Yöntem makalesi

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

331 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71108

⸱

3 Temmuz 2026

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Bu makalede

Özet

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Epitel hücre istilası, Salmonella, Shigella ve Vibrio dahil olmak üzere birçok enterik patojenin temel fenotipidir. Ortaya çıkan bir istilacı patojen, iltihap bağırsak hastalığının (IBD) patogenezinde rol oynayan yapışkan-invaziv Escherichia coli (AIEC)'dir. AIEC suşları, diğer invaziv patojenlerle sıkça ilişkilendirilen virülans faktörlerinden yoksundur, bu da genetik tanımlamayı zorlaştırır. Sonuç olarak, AIEC suşları, epitel hücrelerini istila edebilme yeteneklerine göre saha standartı gentamisin koruma testi kullanılarak fenotipik olarak sınıflandırılır. Ancak, AIEC suşları genellikle tedavi programlarının bir parçası olarak çeşitli antibiyotik alan IBD hastalarından izole edildiğinden, gentamisin dirençli izolatların artması bu testi AIEC sınıflandırması için daha az güvenilir hale getirmiştir. Bu sorunu aşmak için, AIEC hücre istilasını niceleyen ve görselleştiren alternatif bir amikasin bazlı koruma testi geliştirildi. Bu test, diğer aminoglikozitlere dirençli suşları etkili şekilde hedefleyen ve ökaryot konak hücrelere ekstraselüker olarak kalan geniş spektrumlu yarı sentetik bir aminoglikozid olan amikasin kullanır. Böylece, ekstraselülük bakteriler enfeksiyon sırasında öldürülürken, hücre içi bakteriler "korunur". Bu, suş invazivliğini karşılaştırmak için bir nicel testin temelini oluşturur; bu, enfeksiyon sonrası iyileşen koloni oluşturan birimler (CFU) kullanılarak yüzde istila puanı olarak ölçülür. Bu test, enfekte epitel hücrelerinin immünboze edilmesi ve bu hücrelerin konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesi yoluyla istilanın niteliksel ölçümü olarak da kullanılabilir. Bu yöntem, IBD hastalarını AIEC için taramak için tanı aracı olarak hizmet verir ve aynı zamanda hücre istilasını değerlendirmek için diğer çok ilaçlı dirençli patojenlere de uygulanabilir; bu patojenlik virülans ve patogenlik için bir vekildir.

Giriş

İnflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif koliti de kapsayan, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen kronik gastrointestinal bir inflamatuardurumdur. 1. IBD'nin küresel olarak artan sıkıntısına rağmen, genetik ve çevresel, mikrobiyal ve immünolojik faktörlerin karmaşık etkileşimi nedeniyle kesin etiyolojisi belirsizdir 2,3. IBD'nin imza özelliği, genellikle çevresel faktörlerden kaynaklanan değişmiş bağırsak mikrobiyal bileşimidir; örneğin sanayileşmiş ülkelerde yaygın olan yüksek şekerli, yüksek yağlıdiyet 4,5. IBD hastalarının mikrobiyotası genellikle azalan mikrobiyal çeşitlilik, patojenik Gammaproteobakterilerin zenginleşmesi ve koruyucuFirmicutes 6,7'nin azalmasıyla karakterize edilir. CD hastalarında Escherichia coli (E. coli) bağırsak mikrobiyotasında zenginleştirilir, bağırsak mukozasıyla ilişkiye girer ve aktif ve şiddetli hastalık8,9 ile pozitif ilişkilidir. CD ile ilişkili bu ortaya çıkan E. coli patotipine yapışkan-invaziv Escherichia coli (AIEC) denir.

AIEC, CD hastalarının ileal mukozasını sağlıklı kontrol gruplarına göre daha yüksek bir eğilimle kolonileştiren gram-negatif fırsatçıpatojenlerdir 10. CD hastalarından izole edilen AIEC suşları genetik olarak çeşitlilik gösterir ve genellikle hem kommensal hem de patojenik E. coli11'i içeren tüm E. coli filogruplarını kapsar. Shigella ve Salmonella gibi patojenler, tip III salgı sistemlerinin konak hücrelerin istilasını kolaylaştırmasına dayanırken, AIEC bu korunan virülans sistemlerine sahipdeğildir 12. Bu nedenle, AIEC virülansını anlamamız büyük ölçüde in vitro fenotipine dayanır; bu fenotip, epitel hücrelerine yapışıp onları istila etme ve makrofajlar içinde hayatta kalmayeteneğiyle karakterize edilir 10.

AIEC tarafından epitel hücre invaziyası, tip 1 pilus ve uzun kutup fimbriae dahil olmak üzere birden fazla virülans faktörü tarafından yönlendirilir. Tip 1 pilusun ucunda bulunan FimH, ağır glikozillenmiş konakreseptörü CEACAM6 13'te mannoz kalıntılarına yapışma aracılığı sağlar. Bu bağlanma, AIEC'nin enterositlere girişini teşvik eder ve hücre içiçoğaltmasını destekler 14. AIEC ayrıca, uzun kutup fimbriaları ile M hücresi yüzey protein glikoproteini 215,16 arasındaki etkileşimler yoluyla Peyer'in yamalarının üzerinde bulunan özel epitel hücreleri olan mikrofold (M) hücrelerine de yapışır. Bu yapışma, AIEC'nin M hücreleri arasında yer değiştirmesini, alttaki makrofajlara ulaşmasını ve TNF-α gibi pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu tetiklemesini sağlar; bu sitokinler sadece iltihabı teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda makrofajlarda bakteriyel replikasyonudestekler 17,18. Bu patojenik mekanizmaların, CD'de gözlemlendiği gibi, konakta kronik iltihabı sürdürdüğü varsayılır.

AIEC, in vitro fenotipleriyle tanımlanır; bu da gentamisin koruma testini suş sınıflandırması ve virülans faktörünün keşfi için vazgeçilmezkılar. 8. Bu yaklaşım, gentamisine dirençli izolasyonlar nedeniyle karmaşıklaşabilir ve bu da onların yanlış şekilde invaziv11 olarak sınıflandırılmasına yol açabilir. Bu sorunu aşmak için, gentamisin dirençli izolatları etkili bir şekilde öldüren ve konak hücre zarlarını delmeyen alternatif antibiyotikler test edildi. Bu yaklaşımla, amikasin gentamisin için uygun bir alternatif olarak tanımlanmıştır; standart invazion testleriyle karşılaştırılabilir etkinlik ve uyumluluk sunar, ayrıca minimal sitotoksisite sunar; bu, önceki çalışmalarda trypan mavisi boyama ile kanıtlanmış ve burada laktat dehidrojenaz salgılama testi ile daha da doğrulanmış (Ek Şekil 1)11. Amikasin, kanamisin'den türetilen yarı sentetik bir aminoglikoziddir ve protein sentezini bozarak bakteri büyümesini engeller19. Amikacin, Pseudomonas, Acinetobacter ve Escherichia türleri dahil olmak üzere çok ilaca dirençli gram-negatif bakterilerekarşı özellikle etkilidir 19. Özellikle, kanamisin omurgasında yapılan yapısal değişiklikler, amikasini bakteriyel aminoglikozidleri inaktive eden enzimlere karşı daha az duyarlı kılar19. Sonuç olarak, amikasin, çok ilaca dirençli bakterileri istila testlerinde hedeflemek için gentamisine sağlam bir alternatif sunar. Aşağıdaki protokoller, hem referans suş NRG857c hem de amikasin koruma testi ile klinik izolatlar kullanılarak E. coli'nin invazion fenotipinin nasıl değerlendirileceğini açıklar.

