Yöntem makalesi

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İleri genetik taramalar, binlerce genetik elementi bir toplanmış şekilde bozmak için rutin olarak kullanılır ve büyük ölçekli genotip-fenotip haritaları üretmek amacıyla yapılır. Genellikle hücre kültür sistemlerinde yapılsa da, biriken kanıtlar, in vivo ekranların in vitro tekrarlanamayan yeni biyolojiyi ortaya çıkarma gücüne sahip olduğunu doğruluyor. Ancak, bu yaklaşımın yaygın uygulaması iki büyük zorlukla sınırlı olmuştur: gen aktivasyonu yerine fonksiyon kaybı bozulmalarına ağırlık verme ve in vivo spesifik dokulara karmaşık genetik kütüphanelerin iletilmesinde yaşanan önemli teknik engeller. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fare meme bezinde on binlerce ayrı epitel klon üreterek verimli ve hızlı fonksiyonel genomik taramayı mümkün kılan basit ve çok yönlü bir intraduktal enjeksiyon stratejisini tanımlıyoruz. Ayrıca, kütüphane üretimi, intraduktal enjeksiyon, ekran dekonvolüsasyonu ve kapsamlı in vivo ekranlar için CRISPR-Knockout ve Aktivasyon kütüphanelerinin analizi için gerekli tüm detayları sağlıyoruz. Bu araçları kullanarak, CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay) adını verdik, kodlayan ve kodlamayan genom içinde genomun 46 lokusundan beşte birine kadar değişen kütüphanelerde yeni tümör baskılayıcıları ve onkogenler tespit ettik. Önemli olarak, bu yaklaşım ve analiz, homeostaz veya hastalık sırasında herhangi bir genin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara da uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel genomik taramaları, gen fonksiyonunu1. ölçekte sorgulamak için güçlü bir çerçeve sağlar. CRISPR-Cas gen düzenleme teknolojilerinin geliştirilmesi, yüzlerce ila binlerce genin paralel sistematik şekilde bozulmasını mümkün kıldı ve memeli hücre hatlarında birleştirilmiş CRISPR tabanlı ekranlar, modern kanser biyolojisi araştırmalarının temel taşlarından biri halinegeldi 2. Bu in vitro yaklaşımlar, çeşitli kanser bağlamlarında temelgenler 3, tümörbaskılayıcılar 4 ve sentetik ölümcületkileşimler 5 tespit etmiştir. Ancak, temel sınırlamalardan biri, tümörlerin karmaşık biyolojik özelliklerini, bağışıklık sistemi ve stroma ile etkileşimleri, besin gradyanları ve mikro ortam içindeki doku mimarisi dahil olmak üzere in vivo yakalayamamasıdır2. Bu sınırlamayla tutarlı olarak, son çalışmalar, birçok gerçek kanser sürücü genin, özellikle hücre kültüründe olmayan mikroçevresel ipuçlarına bağlı olarak fonksiyonları mikroçevresel ipuçlarına bağlı olduğunda, in vitro olarak ölçülebilir etkiler göstermediğinigöstermiştir.

Fare meme bezi, in vivo fonksiyonel genomik taraması için benzersiz ve avantajlı bir doku bağlamı sağlar. Meme epitel hücreleri son derece rejeneratiftir, estros döngüsü sırasında klonal genişleme turlarından geçer ve kolayca erişilebilen ve genetik olarak manipüle edilebilen dallanmış bir kanal ağıhalinde organize edilir 11,12,13. Bu özellikler, onlarca yıl süren mozaik genetik analizleri ve soy izleme deneylerini desteklemiş ve meme bezini, doku homeostazı ve hastalık sırasında hücre içsel ve mikroçevreye bağlı gen fonksiyonunu sorgulamak için yönetilebilir bir sistem olaraksağlamıştır 14,15,16,17,18,19,20,21,22. 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Önemli olarak, genetik bozulmalar epitel bölmesiyle sınırlı olabilir; bu da epitelye özgü dönüşüm, hücre rekabeti, soy sadıklığı ve tümör ilerleyişinin sağlam bir doku bağlamında doğrudan incelenmesini sağlar.

Genetik bozulmaları doğrudan yetişkin meme bezine yerinde taşımak için birkaç strateji geliştirilmiş olsa da, yüksek verimli uygulamalar için önemli teknik engeller devam etmektedir. Cre rekombinazının adenovürüs aracılı teslimatı, yetişkin meme bezinde koşullu allellerin somatik rekombinasyonunu indüklemekiçin yaygın olarak kullanılmıştır (34,35,36,37), geleneksel genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler) için gereken karmaşık germ hattı üremesi olmadan gen fonksiyonunu manipüle etmenin verimli bir yolunu sunar. Yüksek titrli adenovirüs CRISPR-Cas9 bileşenlerini doku kesintisi hücrelerine de taşıyabilse de, bu vektörler konakgenomuna entegre olmaz 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 . Bu, ekranların ölçeğini ~10–55 genlerle ciddi şekilde sınırlandırır; çünkü her gRNA hedef bölgesi 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 moleküler inversiyon problarıyla ayrı ayrı dizilenmelidir. Ayrıca, mevcut intraduktal doğum yöntemleri doğrudan meme kanal sistemine erişim sağlar ancak ya meme bezinin invaziv cerrahimaruziyetini gerektirir ya da nispeten büyük ve hantalHamilton şırıngalarının kullanımına dayanır. Virüsün lokal olarak taşınmasında etkili olmalarına rağmen, bu yaklaşımlar nispeten invaziv, teknik olarak zorludur ve havuzlanmış lentiviral kütüphanelerin ölçeklenebilir teslimatı için optimize edilmemiştir. Bu çalışmalar topluca, yerinde viral bozulmaların mümkün olduğunu göstermektedir, ancak mevcut araçlar yüksek verimli in vivo CRISPR taraması için gereken istikrarlı, birleştirilmiş ve dizisi geri alınabilir bozulmaları desteklememektedir.

Bu sınırlamaları gidermek için, biz ve diğerleri kararlı ve kalıtsal genetik modifikasyonları mümkün kılan lentiviral vektörleri entegre etmeye yöneldik. Hücre kültür sistemlerinin aksine, in vivo dokular tek bir organ içinde üretilebilecek bozulmuş hücre sayısına sıkı kısıtlamalar koymakta olup, genom genelinde taramayı pratik kılmamaktadır. Sonuç olarak, in vivo CRISPR ekranları, kapsama ile fizibiliteyi dengeleyen biyolojik bilgilendirilmiş, hedefli kütüphanelerin tasarlanmasını gerektirir. Ayrıca, buradaincelenen çoğu in vivo CRISPR taraması, gen aktivasyonunun tamamlayıcı ve örtüşmeyen biyolojik içgörülerin ortaya çıkabileceğine dair artan kanıtlara rağmen, neredeyse tamamen lentiviral fonksiyon kaybı bozukluklarınaodaklanmıştır 52,53,54,55. Biz ve diğerleri daha önce lentiviral CRISPR bozulmalarının yetişkin meme epiteline entegre edilmesinin sabit ve kalıtsal genetik modifikasyonu in situ mümkün kıldığını ve genomikDNA'dan (36,55,56,57,58) geri alınıp nicellenebileceğini göstermiştik. Bu yaklaşımı kullanarak, onkojenik dönüşümün yeni sürücülerini belirleyen in vivo CRISPR taramaları (36,55) birleştirilmiş şekilde gerçekleştirdik ve lentiviral teslimatın ve CRISPR taramasının hem fizibilitesini hem de biyolojik önemini ortaya koyduk. Ancak, bu çalışmalar, aynı bez içinde hem kayıp hem de fonksiyon kazanımı tarama modellerini kapsayacak şekilde geniş çapta benimsenebilecek ve genişletilebilecek basit, standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir protokole ihtiyaç duyduğunu da vurguladı.

Burada, yetişkin fare memebezi 55 içinde CRISPR-knockout ve aktivasyon kütüphanelerinin paralel in vivo taramasını mümkün kılan basit ve çok yönlü intraduktal enjeksiyon stratejisini tanımlıyoruz; bu kütüphaneler CRISPR-KOALA olarak adlandırılır. CRISPR-KOALA, CRISPR-KOA yetenekleri için ya geleneksel 20-21 bp 'tek kılavuz' (sg)RNA ya da CRISPR-A için 14 bp 'ölü kılavuz' (dg)RNA kullanır. dgRNA, Cas9'u hedef bölgesine etkili şekilde yönlendirir ancak Cas9 endonükleazaktivitesini 59,60,61 engeller ve böylece hem nakavt hem de aktivasyon modaliteleri için aktif Cas9'u ifade eden tek bir farenin kullanılmasına olanak tanır. dgRNA trcr'ye iki PP7 saç tokası eklenmesi, PP7 Coat Protein:P65:HSF1 transaktivatörü62'nin alınmasını sağlar ve in vivo55 genlerin verimli aşırı ifade edilmesine yol açar (Şekil 1). Hedefli gRNA kütüphanesi tasarımını yüksek titrli lentiviral üretimi ve cam mikrokapilalar kullanılarak cerrahi olmayan intraduktal teslimatla birleştirerek, bu yaklaşım doku mimarisini ve mikroçevresel etkileşimleri koruyarak on binlerce uzamsal olarak ayrık epitel klonu üretir. Önemli olarak, lentiviral olarak konak genomuna entegrasyon, yüksek verimli dizileme yoluyla gRNA'ların geri kazanılmasını ve nicelendirilmesini sağlar; böylece in vivo fonksiyonel genomik ekranların birleştirilmesini sağlar. Bu, birlikte aynı hücrede, Cas9 eksprese eden farenin aynı meme bezinde paralel veya eşzamanlı CRISPR-KO ve CRISPR-A bozulmalarına olanak tanır.

gRNA kütüphanesi tasarımı, lentiviral üretim ve konsantrasyon, intraduktal teslimat, kütüphane dekonvolüsasyonu ve veri analizini kapsayan ayrıntılı adım adım bir protokol sunuyoruz (Şekil 1). Bu yöntem birlikte, fare meme bezinde in vivo CRISPR bayıltma ve/veya aktivasyon taraması için pratik ve ölçeklenebilir bir çerçeve sağlar ve doku homeostazı, farklı hastalık ortamları, diğer dokular ve fare gibi diğer türler sırasında gen fonksiyonlarını incelemek için uyarlanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Fenogenomik Hayvan Bakımı Merkezi Komitesi tarafından onaylandı (protokol 26-0272H).

