Yöntem makalesi

Sosyal etkileşimler sırasında bireysel farelere ultrasonik seslendirmeleri tespit etmek ve atatmak

199 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71121

⸱

7 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, çoklu fare sosyal etkileşimleri sırasında senkronize video ve ses verilerinin kaydedilmesi için bir yöntem tanımlar. Yöntem, bireysel farelere ultrasonik seslendirmeler (USV) atamak için mikrofon dizisi ve ses kaynağı lokalizasyonu kullanır; böylece hayvanlar ve sosyal bağlamlar arasında ses davranışlarının nicel analizini mümkün kılar.

Özet

Fareler (Mus musculus), sosyal etkileşimler sırasında ultrasonik seslendirmeler (USV) kullanarak iletişim kurar. Ancak, fare USV'leri net görsel göstergelerle ilişkili olmadığı ve insan işitsel aralığı dışındaki frekanslarda meydana geldiği için, bir grup içinde bireysel ses veren fareleri tanımlamak zordur. Bu protokol, çok hayvanlı sosyal etkileşimler sırasında senkronize video ve ultrasonik ses verilerinin kaydedilmesi için bir yöntem tanımlar; böylece davranış ve ses aktivitesinin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Çoklu hayvan takibi, ses algılama, ses kaynağı lokalizasyonu ve bireysel hayvanlara ses atanmasını entegre eden bir hesaplamalı boru hattı hazırlanır. İzleme doğruluğu, ses çıkarma, lokalizasyon hassasiyeti ve atama güvenini her aşamada değerlendirmek için kullanılan doğrulama prosedürleri daha ayrıntılı olarak açıklanır. Bu protokolün dört hayvanlık bir gösteri veri setine uygulanması, bireysel çözünürlüklü ses takibi, mekansal olarak hassas ses kaynağı tahminleri ve ses çıkışı ile akustik özelliklerin nicel ölçümlerini sağlar. Bu yaklaşımlar birlikte, sesli iletişimi bireysel davranışlarla bağlamak için sağlam bir çerçeve sağlar ve cinsiyet farklılıkları, bireysel değişkenlik ve serbest etkileşimde bulunan farelerde sosyal iletişimin sonraki analizlerini mümkün kılar.

Giriş

Hayvan aleminde sosyal iletişim, davranışsal dinamiklerin temel bir bileşenidir ve hayatta kalma ile üreme gibi süreçlere yardımcıolur 1,2. Memeliler arasında, fareler 35 ile 110 kHz3 frekanslarını kapsayan USV'ler aracılığıyla akustik olarak iletişim kurar. USV'ler karmaşık özellikler sergiler, davranışsal bağlama bağlı olarak bilgiiletir 4. Dişi fareler, erkek farelerinUSV'lerini tercih eder 5,6 ve erkek ile dişi fareler flört davranışları sırasında sesli etkileşimegirer 7; bu da USV'lerin önemli sosyal sinyaller olarak işlev gördüğünü gösterir. Belirli USV özellikleri fare davranış durumlarıylabağlantılı olduğundan, bireylere doğru ses atama sosyal etkileşimleri anlamak için gereklidir.

USV'lerin işlevlerini ve sosyal davranışla ilişkisini açıklamak için yapılan kapsamlıçabalara rağmen, alanda devam eden bir zorluk, grup etkileşimleri sırasında bireysel farelere USV'ler atanmaktır. Zorluklar, USV üretimi sırasında görünür ağız hareketlerinin olmamasıve USV'lerin insan kulağına duyulamamasınedeniyle ortaya çıkar 3. Sonuç olarak, USV'ler ile sosyal davranış arasındaki ilişkiye dair önceki çalışmalar, gözlemlenebilir grup davranışlarının çeşitliliğini sınırlayan basitleştirilmiş testler veya kısıtlı ortamlarlasınırlı kalmıştır 9 ve serbestçe etkileşimde bulunan hayvanlarda ses davranışının nasıl geliştiğine dair yalnızca kısmi bir içgörü sağlamıştır.

İşitsel iletişim ile sosyal davranış arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için, fare davranışlarının tam bir yelpazesini yakalamak ve grup içindeki bireylere seslendirmeler atanmak gerekir. Vokalizör kimliklerinin çözülmesi, bireyler arasında cinsiyet ve bağlama bağlı ses aralıklarını belirlemekiçin gereklidir 8, belirli vokal özelliklerin kontür davranışı nasıl yönlendirdiğine dair nedensel hipotezleritest etmek için gereklidir 10,11,12 ve uygun olduğunda ses çıkışını aynı anda ölçülen beyin sinyalleriyle (örneğin, elektrofizyoloji) ilişkilendirmek için gereklidir. Tarihsel olarak, erkek farelerin tek ses vericiler olduğuna inanılırdı; ancak ses kaynağı lokalizasyonu, dişi farelerin grupayarlarında 7 veya erkek14 ile eşleştirildiğinde USV'ler ürettiğini ortaya koydu. Hangi hayvanın USV yaydığı belirlenmediğinden, ses özelliklerini bireysel davranış ve sosyal sonuçlarla ilişkilendirmek serbest etkileşimde bulunan gruplarda sınırlıdır. Bu nedenle, bireysel hayvanlara seslendirme atamasını sağlayan ve doğal etkileşim dinamiklerini koruyan bir lokalizasyon sistemi kullanmak şarttır.