Protokol

NOT: Bu protokol, AIEC suşlarının Caco-2 epitel hücrelerine invaziya kapasitesini değerlendirmek için bir yöntem tanımlar. Bu protokolde kullanılan amikasin konsantrasyonu (240 μg/mL), 13 inflamatuar bağırsak hastalığı hastasından elde edilen 32 temsil AIEC klinik izolatından oluşan bir panelde amikacin MIC test şeritleri kullanılarak belirlenen minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) 10× ile eşleşmektedir. Araştırmacılar, testi yapmadan önce kendi AIEC izolatlarının MIC'ini belirlemelidir ( bkz. Malzeme Tablosu), çünkü antibiyotik hassasiyeti izolatlar arasında değişebilir. Bölüm 1, yüzde istila için amikacin koruma testini detaylandırırken, Bölüm 2 konfokal mikroskopi için amikacin koruma testini tanımlar.

1. İstilanın Yüzdesinin Nicelendirilmesi için Amikacin Koruma Testi

  1. 24 kuyu plakalarının kolajen kaplaması
    1. 35,29 μL steril buzul asetik asidi (bkz. Malzeme Tablosu) 30 mL 1× PBS ( bkz. Malzeme Tablosu) içinde 50 mL'lik konik bir tüpte seyreltin.
    2. 300 μL kolajen (bkz. Malzeme Tablosu) asetik asit çözeltisiyle 1× PBS'ye pipetleyin.
    3. İyi karışması için 10 saniyelik vortex çözeltisi.
    4. Sulandırılmış kolajen çözeltisinden 250 μL'yi steril 24 delikli doku kültürü ile işlenmiş bir plakanın her kuyusuna dağıtın.
      NOT: 30 mL kolajen çözeltisi, yaklaşık beş 24 kuyu ölçülü plakayı kaplamak için yeterlidir.
    5. Tabağı her yöne eğip çözeltinin her kuyunun altını eşit şekilde kapladığından emin olun.
    6. Plakaları 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın ki kollajen plastik yüzeye yapışabilsin.
    7. İnkubasyon tamamlandıktan sonra, her kuyiden kolajen çözeltisi aspire edilir.
    8. Her kuyuya 1 mL 1× PBS pipetle kalan kolajen yıkanıp her kiyi aspire edin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
    9. Tüm görünür nemin buharlaşmasını sağlamak için biyolojik güvenlik dolabının içinde kuru plakalar kalın.
      NOT: Plakalar hücre tohumlaması için hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında saklanabilir. Plakaları saklarken, dış çevreyi steril parafilm ile kapatın veya steril bir zip kilitli torbanın içine yerleştirin.