1. CRISPR kütüphanesi klonlaması

NOT: Bu bölüm, diziyle sentezlenen oligonukleotidlerden lentiviral omurgalara CRISPR knockout ve CRISPR aktivasyon kütüphanelerinin toplu klonlanmasını açıklar. Rutin olarak 4.000 gRNA içeren kütüphaneler üretiyoruz; bu kütüphaneler 8-20 farede 400X-1.000X kapsama alanıyla taranabilir. GRNA sayısı ve kapsama ihtiyacına göre ayarlanabilir, bu da istatistiksel gücü korumak için gereken fare sayısını etkiler. Güçlü fonksiyon kazanımı fenotipleri için yeterli olabilecek minimum 400X kapsama korumasını öneriyoruz.

  1. Rehber RNA kütüphane tasarımı
    1. Bir deneyde incelenecek tüm fare genlerinin listesini derleyin; aşağıdaki CRISPR kütüphanesi tasarımı için ayrı hedef listeleri tutarak, CRISPR knockout (CRISPR-KO) ve CRISPR aktivasyon (CRISPR-A) kütüphaneleri için ayrı hedef listeleri tutulun.
      NOT: CRISPR-KO ve CRISPR-A kütüphaneleri ayrı ayrı oluşturulur ve lentiviral transdüksiyon aşamasında eşzamanlı tarama için birleştirilebilir.
    2. CRISPR-KO kütüphaneleri için, CRISPick62,63, CHOPCHOP64 veya VBC Score65 gibi yüksek puanlı tahmin algoritmaları kullanılarak her gen için dört ila beş tek rehber RNA (sgRNA) seçebilirsiniz.
      NOT: VBC Puanı çok yüksek etkinlik ve hedefe uygun aktivite66 vermektedir. Araç ne olursa olsun, yüksek tahmini hedefe uygun aktivite, minimum hedef dışı potansiyel ve hedefleme kodlama ekzonları içeren rehberleri önceliklendirin.
    3. CRISPR-A kütüphaneleri için, CRISPick62,63 veya CHOPCHOP64 kullanılarak her gen için sekiz ila on rehber seçin. Kullanıcı tarafından belirlenen kılavuz uzunluklarına izin veren araçlar için (örneğin CHOPCHOP), kılavuz üretiminden önce kılavuz uzunluğunu 14 bp olarak ayarlayın. Sadece 20 bp kılavuz üreten bir araç kullanıyorsanız, bu dizileri, genlerin protospacer bitişiği motifinin hemen 5' ötesinde 14 bp dizisini koruyarak ölü kılavuz RNA'lara (dgRNA'lar) dönüştürebilirsiniz.
      NOT: dgRNA'lar, tam uzunluktakisgRNA'ların yaklaşık %50-85'inde tam uzunlukta transkripsiyonel aktivasyonun yaklaşık %50-85'inde DNA bölünmesini tetiklemeden CRISPR tabanlı transkripsiyonel aktivasyonu mümkün kılmak için tasarlanmış kısaltılmış rehberdizilerdir 59,60,61.
    4. Tek bir deneye karşılık gelen tüm sgRNA'lar veya dgRNA'lar ayrı listelere birleştirilerek uniform klonlama, viral üretim ve in vivo tarama mümkün olsun.
      NOT: birlikte taranacak sgRNA ve dgRNA'lar, viral üretim sonrası birleştirilecek.
    5. Daha önce tanımlandığı gibi, hedeflenmemiş55,67 ve genik olmayan gRNAdizileri 68 dahil olmak üzere CRISPR-KO ve CRISPR-A ekranları için havuzlanmış negatif kontrol kütüphaneleri oluşturularak gen bozulması veya aktivasyonundan bağımsız arka plan etkilerini kontrol edin.
      NOT: İstenilirse, hedef olmayan ve genetik olmayan gRNA'lardan oluşan ayrı kütüphaneler oluşturularak iki bağımsız negatif kontrol kütüphanesi oluşturulabilir.
  2. Oligonukleotid havuz tasarımı ve amplifikasyonu
    1. Her gRNA'nın hedefleme dizisi, hedef lentiviral omurga ile uyumlu kısıtlama enzimi çıkıntıları ve karmaşık bir oligonukleotid havuzundan seçici amplifikasyonu mümkün kılan kütüphane-spesifik primer dizilerini içerecek şekilde birleştirilmiş oligonukleotidler tasarlayın (Şekil 1, Tablo 1).
    2. Her gRNA kütüphanesine benzersiz bir primer çifti atayın, böylece paylaşılan oligonukleotid havuzundan bireysel kütüphanelerin bağımsız amplifikasyonu sağlanır. Benzersiz primer çiftleri Tablo 1'de listelenmiştir.
    3. Ticari bir dizi sentez platformundan oluşan oligonukleotid kütüphanelerini sıralayarak her havuzdaki tüm gRNA'ların ekemolar temsilini sağlar.
    4. Aşağıdaki reaksiyon karışımında kütüphaneye özgü primerler kullanarak havuzlanmış oligonukleotid şablonundan bireysel gRNA kütüphanelerini amplifikasyon. Reaksiyon, belirli polimerazın önerilen bileşimine uyacak şekilde değiştirilebilir. Bir toplanmış oligonukleotid şablonu ve bir şablonsuz negatif kontrol reaksiyonu içeren üç reaksiyon hazırlayın.
      4 ng Pooled oligonukleotide şablonu
      2.5 μL 10 μM İleri kütüphane-spesifik primer
      2.5 μL 10 μM Ters kütüphane-spesifik primer
      10 μL 5x Reaksiyon tamponu
      0.5 μL Yüksek isabetli DNA polimeraz
      X μL Nukleazsız su
      50 μL Toplam hacim
    5. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin, kütüphaneye özgü primer erime sıcaklığına göre tavlama sıcaklığını ayarlayın:
      30 saniye boyunca 98 °C sıcaklıkta 1 döngü
      18 döngü: 10 saniye 98 °C, 20 saniye 62–65 °C ve 3 saniye 72 °C
      72 °C'de 5 dakika bir döngü
      NOT: Kütüphane içinde eşit gRNA temsili korumak için 18–19 amplifikasyon döngüsünü aşmayın.
    6. PCR ürünlerini %2,5 agaroz jel üzerinde 120 V'da yaklaşık 45 dakika çözün ve beklenen gRNA insert boyutuna (primer tasarımına bağlı olarak yaklaşık 100 bp; Şekil 2A).
    7. PCR ürünlerini jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın ve son elüasyon aşamasında 20 μL ultrasaf suda elüasyon yapın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Saflaştırılmış gRNA ekleri klonlamadan önce -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
  3. Lentiviral omurgalarının hazırlanması ve sindirimi
    1. GRNA insertlerini klonlamak için çıkarılabilir bir doldurucu dizisi içeren lentiviral omurga plazmidleri hazırlayın. In vivo CRISPR-KO ve CRISPR-A kütüphaneleri için sırasıyla pLKO-Cre (Addgene Plazmid #158032 veya 256774) ve pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plazmid #256776) kullanılır.
    2. Uygun kısıtlama enzimi ve tampon kullanılarak toplam 200 μL reaksiyon hacminde lentiviral omurga DNA'sını 5–10 μg sindirin. pLKO-Cre CRISPR-KO omurgası için Esp3I ve pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A omurgası için SapI kullanın.
      5–10 μg Omurga Plazmidi
      20 μL 10x Enzim tamponu
      5 μL kısıtlama enzimi
      X μL Nükleazsız su
      200 μL Toplam hacim
    3. Sindirim reaksiyonlarını 37 °C'de 2–3 saat kuluçka edin.
    4. Her sindirim reaksiyonuna 2 μL rekombinant alkali fosfataz eklenir ve sindirilmiş omurga defosforile etmek için 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    5. Sindirilmiş ürünleri %1 agaroz jelinde çözün ve linearize omurga bandını kesin (Şekil 2B,C)
      NOT: Her iki omurga için de, doldurucu parça vektöre bağlı olarak yaklaşık 2000-2500 bp hızda ayrı bir bant olarak görünür.
    6. Kesilmiş omurga DNA'sını jel çıkarma kiti kullanarak arındırın ve yüksek DNA konsantrasyonunu (genellikle 20 μL) korumak için minimum miktarda ultrasaf suda elüasyon yapın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Saflaştırılmış sindirilmiş omurgalar, ligasyondan önce -20 °C'de saklanabilir.
  4. gRNA kütüphanelerinin sindirimi ve ligasyonu
    1. 750 ng saflaştırılmış lentiviral omurga DNA'sı, 43 ng gRNA kütüphanesi insert DNA'sı, 3 μL krestriksiyon enzimi, 7,5 μL T4 DNA ligaz, 15 μL 10 mM ATP ve uygun miktarda reaksiyon tamponu ile steril damıtılmış su kullanarak toplam 150 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için hepsi bir arada sindirim-ligasyon reaksiyonları kuruldu.
      NOT: Plazmid omurga sindirim aşamasında başlangıçta kullanılan aynı kısıtlama enzimini kullanın. Önerilen omurgalar kullanıldığında yaklaşık olarak 750 ng saflaştırılmış lentiviral omurga ile 43 ng kütüphane insert DNA'sı oranı, yaklaşık 1:7 vektör-insert molar oranı elde eder.
    2. Her ligasyon karışımını üç eşit aliquot'a ayırarak dönüşüm verimliliğini ve kütüphane karmaşıklığını artırın.
    3. Arka plan ligasyonu değerlendirmek için omurga DNA'sı içeren ancak gRNA eklemeleri olmayan tek bir negatif kontrol reaksiyonu hazırlayın.
    4. Sindirim-ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca 30 °C'de kuluçka edin.
    5. Ertesi sabah, her reaksiyon aliquotuna uygun kısıtlama enziminden 1 μL ekleyin ve omurga sindiriminin tamamlanmasını sağlamak için 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    6. Her reaksiyona 2 μL 10 mM ATP ve 2 μL T4 DNA ligaz eklenin ve ligasyonun tamamlanması için 25 °C'de 2–3 saat kuluçka yapın.
    7. Her kütüphane için üç ayrı sindirim-ligasyon reaksiyonunu birleştirin, reaksiyonları kolon bazlı oligonukleotid temizleme yöntemiyle arındırın ve her birini 21 μL ultrasaf steril damıtılmış suda elüasyon yapın. Tek arındırılmış negatif kontrol reaksiyonunu 7 μL ultrasaf steril damıtılmış suda elüet.
      NOT: Tuz veya EDTA içeren tamponlar içinde ligasyon ürünlerini elüasyon yapmayın, çünkü bunlar bakteriyel elektroporasyon verimliliğini önemli ölçüde azaltır. (DURAKLAMA NOKTASI) Arıtılmış ligasyon ürünleri, elektroporasyondan önce -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
  5. Kütüphane elektroporasyonu ve genişlemesi
    1. Elektroporasyon öncesi en az 20 dakika buzda 2,1 cm elektroporasyon küvetleri, 2 μL aliquot saflaştırılmış ligasyon ürünleri içeren mikrosantrifüj tüpleri ve 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen kültür tüpleri önceden soğutulabilir.
    2. Elektro yetkili bakteri hücrelerini buz üzerinde eritin ve 25 μL hücreyi 2 μL saflaştırılmış ligasyon ürünüyle önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpünde pipetleme ile nazikçe karıştırın.
    3. Hücre-DNA karışımını önceden soğutulmuş 0,1 cm elektroporasyon küvetine aktarın ve 1,8 kV, 25 μF ve 200–600 Ω elektroporatla geçirin.
      NOT: Başarılı bir elektroporasyon genellikle 4,6 ms ile 4,9 ms arasında bir zaman sabiti verir.
    4. Elektrokompetsiyon hücreleriyle birlikte sağlanan 1 mL önceden ısıtılmış, 37 °C geri kazanım ortamını küvette hemen ekleyin, hücreleri nazikçe yeniden süspansiyona yerleştirin ve süspansiyonu 14 mL'lik yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe aktarın.
    5. Kurtarılan hücreleri 30 °C'de 180 rpm'de 90 dakika boyunca sallayarak kuluçka edin.
    6. Kurtarılan hücrelerin 10 μL plakası, 90 μL LB suyu ile seyreltilerek ampisilin içeren LB-agar plakalarına yerleştirilir ve dönüşüm verimliliği ile arka plan ligasyonu değerlendirilmek için gece boyunca 30 °C'de kuluçka edilir.
      NOT: Başarılı klonlama, plaka üzerinde insert ile yüzlerce koloni ve sadece omurga olan negatif kontrol plakasında ise az sayıda (> 30) koloni ile sonuçlanmalıdır (Şekil 3).
    7. U6 promotöründen miniprep için ~10 koloni seçerek ve Sanger dizileme forward'larını seçerek kütüphaneyi daha da doğrulamak için yeterli hale getirin. Başarılı klonlanmış kütüphanelerde, minipreplerin %90'ı gRNA'nın net dizilemesini NOT: Kütüphane temsili, seyreltme plakalarından koloni sayılarını kütüphanedeki toplam gRNA sayısıyla karşılaştırarak değerlendirilebilir ve 1.000 kat kapsama hedeflenir. Bu hesaplamaya yardımcı olmak için birden fazla seri seyreltme kullanılabilir.
    8. Dönüşüm verimliliği yeterliyse, kalan kurtarılan hücreleri uygun antibiyotik içeren 15 cm LB-agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de kuluçka yapın, böylece yoğun bir koloni alanı oluşturulur.
      NOT: Yeterince koloni elde etmek için on 15 cm LB agar plakasının her birine 100 μL kurtarılmış hücreler yerleştirilin.
    9. Ertesi gün, ampisilin ile 500 mL LB çorbasına bakteri kolonilerini kazımak için hücre kazıyıcısı kullanılarak klonlanmış gRNA kütüphanesini temsil eden tek bir bakteri kültürü oluşturulur.
    10. Biriktirilmiş bakteri kültürünü yaklaşık 30 °C sıcaklıkta yaklaşık 3 saat çalkalayarak genişletin ve plazmid DNA'sını maxiprep kiti ile izole edin.