Burada açıklanan ve daha önce 7,15 olarak yayımlanan mikrofon-dizisi ses kaynağı lokalizasyon sistemi, bir arenadaki USV'lerin mekansal kökenini tahmin eder ve ses çıkarma anında bulunan tüm hayvanların konumlarını takip eder; böylece seslendirmelerin yayıcıya atamasını sağlar. Ses kaynaklı tahminler ve takip edilen hayvan pozisyonları, USV'lerin bireysel hayvanlara atamasını desteklemek için olasılık temelli bir metrik kullanılarak entegre edilir. Vokalizasyon ataması, daha önce belirsiz olan grup vokal kayıtlarını etiketlenmiş hayvan vokalverilerine dönüştürür 7,15, böylece ses türü ve zamanlamayı davranış ve ardından gelen türdeş eylemle ilişkilendiren nicel analizler mümkün kılar. Bu çalışmanın amacı, daha önce nicelendirilmiş ve doğrulanmış olan bu yöntemin uygulanması için ayrıntılı bir protokolsağlamaktır 15. Aşağıdaki protokol, mikrofon-dizisi geometrisi, ses-video senkronizasyonu, otomatik ses algılama ve olasılıksal kaynak tahmini, çoklu hayvan pozisyon takibi ve USV'lerin yayıcı hayvana atfedilmesi için kullanılan atama prosedürünü içeren bu sistemin kurulumu, kalibrasyonu ve uygulanmasınıözetlemektedir 7,15.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm protokoller, Delaware Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası: 1275) tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Ses kaynağı yerelleştirme donanımının oluşturulması

  1. Kayıt odasını hazırla.
    1. Kayıt alanı olarak hizmet eden bir kübek çerçeve (76,2 cm × 76.2 cm × 61 cm; genişlik × uzunluk × yükseklik) birleştirin ve sesi azaltan bir kapsayağa yerleştirin.
    2. Duvarları oluşturmak için naylon ağ kullanın ve ses yansımalarını azaltmak için kabin dışını akustik köpükle astarlayın.
    3. Kayıt sırasında ortam sıcaklığını izlemek için kayıt odasının dışında, ancak yakınında bir termometre yerleştirin.
    4. Tüm kayıtları karanlık koşullarda gerçekleştirin.
      NOT: Kayıt oturumları boyunca istikrarlı çevresel koşulları koruyun ve çevresel parametreleri kaydedin.
  2. Video ve ses kayıt sistemlerini yapılandırın.
    1. Arenanın üzerine kızılötesi aydınlatma kurarak karanlıkta video kaydını mümkün kılın.
    2. Bir video kamerayı arenanın üzerine yerleştirin ve 30 Hz'de sürekli kayıt yapacak şekilde ayarlayın.
    3. Ses alım sistemini, sekiz kanallı mikrofon dizisinden ultrasonik sinyalleri 250 kHz örnekleme hızında kaydedecek şekilde yapılandırın.
      NOT: Bu sistemde sekiz mikrofon kullanıldı, ancak mikrofon sayısı deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir.
    4. Video ve ses kayıtlarını, zamansal hizalanmayı sağlamak için paylaşılan harici tetikleyici kullanarak senkronize edin.
    5. Video ve ses verilerinin eşzamanlı kaydedilip her oturum için saklandığını doğrulayın.
      NOT: Donanım ve edinim yazılımları sırasıyla Materyaller Tablosu ve Tablo 1'de listelenmiştir.
  3. Mikrofonları ve arenayı düzenleyin.
    1. Mikrofonları arenanın duvarları boyunca eşit aralıklarla yerleştirin (her duvarda iki tane).
    2. Mikrofon merkezlerini 38,1 cm aralıkta, her köşeden 19,05 cm ve arena zemininden 10,8 cm yükseklikte konumlandırın.
    3. Mikrofon konumlarını görsel olarak işaretleyin, böylece daha sonra kalibrasyon ve doğrulama yapılmasını kolaylaştırın.
      NOT: LED'ler mikrofon pozisyonlarını işaretlemek için kullanılabilir.