  1. Amikacin stok çözeltilerinin hazırlanması
    1. 240 mg amikasin disülfat tartın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. 1 mL steril su pipetleyip amikasini girdabla çözerek çözer, nihai konsantrasyon 240 mg/mL (1000× stok) elde edilir.
    3. Amikacin çözeltisinden 20 μL aliquot alın ve -20 °C'de saklanın.
      NOT: Amikacin 6–12 ay boyunca -20 °C'de stabildir. Tekrarlanan donma-erime döngülerini en aza indirmek için tek kullanımlık aliquotlar hazırlayın.
  2. Caco-2 hücrelerinin hazırlanması
    1. Donmuş stoktan Caco-2 hücrelerinin eritilmesi
      1. Yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, bkz. Malzemeler Tablosu) %10 fetal sığır serumu (FBS, bkz. Malzeme Tablosu) ve %1 antibiyotik-antimikotik çözeltisi (bkz. Malzemeler Tablosu) ile takviye ederek tam büyüme ortamı hazırlamak.
      2. 37 °C'lik su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.
      3. Donmuş Caco-2 hücre şişesini 37 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve hücreler tamamen çözülene kadar 1–2 dakika kuluçka yapın.
      4. Şişeni su banyosundan çıkarın ve şişenin dışına %70 etanol püskürtün.
      5. Biyolojik bir güvenlik kabini içinde, hücreler 9 mL tam büyüme ortamı içeren 15 mL konik bir tüpe şeklinde pipetlenir.
      6. Santrifüj hücreleri 500 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kullanın.
      7. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini 5 mL tam büyüme ortamında yeniden süspansiyona alın.
      8. Hücreleri, 10 mL sıcak tam büyüme ortamı içeren 75cm 2 doku kültürü şişesine (T75) aktarın.
      9. Plakayı 3 kez çevirerek hücrelerin taban kısmına eşit şekilde dağıtıldığından emin olun.
      10. Hücreleri %5 CO2 ile 37 °C'de inkübe edin, hücreler %90 birleşme süresine (6–7 gün) ulaşana kadar.
        NOT: Uyum sağlama, hücrelerin ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirilerek tahmin edilir. Hücreler iyileşirken her 3 günde bir medya değiştirin.
    2. Caco-2 hücrelerinin tohumlanması
      1. 37 °C su banyosunda tam büyüme ortamı ve %0,25 (w/v) tripsin-EDTA (bkz. Malzeme Tablosu) ısıtılmıştır.
      2. Caco-2 hücreleri %90 birleşmeye ulaştığında, solu kültür ortamı aspirasyonu ve 2 mL tripsin-EDTA eklenir. Termosu eğin ve tripsin çözeltisi tüm alt yüzeyi kaplamasını sağlayacak şekilde FBS izlerinin etkisiz hale geldiğinden emin olun.
      3. Tripsin-EDTA çözeltisi aspirasyon yapın ve 3 mL tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri %5CO2 ile 37 °C'de 5–15 dakika boyunca kuluçka edin. Hücreleri inkubasyon döneminde çeşitli zaman noktalarında ışık mikroskobu ile görselleştirerek hücrelerin yuvarlanmasını gözlemleyin; bu da hücrelerin ayrıldığını gösterir.
        NOT: Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için flasın kenarına vurmaktan kaçının, çünkü bu hücrelerin toplayılmasına neden olabilir.
      4. Tripsin-EDTA çözeltisini etkisiz hale getirmek için 6 mL tam büyüme ortamı pipet yapın ve hücreleri yeniden süsküye almak için yukarı aşağı pipetle karıştırın.
      5. Pipet hücrelerini 15 mL'lik konik bir tüpe dönüştürüp 500 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca pelet hücrelerine santrifüj yapın.
      6. 3 mL tam büyüme ortamında aspirasyon ve hücreleri yeniden süspansiyona alın.
      7. Askıda duran Caco-2 hücrelerinden 10 μL 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 10 μL Trypan mavi boyası (bkz. Malzemeler Tablosu) ekleyin ve pipetle birkaç kez karıştırın.
      8. Caco-2/Trypan mavi karışımından 10 μL pipetini hücre sayaç slaytına (bkz. Malzemeler Tablosu). Hücre yaşamlılığını hesaplamak için canlı hücre sayısını sayın.
        NOT: Mevcut Caco-2 hücre sayısını sayarkən, tohumlama için toplam hücre sayısını değil, sadece canlı hücre sayısını dikkate alın.
      9. Caco-2 hücrelerini 24 kuyu tabaklı bir plakaya veya T75 şişesine tohumlayın.
      10. 24 kuyusulu bir plaka için aşağıdaki adımları izleyin:
        1. Aşağıdaki denklemi kullanarak 1 x 105 hücre/mL konsantrasyonda tohum Caco-2 hücreleri:
          [(1 × 105 hücre)(Kuyu tohumlama sayısı + 2)] / [Canlı hücre sayısı konsantrasyonu (hücreler/mL)] = hücreler (mL)
        2. Yukarıda hesaplanan hücre hacmini, 3.2.6. adımda askıda bulunan Caco-2 hücrelerinden 15 mL'lik konik bir tüpe alın. Aşağıdaki denklemi kullanarak hücrelere eklenecek tam büyüme ortamının hacmini hesaplayın:
          (Kuyu tohumlama sayısı + 2 kuyuyu) - hücreler (mL) = ortam (mL)
          NOT: Hesaplamadaki "+2 kuyup" pipetleme hatasını hesaba katmak içindir.
        3. Yukarıda hesaplanan ortam hacmini Caco-2 hücrelerini içeren 15 mL konik olarak pipetleyin ve pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle karıştırın.
        4. 1 mL Caco-2 hücresini tam büyüme ortamında (son konsantrasyon 1 x 105 hücre/mL) kolajen kaplı 24 kuyruklu plakanın her bir kuyusuna pipetleyin.
        5. Hücreler %90 birleşimine ulaşana kadar (3–4 gün) %5CO2 ile 37 °C sıcaklıkta inkübe plakası yapın.
      11. T75 şişesi için aşağıdaki adımları izleyin:
        1. 7.5 x 105 canlı hücreyi aşağıdaki denklemi kullanarak bir T75 şişesine aktarın:
          [(7.5 × 105 hücre)] / [canlı hücre sayısı konsantrasyonu (hücreler/mL)] = hücreler (mL)
          NOT: T75 şişesine eklenecek canlı hücre sayısı, Caco-2 hücre kültürü için ATCC yönergelerine göre belirlendi.
        2. Yukarıda hesaplanan hücre hacmini çıkarıp T75 şişesine aktarın. Aşağıdaki denklemi kullanarak hücrelere eklenecek tam büyüme ortamının hacmini hesaplayın:
          15 mL - termosa eklenen hücre hacmi = ortam (mL)
        3. Yukarıda hesaplanan medya hacmini T75 şabesine pipetleyin.
        4. Plakayı birkaç kez nazikçe çevirerek hücreleri matayın altına eşit şekilde dağıtın. Hücreler %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın, hücreler %90 birleşime ulaşana kadar (3–4 gün).
  3. Amikacin Koruma Testi
    NOT: Tüm hücre kültürü ortamlarının deney başlamadan önce 37 °C'ye kadar önceden ısıtıldığından emin olun.
    1. Bakterilerin hazırlanması
      1. Steril bir tahta çubuk veya steril pipet ucu kullanarak, -80 °C'de saklanan donmuş bakteriyel gliserol stokundan bakterileri nazikçe kazıyıp tek koloni için LB agar plakasında çizgi çizerek çıkarın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçka edin.
      2. Steril bir tahta çubuk veya steril pipet ucu kullanarak, agar plakasından tek bir koloni alıp 3 mL LB çorbasına aşılayın. Kültürü 37 °C'de 200 rpm'de gece boyunca sallayarak kuluçka edin.