2. In vivo görüntüleme için lentiviral üretimi

NOT: İç dükktal doğum ve in vivo havuzlu tarama için, meme epitel hücrelerinin verimli transdüksiyonunu sağlamak amacıyla lentiviral preparatlar yüksek titrler elde etmek için konsantre olmalıdır (ideal olarak 1 x 108 pfu /mL ile 1 x 109 pfu/mL arasında). Aşağıdaki protokol, in vivo kullanım için optimize edilmiş yüksek titrli lentiviral üretimi tanımlar.

  1. Lentiviral üreten hücrelerin hazırlanması
    1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) %10 fetal sığır serumu, %1 Penisillin-Streptomisin ve kültür hücreleri %5CO2 ile takviye edilmiş HEK293TN hücre tutulur.
    2. Logaritmik büyümeyi korumak ve hücrelerin %90 birleşimini aşmamak için her 2–3 günde bir geçiş hücreleri yapılır. Optimal viral üretim için <20 geçişlerde hücreler kullanın.
    3. Transfeksiyondan bir gün önce, 15 cm doku kültür plakalarını poli-L-lizin (0,02 mg/mL) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca kaplayın. Bir viral hazırlık partisi için dokuz tabak hazırlayın.
    4. Poli-L-lizin çözeltisini çıkarın ve plakaları fosfatla tamponlanmış tuzlu su ile iki kez yıkayın.
    5. Tohum 1.1 x 107 HEK293TN hücreyi dokuz poli-L-lizin kaplı 15 cm doku kültür plakasının her birine yerleştirerek hücrelerin transfeksiyon anında ~%90 birleşime ulaşmasını sağlar.
      NOT: Maksimum viral titr gerektirmeyen uygulamalarda, lentiviral üretimi orantılı olarak daha düşük verimle daha az plakaya (örneğin, üç veya altı plaka) indirilebilir. Transfeksiyon için reaktifleri (plazmid DNA, PEI ve DMEM) buna göre azaltın.
  2. PEI tabanlı lentiviral transfeksiyon
    1. 95 μg gRNA kütüphanesi plazmidi, 95 μg paketleme plazmidi psPAX2 (Addgene Plazmid #12260) ve 65 μg VSV-G zarf plazmidi pMD2.G (Addgene Plazmid #12259) içeren üç plazmidli sistem kullanarak lentiviral üretimi için plazmid DNA'sını hazırlamak.
    2. Lentiviral üretimi için üç plazmid 10,8 mL serumsuz DMEM'de birleştirin ve yaklaşık 10 saniye vorteksle iyice karıştırın.
    3. Sulandırılmış DNA çözeltisine 366 μL 1 mg/mL polietilenin (PEI) damla olarak ekleyin, yaklaşık 10 saniye girdabla karıştırın ve DNA-PEI komplekslerini oda sıcaklığında 10–30 dakika kuluçka yapın.
    4. Kompleks oluşum sırasında, HEK293TN plakalardan aspirasyon kültürü ortamı alın ve 14 mL serumsuz DMEM eklenin.
      NOT: Fetal sığır serumu hücreler tarafından plazmid alımını engelleyebilir.
    5. DNA-PEI kompleksinin 1,2 mL'sini levha boyunca damla olarak dağıtın ve eşit dağılımı sağlamak için kayaç yapın.
    6. Hücreleri %5CO2 ile 37 °C sıcaklıkta, 6–8 saat boyunca kuluçka edin.
    7. Her plakadaki ortamı 20 mL önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin ve %10 fetal sığır serumu (%1 Penicillin-Streptomisin içermeden) takviye edin ve hücreleri %5CO2 ile 37 °C'de kültüre devam ettirin.
      NOT: Gece transfeksiyonu önerilmez, çünkü PEI'ye uzun süre maruz kalmak ve serum eksikliği viral verimini azaltır.
  3. Viral hasat ve ultrasantrifüjasyon
    1. 200 mL sukroz yastık çözeltisi, 40 g sukroz, 11,7 g sodyum klorür, 4 mL 1 M HEPES (pH 7,4) ve 1 mL 0,5 M EDTA (pH 7,9) uygun miktarda steril damıtılmış su hacminde birleştirerek ve 0,45 μm düşük protein bağlayıcı polietersulfon filtrasyon ünitesinden filtre-sterilize edilerek hazırlanır. Bu çözelti birkaç ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
    2. Transfeksiyondan 48–72 saat sonra lentiviral süpernatantı toplayın.
    3. 0,45 μm düşük protein bağlayıcı polietersülfon filtrasyon ünitesinden %10 fetal sığır serumu takviyesi ile takviye edilmiş 10 mL DMEM geçirilir. Akışı at. Süpernatantı filtreye yükleyin ve vakumu uygulayın.
      NOT: Eğer konsantrasyon hemen sağlanamazsa, berrak edilmiş viral süpernatantı gece boyunca 4 °C'de saklayın.
    4. Ultrasantrifüj tüpüne 30 mL arıtılmış viral süpernatan ekleyin.
    5. Aydınlaştırılmış viral süpernatantı 4 mL sukroz yastığı çözeltisiyle yavaşça altına yerleştirin.
    6. Ultrasantrifüj borusunu sallanan bir kovalı rotor için uyumlu bir adaptöre yerleştirin ve tüpleri hassas şekilde dengeleyin.
    7. Tüpleri 104.000 × g sıcaklıkta en az 2 saat boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
      NOT: Beckman JS24.38 rotoru gibi sallanan bir kovalı rotor, virüsü sakroz yastığından doğru şekilde pelletlemek için gereklidir.
    8. Tüpün tabanında soluk beyaz veya saydam bir film gibi görünebilecek viral pelleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice boşaltın.
    9. Tüplerin en az 10 dakika hava kurumasına izin verin ve laboratuvar mendiliyle tüpün içindeki kalanı sıvı parçasını rahatsız etmeden çıkarabilirsiniz.
      NOT: Tüpün doğru şekilde kurutması, yüksek viral konsantrasyonlara ulaşmak için kritik öneme sahiptir, çünkü nihai geri kazanım hacmini azaltır.
    10. Viral pelletleri 20 μL soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla tekrar askıya alın ve hava kabarcıklarından kaçınarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
    11. Tüpleri 2 saat boyunca buzda hafif bir çaltlama ile inkubka yapın, böylece viral pelletler tamamen yeniden süzülür.
    12. Konsantre virüsü temiz bir mikrofug tüpüne aktarın ve çözeltiyi 2.000 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle geçirerek aydınlaştırın.
      NOT: Bu spin, ameliyat sırasında enjeksiyon iğnesini tıkayan kalıntıları ve kalıntı partikülleri temizler.
    13. Konsantre virüsü tek kullanımlık hacimlere ayırarak tekrar tekrar donma-çözülmeleri önlemez ve -80 °C'de depolayın.
  4. LSL-tdDomates fare embriyonik fibroblastları (MEF) kullanılarak lentiviral titrasyon
    1. Enfeksiyondan bir gün önce 6 kuyulu bir plakada 100.000 LSL-tdDomates MEF'i (Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]]'dan türetilmiş) DMEM'de %10 fetal sığır serumu, %1 Penisillin-Streptomisin takviyesi ile takviye edilmiş ve hücreleri %5CO2 ile 37 °C'de kültürlendirin. Hücre sayımı için ekstra bir kutu tabaka koyun.
      NOT: LSL-tdTomato MEF'leri, lentivirüs içindeki Cre için muhabir olarak görev yapar. Diğer omurgaların viral titremesi için uygun herhangi bir raporlayıcı sistemi kullanılabilir.
    2. Ertesi gün, enfeksiyon anında bulunan hücre sayısını ölçmek için ekstra bir kuyulardan LSL-tdDomates MEF'lerinin sayısını sayın.
    3. Toplam 2 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında ve %10 fetal sığır serumu ile takviye edilen Cre rekombinazını kodlayan konsantre lentivirüs seri seyreltmeleri hazırlanın. Genel olarak, 0,4 μL, 0,1 μL ve 0,025 μL konsantre virüs temiz, dinamik doğrusal bir aralık sağlar (Şekil 4A–D).
