansiyon kültürü için serumsuz ortam
Penisilin ve dash; streptomisin (100 kez ;)	Servicebio	G4003	Hücre kültürü için antibiyotik takviyesi
Fenilmetil sülfonil florür (PMSF)	Sangon	A610425	Proteaz inhibitörü
Fosfataz inhibitörleri	Lablead	C0104	Protein defosforilasyonunu önleyin
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)	Servicebio	G4202	Hücrelerin yıkaması için tampon
Potasyum asetat	Sigma	236497	1 M stok çözeltisi suda, 4 derece sıcaklıkta saklanıyor; C
Güç kaynağı	Bio-Rad	1645052	Elektroforez için voltaj sağlar
Proteaz inhibitörü kokteyli, EDTA'sız	Roche	4693132001	Geniş spektrumlu proteaz inhibitörü karışımı
PVDF membranı	Millipore	ISEQ00010	Western blotting için membran
RPN1 antikoru (tavşan mAb)	Abcam	AB197888	ER işaretçisi
SDS-PAGE jeli (4&n, 20%)	—	—	Protein ayrımı için kullanılır
SDS-PAGE yükleme tamponu (5& kez;)	Solarbio	P1040	Protein numunesi hazırlama tamponu
Sec22b antikoru (tavşan mAb)	Abcam	ab181076	COPII kargo işaretçisi
Soya fasulyesi tripsin inhibitörü (SBTI)	Sigma	T9128	PBS'de 1 mg/mL stok, & eksis'te depolanmıştır; 20 derece ve derece; C
STING antikor (tavşan mAb)	CST	13647	Birincil antikor
TBST tamponu	Servicebio	G0004	İmmünoblotasyon için yıkama tamponu
Termal döngücü	Bio-Rad	186-1096	Isıtma ve kuluçka için kullanılır
Termostatik metal banyo	DLAB	5062102100	Sabit sıcaklık sağlar
Transfer hücresi	Bio-Rad	1703930	Protein transferi için kullanılır
Tripsin-EDTA (%0,25)	Servicebio	G4011	Hücre ayrımı için kullanılıyor
Ultrasantrifüj	Thermo Fisher	75000100	Yüksek hızlı santrifüjleme için kullanılır
Ultrasantrifüj tüpleri (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Ultrasantrifüjasyonla uyumlu tüpler
Ultrafiltrasyon tüpü (4 mL, 10 kDa MWCO)	Millipore	UFC8010	Sitozol konsantrasyonu için kullanılır