İnsan ve kemirgenlerden izole edilmiş pankreas adacıqlarının otomatik görüntü tabanlı nicelik ölçüsü için bir web platformu

Özet

Bu protokol, derin öğrenme destekli görüntü analizi ve görsel kalite kontrolü kullanarak izole insan ve kemirgen pankreas adacıklarının standart örnekleme, boyama, görüntü alımı ve otomatik web tabanlı nicelendirilmesini açıklar.

Özet

Bu yayının amacı, örnekleme ve görüntü alımından görsel doğrulamaya, görsel doğrulamaya ve otomatik rapor oluşturmaya kadar izole pankreas adacıklarının otomatik nicelenmesi için web tabanlı bir platform olan IsletNet'in standart kullanımı için yazılı ve canlı eylemli adım adım bir protokol sağlamaktır. Platform, klinik ve deneysel adacığı izolasyon iş akışlarını desteklemek amacıyla izole pankreas adacıqlarının iki boyutlu mikroskobik görüntülerinin standartlaştırılmış ve otomatik değerlendirilmesi için geliştirilmiştir. Derin öğrenme tabanlı görüntü segmentasyonu, görüntü analizi için konturların çıkarıldığı adacıkları ve ekzokrin dokuları tanımlamak için kullanılır. Hesaplamalı algoritmalar daha sonra adacığığı sayımı, hacmini ve saflığını nicelikle ölçülür. Görsel Kalite Kontrol aracı, kullanıcıların geçersiz görüntüleri kabul etmesi, manuel düzeltmesi veya hariç tutmasını sağlayarak otomatik görüntü analizlerinin uzman doğrulanmasını destekler. Klinik Adacık İzolasyonu modülü, saflık fraksiyonu toplu analizini destekler ve kayıt tutmak ve analiz için indirilebilir görüntü ve tablo veri dosyalarıyla birlikte otomatik PDF raporları oluşturur. Basit Karşılaştırma modülü, otomatik tahminleri, yerel olarak elde edilen referans sonuçlarla karşılaştırarak yerel olarak standartlaştırılmış görüntülerin otomatik analiz için uygunluğunu değerlendirir. Protokol ayrıca gerektiğinde yerel olarak oluşturulmuş standartlaştırılmış görüntülerin yeniden eğitim önerilerini de belirtir. Kemirgen ve insan adacığı izolasyonlarından elde edilen temsil eden veriler, zorlu örnekler dahil, uygun eğitimden sonra otomatik analiz performansının arttığını göstermektedir.

Giriş

İzole pankreas adacığının diyabetik alıcılara nakledilmesi, dış insülin uygulamasına olan ihtiyacı azaltır veya ortadan^{kaldırır 1}. Kadavra veya yaşayan bağışçılardan adacığın izolasyonu süreci, verim ve kalitedeki farklılıklarla yansıyan biyolojik ve prosedürel heterojenliğe bağlıdır. Toplam adacığı hacmi, doz belirleme ve nakil uygunluğuna dair klinik karar alma için birincil^{girdiyi temsil eder 2}. Adacık boyutu histogramı ve adacık indeks numarası, boyuta bağlı etkililikteki farklılıkları^{açıklar 3}. Bu nedenle, toplam hacmin yanı sıra bireysel adacıklara da dikkat edilir; bu hacm, şu anda beta hücre içeriği için bir vekil işaretçi olarak hizmet vermektedir. İzole insan adacıqları, kemirgen adalarından daha az yoğundur ve genellikle dış dokudan iyi ayrılmazlar. Bu nedenle, lekelenmedikçe ayırt etmek daha zordur. Ditizon kullanılarak hızlı ve basit bir çinko boyama yöntemi benimsenmiştir; bu yöntemde çinko ile zenginleştirilmiş insülin granüllerinden yoğun kırmızı ışığı^{yansıtılır 4}. Dokunun opaklığı göz önüne alındığında, sadece yüzeyden yansıyan ışık toplanır ve bu da ışık kaynağı ve kamera ile donatılmış basit stereo- veya ters mikroskopik aletlerin kullanılmasına olanak tanır.