    4. LSL-tdDomates MEF'lerinin her kuyusuna 2 mL viral seyreltme ekleyin ve her birine 2 μL 10 mg/mL polibren ekleyin.
    5. MEF'leri 400 × g'de 37 °C'de 90 dakika boyunca dönerek enfekte edin.
    6. Viral ortamı %10 fetal sığır serumu ve %1 Penisillin-Streptomisin takviyesi olan 2 ml DMEM ile değiştirin ve hücreleri %5 CO 2 ile 37 °C'de 48–72 saat boyunca kültürlendirin.
    7. Her seyreltmede enfekte hücrelerin oranını belirlemek için floresan mikroskopisi veya akış sitometrisi ile tdDomates pozitif hücreleri niceliklerini ölçerin.
    8. Enfekte hücre oranına ve enfeksiyon anında bulunan hücre sayısına göre fonksiyonel titri hesaplayın.
      NOT: CRISPR-KO ve CRISPR-A virüsleri ayrı ayrı üretilir, konsantre edilir ve titredilir. LSL-tdTomato MEF'leri kullanılarak belirlenen fonksiyonel titreler, intraduktal enjeksiyondan önce CRISPR-KO ve CRISPR-A virüslerini belirli bir oranda karıştırmak için kullanılır.
  5. Plazmid ve lentivirüs kütüphanelerinin kalite değerlendirmesi
    1. GRNA kütüphanelerinin yeterli derinlik/kapsama ile klonlandığını ve tüm gRNA'ların klonlama ile virüs üretimi sırasında korunduğunu kesin etmek için, plazmid havuzunun ve transdüksiyon edilen MEF'lerin sıralanması şiddetle tavsiye edilir.
    2. Lentiviral kapsamını değerlendirmek için, hesaplanan viral titreme esasında lentivirüslü MEF'leri >1000× kapsama ile transfekte edin. Bu aşamada hücrenin tek bir enfeksiyonu olmasını sağlamak zorunlu değildir.
    3. 48–72 saat sonra, hücreleri tripsin veya bir kazıyıcı ile ayırın ve hücreleri pellet olarak parçalayın. DNA'yı ticari bir gDNA çıkarma kiti kullanarak çıkarın.
    4. Bölüm 5'te tanımlanan protokol kullanılarak 1 μg plazmid ve 3 μg ekstraksiyon MEF DNA'sı dizisi. <5000 gRNA'ya sahip çoğu özel kütüphanede 5 milyon okuma derin dizileme yeterlidir.
      NOT: Plazmid havuzunun okumaları ile rehberlerin nispeten eşit temsili (>1 log on yıl içinde rehberlerin %70'i) ve kütüphane sayılarını domine eden tek rehber olmadan, güçlü bir korelasyon (R2> 0.6) iyi kaliteyi gösterir (Şekil 4E).

3. Fare meme bezine intraduktal lentiviral enjeksiyon

  1. İğne ve virüs seyreltmesi
    1. Cam mikrokapiller iğneleri, mikropipet iğne çekicisi kullanarak 9–10 μL hacimli intraduktal enjeksiyon için uygun ince uçlu kapillyarlar üretir. İğnenin en ucunu kırmak için ince bir pens kullanın.
      NOT: Optimal konum, sıvı doldurulabilecek kadar büyük ama meme ucu açıklığına kolayca sığacak kadar ince bir iğne boyutu oluşturur.
    2. Lentiviral preparatları, steril fosfatla tamponlu tuzlu suyla 1 × 107 pfu /mL nihai konsantrasyona kadar seyreltirin ve %0,05 (w/v) Fast Green FCF boyası ile takviye olun.
    3. CRISPR-KO ve CRISPR-A virüslerini aynı karmaşık havuzda taramak için karıştırıyorsanız, iki kütüphaneyi steril fosfat-tamponlu tuzlu suyla eşit viral titere ayarlayın ve her iki kütüphanede gRNA'ların eşit temsili için oranda karıştırın.
  2. Farelerin intraduktal enjeksiyon için hazırlanması
    1. 8–20 haftalık yetişkin dişi fareyi %4 izofluran altında 1 L/dakika oksijenle anestezi edin ve korneanın kurumamasını önlemek için her iki göze steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
      NOT: İndaduktal enjeksiyon invaziv olmayan bir işlemdir ve analjezi gerektirmez. Bu deneyler için Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 veya Rosa-LSL-tdTomato farelerini kullanın.
    2. Fareyi sırtüstü pozisyonda kapalı bir ısıtma pedinde sabitleyin; vücut sıcaklığını korumak ve anestezi sürdürmek için %2 izofluran ile burun konusundan 1 L/dakika oksijen ile anestezi uygulanır.
    3. Üçüncü göğüs ve dördüncü karın meme uçlarının çevresindeki tüyleri, steril pamuk çubukla yaklaşık 0,5 cm yarıçaplı dairesel alanda 10–15 saniye boyunca uygulanan depilatör krem ile temizleyin. Cilt tahrişini önlemek için kremi hemen steril gazlı bez ve steril suyla çıkarın.
      NOT: Üçüncü ve dördüncü meme bezleri genellikle enjekte edilmesi en kolay olanlardır. Alternatif olarak, ikinci ve beşinci bezler de aynı şekilde enjeksiyon için hazırlanabilir.
    4. Her meme ucunun çevresindeki deriyi %70 izopropil alkol ve iyot ile steril gazlı bezle sıralı olarak dezenfekte edin.
    5. Fareyi bir biyolojik güvenlik kabininde diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirerek meme uçlarının net görselleştirilmesini sağlar.
    6. %70 etanol ile temizlenmiş ince forseps kullanarak, meme ucunun üzerindeki ölü deriyi nazikçe çıkararak kanal açıklığını açığa çıkarın.
      NOT: Bu ölü keratinlenmiş tabaka gevşek şekilde tutturulmuş ve iğne girişini engelleyebilir. Çıkarma, canlı cilde veya alttaki dokuya zarar vermemelidir.
  3. İntoduktal enjeksiyon
    1. Sulandırılmış virüsün 8 μL'sini çekilen cam mikrokapillere yükleyin.
    2. Meme ucu bölgesini ince forsepsle tutun ve iğne ucunu nazikçe meme ucu açıklığına sokun (Şekil 5A). Uygun yerleştirilmiş bir iğne, kanala minimum dirençle girer. Viral süspansiyonu meme kanalına 5–10 saniye boyunca yavaşça dağıtın.
      NOT: 1 × 107 pfu/mL lentivirüs'ün 8 μL'si, luminal meme epitel hücrelerinin yaklaşık %30 enfektifliği ve bazal meme epitel hücrelerinin %5 enfektifliği sağlar; stroma36'nın ise %0,5 enfeksiyonu (< %0,5) vardır. Viral titer, daha yüksek veya daha düşük enfeksiyon sağlamak için ayarlanabilir.
    3. Enjeksiyon sırasında Fast Green boyasının yayılmasını disseksiyon mikroskobu üzerinden izleyin. Deri altındaki kanal ağı boyunca boya dağılımı gözlemleyerek başarılı intraduktal teslimatı doğrulayın (Şekil 5B).
    4. Başarısız enjeksiyonları, boya kanal ağacı boyunca değil, meme ucuna bitişik meme yağ yastığı içinde birikerek tespit edin (Şekil 5C).
    5. Her iki tarafta üçüncü göğüs ve dördüncü karın meme bezleri için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın; her fareye toplamda dört bez enjekte edilir.
      NOT: Deneyimle, enjeksiyonların %>95'inde başarılı intraduktal doğum sağlanır. Yağ pediyle sınırlı alınan başarısız enjeksiyonlar yan etkilerle ilişkilendirilmez ve kalan bezler yine de kullanılabilir. İmmöhistokimya ve akış sitometrisi yoluyla enjeksiyonların daha fazla doğrulanması yapılabilir (Şekil 5D,E).
    6. Anestezi bırakın ve fareyi temiz bir iyileşme kafesine nakledin.
    7. Fareyi tam olarak ambulasyon haline getirene kadar izleyin ve normal davranış gözlemlendikten sonra fareyi belirlenmiş biyogüvenlik yuvasına geri gönderin.
    8. Enjeksiyondan üç gün sonra, tüm kafes değişimi yapın, tüm yuva ve yatak malzemelerini viral atık olarak atın ve fareyi standart muhafaza döndürülebilecek temiz bir kafese aktarın.