      3. Gece kültüründe 1 mL LB et suyu ile 1:10 seyreltilmesi yapılacak ve kültürün 600 nm (OD600) noktasında optik yoğunluğu spektrofotometre kullanılarak ölçün.
    2. Enfeksiyonun Çokluğu (MOI) hesaplaması
      1. Gece kültüründen 100 μL'yi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 6000 × g hassasiyette 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      2. Hücre pelletini rahatsız etmeyecek şekilde süpernatantı dikkatlice aspire edin. Pelleti 1 mL serum ve antibiyotik-antimikotiksiz ortamda yeniden süspansiyona bırakın.
        NOT: Bu, bakteriyel kültürün gece boyunca 1:10 seyreltilmesi şeklindedir. MOI hesaplaması için, seyreltme faktörü için düzeltilmiş OD600 değeri değil, 4.1.3 adımında seyreltilmiş gece kültürü için hesaplanan ham OD600 değerini kullanın.
      3. 4.2.2. adımdan itibaren eklenecek bakteri süspansiyon hacmini hesaplayarak Caco-2 hücrelerini 10 MOI ile enfekte etmek için aşağıdaki hesaplamayı kullanın:
        [1 OD birimi/2.4 × 109 bakteri] × [10 bakteri/hücre] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = hacim (uL)
        NOT: Her örnek için hesaplanan hacmi dikkatlice kaydedin; bu değer daha sonra inokulum CFU/mL hesaplamasında kullanılacaktır. Bu bakteri süspansiyon hacmi sadece 24 kuyu içindeki 1 kuyuk içindir.
      4. Enfeksiyon ortamını, 4.2.3 adımından hesaplanan bakteri süspansiyon hacmini steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak hazırlayın. 1 mL serum ve antibiyotik-antimikotiksiz madde ekleyin. Nazikçe pipetle birkaç kez yukarı aşağı karıştırın.
    3. Caco-2 hücre enfeksiyonu
      1. Caco-2 hücre monokatmanlarını içeren 24 kuyu plakasını kuluçka makinesinden çıkarın ve tam ortamı aspire edin.
      2. Her kuyuya 1 mL serum ve antibiyotik-antimikotik içermeyen madde pipetleyin ve serum içeren medya izlerini gidermek için aspirasyon yapın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın (toplamda 2 yıkama).
        NOT: Solu yaparken hücre monotabakasını bozmamak için vakum basıncını düşürün.
      3. 4.2.4. adımdan enfeksiyon ortamından 1 mL pipotle, Caco-2 hücrelerini içeren 24 kuyu plakanın her bir kuyusuna gönderin.
      4. 24 kuyuluklu plakayı 500 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjlenerek bakteriyel teması epitel hücreleriyle senkronize edin.
      5. 24 kuyu plakasını 37 °C'de %5CO2 ile 3 saat boyunca inkübe yapın ki bakteriyel istila mümkün olsun.
      6. Kuluçka döneminde, 4.2.2. adımdan itibaren seyreltilmiş gece kültürünün CFU/mL'si, steril 1× PBS içinde 96 kuyu bir plaka kullanılarak 10 kat seri seyreltme uygulanarak belirlenir.
        1. Her seyreltmeyi hazırlamak için, 200 μL seyreltilmiş gece kültürünü 4.2.2. adımdan plakadaki ilk kuyuya aktarın.
        2. Kültürün 20 μL'sini bir sonraki sıraya 180 μL 1× PBS içeren pipetle gönderin. 10 kez pipetle yukarı ve aşağı karıştırın. Her seferinde taze pipet ucu kullanarak seyreltmeler 10-6'ya ulaşana kadar tekrar edin.
        3. 10 μL spot seyreltmeleri 10-2'den 10-6'ya kadar olan seyreltmelerden LB agar plakalarına üçlü olarak alın. Lekelerin alev altında agar'a emilmesine izin verin.
        4. Plakaları gece boyunca 27–30 °C sıcaklıkta kuluçka yapın; böylece koloni aşırı büyüme önlenir ve net ve ayrı bireysel koloniler sağlanır.
          NOT: Üçlü olarak spot kaplama, nicelik hassasiyetini artırır ve çeşitli bakteri konsantrasyonlarında tespit yapılmasını sağlar. Daha düşük kuluçka sıcaklığı bakteri büyümesini yavaşlatır ve yüksek konsantrasyonlu örneklerden daha doğru CFU tahmini yapılmasını sağlar.
      7. Önceden ısıtılmış serum ve antibiyotik-antimikotiksiz maddeye 240 μg/mL amikasin ekleyerek antibiyotik içeren ortam hazırlayın.
      8. 3 saat enfeksiyon tamamlandıktan sonra, Caco-2 hücre monokatmanlarından madde aspirasyonu yapılır. Her kuyuya 1 ml serum ve antibiyotik-antimikotik içermeyen madde ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın (toplamda 2 yıkama).
      9. Her kuyuya 1 mL 240 μg/mL amikasin içeren ortam pipetleyin ve ekstraselük bakterileri yok etmek için %5CO2 ile 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe yapın.
      10. Her kuyidan ortamı aspire edin ve amikasin tarafından öldürülen yapışkan bakterileri temizlemek için 1 mL 1× PBS ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın (toplamda 2 yıkama).
      11. Her kuyuya 1× PBS ile seyreltilmiş 200 μL Triton-X-100 ( bkz. Malzeme Tablosu) pipet koyun. Epitel hücreleri lizize etmek için 90 rpm'de bir orbital sallayıcıda 10 dakika kuluçka yapın.
      12. Hücreleri 24 kuyu plakasından yaklaşık 30 kez yukarı aşağı pipetleyerek ayırın.
        NOT: Plakaların kollajenle kaplanması hücre yapışmasını iyileştirdiğinden, monotabakanın plakadan ayrıldığından emin olmak önemlidir. Bu, lizlenmiş bir kuyuyu, lizsiz bir kuyuya ve Caco-2 hücresi olmayan bir kuyuya göre karşılaştırarak görsel olarak doğrulanabilir; bu da temiz görünecektir.
      13. Hücre lizatlarının 96 kuyu bir plakada 1× PBS kullanılarak 10 kat seri seyreltilmesi gerçekleştirilir.
        NOT: 10-3 seyreltmeye kadar seri seyreltme yapın.
      14. LB agar plakalarına 10 μL nokta seyreltmeleri üçlü olarak verildi, seyreltilmeden 10-3 seyreltiğe kadar. Lekelerin alev altında agar'a emilmesine izin verin. Koloni aşırı büyümesini önlemek ve net ve ayrı bireysel koloniler sağlamak için plakaları gece boyunca 27–30 °C sıcaklıkta kuluçka yapın.
    4. Koloni sayımı ve yüzde istila hesaplaması
      1. Gece kuluçkasından sonra, seyreltilmiş gece kültürü ve alınan lizattan alınan her noktadaki koloni sayısını sayın. Her noktada 7'den fazla izole koloni içeren bir seyreltme seçin. Aynı seyreltmeyi üçlükler üzerinde kullanarak, bu seyreltme için alınan bakteri koloninin ortalama sayısını hesaplayın.
        NOT: İyi izole edilmiş tek koloniler içeren nokta seyreltmeleri sayın ve temas eden kolonileri içeren seyreltmeleri saymaktan kaçının.
      2. Aşağıdaki denklemleri kullanarak inokulum CFU/mL, alınan CFU/mL ve yüzde istila sayısını hesaplayın:
        Inoculum CFU (CFU/mL):
        CFUinokulum = (ortalama koloni sayısı)(seyreltme faktörü)(enfeksiyon ortamından hacmi (μL) x 100
        Alınan CFU (CFU/mL):
        CFU alındı = (ortalama koloni sayısı)(seyrelme faktörü) x 100
        İstila Yüzdesi (%):
        İstila (%) = [(CFUalındı)/(CFUaşısı)] × 100