Laboratuvarlar arası varyasyonu azaltmak için dijital görüntü analiz araçları 5,6,7,8,9,10,11,12 kullanılmıştır; ancak bu yaklaşımların birkaç sınırlaması vardır. Bu yöntemlerde, adacıkların ve ekzokrin dokunun segmentasyonu ya manuel eşiklendirmeye dayanır ki bu da öznel^{hataya yatkındır} 5,6,7,8,9,10, ya da tam otomatik segmentasyon ^{yaklaşımları 11,12} kullanır. Ayrıca, yerel yazılım kurulumu genellikle 5,6,7,8,9,10,11 olarak gereklidir ve belirli donanım ^10,11 ile sınırlı olabilir, bu da genel erişilebilirlik ve standartlaştırmayı sınırlar.

Bu yayının genel amacı, insan uzmanı gözetimiyle web tabanlı derin öğrenme platformu kullanarak izole pankreas adacığının otomatik nicelendirilmesi için standart bir iş akışı sağlamaktır. IsletNet, ada cadı görüntü analizinin hem erişilebilirliği hem de güvenilirliğiyle ilgili sınırlamaları ele alır. Bu makalede, adacığığı greftlerinin örneklenmesi, uygun mikroskobik görüntülerin oluşturulması ve IsletNet araçlarının doğru kullanımı için önerilen yönergeler sunuyoruz. Protokol, otomatik olarak üretilen sonuçların insan denetimi kavramını tanıtır ve potansiyel ve yerleşik kullanıcılar için iş akışlarını sunar (Şekil 1). Basit Karşılaştırma aracı, potansiyel kullanıcıların IsletNet sonuçlarını doğrudan yerel kaynaklı referans yöntemleriyle karşılaştırmasına olanak tanır (Şekil 1A). Yerel olarak üretilen standart görüntüler merkezler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğinden, güvenilir analiz yapılabilmek için IsletNet'in yeniden eğitimi gerekebilir (Şekil 1B). Bu süreci kolaylaştırmak için standart boyama ve görüntü alımı önerileri sunulmaktadır. Yerleşik kullanıcılar için, Klinik Adacık İzolasyonu aracı, insan adacığı izolasyonu iş akışını desteklemek üzere tasarlanmıştır (Şekil 1C). İndirilebilir raporlar, IsletNet tarafından oluşturulan ek tablolar ve görselleştirmelerle birlikte Tablo 1'de açıklanırken, temel hesaplanan parametreler Tablo 2'de özetlenmiştir.

Şekil 1: Platformun potansiyel ve yerleşik kullanıcıları için iş akışı. (A) Basit Karşılaştırma modülü kullanılarak yerel doğrulama iş akışı. (B) Yeniden eğitim, yerel olarak standartlaştırılmış görüntüleri temsil eden bir küme gerektirir. (C) Klinik Adacığı İzolasyonu modülü kullanılarak rutin kullanım iş akışı. Temel iş akışı adımları görüntü yükleme, analiz, görsel kalite kontrolü (vQC) ve rapor oluşturma için özetlenir. Ölçek çubukları uygulanamaz. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Platform tarafından oluşturulan indirilebilir sonuç dosyaları. Klinik Adacığı İzolasyonu ve Basit Karşılaştırma araçları tarafından oluşturulan indirilebilir çıktı dosyalarının listesi, dosya formatı ve çıktı kategorisine göre gruplandırılmıştır. Tablo, rapor dosyalarını, segmentli görüntü çıktılarını, görselleştirme dosyalarını ve adacığı sayımı, hacmi, saflığı ve histogram analizleri için elektronik tablo dışnatılarını içerir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: İndirilebilir raporlar ve elektronik tablo çıktılarında yer alan temel parametreler. Klinik Adacığı İzolasyon ve Basit Karşılaştırma araçları tarafından oluşturulan indirilebilir XLSX ve CSV dosyalarında yer alan meta veriler, kullanıcı tanımlı ayarlar ve nicel analiz parametrelerinin ayrıntılı listesi. Parametreler arasında oturum meta verileri, görüntü alım ayarları ve görüntüler ile bireysel adacıklar için adacık nicelendirme metrikleri bulunur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC uyarınca Çekya Sağlık Bakanlığı tarafından (Onay no. 49/2023) onaylanmıştır. İnsan adacığı izolasyonu ve kullanım prosedürleri Devlet İlaç Kontrol Enstitüsü tarafından onaylandı (Onay no. sukls111286/2023). Fare ve insan adacığı preparatlarının standartlaştırılmış mikroskobik görüntüleri, Simple Comparison ve Clinical Islet Isolation araçları kullanılarak analiz edilerek otomatik analiz ile manuel sayımla karşılaştırıldı. Standart (kısa) dönüşüm^{tablosu 13} , hem manuel hem de otomatik adacığı eşdeğer hesaplamalar için kullanıldı.