4. Meme bezleri ve tümörlerden genomik DNA izolasyonu

NOT: Hayvan bakım yönergelerine uygun olarak, fareleri CO2 maruziyeti veya aşırı doz anestezi ve ardından servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın. Meme bezlerini veya meme tümörlerini istenen zaman noktalarında veya insani son noktada düzenleyici yönergelere göre toplamak. Enfekte hücreler, lentiviralenfeksiyondan 48 saat sonra 36,55 veya enjeksiyondan 5+ ay sonra, yabani tipfarelerde 36, ya da onkojenik arka planda >24 ay kadar erken bir süre toplanmıştır55. Aşağıdaki adımlar, DNA Silme ile temizlenmiş ve sgRNA/dgRNA kasetleri içeren plazmidlerden arındırılmış ekipmanlarla temizlenmiş bir alanda yapılmalıdır. Plazmid DNA'sının iz miktarı bile doku örneklerinin kontaminasyonuna yol açacak kadar yeterlidir ve temiz hazırlıklar için derin dizileme PCR'ları ve negatif (dokusuz) kontroller yapılmalıdır.

  1. Doku ayrışması
    1. Meme bezleri için, her meme bezini 2 mL tam Epicult-B Medium (fare) ile 0,2 mL nazik kollajenaz/hyaluronidase ile 15 mL konik bir tüpte sindirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
    2. Oda sıcaklığında 450 × g 450 g'de pellet dissosiyasyon hücreleri kullanın.
    3. Üst yağ tabakasını dikkatlice sığır serumu albumin kaplı pipet ucu kullanarak yeni 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve kalan üst tabakayı atın.
      NOT: Bu aşamadaki üst yağ tabakası genellikle ayrılmamış ve yağ dokusuyla ilişkili kalan epitel organoidleri içerir. Bu fraksiyonu ayrı bir tüpte işlenmesi, epitel hücre iyileşmesini büyük ölçüde artırır.
    4. Hem yağ fraksiyonunu hem de hücre pelletini 5 ml fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla bir kez yıkayın, 450 × g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanları atın.
    5. Yıkanmış yağ fraksiyonu ve aynı meme bezinden hücre pelletini 5 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu bir süzen içeren tek bir 15 mL konik tüpte birleştirin.
    6. Birleşik malzemeyi 450 × g'de 5 dakika boyunca pellet edin ve süpernatantı atın.
    7. Meme tümörleri için, steril makas veya skarpel kullanarak dokuyu küçük parçalara ayırın ve doğrudan 2 mL'lik bir mikrofug tüpüne aktarın.
  2. Genomik DNA izolasyonu
    NOT: Genomik DNA çıkarımı, üretici talimatlarına uygun olarak veya aşağıdaki fenol-kloroform protokolü kullanılarak Qiagen DNEasy Kan ve Doku kiti kullanılarak yapılabilir.
    1. 5 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 mL EDTA (pH 8.0), 25 mL 5 M NaCl ve 50 mL %10 SDS birleştirerek DNA lüz tamponu hazırlayın ve son hacmi steril damıtılmış suyla 500 mL'ye getirin.
    2. Her örnekte 1 mL DNA lizis tamponu ve 10 μL Proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin ve inversiyon ile iyice karıştırın.
    3. Örnekleri gece boyunca 56 °C'de kuluçka altına alın, böylece tam liziz sağlanır.
    4. Santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16.000 × g üzerinde lizatlanır ve çözünmeyen kalıntılar pellet edilir.
    5. Aydınlaştırılmış süpernatantı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      DIKKAT: Fenol:kloroform:izoamil alkol toksik ve aşındırıcıdır. Organik çözücülerle ilgili tüm adımları uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir duman davlumonunda gerçekleştirin.
    6. Eşit hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol ekleyin ve yaklaşık 15 saniye vorteksle yoğun karıştırın, ta ki homojen bir karışım oluşana kadar.
    7. Organik ve inorganik fazları ayırmak için 16.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    8. Üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın, fazı bozmadan yapın.
      NOT: Protein ve RNA kontaminasyonunu en aza indirmek için beyaz ara fazdan amiş bir malzeme asık bulunmayın.
    9. Geri kazanılan sulu faza 0,7 hacim izopropanol ekleyin ve yaklaşık 15 saniye girdabla karıştırın.
    10. 16.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    11. Süpernatantı dikkatlice atın ve DNA pelletini %70 etanol içeren 500 μL ile durulayın.
    12. 16.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve etanolü tamamen çıkarın.
    13. DNA pelletini oda sıcaklığında 10 dakika hava ile kurut.
    14. DNA pelletini 50 μL steril damıtılmış suya yeniden süskü altına alın.
    15. Genomik DNA'nın tam yeniden süspansiyonunu sağlamak için örnekleri 37 °C'de 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka edin.
    16. DNA konsantrasyonunu ve saflığını nanodrop veya florometrik niceleme ile ölçün.

5. CRISPR kütüphanelerinin yeni nesil dizilemesi


NOT: GRNA katlama değişimlerinin zaman içinde hesaplanmasını sağlamak için referans örneği oluşturun. Enfeksiyondan 3 gün sonra alınan transdüksiyon edilmiş MEF'ler (Bölüm 2) veya meme bezleri (Bölüm 4) ile orijinal plazmid maxiprep, başlangıç kütüphanesinde ve viral stokta rehber temsili belirlemek için kullanılabilir.