2. Konfokal Mikroskopi için Amikacin Koruma Testi

  1. Steril poli-L-lizin kaplı kapak kapaklarının hazırlanması
    1. Biyolojik güvenlik kabinde, steril forsepsler kullanarak poli-L-lizin kaplı kapak kapaklarını (bkz. Malzemeler Tablosu) %70 etanolle ıslatılmış bir kağıt havluya yerleştirin.
    2. Örtü kaydırmalarının her iki sürgüsünü %70 etanol ile püskürtün, steril forseps kullanarak örtü kıvırını her iki tarafa çevirin.
    3. Örtü kapaklarını biyolojik güvenlik dolabında UV ışığı altında tamamen kuruyana kadar kurutmaya bırakın.
  2. Caco-2 hücrelerinin 6 kuyu bir plakada tohumlanması
    1. Biyolojik bir güvenlik kabinde, 6 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 1 poli-L-lizin kaplamalı kapak koyun.
    2. "Caco-2 hücrelerinin tohumlanması" bölümünden 3.2.1–3.2.8 adımlarını tekrarlayın.
    3. Aşağıdaki denklem kullanılarak 6 kuyu plakasında 1 x 105 hücre/mL konsantrasyonda tohum Caco-2 hücreleri alın:
      [(1 × 105 hücre)(Kuyu tohumlama sayısı + 2)] / [Canlı hücre sayısı konsantrasyonu (hücreler/mL)] × 2 = hücre (mL)
      NOT: Bu değer, 6 kuyu plakası kullanıldığında her kuyu başına 2 mL madde eklemeyi hesaba kaldırmak için 2 ile çarpılır.
    4. Yukarıda hesaplanan hücre hacmini 15 mL'lik konik bir tüpe alın. Aşağıdaki denklemi kullanarak hücrelere eklenecek tam büyüme ortamının hacmini hesaplayın:
       (Kuyu tohumlama sayısı + 2 kuyyu) x 2 - hücre (mL) = ortam (mL)
    5. Yukarıda hesaplanan ortam hacmini Caco-2 hücrelerini içeren 15 mL konik olarak pipetleyin ve pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle karıştırın.
    6. 6 kuyu tabakasının her kuyusuna tam büyüme ortamında 2 mL Caco-2 hücresi ekleyin (nihai konsantrasyon 1 × 105 hücre/mL).
    7. Plakayı %5CO2 ile 37 °C'de inkubka edin, hücreler %90 birleşme seviyesine (2–3 gün) ulaşana kadar.
  3. Amikacin koruma testi
    1. Amikacin koruma testini Bölüm 1, Adımlar 4.1-4.3.10'da yazıldığı gibi gerçekleştirin
  4. İmmünofloresans boyama
    1. Caco-2 hücrelerinin fiksasyonu ve permeabilizasyonu
      1. Hücreleri, her kuyuya 1X PBS ( bkz. Malzeme Tablosu) ile seyreltilmiş %4 paraformaldehit ekleyerek sabitleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
      2. Her bir kuyuyu aspirasyon yapın ve hücreleri yıkamak için 1 mL 1× PBS ekleyin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
        NOT: Hücreler birkaç gün boyunca 1X PBS'de 4 °C'de saklanabilir.
      3. Her kuyuya 1 mL %0,1 Triton-X-100 ekleyin ve hücreleri geçirimlileştirmek için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
      4. Triton-X-100 çözeltisini aspire edin ve her kuyuya 1 mL 1× PBS ekleyin. 1× PBS ile hücreleri 5 dakika kuluçka edin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
    2. Bloklama ve antikor boyama
      1. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için, %1 sığır serum albümini (BSA), 22,52 mg/mL glisin içeren bir blokaj çözeltisi hazırlayın; 1× PBS + %0,1 Tween20 (bkz. Malzeme Tablosu).
      2. Her kuyuya 1 mL bloklayıcı çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
        NOT: Bloklama adımı 4 °C'de 16 saat boyunca da yapılabilir.
      3. Aspirasyon bloklama çözeltisi ve hücreleri anti-Rabbit E. coli birincil antikoru ( bkz. Malzeme Tablosu) ile incelendirin (önerilen 1:500 seyreltme) blok çözme çözeltisinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca seyreltirilmiştir.
        NOT: Birincil antikor ile kuluçka işlemi 4 °C'de 16 saat boyunca da yapılabilir.
      4. Primer antikor çözeltisi aspirasyon yapın ve 1 mL 1× PBS + %0,1 Tween20 ekleyin. Hücreleri 1× PBS + %0,1 Tween20 içinde 5 dakika kuluçka edin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
      5. Hücreleri, keçi anti-Tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikoru ( bkz. Malzeme Tablosu) seyreltilmiş (önerilen 1:1000 seyreltme) blok çözeltisinde oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edin. Floroforu ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyoya sarın.
      6. İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve 1 mL 1× PBS + %0,1 Tween20 ekleyin. Hücreleri 1× PBS + %0,1 Tween20 içinde 5 dakika kuluçka edin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
    3. Kaplama boyama ve kaplama üzerine montaj
      1. Konak ve bakteri DNA'sını ve konak aktini boyamak için, 10 mg/mL Hoechst (önerilen 1:2000 seyreltme, bkz. Malzemeler Tablosu) ve Rhodamine-phalloidin (önerilen 1:1000 seyreltme, bkz. Materyal Tablosu) kullanılarak 1× PBS ile kombinasyon susuşu hazırlanın.
      2. Her kuyuya 1 mL boya çözeltisi ekleyin ve 10 dakika kuluçka yapın.
      3. Boya çözeltisi çıkarın ve her kuyuya 1 mL 1× PBS ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın (toplamda 2 yıkama).
      4. 1 mL 1× PBS ekleyin ve hücreleri çözeltide batırın.
      5. Etiketli slayta bir damla montaj ortamı (bkz. Malzemeler Tablosu) koyun.
      6. 6 kuyruklu plakadan kılıfı dikkatlice eğik bir iğne kullanarak kaldırın ve kapak kayağını, hücrelerin bulunduğu taraf, montaj ortamının bulunduğu sürgüye bakacak şekilde ters çevirin.
      7. Kapak parçasını montaj ortamına yerleştirin. Montaj ortamının tüm kapak parçasına eşit şekilde dağıldığından emin olun.
      8. Monte edilmiş kaydırakları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçka altına alın.
      9. Örtü kenarlarını şeffaf oje ile kapatın ve slaytları 4 °C'de sürgü kutusunda sakla.
      10. Monte edilen örnekleri, konfokal mikroskopla kullanılan boyalara/floroforlara uygun kanallarla görüntüleyin.

Sonuçlar

Amikacin tedavisinin ekstrasellüler bakterileri yok etmedeki etkinliğini değerlendirmek ve hücre içi istilayı görselleştirmek için, Caco-2 hücre monokatmanları kullanılarak enfeksiyon deneyleri yapıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, E. coli NRG857c (pozitif kontrol) veya E. coli DH5α (negatif kontrol) enfeksiyonu sonrası gentamisin veya amikasin ile yapılan tedavi benzer invazion profilleriyle sonuçlandı. Bu bulgular, amikasinin hücre dışı bakterileri yok etmede gentamisin kadar etkili olduğunu ve hücre içi bakteri yükünü doğru şekilde yansıttığını göstererek, invaziya testleri için alternatif bir antibiyotik olarak kullanımını desteklemektedir. NRG857c'nin ~%4-10 iyileşme aralığı ve E. coli DH5α için %<1 iyileşme, mutant suşlara veya diğer klinik izolatlara kıyasla istila fenotiplerinin doğru yorumlanması için kabul edilebilir kabul edilirve önceki gözlemlerle uyumlu 11. Pozitif ve negatif kontrollerin invaziya yüzdesi bu beklenen iyileşme aralığının dışındaysa, sonuçlar temkinli yorumlanmalı ve test tekrarlanmalıdır.