1. İnsan Denetimi

1. Birincil Sonuçların İlk Görünümü (Şekil 2)
   1. Adacık sayısı, hacim ve saflık için otomatik olarak oluşturulan değerlerin yanı sıra ilgili otomatik açıklamaların (örneğin, konturlar veya segmentasyonlar) grafiksel görselleştirmesi Toplu Sonuçlar penceresinde görünmesini bekleyin.
   2. Mevcut örnek görüntünün özet sonuçlarını sol bilgi panelinde görüntüleyin (Şekil 2A).
   3. Sağdaki tabloda tekrarlanan değerleri (Şekil 2B) ve parti ortalamalarını (Şekil 2C) görüntüleyin.
   4. Görsel önizlemesine (Şekil 2D,E) bağlantıları (Şekil 2F) üzerinden göz atın. Gerekirse görsel önizlemesine sağ tıklayın ve açılır menüden takip ederek tek bir görsel indirebilirsiniz.
   5. Örnek görüntüleri navigasyon oklarıyla (Şekil 2G) gezin veya doğrudan tablodan seçin.
   6. Otomatik olarak oluşturulan konturların kalitesini değerlendirmek ve sonuçları doğrulamak için mevcut görsel önizlemesinin içine (Şekil 2D) tıklayarak İndenetleme penceresini açın.
2. Görsel Kalite Kontrolü
   1. Görüntüde hareket edin ve (Şekil 3A) yakınlaştırarak konturları olası hata açısından inceleyin.
   2. Kontur (sadece sayılan adalarda var), Orijinal görüntü ve ek görselleştirme görünümleri arasında geçiş yapın.
      NOT: Mevcut görünümler pencerenin sağ tarafındaki Efsane'de (Şekil 3B) listelenmiştir ve klavye kısayolları veya üst navigasyon çubuğundaki bağlantılar kullanılarak erişilebilir (Şekil 3C; Tablo 3).
   3. Konturlar kabul edilebilirse aşağı ok tuşuna basarak sonraki görüntüye geçin (Tablo 3).
   4. Kontur hatalarını mümkün olduğunca manuel olarak düzeltin. Tespit edilmemiş, kısmen tespit edilmiş veya sahte adacik kalırsa, görüntüyü geçersiz olarak sınıflandırın ve analizden hariç tutun.
      NOT: Hariç tutulan görüntüler Toplu Sonuçlar penceresinde (Şekil 2J) ve indirilen tüm dosyalarda işaretlenmiştir.
3. Düzeltilebilir Hatalar: Ayrılmamış Bitişik Adacıklar
   1. Gerektiğinde bitişik adaları manuel olarak ayırın.
   2. Adacıqların dışına sol tıklayarak bir ayrım hattı başlatın (Şekil 3D).
   3. Bitişik adacıklar arasındaki ayrım çizgisini yönlendirmek için ara sol tıklamalar ekleyin (Şekil 3E).
   4. Ayırma hattını tamamlamak için adacıqların dışına sağ tıklayın (Şekil 3F).
   5. Sonucu güncellemek için ayırma hattını gönderin (Şekil 3G).
      NOT: Eklenen ayırma çizgilerinin görselleştirmesini gerektiğinde açıp kapatın (Şekil 3H).
4. Düzeltilebilir Hatalar: Sahte Adabaşlar
   1. Ayırma aracını kullanarak sahte bir adacığı adacık boyutu eşiğinden daha küçük birden fazla cisme bölebilirsiniz.
   2. Küçük adacığı saymaktan kaçının, önceden tanımlanmış minimum adacık boyutu eşiğini (geleneksel olarak 50 μm) belirleyin. Gerekirse eşiği yerel laboratuvar uygulamalarına göre ayarlayın.
   3. Çizgideki herhangi bir noktaya sağ tıklayın ve açılır menüden uygun seçeneği seçerek manuel olarak eklenen ayırma çizgilerinden birini veya hepsini kaldırın (Şekil 3I).
5. Düzeltilemeyen Hatalar: Eksik, Kısmen Segmentlenmiş veya Sahte Adacik
   1. Adacıqların tespit edilip edilmediğini doğrulamak için Segmentasyon görünümünü açın.
   2. Parti ortalaması hesaplamasından, tespit edilmemiş, kısmen tespit edilmiş veya birden fazla sahte adacığı içeren geçersiz görüntüleri hariç (Şekil 3J).
6. Düzeltilemeyen Hatalar: Yanlış Sınıflandırılmış Nesneler
   1. Eğer dış doku, arka plan eserleri veya baloncuklar yanlışlıkla adacık olarak sınıflandırılmışsa, görüntü değerlendirmeden çıkarılır (Şekil 3J).