2. Sosyal davranışların kaydedilmesi için hazırlıklar

  1. Deneysel hayvanları kur.
    1. Kaydedilecek fareleri seçin. Burada, kayıt sırasında 8 ila 12 haftalık arasında 2 erkek ve 2 dişi C57BL/6J faresinden oluşan gruplar kullanıldı.
      NOT: Mevcut deneysel paradigmada farelerin sürün, cinsiyet oranı, yaş aralığı ve kayıt günü sayısı farklı deneysel hedeflere göre ayarlanabilir. Bu yöntemin gösterimi için, deneysel farelerin bir alt kümesi iki kayıt günü boyunca yeniden kullanıldı. 12 haftadan büyük C57BL/6J farelerinde yüksek frekanslı seslere karşı hassasiyet azalabilir16.
  2. Hayvanları barındırın.
    1. Kayddan önce her fareyi 14 gün boyunca ayrı ayrı muhafaza edin.
      NOT: Bireysel konut, önceki sosyal deneyimin grup etkileşimleri üzerindeki etkisini en aza indirir.
    2. Her kafese yatak malzemesi, zenginleştirme ve yiyecek ile suya ima kadar erişim sağlanır.
  3. Görsel tanımlama için hayvanları işaretleyin.
    1. Kayıttan iki gün önce, her fareyi %2,5 isofluran ile oksijende 1 L/dakika akış hızında anestezi edin, hassas bir buharlaştırıcı ile kapalı bir odada alın. Her fare anestezi edildikten sonra, onu odadan çıkarır, sırtı erişilebilir şekilde düz yatar, işaretleme işlemi süresince burun konisinden anestezi alır.
      NOT: Mevcut deneysel paradigmada tanımlanan anestezi protokolü hayvan protokolümüzde onaylanmış ve her fareye seri olarak uygulanmıştır, ancak farklı hayvanlar veya deneysel hedefler için ayarlanabilir.
    2. Her fare anestezi altındayken, takip sırasında görsel tanımlamayı sağlamak için zehirsiz saç boyası kullanarak sırtına benzersiz bir desen uygulayın.
    3. Her hayvanı boyanın sertleşmesi sırasında sürekli izleyin, anestezi yaklaşık 15 dakika sürdürülür ve anestezi süresini kaydedebilirsiniz.
    4. Her fareyi durulayın ve tamamen ambulatör olana kadar ısıtılmış bir toparlanma kafesine yerleştirin.
    5. Her fareyi yatak, zenginleştirme ve yiyecek ile suya erişimle birlikte temiz bir kafese geri gönderin.
      NOT: Erkek koku ipuçlarının sonraki davranışları etkileyebileceği transferini en aza indirmek için dişi farelere işaretler uygulanır.
  4. Karşı cinse maruz kalın.
    1. Kayıttan bir gün önce, yataksız temiz kafesler hazırlayın.
    2. Her deneysel fare için, hayvanı bir kafese yerleştirin, ardından karşı cinsten yeni bir fare alın.
    3. Hayvanların 10 dakika boyunca etkileşime girmesine izin verin.
    4. Etkileşimleri gözlemleyin ve davranış olaylarını manuel olarak kaydedin.
    5. Maruziyetin ardından, deneysel hayvanları maruziyetten sonra bireysel konuta geri gönderin.
      NOT: Karşı cinse maruz kalma, mevcut deneysel paradigmaya özgüdür, çünkü sonraki grup kayıtlarında ses davranışının olasılığını artırır17; ancak tanımlanan yöntemlerin zorunlu bir bileşeni değildir. Çiftleşme davranışı gözlemleniyorsa hayvanları ayırın.
  5. Dişi farelerin estrous durumlarını belirleyin.
    1. Kayıttan yaklaşık 2 saat önce, her dişi farenin estrous durumunu değerlendirin (dişi denekler kullanılıyorsa).
    2. 30 μL fosfatla tamponlanmış salin kullanarak vajinal yıkama yapın.
    3. Lavaj örneğini temiz bir mikroskop slaytına aktarın ve eşit şekilde yayın.
    4. Slaytların tamamen kurumasına izin verin.
    5. Her slayta kristal mor leke uygulayın ve pipet kullanarak nazikçe suyla durulayın.
    6. Slaytları ışık mikroskobu altında inceleyin.
    7. Nükleeli epitel hücrelerin, kornifikasyonlu epitel hücrelerinin ve lökositlerin göreceli oranlarına göre estros durumusınıflandırın 18.
    8. Her dişi için estrous durumunu kaydedin.
      NOT: USV'ler dişialıcılığını 19,20 döneminde etkileyebildiğinden, estros durumu belirlemek mevcut deneysel paradigmaya özgüdür.; ancak tanımlanan yöntemlerin zorunlu bir bileşeni değildir.