  1. Genomik DNA'dan gRNA kasetlerinin PCR amplifikasyonu
    1. Tablo 2'de listelenen primer çiftlerini kullanarak örnekleri benzersiz şekilde indeksleyin; böylece dizileme sonrası 306 örnekle çoklamaya ve demultiplexlemeye olanak tanıyabilir.
    2. PCR reaksiyonlarını şablon olarak 1 μg genomik DNA kullanarak hazırlayın; toplam 50 μL reaksiyon hacmi 25 μL 2x Q5 Master Mix, 2,5 μL 10 μM ön primer ve 2,5 μL 10 μM ters primer içerir.
    3. Kontaminasyonu izlemek için paralel olarak şablonsuz bir kontrol reaksiyonu ekleyin.
    4. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin, kütüphaneye özgü primer erime sıcaklığına göre tavlama sıcaklığını ayarlayın:
      30 saniye boyunca 98 °C sıcaklıkta 1 döngü
      5 döngü: 10 saniye için 98 °C, 10 saniye için 68 °C (-1 °C/döngü) ve 15 saniyede 72 °C
      20 döngü: 10 saniye 98 °C, 30 saniye 63 °C ve 15 saniye 72 °C
      72 °C'de 2 dakika bir döngü
    5. PCR ürünlerini %2,5 agaroz jeliyle çözerek doğru amplikon boyutunu doğrulayın.
    6. pLKO tabanlı sgRNA kütüphaneleri için yaklaşık 306 bp ve pXPR502 tabanlı dgRNA kütüphaneleri için 430 bp bantların varlığını doğrulayın (Şekil 6).
      NOT: Şablonsuz net bir kontrol, reaktiflerin saflığını sağlar ve testin çapraz kontaminasyondan arındığını doğrular.
    7. PCR ürünlerini uygun bir DNA arıtma yöntemiyle arındırın ve florometrik nicelendirme ile DNA konsantrasyonunu nicelikle ölçün.
  2. Yeni nesil dizileme
    1. Beklenen kütüphane karmaşıklığı ve örnek klonalitesine dayalı gerekli dizileme derinliğini belirleyin.
      NOT: Klonal olduğundan şüphelenilen tümörler için, kılavuz temsilini doğru şekilde nicelemek için yaklaşık 1 milyon okuma yeterlidir. Meme bezlerinden dizileme derinliğini hesaplamak için, kütüphanedeki rehber sayısını 1.000 kat kapsama ile çarpın, ardından 6 pg genomik DNA/hücre ile çarparak PCR ile amplifikasyon yapılması gereken bir örnek başına toplam genomik DNA kütlesi hesaplanın. Dizileme için gereken toplam okuma sayısı, kütüphanedeki rehber sayısının 1.000 çarpmasına eşittir.
    2. Farklı örneklerden ekemolar konsantrasyonlarda saflaştırılmış kütüphaneleri havuzlayın.
    3. Kısa okuma Illumina dizileme platformu kullanarak kütüphaneleri sıralı havuza aldı.
  3. Veri analizi
    1. Numuneye özgü indeksler kullanarak ham dizileme FASTQ dosyalarını demultiplex ile demultiplex.
    2. Trimmomatic69 kullanılarak gRNA protospacer dizisine okuyor. CRISPR-A örneklerinde trim 14 bp'ye kadar okunurken, CRISPR-KO için trim ön primerin ucundan 20 bp olarak okunur.
    3. Kesme okumaları Bowtie70 kullanılarak ilgili gRNA referans kütüphanesine hizala. CRISPR-KO için -v 2 ve -m 1 , CRISPR-A ve karışık havuzlar için ise -v 2 ve -m 2 hizalama parametrelerini kullanın.
      NOT: Genellikle, okumaların %90'ından fazlası başarıyla hizalanır. Düşük hizalama genellikle kesme hataları, giriş dosyalarının yanlış biçimlendirilmesi veya PCR sırasında örnek kontaminasyonundan kaynaklanır.
    4. MAGeCK72'deki sayma fonksiyonunu kullanarak her gRNA için hizalanmış okumaları nicelikle ölçülerek aşağı akış analizi için nihai gRNA sayım tabloları oluşturulur.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare meme bezinde havuzlu in vivo CRISPR taraması için bir protokol sunuyoruz. Bu boru hattı, oligonukleotid dizilerinden toplanan gRNA kütüphanelerini tasarlamak ve güçlendirmek, gRNA kütüphanelerini lentiviral omurgalarına klonlamak, yüksek titrli lentivirüs üretmek, havuzlanmış lentiviral kütüphanelerin yetişkin meme bezine intraduktal teslimatı gerçekleştirmek ve kütüphane temsilinin dizileme tabanlı dekonvolüsyonu için gRNA'ları geri almak için uçtan uca kullanılabilir (Şekil 1).

Biriktirilmiş gRNA kütüphanelerinin başarılı amplifikasyonu ve klonlanması ilk olarak agararoz jel elektroforezi ile değerlendirilir. gRNA kütüphanelerinin PCR amplifikasyonu, havuzlanmış oligonukleotid çip dizilerinden uniform amplifikasyonu gösteren ayrık bantlar verir (Şekil 2A). pXPR502 PPH-Cre ve pLKO Cre omurgalarının kısıtlama sindirimi, doğrusal omurganın doldurucu parçadan net ayrılmasına yol açar (Şekil 2B,C). Etkili sindirim ve omurganın temiz iyileşmesi, klonlama sırasında arka plan ligasyonu en aza indirmek ve yüksek kütüphane karmaşıklığına ulaşmak için kritik öneme sahiptir.

CRISPR-KOALA kullanımı için önemli bir husus, dgRNA'ların canlı Cas9 ile birlikte verimliliğidir; tam uzunlukta sgRNA'lar ve ölü Cas9 kullanan diğer geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu yöntemdir. Daha önce, canlı Cas9 içeren dgRNA'ların, tam uzunluktaki sgRNA'ların yaklaşık %50-85 verimliliğinde gen aktivasyonunu indüklemek için yeterli olduğunugöstermiştik. Bu aktivasyon azalmasını telafi etmek ve sgRNA'lara kıyasla daha verimsiz dgRNA'ların potansiyelini aşmak için, kütüphane tasarımımıza gen başına iki kat fazla dgRNA eklemeyi hedefliyoruz. Bu yöntem sadece canlı Cas9 kullanılarak gen etkisini yakalandığından, bu aktivasyon seviyesinin CRISPR taraması için yeterli olduğunu düşündük. Bunu test etmek için, Erbb2, Esr1 ve Plgrkt dahil olmak üzere birkaç endogen genin dgRNA aracılı gen aktivasyonunu gerçekleştirdik ve hem mRNA hem de proteinseviye 55'te sağlam bir ekspresyon elde ettik. Önemli olarak, hedef gen ifadesinde düzenli olarak 3 ila 10 kat artış elde ettik; bu, genellikle birkaç geleneksel CRISPR-A sisteminde gözlemlenen 100 ila 1.000 kat artışlardan daha fizyolojik olarak daha önemlidir.

Ligasyon ve elektroporasyon sonrası kütüphane karmaşıklığı, dönüştürülmüş bakterilerin seri seyreltmeleriyle değerlendirilir. Başarılı kütüphane klonlama, ligasyon reaksiyonlarında yoğun ve eşit dağılımlı koloni ile gösterilirken, sadece omurga olan negatif kontrol plakalarındaki az sayıda koloni ile karşılaştırılır (Şekil 3). Sulandırma plakalarındaki koloni sayıları, kütüphane temsili tahmin etmek için kullanılır ve 1.000 kattan fazla kapsama hedeflenir (örneğin, kütüphanede gRNA başına 1.000 bakteri kolonisi). Negatif kontrol plakalarında yetersiz kapsayıcı veya yüksek arka plan, optimal olmayan ligasyon ve/veya elektroporasyon anlamına gelir. Bu durumda, bakteriyel kültürlerin büyük ölçekli genişlemesinden önce bu adımlar tekrarlanmalıdır.

İntoduktal meme bezi enjeksiyonları ve havuzlanmış in vivo tarama için, lentiviral preparatlar yeterince yüksek fonksiyonel titreler elde etmek için konsantre olmalıdır. Yüksek titrli viral üretim, LSL-tdTomato fare embriyonik fibroblastları (MEFs, JAX# 007909) kullanılarak fonksiyonel titrasyon ile doğrulanabilir; çünkü hem pLKO hem de pXPR502 omurgaları bu protokolde vurgulanan Cre'yi ifade eder. Ancak, diğer omurgalar için alternatif yöntemler gerektiğinde kullanılabilir (örneğin, lentiviral omurga içinde farklı bir floresan raporlayıcı veya antibiyotik seçimi kullanmak). Verimli lentiviral preparatlar, tdDomates ifadesinin doğrusal aralıkta net ve doz bağımlı bir indüksiyonunu gösterir ve fonksiyonel titrerlerin hesaplanmasını mümkün kılar (Şekil 4A–D). Havuzlanmış ve çoklanmış CRISPR-KO ve CRISPR-A ekranları için lentivirüsler ayrı ayrı üretilir, yoğunlaştırılır ve titerlenir; fonksiyonel titreler enfeksiyondan önce iki lentiviral kütüphaneyi belirli oranlarda normalize etmek ve karıştırmak için kullanılır.

Meme epitelini en iyi şekilde enfekte etmek için biriktirilmiş lentiviral kütüphanelerin yetişkin meme bezine doğru ve verimli şekilde ulaşımı gereklidir. Cam mikrokapillerin meme ucu ile doğru şekilde yerleştirilmesi, meme kanalına erişim sağlamak için (Şekil 5A), lentivirüsün kanal ağacı üzerinden yayılması için çok önemlidir. Uygun boyutta bir iğne ucu, lentivirüsün iğnenin içine yüklenmesini sağlarken, meme kanalına minimum dirençle girişi sağlar. Başarılı enjeksiyonlar, enjeksiyondan hemen sonra bezlerin içinde dışarıdan görülen Fast Green boyasının meme kanal ağacı boyunca eşit şekilde yayılmasıyla gösterilebilir (Şekil 5B). Buna karşılık, başarısız enjeksiyonlar, boya meme ucu altında birikmesiyle karakterize edilir; bu da meme kanalı yerine meme yağ yastığına ulaşmayı yansıtır (Şekil 5C). Meme dokusu kesitlerinin immünohistokimyasal boyaması, epitel hücrelerinin enfeksiyonunu doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 5D), akış sitometrisi ise luminal ve bazal epitel hücre enfeksiyonlarının oranını niceltmek için kullanılabilir (Şekil 5E); her ikisi de intraduktal teslimat sonrası meme epitel hücrelerinin başarılı hedeflenmesini doğrular.

Genomik DNA geri kazanıldığında, belirli bir numunede hangi gRNA'ların zenginleştirildiğini ölçmek için yeni nesil derin dizileme için PCR ile amplifikasyon yapılır. PCR'den sonra, ürünler jel elektroforezi ile ayrılır ve bu da lentiviral-spesifik ürünler elde eder (Şekil 1 ve Şekil 6). Özellikle CRISPR-A örneklerinde (Şekil 6B) ara sıra spesifik olmayan amplifikasyon gözlemlenebilir; ancak bu ürün genellikle 1.000 bp'den büyük ve ilgi duyulan çarpımdan iyi ayrılmıştır; Ancak, beklenen büyüklükte güçlü bir bandın varlığı, kütüphane toparlanmasının başarılı olduğunu gösteriyor. Şablonsuz kontrol reaksiyonları tespit edilebilir bir bant vermemelidir ve bu kontrollerdeki amplifikasyonun varlığı, aşağıya kütüphanelik niceliyini tehlikeye atacak olan bir kirlenmeye işaret eder (Şekil 7A). Bu kirlenme gözlemlenirse, her primer stoku suya göre test edilmeli ve kirlenmenin kaynağını belirlemek için şablon olarak kullanılmalı ve bu primer(ler) hemen değiştirilmelidir. Saflaştırılmış amplikonlar ekvimoler oranlarda toplanır ve aşağı akış kılavuz niceliği için kısa okunan bir Illumina dizileme platformunda sıralanır.