Şekil 2. Parti Sonuçları penceresi. (A) Güncel örnek sonuç özeti. (B) Örnek görüntülerin tekrarlanması için sonuçlar. (C) Sadece kabul edilen görsellerden alınan toplu ortalama değerler. (D, E, F) Grafiksel sonuç önizlemeleri ve bağlantılar. (G) Örnek navigasyon okları. (H, I, J) Değiştirilen, kabul edilen ve hariç tutulan görüntüler. (K) IsletNet üst navigasyon çubuğu. (L, M) Batch Results pencere başlığı ve altbilgisi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. vQC ve manuel kontur düzeltme için inceleme penceresi. (A) Görüntü yakınlaştırma ekranı. (B) Efsane ve navigasyon ipuçları. (C) Denetim penceresinin üst navigasyon çubuğu. (D–G) Bitişik adacıqlar için manuel bir ayırma hattının inşası ve teslimi yapıldı. (H) Manuel ayırma çizgilerini görüntülemek veya saklamak için anahtar. (I) Manuel ayırma hatlarının kaldırılması. (J) İstatistikten bir görüntüyü hariç tutmak için anahtar. Bu arayüz görünümünde ölçek çubukları gösterilmemiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Denetim penceresinde mevcut modları, klavye kısayollarını ve navigasyon kontrollerini görüntüleyin. vQC sırasında sunulan görüntü görselleştirme modları, klavye kısayolları ve navigasyon fonksiyonlarının özeti ve segmentasyonun manuel incelemesi sonuçlar Denetim penceresinde elde edilir. Tablo, Klinik Adacık İzolasyonu ve Basit Karşılaştırma araçlarında kullanılan kontur örtüleri, segmentasyon göstergeleri, histogram görselleştirme ve görüntü navigasyon kontrollerini içerir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Platformda Gezinme

1. İzleme Versiyonu ve Teknik Bilgiler
   1. Mevcut yazılım sürümünü ve üst navigasyon çubuğunda gösterilen en son eğitim tarihini inceleyin (Şekil 2K).
   2. Teknik açıklama ve ilgili referans bilgilerine erişmek için Ana sayfa bölümünü açın.
2. Yerel Görüntülerin Ön Değerlendirmesi
   1. Yerel olarak oluşturulan standartlaştırılmış görüntülerin, Adım 1.2.4 ve 1.5.2'de açıklanan hata kriterlerine dayanarak platform tarafından zaten doğru şekilde analiz edilip edilemeyeceğini veya yerel standartlaştırılmış görüntüler için yeniden eğitim gerekip gerekmediğini belirleyin (Şekil 1A ve 1B).