3. Sosyal etkileşim kayıtları

  1. Kayıt alanını hazırlayın.
    1. Arena zeminine yaklaşık 1,25 cm eşit derinlikte beyaz kağıt bazlı yatak örtüleri ekleyin.
    2. Yatak takımının tüm köşeleri eşit şekilde kaplamasından emin olun.
    3. Tüm mikrofonların hizalandığını, engelsiz ve arenaya doğru yönlendirildiğini doğrulayın.
    4. Deneysel kayıtlardan önce, arenanın merkezine bir cetvel ve yüksek kontrastlı bir nesne yerleştirerek kamera odakını doğrulayın ve mekânsal ölçeklendirme oluşturuldu.
    5. Davranışsal kayıtlar başlamadan önce kalibrasyon nesnelerini kaldırın.
      NOT: Beyaz kağıt tabanlı yatak örtüsü, daha koyu tüylü hayvanlar için kontrast sağlar ve takip etmeyi kolaylaştırır. Açık tüylü hayvanlar kullanılıyorsa, siyah kağıt bazlı yatak örtüsü takip etmeye yardımcı olur. Kayıt süreleri uzatılırsa, arenaya yiyecek ve su ekleyin. Cetkele Kuzey/Güney ve Doğu/Batı yön işaretlerinin eklenmesi, sekiz mikrofonun tanımlanmasını kolaylaştırır.
  2. Ön davranış sistemi kayıtları yapın.
    1. Davranışsal kayıtlardan hemen önce, kızılötesi ışıklar açık iken 15 saniyelik arka plan gürültüsü kaydedin.
    2. Kızılötesi ışıklar kapalı ve mikrofon göstergesi ışıkları açık iken 15 saniyelik mikrofon lokalizasyon testini kaydedin.
    3. Tüm davranış öncesi kayıtları sistem performansının daha sonra doğrulanması için kaydet.
      NOT: Bu kayıtlar mikrofonun işlevini ve temel gürültü seviyelerini doğrulamak için kullanılır. Kayıt için kullanılan betikler, ilgili kod deposunda mevcuttur.
  3. Grup sosyal davranışlarını kaydet.
    1. Veri toplamadan önce hayvan etkileşimini en aza indirmek için tüm kayıt ayarlarını önceden hazırlayın.
    2. Dişi fareleri arenaya yerleştirin.
    3. Erkek fareleri arenaya yerleştirin.
      NOT: Aynı cinsiyetten birden fazla hayvanı kaydediyorsanız, her iki hayvanı aynı anda yerleştirin.
    4. Kafesi kapatın ve kayda başlayın.
    5. Grup sosyal davranışlarını 10 dakika boyunca kesintisiz kaydet.
      NOT: Kayıt süresi ayarlanabilir.
    6. Ön işlemeden önce video ve ses dosyalarının okunabilir ve bozulmadan uzak olduğundan emin olun.
    7. Kaydın sonunda, bir hayvan hariç tüm hayvanları çıkarın.
  4. Bireysel hayvanları kaydedin.
    1. Kalan fareyi arenada yalnız 10 dakika kaydedin.
    2. Kalan fare için ayrı kayıtları tekrarlayın.
    3. Her fareyi bireysel kayıtlardan hemen sonra tartın.
      NOT: Bireysel kayıtlar, çoklu hayvan takibi eğitimi ve doğrulaması için kullanılır. Her kayıt oturumundan önce sistemin içindeki sıcaklığı belgeleyin, çünkü sıcaklık ses yayılımını etkiler. Video veya ses dosyaları bozulmuş veya eksikse kayıt oturumunu tekrarlayın.

4. Video ön işleme

  1. Video dosyalarını hazırlayın.
    1. Tüm video kayıtlarının deneyle ilişkili tek bir dizinde saklandığını doğrulayın.
  2. Takip için video yoğunluğunu ayarlayın.
    1. Gerekirse, her piksele sabit bir değer (brightness_adjustment x 255) ekleyerek tüm video karelerine eşit parlaklık ayarı uygulayın; burada brightness_adjustment ışık koşullarına bağlı olarak genellikle 0.1 ile 0.6 arasında değişen bir skalardır.
    2. Gerekirse, yoğunluk yeniden eşlemesi (örneğin, MATLAB'ın ayarlama fonksiyonu) ile küresel kontrast ayarı uygulayın; bu da piksel yoğunluklarını maksimumun %20'sinde siyah ile %80 ve maksimumun %80'i beyaza eşler ve doğrusal olarak ara değerleri ölçekler. Bu adım, açık renkli tanımlama işaretleri ile arka plan arasındaki mesafeyi artırmak için yapılır.
    3. Piksel yoğunluklarını video bit derinliği için geçerli aralıkta (yani 8-bit video için 0'dan 255'e kadar) krampin.
      NOT: Tutarlılığı sağlamak için kayıt içindeki ve kayıtlar boyunca tüm karelere aynı ön işleme parametreleri uygulanmalıdır. Bu ayarlamalar isteğe bağlıdır ve kayıt koşullarına bağlıdır. Burada sunulan temsil veriler için parlaklık veya kontrast ayarlaması yapılmadı. Ayar gerektiğinde, kullanıcılar tüm videoyu işlemeden önce hayvanlar ile arena arasındaki yeterli kontrastı doğrulamak için işlenen ilk kareyi önizlemelidir.
  3. Önceden işlenmiş videoları dışa aktarın.
    1. Önceden işlenmiş video dosyalarını, orijinal kayıtlarla aynı kare hızı ve zaman hizalamasında kaydedin.
    2. Referans ve doğrulama için orijinal video dosyalarını sakla.
      NOT: Video ön işleme için kullanılan betikler ve uygulanan özel parametre değerleri, ilgili kod deposunda mevcuttur.