Kütüphanelerin sıralanması, kütüphane klonlama ve viral üretimin başarısının net bir ölçütü sunar. En iyi üretilen ve kalite kontrollü kütüphaneler, transdüksiyon edilen hücrelerde hiçbir (veya çok az) rehber bulunmadığı için gRNA'lar arasında eşit bir temsil gösterir (Şekil 7B). Büyük kütüphaneler için, az sayıda gRNA'nın kesilmesi, her gen için kalan gRNA'lar iyi temsil edilirse kütüphanenin performansı üzerinde güçlü bir etki yaratmaz.

Şimdiye kadar, bu tarama yaklaşımı ağırlıklı olarak tümörle duyarlı genetik arka planlarda meme epitel hücresi dönüşümünü ve tümör büyümesini tetikleyen tek klonal genetik bozulmaların eğiliminideğerlendirmek için kullanılmıştır 36,55. Bireysel bir klonal tümörün diseksiyonu ve dizilenmesi genellikle tek bir gRNA'nın klonal zenginleşmesini ortaya koyur ve bu da bir ekran vuruşu olarak sınıflandırılabilir (Şekil 7C). Bazı durumlarda, tümörlerde yaklaşık eşit oranlarda iki veya daha fazla gRNA bulunur. Bunlar çift enfeksiyonun sonucu ya da iki klonun birlikte büyüyüp tek bir tümör kütlesi oluşturması olabilir. Bazen aynı tümörün birden fazla alanını örnekleyerek bu iki olasılığı ayırmak mümkündür, ancak bu kadar granülarlık genellikle gerekli değildir. Gerçek izler, ekrandaki birçok tümörde yaygınlıklarına göre birden fazla enfeksiyondan kolayca ayrılırken, rastgele izleyiciler birden fazla tümörde tekrar ortaya çıkmaz. Ekranda hitleri çağırmak için standart yaklaşımımız, belirli bir örneklemdeki en az %80'ine sahip olan herhangi bir gRNA'nın hit olarak adlandırılmasıdır; bu nedenle %80'lik okuma sayısı belirlenir. Tüm dizilenmiş tümörlerde bu vuruşların sayısını nicelikle ölçerek, hangi genlerin en güçlü fenotipik etkiye sahip olduğunu belirleyecektir.

Bu yöntem, tümör oluşumundan önce meme bezlerinde MAGeCK71 gibi araçlarla gRNA bollukları değerlendirilerek de kullanılabilir. Bu ortamda, bu yaklaşım zenginleştirici tarama bağlamında iyi çalışır. Tükenme testi mümkün olsa da, çok daha yüksek kapsama gerektirir ve ortaya çıkan veriler daha az güvenilir olabilir; çünkü gRNA'nın tükenmiş olup olmadığını veya ekran başlangıcında sadece yok mı olduğunu belirlemek istatistiksel olarak zordur. CRISPR-StAR bu konuda değerli bir alternatifteknoloji sunar 9,10 ancak GEMM'lerde in vivo tarama için optimize edilmesi gerekmektedir.

Bu temsilci sonuçlar birlikte, kütüphane klonlamasından viral üretimden intradüktal teslimat ve dizileme tabanlı dekonvolüsyona kadar havuzlanmış in vivo CRISPR tarama iş akışının her ana adımı için kalite kontrol kıyaslamaları sağlar.

figure-results-1
Şekil 1: Fare meme bezi için in vivo tarama boru hattının şematik temsili. Bu protokol, gRNA kütüphanesi oligonukleotid çiplerinin tasarımını, kütüphane PCR ve klonlamayı, lentiviral preparatları, intraduktal meme bezi enjeksiyonlarını ve ardından dekonvolüt darbeler için sonraki analizleri içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: gRNA kütüphanesi amplifikasyonu ve klonlama. (A) gRNA kütüphanesi PCR reaksiyonları, (B) sindirilmiş pXPR502 PPH Cre omurgası ve (C) sindirilmiş pLKO Cre omurgası için temsil agararoz jel görüntüleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Elektroporasyon sonrası gRNA kütüphanesiyle transdüksiyon yapılan bakteriyel havuzun seri seyreltmesinin temsilci görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Lentiviral titerleme. (A–D) Örnek (A ve B) düşük titr ve (C ve D) yüksek titrli viral hazırlıktan viral titrelerin hesaplanması için temsil akış sitometrisi. Her iki durumda da, LSL-tdTomato MEF'leri, Bölüm 2.5'te belirtildiği gibi Cre-ekspresyon virüslerle birlikte transdüksiyon edilmiştir. (E) Derin dizilenmiş plazmid ile transfekte edilmiş hücreler arasında sayım karşılaştırmasının temsil edici sonuçları, bir zayıf temsil edilen bir kütüphane (solda), sayımda büyük farklılıklar ve birçok düşük sayılı gRNA'ya sahip, daha sıkı bir dağılıma sahip iyi temsil edilen bir kütüphaneye kıyasla. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Meme bezinin intraduktal enjeksiyonu. (A) Meme ucu içine yerleştirilen cam iğnenin görünümü. (B) Farenin dışından (solda) veya enjeksiyondan hemen sonra diseksiyona uğrayan meme bezinde (sağda) ağacın içinden geçen boya ile başarılı enjeksiyon. (C) Meme ucu altında boya birikmesiyle belirtilen başarısız meme enjeksiyonu. (D) Anti-GFP ile boyanmış meme bölümleri ve enfekte hücreler gösteriliyor. (E) GFP+ enfekte luminal ve bazal hücreleri gösteren temsil akış sitometri grafikleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Örneklemlerin dizileme tabanlı dekonvolüsyonu. (A) MEF örnekleri ve plazmid örneklerinden temsil eden derin dizileme jelleri ve (B) tümör örnekleri. Bazı CRISPR-A örnekleri için 1 kb bandının spesifik olmayan bir bant olduğunu ve göz ardı edilmesi gerektiğini unutmayın. Numuneye katkıda bulunan yapılar kuyunun üstünde gösterilmiştir (pLKO için KO, pXPR502 için A). Bant yoğunluğundaki değişim normaldir, ancak bandın tamamen yokluğu başarısız bir reaksiyon anlamına gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Tümör derin dizilemesinin kütüphane temsili ve temsil eden sonuçları. (A) Başarılı bir dizilenmiş tümör için sonuçları, birçok okumanın kütüphaneye eşlenemeyeceği kontamine derin dizileme reaksiyonuna kıyasla haritalanma. (B) Plazmid, klonal tümör ve meme bezinden bir bölgeden dizileme gösteren temsil edici sonuçlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kütüphane tasarımı ve primerler.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Derin dizileme primerlerinin listesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Havuzlu in vivo CRISPR taraması için önemli bir husus, yeterli kütüphane kapsamını sağlayıp seyrek, tek hücreli transdüksiyonu koruyarak klonalçözünürlüğü 2'yi korumaktır. Fare meme bezinde, epitel bölmesi konservatif olarak yaklaşık 3,5 ×10,5 hücreden oluşur her bez36. Ortalama %15 lentiviral transdüksiyon oranıyla, hücre başına birden fazla enfeksiyon sıklığını en aza indiren intraduktal doğumda, her bez başına yaklaşık 5 × 10-4 transdüksiyon epitelhücresi oluşur (36,55). Böylece hem üçüncü torasik hem de dördüncü abdominal meme bezinin iki taraflı enjeksiyonu, fare başına ~2 × 105 transdüksiyon epitelhücresi elde eder 36,55. Bu parametrelere dayanarak, 4.000 gRNA içeren bir kütüphane (CRISPR-KO için ~1.000 gen veya CRISPR-A için ~500 gen), yaklaşık 4 × 106 transdükasyon hücresi gerektirir; böylece gRNA başına yaklaşık 1.000 kat temsil elde edilir; bu da yaklaşık 20 farelik bir kohort büyüklüğüne karşılık gelir. Güçlü bir fonksiyon kazanımı fenotipi bekleniyorsa, daha düşük kapsama (örneğin 400× veya 8 fare) yeterli olabilir. Alternatif olarak, örneğin %30-35 gibi daha yüksek bir enfeksiyon oranı da mümkün olabilir, özellikle daha büyük kütüphaneler için. Öte yandan, bazal meme epitel hücrelerine odaklanan deneyler, yeterli kapsama sağlamak için daha yüksek lentiviral titrerler veya daha fazla hayvan sayısı gerektirebilirken, bu lentiviral aracılı yaklaşım, bu hücrelerin aşırı düşük enfektifliği nedeniyle stromal bozulmalara uygun olmayabilir. Bu nicel çerçeve, kütüphane karmaşıklığı, hayvan kullanımı ve klonal çözünürlük arasında denge sağlayarak deneysel tasarım için pratik bir temel sağlar ve tahmini hedef hücre sayıları ile dokuya özgü transdüksiyon verimliliği ayarlanarak diğer tarama bağlamlarına uyarlanabilir.