3. Yerel Görüntülerle Basit Karşılaştırma ve Dış Eğitim

1. Basit Karşılaştırma
   NOT: Basit Karşılaştırma aracını kullanarak otomatik analiz sonuçlarını yerel olarak belirlenmiş bir referans yöntemiyle karşılaştırın; genellikle standart manuel^{sayma 13}, alternatif^{tablolar 7,11,18} veya modeller ^5,6. Yerel olarak oluşturulmuş standart görüntüleri, ilgili referans değerleri ve referans yöntem tipiyle birlikte yükleyin. Çıktı, indirilebilir tablolar, görseller ve PDF raporlarını içerir (Tablo 1).
   1. Üst navigasyon çubuğundan Basit Karşılaştırma panelini açın (Şekil 4A ve 4B).
   2. Gerekli görüntü özellikleri için İpuçları bölümünü inceleyin (Şekil 4C).
   3. form.xlsx şablonunu indirin (Şekil 4D).
   4. Yerel olarak belirlenmiş bir referans yöntemiyle birden fazla örneklemde adacıkları saymak.
   5. Sayılan örneklere karşılık gelen standart mikroskobik görüntüler alın.
   6. Sayılan tüm adacıqların tamamen görüntü çerçevesine dahil olduğundan emin olun.
   7. Tam resim dosya adlarını ve karşılık gelen parametre değerlerini form.xlsx şablonuna İngilizce ondalık noktalar kullanarak girin (Şekil 4E).
   8. Tamamlanmış tabloyu ve ilgili görsel dosyalarını sürükle-bırak veya yükleme butonları kullanarak yükleyin (Şekil 4F).
   9. Adacık hacmi tahmini için kullanılan dönüşüm tablosunu veya modelini seçin (Şekil 4G).
   10. Yan yana karşılaştırma oluşturmak için Gönder partisine tıklayın.
   11. Analiz sonuçlarının çıkmasını bekleyin.
   12. Konturların görsel doğrulamasını yapmak için Denetim penceresini açın.
   13. Konturlar yanlışsa görüntüleri analizden hariç tutun (Şekil 3J).
       NOT: Basit Karşılaştırma aracında manuel kontur düzenlemesi mevcut değildir.
   14. Sonuçları tablo, görsel ve PDF raporu olarak indirin (Tablo 1).
2. Yerel olarak standartlaştırılmış görüntüler için IsletNet eğitimi
   1. Deneysel Tıp Enstitüsü (IKEM) geliştirme ekibiyle info@isletnet.com numaralı telefondan iletişime geçin.
   2. Yerel olarak elde edilen görüntü kalitesi aralığını kapsayan temsilli görüntüleri paylaşın.
   3. Geliştirme ekibiyle görüntü kalitesi gereksinimlerini görüşün.
      NOT: Temel görüntü kalitesi parametreleri arasında yeterli kontrast, görüntü çerçevesine adacıkların tamamen dahil edilmesi ve bitişik adacıqlar arasında minimum örtüşme yer alır. Adacığının rengi, ekzokrin dokudan ayırım açık kalınca kırmızıdan pembe veya mora kadar değişebilir.
   4. Adacığığı saflığı, büyütme ve renk varyasyonu gibi beklenen aralığı kapsayan bir eğitim görüntü seti oluşturun.

Şekil 4. Basit Karşılaştırma aracı, gösterge paneli ve iş akışı. (A) Üst navigasyon çubuğu. (B) Basit Karşılaştırma Paneli. (C) İpuçları ve talimatları yükleyin. (D, E) form.xlsx şablon indirme ve yüklenen parametre görselleştirmesi. (F) Görseller ve tablolar için sürükle-bırak yükleme alanı. (G) Adacık boyutu hacmine dönüşümünü seçmek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Örnekleme

NOT: Adacıqları boyut ve şekle göre hızlı ve farklı şekilde tortulur, bu da örnekleme sonuçlarını yanlışlıkla etkileyebilir.

DIKKAT: Tüm adacık kullanımı işlemlerini uygun kişisel koruyucu ekipman takarak laminar akış başlığı içinde gerçekleştirin.

1. Adacığı süspansiyonu için 50 mL veya 250 mL tüpler kullanın.
2. Gözlemlenen pellet hacmi ve saflığına göre gerekli örnekleme fraksiyonunu yerel standart işletim prosedürleriyle belirlemek.
3. Örnek toplamadan hemen önce tüpü nazikçe beş kez ters çevirerek adacık süspansiyonunu iyice karıştırın.
4. Ekzokrin doku tıkanıklığını önlemek ve adacığak hasarını en aza indirmek için büyük delikli pipet ucu kullanarak numuneyi hemen alın.