Amikasinin gentamisin dirençli klinik E. coli izolatlarını etkili şekilde hedefleyebildiğini göstermek için gentamisin ve amikasin koruma testleri paralel olarak yapıldı ve izolatların invazion profilleri incelendi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, gentamisin dirençli izolatların gentamisinle işlenmesi, %21,52'den %2788,50'ye kadar değişen yüksek değişkenlikli iyileşme değerleri sağlamıştır. Buna karşılık, amikasin ile yapılan tedavi tüm izolatlarda iyileşmeyi önemli ölçüde azalttı, etkinliğini vurguladı ve daha doğru ve güvenilir istila ölçümlerini mümkün kılıyordu.

Son olarak, AIEC'nin invazion sırasında hücre içi fenotipini değerlendirmek için, Caco-2 hücreleri E. coli NRG857c ile enfekte edilmiştir. Şekil 3 , rodamin-falloidin ve Hoechst ile karşı boyama ile görselleştirilmiş bakteriler (yeşil) ile boyanmış enfekte Caco-2 hücresinin temsil edici görüntüsünü göstermektedir. Enfeksiyondan 4 saat sonra, NRG857c'nin sitoplazmada, çekirdeğe yakın ve aktin sınırları içinde yerleştiği gözlemlenir; bu da bu bakterilerin hücre içi doğasını doğrular.

figure-results-1
Şekil 1: AIEC sırtı NRG857c ile enfekte olan Caco-2 hücrelerine gentamisin veya amikasin eklenmesi, karşılaştırılabilir invazion profilleri ortaya çıkarır. Caco-2 hücre monokatmanları, MOI oranı 10 ile AIEC stürü NRG857c ve E. coli DH5α ile enfekte edildi. Enfeksiyondan 3 saat sonra, hücreler ekstraselülük bakterileri yok etmek için 1 saat boyunca gentamisin (100 μg/mL) veya amikasin (240 μg/mL) ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra %1 Triton-X-100 ile lizedilmiş, homojenatlar ise seri olarak seyreltilip CFU sayımı için LB agar'da kaplanmıştır. İstila, ilk aşıya göre kurtarılan bakterilerin yüzdesi olarak ifade edildi. Veriler üç bağımsız deneyi temsil eder (n = 3); Hata çubukları ortalamanın standart sapmasını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Amikacin, gentamisine dirençli E. coli suşlarını etkili bir şekilde hedefliyor. Caco-2 hücre monokatmanları, IBD hastalarından izole edilen E. coli suşlarıyla MOI 10 ile enfekte edildi. Enfeksiyonun 3 saatinden sonra, hücreler ekstraselüler bakterileri yok etmek için 1 saat boyunca gentamisin (100 μg/mL) veya amikasin (240 μg/mL) ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra %1 Triton-X-100 ile lizedilmiş, homojenatlar ise seri olarak seyreltilip CFU sayımı için LB agar'da kaplanmıştır. İstila, ilk aşıya göre kurtarılan bakterilerin yüzdesi olarak ifade edildi. Veriler üç bağımsız deneyi temsil eder (n = 3); Hata çubukları ortalamanın standart sapmasını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: E. coli tarafından epitel hücre istilasının görselleştirilmesi. E. coli NRG857c'yi enfekte eden Caco-2 hücrelerinin temsilci konfokal mikrografları. Caco-2 hücreleri 3 saat enfekte edildi ve ardından amikasin (240 μg/mL) ile 1 saat kuluçka yapıldı. Konak aktin rodamin-fallodin (kırmızı) ile boyanmış, konak ve bakteri DNA'sı ise Hoechst (mavi) ile boyanmıştır. E. coli (yeşil) anti-tavşan E. coli birincil antikoru ve keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikoru kullanılarak tespit edildi. Görüntüler, Leica konfokal mikroskobu kullanılarak 3× yakınlaştırma ile 63× bir objektif üzerinde alındı. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Çalışmanın akış şeması. (A) AIEC suşları gece boyunca yetiştirildi, yıkandı ve 10 MOI ile Caco-2 monolayerlarına eklendi. 3 saat enfeksiyon ve 1 saat amikacin tedavisinin ardından, hücre içi bakteriler kurtarıldı ve seri seyreltmeler üçlü olarak uygulanarak nicelendirildi. (B) Enfekte monokatmanlar sabitlenmiş, antikorlarla boyanmış ve floresan mikroskopisiyle görüntülenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Amikasin tedavisi epitel hücrelerinde minimal sitotoksisite sağlar. Caco-2 hücreleri 1 saat boyunca gentamisin (100 μg/mL) veya amikasin (240 μg/mL) ile işlendi. Sitotoksisite, kültür ortamına salınan laktat dehidrojenazın ölçülmesiyle belirlendi. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir (n = 3). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Amikasin koruma testi, E. coli'nin epitel hücrelere invaziyasını değerlendirmek için modifiye edilmiş bir yaklaşımdır. Bu testin başarısı için plakaların kolajen kaplaması, tek katmanlı bütünlüğün korunması ve verimli hücre lizisi gibi birkaç adım kritik öneme sahiptir. Caco-2 hücreleri, doku kültüründe işlenmiş plastiklere bağlanabilen ve monolayer20 oluşturabilen yapışkan bir hücre hattıdır. Ancak enfeksiyon sırasında, serumsuz madde kullanımı ve tekrar tekrar yıkama hücre ayrılmasını etkileyebilir ve bakteriyel istilanınyeterince temsil edilmemesine yol açar 21. Bunu çözmek için, plakaların tip IV kolajen gibi ekstraselüler matris bileşenleriyle kaplaması, enfeksiyon21 sırasında hücre tutunmasını ve stabil, birleşen bir monotabakanın oluşmasını teşvik edebilir. Bu önemlidir çünkü AIEC sızı LF82'nin istila sırasında sıkı bağlantıları bozduğu gösterilmiştir ve eksik tek katmanlı oluşum bu adımı atlayarak çarpıksonuçlara yol açabilir 22. Son olarak, etkili hücre lizisi bakteriyel iyileşmeyi etkileyen bir diğer önemli adımdır; çünkü eksik liziz invazivliği gizleyebilir ve analiz sonuçlarınıkarıştırabilir. 23. Bunu aşmak için, Triton-X-100 ile kuluçka sonrası hücre lizatının tamamen yeniden süzülmesi önemlidir.