5. Çok hayvanlı takip

  1. Takip yazılımını ve verileri hazırlayın.
    1. Çok hayvanlı bir takip yazılımı ve gerekli tüm bağımlılıkları kurun. Bu çalışmada MOuse TRacker (MoTR; Tablo 1) çünkü çıkış formatı, ses kaynağı yerelleştirme hesaplamaları için kullanılan başka bir yazılım olan Muse (Tablo 1) ile uyumludur.
      NOT: Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 veya DeepLabCut23 gibi diğer otomatik takip yazılımları, hayvanın konumu, yön yönü ve burnunun konumu oluşturulduğu sürece hayvanları takip etmek için kullanılabilir.
    2. Önceden işlenmiş video dosyalarını tek hayvan ve çok hayvanlı kayıtların net şekilde ayrılması için düzenleyin.
    3. Tüm video dosyalarının tutarlı kare hızları ve mekansal çözünürlüklere sahip olduğundan emin olun.
      NOT: Yazılım kurulum talimatları ve bağımlılık gereksinimleri ilgili kod deposunda sağlanmıştır.
  2. Tek hayvan modellerini eğitin.
    1. Her deneysel denek için tek hayvan kayıtlarını seçin.
    2. Her hayvan için ayrı bir kimlik sınıflandırıcı eğitin, o hayvanın tek hayvan kaydından alınan özellikler kullanılarak. Grup kayıtları sırasında, bu hayvan başına sınıflandırıcı çıktıları, hayvan kimliğini korumak için çerçeveler boyunca yörünge bilgileriyle birleştirilir.
    3. Eğitimin başarıyla tamamlandığından emin olun ve devam edin.
      NOT: Tek hayvan kayıtları, çoklu hayvan oturumlarında kimliğe özgü takip başlatmak için kullanılır.
  3. Çok hayvanlı kayıtları takip edin.
    1. Eğitilmiş takip modelini çok hayvanlı sosyal etkileşim kayıtlarına uygulayın.
    2. Her denek için hayvan konumu, yönelimi ve vücut şekli hakkında kare kare tahminler oluşturun.
    3. İzleme çıktılarını aşağı akış analizleri için saklayın.

6. Akustik segmentasyon

  1. Ses verisini hazırlayın.
    1. Bireysel mikrofon kanallarından alınan tüm ses kayıtlarının mevcut ve erişilebilir olduğundan emin olun.
  2. Sesleri algılayın.
    1. Her kayıtta USV'leri tespit etmek için akustik segmentasyon yazılımı Ax'i (Tablo 1) çalıştırın.
    2. Ax tarafından değerlendirilen bir giriş dosyasında tanımlanan zaman-frekans parametrelerini yapılandırın. Mikrofon örnekleme frekansı 250 kHz'e ayarlandı.
      NOT: Uniform olmayan Hızlı Fourier Dönüşümü için 64, 128 ve 256 örnek dahil olmak üzere üç pencere boyutu değerlendirildi. 3 ile 5 konik çoklu konik zaman-bant bant bant etimi uygulandı ve 0.05 anlamlılık eşiği uygulandı. Minimum 0 örnek süresi kullanılmış, düşük frekans kesmesi 30 kHz ve yüksek frekans kesim 110 kHz olmuştur. Konvolüsyon boyutu 1001 Hz x 0.001 saniye olarak ayarlandı. Harmonik olarak ilişkili sinyalleri birleştirmek için bir bayrak eklendi. Özel detaylar için bkz. Neunuebel ve ark.7.
    3. Bu zaman-frekans özelliklerine dayanarak aday USV'leri çıkarın.
    4. Her kayıt için segmentasyon çıktılarını bir tablo olarak kaydedin.
      NOT: Yazılım kurulum talimatları, betikler ve parametre ayarları ilgili koddeposu 7'de sağlanmıştır.
  3. Segmentasyon çıktılarını derleyin.
    1. Algılanan seslendirme olaylarının birleştirilmiş listesini başlatma zamanları, kayma süreleri ve frekans sınırları içeren bir listeyi oluşturun.
    2. Downstream lokalizasyon analizleri için konsolide vokalizasyon dosyalarını kaydet.