5. Adacık Görüntü Ediniminin Optimize Edilmesi

1. Dithizone Hazırlığı
   NOT: Adacıqlar ile ekzokrin dokular arasında yeterli kontrast sağlamak için tutarlı ditizon boyama gereklidir. Aşağıda yaygın olarak kullanılan iki hazırlık yöntemi açıklanmıştır.
   DIKKAT: Ditizon, üreme toksini şüphesidir. Dimetil sülfoksit (DMSO) toksiktir ve cilde nüfuz edicidir. Sodyum hidroksit son derece aşındırıcı ve ciddi kimyasal yanıklara neden olabilir. Tüm kimyasalları uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kullanın, cilt temasından kaçının ve atıkları kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.
   1. DMSO^13'te yeniden askıya alma
      1. 50 mg ditizon tozu ağırlığında ol.
      2. Ditizonu 5 mL DMSO'da çöz.
      3. Çözeltiyi 37°C'de kuluçka yapın ve her 5 dakikada bir 1 dakika boyunca güçlü bir girdabda bırakın, ta ki çözünme tamamlanana kadar.
      4. Stok çözeltisini %2 fetal sığır serumu içeren 20 mL Hank's Balanced Salt Solution ile 1 mL seyreltirin ve çalışma çözeltisi hazırlanır.
      5. Çözeltiyi 0.22 μm şırınga filtresinden geçirin.
      6. Tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
         NOT: Çalışma çözümünü yaklaşık 12 saat içinde kullanın.
   2. Alkalin alkol çözeltisinde yeniden süspansiyon (Ref. 8'e alternatif)
      1. 50 mg ditizon tozu ağırlığında ol.
         NOT: İsterseniz aliquotları önceden hazırlayın.
      2. Ditizone'a %70 etanol içeren 800 μL ekleyin.
      3. 400 μL 1 M sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin ve çözünürme tamamlanana kadar iyice girdabla girdirin.
      4. Çözeltiyi fosfatla tamponlanmış tuzlu sıvı ile inceltin olarak 0,2 mg/mL insan albümini son hacmi 20 mL elde edin.
      5. Çözeltiyi 0.22 μm şırınga filtresinden geçirin.
      6. Tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
         NOT: Çalışma çözümünü yaklaşık 12 saat içinde kullanın.
2. Adacığı Boyama
   1. 35 mm bir çanak ortasına 25 μL ditizon çalışma çözeltisi ekleyin.
   2. 50 μL adacık ekleyin; albümin içeren Hank's Balanced Salt Solution, Complete Culture Medium veya Transplantasyon Ortamı içeren bir adacığı ekleyin.
      NOT: Gerçek örnek hacmi saflık-fraksiyon pelletine bağlı olarak 20-50 μL arasında değişir ve nihai ditizon konsantrasyonu 0,85 mg/mL ile 1,37 mg/mL arasındadır.
   3. Süspansiyonu üç kez pipet edin, ilk durağı yavaşça kullanarak çözeltileri nazikçe karıştırın ve baloncuk oluşumunu önleyin.
   4. Örneği 20°C–25°C arasında 1–2 dakika boyunca kuluçka edin, böylece lekelenme gözünüz altında izlenerek adacıklar parlak kırmızı görünene kadar izlenin. Bazı hazırlıklar kötü lekelenmiş adacıqlar içerebilir ve IsletNet de bu konuda eğitim almıştır.