İstila testi değişkenliğine katkıda bulunabilecek teknik zorlukların yanı sıra, AIEC LF82 sızı için enfeksiyon sonrası iyileşme yüzdesi %0,61 ile %17,25 arasında değişmektedir8. Bu değişkenlik, bu in vitro testte safra tuzları, müsin ve diğer bağırsak metabolitleri gibi AIEC virülansına katkıda bulunduğu bilinen bazı çevresel ipuçlarının olmamasınedeniyle etkilenebilir. 24,25,26. Özellikle, safra tuzlarının uzun kutup fimbrialarının ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir; bu da M hücreleri arasında AIEC bağlanmasını ve translokasyonunuartırır 27. Vibrio ve Shigella gibi diğer gastrointestinal patojenlerin, tip III salgı sistemlerini safra ile düzenleyerek epitel hücre istilasını aracılıkettikleri bilinmektedir 28,29. Virülens faktör ekspresyonunu indüklemek için safra tuzlarıyla alt kültüre edilmek, diğer patojenler için gentamisin koruma protokollerinde standarttır ve bu çevresel ipuçlarıyla AIEC büyütmek istilayı stabilize edebilir ve daha tutarlı profillerelde edebilir 30,31.

Bu testin bir diğer sınırlaması, bakteri istilasının tek bir zaman noktasında değerlendirilmesidir; bu da alanda standart olsa da, muhtemelen istila sürecini aşırıbasitleştirir. 12. Bakteriyel istila, yapışma, içselleştirme, hücre içi çoğaltma ve konak hücreden kaçmayı içeren dinamikbir süreçtir. AIEC istilasına katkıda bulunan yeni genlerin tanımlanması zor olduğundan, tek bir zaman noktası testi bu sürece katkıda bulunan gen sayısını az temsiledebilir 12. Bu nedenle, zaman süresi invazion testleri, spesifik genlerin invaziya nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek ve I-407 ile Hep-2hücrelerinde AIEC replikasyonunu incelemek için kullanılmıştır 8,33. Zaman kursu invazion testinin kullanımı, bireysel genlerin istilaya katkısını karakterize etmek için değerli olsa da, özellikle birçok klinik izolatın taranması sırasında emek yoğundur. Bu nedenle, istilayı değerlendirmek için tek bir zaman noktası kullanılır.

Ayrıca, AIEC'nin hücre içi yaşam tarzı çok iyi tanımlanmamıştır. Çoğu çalışma, çeşitli virülans faktörü silinme mutantlarının CFU'sunda değişiklikleri tespit etmek için birincil gösteri olarak yüzde istilasınıkullanır 14,34. Enfekte konak hücrelerinin görselleştirilmesi, yalnızca CFUsayımlama 35 kullanıldığında gözden kaçan AIEC biyolojisi hakkında benzersiz içgörüler sağlayabilir. Bu nedenle, hücre istilasında farklı genlerin rolünü kapsamlı şekilde değerlendirmek için, enfekte hücrelerin immünoflüoresans mikroskopisi CFU sayımı ile birlikte yapılmalıdır. Bu önemlidir çünkü endozomal hayatta kalmada işlev gören ve kaçan, konak sitoskeletini hedefleyen veya hücre başına bakteri yükünde farklar gösteren genlerin tespit edilmesine yol açabilir; bu farklar sadece CFU kurtarılmasıyla göz ardı edilebilir. Burada tanımlanan immünofluoresans boyama protokolünün hücre içi bakterileri tespit etmek için kullanılmasının, gerçekten içselleştirilmiş bakteriler ile hücre yüzeyine yapışanları ayırt etmediğini belirtmek önemlidir. Hücre dışı bakterilerin permeabilizasyondan önce belirgin bir ikincil antikorla etiketlendiği ve permeabilizasyondan sonra hücre içi bakterilerin boyandığı bir diferansiyel boyama yaklaşımı bu sınırlamayı ele alacak ve bu popülasyonları daha kesin ayırt etmek için gelecekteki çalışmalardauygulanabilir.

Bu yöntemin önemi büyük ölçüde çeşitli antibiyotik tedavisi gören IBD hastalarından çok ilaca dirençli E. coli izolelerinin tarama yeteneğindeyatmaktadır 11. Gentamisin, erken başlangıçlı IBD hastalarını tedavi etmek için kullanılır ve diğer bakteriyel enfeksiyonların tedavisindede uygulanabilir. Gentamisin dirençli izolatların ortaya çıkması, standart testin kullanılmasını engelleyecek ve amikasini daha güvenilir bir alternatifhaline getirecektir 11. Bu makalede belirtilen protokollerin kullanılması, AIEC enfeksiyon biyolojisinin daha kapsamlı bir karakterizasyonuna olanak tanıyacak ve istilaya katkıda bulunabilecek yeni genlerin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Bu yöntemler, bakteriyel patogenez ve konak-patojen etkileşimi araştırmaları bağlamında önemlidir; çünkü yeni virülans faktörlerinin keşfini, bakteriyel hücre içi yaşam döngüsünün karakterizasyonunu ve enfeksiyon sırasında hedeflenen konak yollarının sorgulanmasını mümkün kılar. Ayrıca, in vitro epitel hücre modelleri kullanılarak diğer istilacı patojenleri incelemek için geniş çapta uygulanabilirler.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Gelişen Patojenler Girişimi (K.O., J.N.), Welch Vakfı 1-561 (K.O.), Once Upon a Time Foundation (K.O.), NIH hibe R35 GM134945 (K.O.), NIH hibe NIDDK K08-DK-123316 (J.N.), Burroughs Wellcome Fonu Tıp Bilimcileri Kariyer Ödülleri - 1020904 (J.N.) ve NIH T32 AI007520 (S.F.) tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
75 cm2 Tissue culture flaskFisher Scientific FB012937
Amikacin disulfate Research Products International A20540-25.0
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062
Anti-E.coli antibodyAbcamab137967
BioLite microwell plates - 6 wellFisher Scientific 12-556-004
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906
Collagen I, Rat tail, 100 mgCorning354236
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10312
DMEM, high glucoseGibco11965118
Fetal bovine serumCorning35-011-CV
Galcial acetic acidSigma-AldrichA6283
Glycine ultrapureUSBiologicalG8165
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, trihydrochloride trihydrateInvitrogenH3570
Liofilchem MTS amikacin [AK] 0.016-256 μg/mLFisher Scientific 22-777-704Amikacin MIC Test Strips
Paraformaldehyde solution, 4% in PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Poly-L-lysine coated sterile German glass coverslips for cell cultureNeuvitroNC1327375
ProLong gold antifade mountant InvitrogenP36934
Rhodamine-PhalloidinInvitrogenR415Kırmızı-turuncu 540/565 nm
Surface treated sterile tissue culture platesFisher Scientific FB01292924-well plates
Triton X-100 (Electrophoresis)Fisher Scientific BP151-100
Trypan blueInvitrogenT10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