7. Ses kaynağı yerelleştirmesi

  1. Yerelleştirme için girdileri hazırlayın.
    1. Her kayıt için akustik segmentasyon çıktılarının ve çoklu hayvan takip sonuçlarının mevcut olduğunu doğrulayın.
    2. Yerelleştirme girişlerini, ses verileri, takip verileri ve arena geometrisi bilgilerinin yerelleştirme yazılımına erişilebileceği şekilde organize edin.
      NOT: Giriş dosyalarını düzenlemek, gerekli dizin yapılarını tanımlamak ve arena geometri bilgisini toplamak için kullanılan betikler, ilgili kod deposunda sağlanır.
  2. Ses kaynağı konumlarını tahmin edin.
    1. Algılanan her ses kaynağı yerelleştirme algoritması MUSE (Tablo 1) her tespit edilen seslenmeyeuygulanır 7.
    2. Mikrofon dizisi kayıtları kullanılarak, arenadaki her vokalizasyonun mekansal kökenini tahmin edin.
    3. Her ses için, ses kaynağı konumunu jackknife yeniden örnekleme ile tahmin edin; lokalizasyon prosedürünü sekiz kez tekrarlayın, her seferinde bir mikrofon çıkarılarak kalan yedi mikrofona dayanılır. Bu, her ses başına sekiz tahmin oluşturur.
      NOT: Mikrofonlar arasında varış süresindeki farklılıklar, ses kaynağı konumunu tahmin etmek için kritiktir. Jackknife yeniden örnekleme, yerelleştirme güvenilirliğini değerlendirmek ve bireysel mikrofon kanallarına duyarlılığı azaltmak için kullanılır. Ses kaynağı konumunu tahmin etmek için kullanılan betikler, ilgili koddeposunda sağlanır 7.
  3. Ses kaynağı konum olasılık dağılımlarını hesaplayın.
    1. Her seslendirme için, bir kovaryansmatrisi 24 hesaplayın ve bu ile ortalama jackknife puan tahminlerini kullanarak arena zemini boyunca olasılık yoğunluğunu hesaplayın.
  4. Yerelleştirmeyi hayvan pozisyonlarıyla entegre edin.
    1. Her ses anında tüm hayvanların baş veya burun pozisyonlarını takip edin.
    2. Her seslendirme için, her hayvanın burnunun bulunduğu yerdeki lokalizasyon olasılık yoğunluğunu değerlendirin.
    3. Her seslendirme için, olasılık değerlerine dayanarak her hayvan için bir atama güven ölçütü hesaplayın. Atama güveni metri, her hayvan için, o hayvanın burnundaki yoğunluk değerinin tüm hayvanların yoğunluk değerlerinin toplamına bölünmesiyle hesaplanır. Bu metrike fare olasılık indeksi (MPI)15 diyoruz.
  5. Seslendirmeleri ata.
    1. Tek bir fare için atama güven metriği 0.95'i aşarsa, sinyal ofareye 7,15 atanır.
    2. Atama kriterlerini karşılamayan seslendirmeleri atamamış olarak etiketleyin.
    3. Yerelleştirme ve atama çıktılarını sonraki doğrulama ve analiz için kaydedin.
      NOT: Atama eşikleri, güven kriterleri ve kod ilgili analiz betiklerinde sağlanmıştır.