   5. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 4 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu, 0.2 mg/mL albümin takviyesi ile doğrudan boyanmış numuneye enjekte ederek hem kabarcıkları hem de sıçramayı önleyin.
   6. Hemen yemeği yuvarlak bir hareketle hızla karıştırarak çözeltileri karıştırın, adacıkları merkeze doğru hareket ettirin ve sonra yerleşin.
      SEÇENEK 1: Dikkatlice etrafına 4 mL PBS/albümin ekleyin, ditizondaki adacıkları bozulmadan bırakın. Sonra, kapı dairesel hareketlerle nazikçe karıştırarak adacıkları ortada tutarak karıştırın. Dithizin tabakta dağılmasını bekle.
      SEÇENEK 2 (stereomikroskop için uygun): Adacıkları seyreltmek yerine, ditizon-adacığını pipet ucu veya iğne ile ince bir tabaka halinde yayarak yansımaları azaltın.
   7. Örneği mikroskop altında inceleyin ve çevresindeki çözeltiyi pipet ucuyla döndürerek hemen yer değiştirmiş adacıkları kamera alanına nazikçe geri gönderin.
   8. Sitotoksisiteyi ve adacığak hacmi değişikliklerini en aza indirmek için görüntü alımı hemen başlatın.
3. Görüntü Edinimi
   NOT: Düşük büyütme objektif ve stabil bir ışık kaynağı ile donatılmış stereo veya ters bir mikroskop kullanın. Çanak, oda aydınlatması gibi ek ışık kaynaklarından korun.
   1. Işık kaynağını aç ve halojen ampulün 5 dakika ısınmasına izin ver.
   2. Parlama ve az pozlamadan kaçınmak için standart bir ışık yoğunluğu ayarlayın. Kesin aralık, kullanılan görüntüleme donanımına bağlıdır.
      NOT: Optimal ışık yoğunluğu büyütme ve örnek saflığına göre değişebilir.
   3. Tüm adacıqların kamera görüş alanında kalmasını sağlayan hedef ve yakınlaştırma ayarını seçin.
   4. Bir partideki tüm örnekler için ve tercihen tüm saflık partilerinde aynı büyütmeyi koruyun.
   5. Gerekirse beyaz dengesini normalize edilmiş beyaz kaydırma ile kalibre edin. Eğer görüntü kalitesi adacığı hazırlamanın benzersiz özellikleri nedeniyle tatmin edici değilse, RGB değerlerini ve/veya gamma ayarlarını ayarlayın.
   6. Aşırı pozlamadan kaçınmak için renk histogramı kullanarak pozlama süresini ve gerekirse aydınlatma yoğunluğunu veya kazancını ayarlayın.
      NOT: Bol miktarda ekzokrin doku içeren örnekler, adacık dışı dokudan yansıyan ışık nedeniyle farklı kamera veya aydınlatma ayarlarına ihtiyaç duyabilir. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, bu parametreleri gelecekte referans için ayrı bir yapılandırma dosyası olarak kaydedin.
   7. Görüntüyü yakalayın ve dosyayı desteklenen bir formatta, JPG, PNG, TIFF veya BMP dahil olmak üzere kaydedin.
      NOT: Gelecekteki yeniden analiz (örneğin, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg) için dosya adında tarih, saflık kesimi, büyütme veya piksel boyutu ve seyreltme belirtin.
   8. Örnek görüntüleme için kullanılan aynı büyütme ve yakınlaştırma ayarlarıyla aşama mikrometresinin bir görüntüsünü alın.