Kaynaklar

  1. Bruner, L. P., White, A. M., Proksell, S. Inflammatory bowel disease. Prim Care. 50 (3), 411-427 (2023).
  2. Richard, N., Savoye, G., Leboutte, M., Amamou, A., Ghosh, S., et al. Crohn's disease: Why the ileum?. World J Gastroenterol. 29 (21), 3222-3240 (2023).
  3. Hracs, L., et al. Global evolution of inflammatory bowel disease across epidemiologic stages. Nature. 642 (8067), 458-466 (2025).
  4. Lewis, J. D., Abreu, M. T. Diet as a trigger or therapy for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 398-414.e6 (2017).
  5. Khan, S., et al. Dietary simple sugars alter microbial ecology in the gut and promote colitis in mice. Sci Transl Med. 12 (567), (2020).
  6. Ma, X., et al. Gut microbiota in the early stage of Crohn's disease has unique characteristics. Gut Pathog. 14 (1), 46 (2022).
  7. Vester-Andersen, M. K., et al. Increased abundance of proteobacteria in aggressive Crohn's disease seven years after diagnosis. Sci Rep. 9 (1), 13473 (2019).
  8. Boudeau, J., Glasser, A. L., Masseret, E., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Invasive ability of an Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient with Crohn's disease. Infect Immun. 67 (9), 4499-4509 (1999).
  9. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  10. Barnich, N., et al. Adherent-invasive Escherichia coli in Crohn's disease: the 25th anniversary. Gut. , (2025).
  11. Kim, J., et al. Genetic and microbial analysis of invasiveness for Escherichia coli strains associated with inflammatory bowel disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (4), 101451 (2025).
  12. Camprubi-Font, C., Martinez-Medina, M. Why the discovery of adherent-invasive Escherichia coli molecular markers is so challenging?. World J Biol Chem. 11 (1), 1-13 (2020).
  13. Barnich, N., et al. CEACAM6 acts as a receptor for adherent-invasive E. coli, supporting ileal mucosa colonization in Crohn disease. J Clin Invest. 117 (6), 1566-1574 (2007).
  14. Boudeau, J., Barnich, N., Darfeuille-Michaud, A. Type 1 pili-mediated adherence of Escherichia coli strain LF82 isolated from Crohn's disease is involved in bacterial invasion of intestinal epithelial cells. Mol Microbiol. 39 (5), 1272-1284 (2001).
  15. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  16. Chassaing, B., et al. Crohn disease--associated adherent-invasive E. coli bacteria target mouse and human Peyer's patches via long polar fimbriae. J Clin Invest. 121 (3), 966-975 (2011).
  17. Glasser, A. L., Boudeau, J., Barnich, N., Perruchot, M. H., Colombel, J. F., et al. Adherent invasive Escherichia coli strains from patients with Crohn's disease survive and replicate within macrophages without inducing host cell death. Infect Immun. 69 (9), 5529-5537 (2001).
  18. Bringer, M. A., Billard, E., Glasser, A. L., Colombel, J. F., Darfeuille-Michaud, A. Replication of Crohn's disease-associated AIEC within macrophages is dependent on TNF-alpha secretion. Lab Invest. 92 (3), 411-419 (2012).
  19. Ristuccia, A. M., Cunha, B. A. An overview of amikacin. Ther Drug Monit. 7 (1), 12-25 (1985).
  20. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  21. Vllasaliu, D., Falcone, F. H., Stolnik, S., Garnett, M. Basement membrane influences intestinal epithelial cell growth and presents a barrier to the movement of macromolecules. Exp Cell Res. 323 (1), 218-231 (2014).
  22. Wine, E., Ossa, J. C., Gray-Owen, S. D., Sherman, P. M. Adherent-invasive Escherichia coli, strain LF82 disrupts apical junctional complexes in polarized epithelia. BMC Microbiol. 9, 180 (2009).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  24. Delmas, J., et al. Metabolic adaptation of adherent-invasive Escherichia coli to exposure to bile salts. Sci Rep. 9 (1), 2175 (2019).
  25. Zhang, S., et al. Mucosal metabolites fuel the growth and virulence of E. coli linked to Crohn's disease. JCI Insight. 7 (10), (2022).
  26. Viennois, E., et al. Dietary emulsifiers directly impact adherent-invasive E. coli gene expression to drive chronic intestinal inflammation. Cell Rep. 33 (1), 108229 (2020).
  27. Chassaing, B., Etienne-Mesmin, L., Bonnet, R., Darfeuille-Michaud, A. Bile salts induce long polar fimbriae expression favouring Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli interaction with Peyer's patches. Environ Microbiol. 15 (2), 355-371 (2013).
  28. Gotoh, K., et al. Bile acid-induced virulence gene expression of Vibrio parahaemolyticus reveals a novel therapeutic potential for bile acid sequestrants. PLoS One. 5 (10), e13365 (2010).
  29. Bajunaid, W., et al. The T3SS of Shigella: Expression, structure, function, and role in vacuole escape. Microorganisms. 8 (12), (2020).
  30. Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial cell infection analyses with Shigella. J Vis Exp. (204), e66426 (2024).
  31. Chimalapati, S., Lafrance, A. E., Chen, L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus: Basic techniques for growth, genetic manipulation, and analysis of virulence factors. Curr Protoc Microbiol. 59 (1), e131 (2020).
  32. Rodrigues, E., Marzook, N. B., Pallett, M. A., Sateriale, A. Convergent mechanisms of epithelial cell structure manipulation by intestinal pathogens. PLoS Pathog. 21 (7), e1013367 (2025).
  33. Jaishankar, J., et al. A critical role for Vibrio parahaemolyticus LPS to mediate evasion of host immune response during infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (33), e2426547122 (2025).
  34. Cieza, R. J., Hu, J., Ross, B. N., Sbrana, E., Torres, A. G. The IbeA invasin of adherent-invasive Escherichia coli mediates interaction with intestinal epithelia and macrophages. Infect Immun. 83 (5), 1904-1918 (2015).
  35. Liu, H., Semino-Mora, C., Dubois, A. Mechanism of H. pylori intracellular entry: an in vitro study. Front Cell Infect Microbiol. 2, 13 (2012).
  36. Heesemann, J., Laufs, R. Double immunofluorescence microscopic technique for accurate differentiation of extracellularly and intracellularly located bacteria in cell culture. J Clin Microbiol. 22 (2), 168-175 (1985).
  37. Lev-Tzion, R., Ledder, O., Shteyer, E., Tan, M. L. N., Uhlig, H. H., et al. Oral vancomycin and gentamicin for treatment of very early onset inflammatory bowel disease. Digestion. 95 (4), 310-313 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İmmünoloji ve EnfeksiyonSayı 233Sayı 233JoVE'de Bu AySayıAdherent-invaziv Escherichia colibakteriyel invazyon deneyiintestinal epitel hücreleriepitel hücresi invazyonuimmünofloresan boyama
Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.