8. Sonuçların doğrulanması

  1. Çok hayvanlı takip işlemlerini doğrulayın.
    1. Her kayıt için kesinleştirilmiş takip çıkışlarını yükleyin.
    2. İzlenen hayvan pozisyonlarını ve vücut şeklini ilgili video karelerine bindirin.
    3. Doğru fare konumunu ve kareler arasında tutarlı kimlik atamasını doğrulamak için takip sonuçlarını görsel olarak inceleyin.
      NOT: İzleme sonuçları, her video karesinde her farenin üzerinde üst üste bindirilmiş kafa yönünü gösteren renk kodlu elipsleri içerir. Her karede ellips boyutu ve vücut yönelimi, sırasıyla fare boyutu ve yönü ile eşleşmelidir. Elips rengi, kayıt boyunca her fare için tutarlı olmalıdır.
    4. Takip hatalarını tespit edin ve düzeltin.
      Düzeltilmiş takip çıktılarını sonraki analizler için kaydet.
      NOT: Yaygın takip hataları yakın sosyal etkileşimlerde veya arena sınırlarına yakın zamanlarda meydana gelir. Tüm baş-kuyruk dönüşleri, kimlik değişimleri ve ellips zıplamaları ile kaymaları düzeltin.
      NOT: Takip çıktısını görüntüleme ve hataları düzeltme programları kod deposunda sağlanmıştır.
  2. Ses çıkarımı doğrulayın.
    1. Her kayıt için akustik segmentasyon çıkışlarını yükleyin.
    2. Temsil zaman aralıkları için ham ses verisinden spektrogramlar oluşturun.
    3. Overlay, bireysel seslendirme süresi ve frekans aralıkları dahil olmak üzere seslendirme olaylarını spektrogramlara tespit etti.
    4. Spektrogramlarda gözlemlenen tespit edilen olaylar ile seslendirmeler arasındaki uyumu görsel olarak doğrulayın.
    5. Sistematik hatalar gözlemlenirse, çıkarma ve lokalizasyon adımlarını tekrar çalıştırmadan önce segmentasyon parametrelerini ayarlayın veya segmentasyon hatalarını manuel olarak ayarlayın (örneğin, ses süresi veya frekans aralığının yanlış tanımlanması).
  3. Vokalizasyon görevini doğrulama.
    1. Ses kaynağı lokalizasyonu ve atama çıkışlarını yükleyin.
    2. Her seslendirme için, video karelerinde yerelleştirme tahminlerini, mekânsal olasılık dağılımlarını ve hayvan pozisyonlarını görselleştirin.
    3. Lokalizasyon olasılık yoğunluklarının atanan hayvanın başı yakınında merkezlenmiş ve diğer hayvanlardan açıkça ayrıldığını doğrulayın.
    4. Atama kriterlerine girmeyen seslendirmelerin atamamış olarak etiketlendiğini doğrulayın.
      NOT: Atama çıktısı için kontroller, tüm beklenen çıktıların üretildiğini ve her seslendirme için olasılık haritasının arena sınırları içinde ve seslendirmeye atanan farenin çevresinde yer aldığını doğrulamayı içerir.
    5. Doğrulanmış atama sonuçlarını aşağı akış analizleri için kaydedin.
      NOT: Atama güven eşikleri ve doğrulama kriterleri ilgili analiz betiklerinde tanımlanmıştır.

9. Veri analizleri

  1. Ses kaynağı yerelleştirmesini görselleştirin.
    1. Tek veya çok hayvanlı kayıt oturumlarında, ses kayıtlarının tespit edildiği video karelerini seçin.
    2. Seçilen video karelerinin şematize temsillerini oluşturun.
    3. MUSE çıktısından bir mekânsal şema oluşturun; tüm mikrofonların konumlarını, bireysel ses kaynağı nokta tahminlerini, tahmini ses kaynağı konumunu, mekansal olasılık dağılımını, fare konumlarını, çıkarılan ses çıkarıcı kimliğini ve bir ölçek çubuğunu çizerek oluşturulur.
    4. Her mikrofon kanalı tarafından kaydedilen ilgili ses spektrogramlarını oluşturun.
      NOT: Bu görselleştirmeler, hem bireysel hem de grup bağlamlarında yerelleştirme performansını niteliksel olarak değerlendirmek için faydalıdır.
  2. Yerelleştirme hatasını ve hassasiyetini nicelikle ölçerin.
    1. Tahmini ses kaynağı konumu ile kaydedilen hayvanın konumu arasındaki mesafeyi hesaplayarak lokalizasyon hatasını nicelikle ölçebilirsiniz. Bu hesaplamalar için tek fare kayıtları kullanın, çünkü sadece tek bir yayıcı vardır ve kaynak bilinir.
    2. Atama hassasiyetini değerlendirmek için, ses kaynağı tahminlerini ve ilgili hayvan pozisyonlarını ses veren hayvan merkezli bir referans çerçevesine dönüştürün.
    3. Ses kaynağı tahminlerinin merkezlenmiş hayvan pozisyonuna göre mekânsal dağılımını görselleştirin.
  3. Seslendirmeleri görselleştirmek için spektrogramlar oluşturun.
    1. Vokalizör kimliği, vokalizasyon başlangıç ve kayma zamanları ile yüksek ve düşük frekans sınırlarını içeren vokal çıkarma çıktıları kullanılarak ilgi çekici vokalizasyon patlamalarını belirleyin.
    2. Her dövüşte ilk vokalizasyonun başlamasından öncesinden son vokalizasyonun kayışından sonrasına kadar olan zaman aralıklarını seçin.
    3. Seçilen zaman aralıkları için ses kanalı dosyalarından voltaj izlerini çıkarın.
    4. Zaman alanından frekans alanına çıkarılan gerilim izlerini dönüştürerek spektrogramlar oluşturun.
    5. Spektrogramda farklı renklerle atanan ve atanmamış seslendirmelere karşılık gelen zaman noktalarını işaretleyin.
    6. Sosyal etkileşim seansları için, farklı bireylerin ürettiği ses ataklarını tespit edin ve kimliğe özgü renklerle belirtilen vokalizör kimlikleriyle spektrogramlar oluşturun.
  4. Vokal çıktısını bireylere göre niceliklendirin.
    1. Ses kaynağı yerelleştirme kodunun çıktısını kullanarak her seslendirmeye bir kimlik etiketi atanır; böylece lokalize edilmemiş, yerelleştirilmiş ama atamamış ve bireysel hayvan kimlikleri sayısal olarak kodlanır.
    2. Her hayvanın çıkardığı ses sayısını topla.
    3. Bireyler arasında ve cinsiyetler arasında ses sayılarını karşılaştırın.
  5. Vokal özellikleri analiz edin.
    1. Her vokalizasyon için frekans konturlarını çıkarın.
    2. Maksimum frekans, minimum frekans, ortalama frekans, bant genişliği ve vokalizasyon süresi gibi vokal parametreleri nicelikle ölçülür.
    3. Cinsiyetler arasındaki ses parametrelerini karşılaştırın.
    4. Verilerin dağılım özelliklerine dayalı uygun istatistiksel analizler yapın.
      NOT: Ölçülen değişkenlerin parametrik özelliklerine uyacak istatistiksel yöntemler seçin. Burada, konu sayısı istatistiksel karşılaştırmalar için çok azdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu makalede sunulan sonuçlar, 2 gün boyunca yapılan kayıtlardan alınmakta olup, protokolün çıktısını göstermek amacıyla hazırlanmıştır; protokol ilk olarak Warren ve ark.15'te yayımlanmıştır. Bu veriler, istatistiksel çıkarım veya genelleştirilmiş sonuçları desteklemek amacıyla tasarlanmamıştır.