Bu protokol, ölçeklenebilir havuzlu in vivo CRISPR taramasını mümkün kılsa da, deneyler tasarlanırken birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Birincisi, etkili kütüphane kapsamı doku boyutu ve ulaşılabilir transdüksiyon verimliliği ile sınırlıdır; bu da çoğu in vivo uygulama için genom çapında değil hedefli kütüphanelergerektirir 2. Bezler ve/veya hayvanlar arasındaki intraduktal enjeksiyon etkinliğindeki değişkenlik, verimli kapsamı daha da azaltabilir ve dikkatli enjeksiyon tekniği, tutarlı viral titreleme ve enfeksiyon oranlarını tahmin etmek için pilot deneylerle azaltılmalıdır. Bu potansiyel değişkenlik kaynaklarına rağmen, yakın zamanda 4.000 gRNA'lık kütüphaneye sahip CRISPR ekranlarının, kütüphane dekonvolüsyonu55'ten sonra 20 farede neredeyse doygunluğa ulaştığını gösterdik.

Bu kadar sağlam örtüleri korumak için gereken fare sayısını azaltmak amacıyla, bu protokolde vurgulandığı gibi, ikinci torasik ve beşinci inguinal meme bezlerinin yanı sıra ikinci torakal ve beşinci inguinal meme bezlerinin enjekte edilmesi mümkündür; bu protokolde vurgulandığı gibi. Bu ek bezlerin meme uçları işlem sırasında diseksiyon kapsamı altında kolayca gözlemlenirken, ilk servikal meme bezi genellikle burun konisine bağlı ön uzuvlarla örtülü ve örtülü olur. Her meme bezi hemçiftler içinde hem de çiftler arasında 72 birbirinden farklılık gösterdiğinden, bu ek bezlerdeki meme epitel hücre sayısının etkili kapsama hesaplamak için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Ancak önemli bir husus, tek bir farenin sekiz meme bezi boyunca meme tümörlerinin indüklenmesinin, tüm gRNA içeren klonların açıkça zenginleşmesinden önce toplam kümülatif tümör yükü endpoint noktasına yol açabileceğidir. Alternatif olarak, in vivo CRISPR taraması için gereken kapsamı azaltmak için heyecan verici yeni yaklaşımlar, örneğin CRISPR-StAR (Yeniden Kombinasyonla Stokastik Aktivasyon)9,10 CRISPR-KOALA teknolojimizle birleştirilebilir. CRISPR-StAR, her gRNA için benzersiz bir soy izi ve dahili kontrollü negatif kontrol sunar; bu kontrol ksenograft ortamlarında tarama kapsama gereksinimlerini iki kademe9'dan fazla azalttığı gösterilmiştir. Bu ilkelerin CRISPR-KOALA teknolojimize uygulanıp uygulanmayacağı henüz test edilmemiş, ancak bir ekran başına gereken hayvan sayısını azaltmaya devam etmek için heyecan verici bir fırsat sunuyor.

Havuzlu in vivo CRISPR taramasını mümkün kılmanın yanı sıra, bu protokol mevcut yaklaşımlara göre intraduktal teslimatı da basitleştirir. Meme kanal sistemine doğrudan erişim için önceki yöntemler, bezicerrahi olarak maruz bırakmak veya enjeksiyoniçin Hamilton şırıngalarının kullanılmasına dayanıyordu; bu da invaziv ve teknik olarak daha zahmetli olabilir. Buna karşılık, burada tanımlanan cerrahi olmayan intraduktal enjeksiyon stratejisi ince cam mikrokapiller iğneler kullanır; bu da minimal doku bozulması ile hızlı ve tekrarlanabilir konsantre lentivirüs hacmlerinin verilmesinisağlar 36,55. Bu sade yaklaşım, bağımsız olarak bozuk olan çok sayıda epitel klonunun verimli üretilmesini kolaylaştırır ve özellikle maksimum viral yayılımın önemli olduğu tarama uygulamalarında ortak lentiviral teslimat için uygundur.

Bu boru hattının en büyük güçlü yanlarından biri, çerçevenin hücre hatları ve doku bağlamları arasında son derece uyarlanabilirolmasıdır 55. Hedefli gRNA kütüphanesi tasarımı, seyrek lentiviral transdüksiyon ve dizileme tabanlı dekonvolüsyon ilkeleri, geleneksel in vitro CRISPR ekranlarında kullanılanlarlaeşdeğerdir 2. Ancak burada, aynı ekran içinde çoklanmış CRISPR-KO ve CRISPR-A gerçekleştirmek için ek bir platform sağlıyoruz; bu platform, genom çapında in vitro olarak kullanılabilir; burada daha yüksek hücre sayıları artan kütüphane karmaşıklıklarına ve daha derin kapsama alanlarına izin veriyor. CRISPR-A için ölü kılavuz RNA'larının kullanımı, aynı Cre-induktif veya yapısal Cas9 faresinin CRISPR-A ve CRISPR-KO işlemlerini gerçekleştirmesini sağlar. Ayrıca, bu deneyler aynı meme bezinde yapılabilir veya aynı hücre içinde sgRNA vedgRNA 55 ifade eden yapılar kullanılarak çoklu olarak üretilebilir. CRISPR tarama protokolü kararlı lentiviral entegrasyon ve barkod kurtarma üzerine dayandığı için, CRISPR-Inhibition62, Cas12 73,74 ve ORF tabanlı ekranlar75 gibi alternatif pertürbasyon modaliteleriyle uyumludur ve uyarlanabilir. Taramanın yanı sıra, aynı boru hattı bireysel genleri klonlayarak gRNA, siRNA veya ORF'leri klonlayıp bunları aynı şekilde bireysel bozulmalar olarak sunmakiçin kullanılabilir 36,55,67,76,77,78,79.

Ayrıca, bu teknolojiyi diğer türlere, özellikle fare80'e uyarlamak büyük ilgi çekici olacaktır. Fare meme bezinin daha büyük boyutu, yüksek kapsama ve enfeksiyonverimliliğini 80 korurken önemli ölçüde genişletilmiş kütüphanelerin kullanılmasına olanak tanır. Ayrıca, fare meme biyolojisi insan bezinin bazı özelliklerini fare'den daha yakındanyansıtır 80,81,82,83,84,85; Örneğin, fare meme tümörleri ağırlıklı olarak hormondan bağımsızolsa da, sıçanların meme tümörleri genellikle hormonlarabağımlıdır 81,82,85.

Özetle, bu protokol yetişkin fare meme bezinde toplanan in vivo CRISPR nakatlanma ve aktivasyon taraması için pratik ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Hedefli kütüphane tasarımını yüksek titrli lentiviral üretim, basitleştirilmiş cerrahi olmayan intraduktal doğum ve dizileme tabanlı dekonvolüsyonla entegre ederek, in vivo fonksiyonel genomiklere yönelik teknik engelleri azaltır ve gen fonksiyonunun doğal doku ortamlarında doğrudan sorgulanmasını sağlar. Bu çerçeve, ortak in vivo tarama yaklaşımlarının daha geniş benimsenmesini kolaylaştırmalı ve doku homeostazı ile hastalığın bağlama bağlı genetik düzenleyicilerinin sistematik olarak incelenmesini desteklemelidir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S., ViVerita Therapeutics için danışman ve kurucusudur; laboratuvarı ViVerita Therapeutics ile araştırma ve hizmet anlaşmaları desteklemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmayla ilgili faydalı yorumlar ve tartışmalar için laboratuvarlarımızın tüm üyelerine teşekkür ederiz. Ayrıca, Kanada'nın Toronto kentindeki Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü'nde (LTRI) fare çalışmaları konusundaki tüm yardım ve uzmanlık için The Centre for Phenogenomics ile teşekkür eder ve teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT462506) tarafından alınan proje hibesi ve Terry Fox Araştırma Enstitüsü Program Projeleri D.S.'ye (TFI Projesi #1107) ve Nicol Ailesi Vakfı'na verilen bir hibe ile desteklendi. E.R.L., Kanada Kanser Derneği Araştırma Eğitim Ödülü ve Frank Fletcher Anma Fonu tarafından desteklendi. K.N.A., H.L. Holmes Doktora Sonrası Ödülü ve Kanser Araştırma Derneği'nden 1318698 ve 26089 numaralı hibelerle desteklendi. J.N., Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri Kanada Lisansüstü Bursu – Yüksek Lisans ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri Doktora Araştırma Ödülü (#193389) ile desteklendi. Y.L, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nin Araştırma Mükemmelliği, Çeşitlilik ve Bağımsızlık bursu (#ED6-190718) tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 micron filtreSigmaS2HVU02RE
12k veya 92k oligo çipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm hücre kültür plakalarıCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkalin fosfatazNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart tamponuNEBB6004S
Derin sekanslama (Next-Seq veya Hi-Seq)Illumina
DNAesy Kan ve Doku DNA ekstraksiyon kitiQiagen69506
Dulbecco’s modifiye edilmiş Eagle ortamıWisent319-015-CL
Endura elektrokompetan hücrelerLucigen60242-1
EpiCult-B Fare Ortam KitiStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovin SerumWisent090-150
Jel DNA temizleme kitiZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporasyon KüvetlerBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
Yüksek Hızlı SantrifüjBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Mikropipet çekiciSutter InstrumentP97
Mini-prep plazmid KitiFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (BsmBI için tampon)NEBR0580L
Oligo Temizleme ve KonsantratörZymo ResearchD4061
Oligo temizleme kitiZymo researchD4060
PAGE saflaştırılmış illumina sekanslama primeriIDT DNA
PCR MikropipetlerDrummond5-000-1001-X10
PEI (polietilenimi)Sigma408727-100ML
Penisilin ve StreptinomizinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LizinSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polimeraz 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Florometrik NicelendirmeInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato fareleriJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligazNEBM0202L
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter344058
Vakuum Filtre ÜniteleriFisher ScientificSCHVU02RE

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GenetikSay 233Say 233HepsiSayHepsiSayBo De erSay
Video yakında

İlgili makaleler