USV'lerin çıkarılması ve atanması
USV'ler, mikrofon-dizisi yerelleştirme sistemi kullanılarak hem bireysel hem de grup sosy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

USV'lerin grup etkileşimleri sırasında bireysel hayvanlara güvenilir şekilde atfedilmesi, fare ses iletişimi çalışmalarında önemli bir teknik sınırlama olmuştur. Fareler sosyal iletişimi incelemek için yaygın olarak kullanılsa da, belirli bireylere ses atamaması doğal sosyal ortamlarda ses davranışının nicel analizini sınırlamıştır. Sosyal etkileşimler sırasında hayvana özgü ses takibi mümkün kılan bir yöntem, serbestçe etkileşimde bulunan farelerde ses üretimini incelemek için gereklidi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Delaware Üniversitesi Yaşam ve Bilim Araştırma Tesisi hayvan bakımı personeline, laboratuvar ekipmanlarının inşasında yardımları için Jim Farmer ve Jamie Quesenberry'ye, ayrıca bilgisayar kümesinin sürdürülmesinde destek verdikleri için Delaware Üniversitesi Yüksek Performanslı Hesaplama Grubu'na teşekkür ediyoruz. Veri toplama konusunda yardımı için Andre Yichong Ma'ya teşekkür ediyoruz. Çalışmalar NIH tarafından finanse edildi, hibe numaraları R01MH122752 ve T32GM142603.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alpha-Dri YatakShepherd Specialty PapersALPHA-driSes kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Alüminyum Ekstrüzyon8020Kayıt alanına uyacak şekilde özel yapılmışSes kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
BNC-2110National Instruments777643-01Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Şeffaf Akrilik PanelHome DepotMC-24Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
BilgisayarHewlett–PackardZ620Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-CSes kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
IR ışıklarıGANZIR-LT30Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
NI PXIe-1073National Instruments781161-01Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
NI PXIe-6356National Instruments781053-01Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Kafes duvarları için naylon fileMcMaster-Carr9318T25Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Güç KablosuNational Instruments763000-01Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli
Sonex köpükPinta AcousticVLW-35Ses kaynağı lokalizasyon sistemi için gerekli

Kaynaklar

  1. Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
  2. Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
  3. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
  4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  5. Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
  6. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  7. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
  8. Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
  9. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
  10. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  11. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  12. Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
  13. Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
  14. Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
  15. Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
  16. Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
  17. Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
  18. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  19. Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
  20. McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
  21. Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
  22. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  23. Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  24. Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
  25. Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
  26. Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DavranSay 233Say 233JoVE de Bu AySaysosyal davranses kayna lokalizasyonumikrofon dizisivokalizasyon atamascinsiyet farkl l klarakustik parametreleroklu hayvan takibi
Video yakında

İlgili makaleler