6. Klinik Adacığı İzolasyon Aracı

NOT: Ana iş akışı adımları Şekil 1C'de özetlenmiştir. Örnekler mevcut oldukça saflık fraksiyonu partilerindeki görüntüleri analiz edin.

1. Piksel Boyutunun Ayarlanması
   NOT: Hesaplanan piksel boyutu, yalnızca analiz edilen örneklerle aynı büyütme ve yakınlaştırma ayarlarıyla sahne mikrometre görüntüsü alındığında geçerli kalır.
   1. Klinik Adacığı İzolasyon panelini açın.
   2. Upload Stage Micrometer seçeneğine tıklayın ve sahne mikrometre görüntüsünü seçin.
   3. Dijital cetvel üzerinde bilinen bir mesafe boyunca kırmızı ölçüm çizgisinin uç noktalarını çizin.
      NOT: Ölçüm doğruluğunu artırmak için mümkün olduğunca daha uzun bir kalibrasyon mesafesi kullanın.
   4. Bilinen mesafeyi mikrometre (μm) cinsinden girin.
   5. Hesaplanan piksel boyutunu gönderin.
      NOT: Platform, manuel olarak değiştirilene kadar hesaplanan piksel boyutunu korur.
2. Saflık Fraksiyonu Görüntülerinin Toplu Yüklemesi
   NOT: Parti ortalaması ve standart sapma değerlerinin güvenilir şekilde hesaplanmasını sağlamak için 3–4 örnek kullanın. Bir partideki tüm örnekler için aynı seyreltme kullanın.
   1. Aynı saflık fraksiyonuna sahip örnekleri yükleme alanına çoğaltmayı temsil eden görüntüleri sürükle bırakın.
      NOT: Platform, dosya adı tanıma temelinde aynı görüntünün tekrar kullanılmasını engeller.
   2. Gerekirse piksel boyutunu değiştirin.
   3. Minimum adacık boyutu eşiğini girin.
   4. Örnek seyrelme değerini girin (örneğin, 1000).
   5. Orijinal şişeden kaydedilen mililitre cinsinden pellet hacmine girin.
   6. Operatör baş harfleri girin.
      NOT: Operatör baş harfleri oluşturulan raporda yer alır.
   7. Mevcut izolasyon prosedürünü temsil eden Oturum Kimliği'ni girin.
   8. Parti Kimliğini girin (örneğin, 1 Yüksek Saflık).
      NOT: Platform, Batch ID'ye göre kesirleri alfanumerik olarak sıralar.
   9. Analizi başlatmak için Toplu Gönder'e tıklayın.
3. Parti Sonuçlarını İnceleme ve Kesinleştirme
   NOT: Gerekirse başlığa tıklayarak önceki Toplu Sonuçlar penceresini kapatın (Şekil 2L).
   1. Sayısal ve grafiksel sonuçların Toplu Sonuçlar penceresinde görünmesini bekleyin.
   2. Toplu Sonuçlar penceresinde görsel önizlemeye çift tıklayarak Denetim penceresini açın.
   3. Adım 1'de tanımlandığı şekilde konturları gözden geçirin ve gerekirse düzeltin.
   4. Konturlar kabul edilebilirse, aşağıya ok tuşu ile sonraki görüntüye geçin.
   5. Başka bir parti ekleyin veya pencerenin altındaki butonları kullanarak oturum özetine geçin (Şekil 2M).
4. Toplu Düzenleme
   NOT: Platform, aynı görüntünün yanlışlıkla tekrar kullanılmasını önlemek için oturum boyunca görüntü dosya adlarını saklar. Bu, kaldırılan görüntüleri de kapsar. Gerekirse tekrar kullanmadan önce resimleri yeniden adlandırın.
   1. Görsel eklemek veya kaldırmak, örnek özelliklerini düzeltmek veya partinin adını değiştirmek için Edit Batch tuşuna tıklayın (Şekil 2L).
      NOT: Eğer görüntü yeniden kullanımı bekleniyorsa, toplu değişikliğe başlamadan önce görüntü dosya adlarını kaydedin.
   2. Partiyi tamamen silmek için Partiyi Kaldır tuşuna tıklayın (Şekil 2L).
5. Özetin İzlenmesi ve Raporların Oluşturulması
   1. Oturum genel görünümünü görüntülemek için Göster Özetine tıklayın (Şekil 2M).
      NOT: Önceki partilere geri dönün ve gerekirse düzenleyin.
   2. Oturum için toplam adacığı sayısı, hacmi ve pellet hacmi değerlerini ve ilgili ortalama parti değerlerini görüntüleyin.
6. Raporu indirin.
   NOT: Kısa raporda toplam adacık sayısı, hacm, saflık, pelet değerleri, histogramlar ve saflık fraksiyonu özetleri yer almaktadır. Tam rapor ayrıca her örnek görüntü için grafik bilgileri içerir; kabul edilen değerler kırmızı ve hariç değerler siyah ile gösterilir.

Sonuçlar

Saf Fare Adacığı

İlk deneyde, dört bağımsız görüntüleme oturumunda toplam 249 saflaştırılmış fare adacığını içeren 12 örneği temsil eden 36 görüntü alındı. Görüntüler, halojen ve ışık yayıcı diyot (LED) ışık kaynakları ile farklı kamera ayarları kullanılarak üç standart ama farklı aydınlatma koşullarında stereomikroskop kullanılarak oluşturuldu. IsletNet eğitim uzmanı tarafından üç temsilci görsel için yeraltı gerçeklik (GT) segmentasyonları manuel olarak oluşturuldu.

Görüntüler, Simple Comparison aracının halka açık versiyonu kullanılarak analiz edildiğinde, otomatik olarak oluşturulan konturların hiçbiri görsel kalite kontrolünden geçmedi (vQC, Şekil 5F). Platform daha sonra temsil yerel görüntülerle yeniden eğitildi ve yeniden eğitilen deneysel versiyonun tüm konturları vQC'den geçti (Şekil 5C).

Otomatik ve manuel adacığı hacim tahminlerinin oranı, yeniden eğitimden sonra üç görüntüleme koşullarında tutarlı performans gösterdi; A, B ve C aydınlatma koşulları için medyan değerler sırasıyla 1.03, 0.98 ve 0.94 olarak belirlendi (Şekil 5A). Bu sonuçlar, orijinal eğitim modeline kıyasla önemli bir gelişme anlamına geliyordu (Şekil 5B).

GT segmentasyonlarıyla piksel karşılaştırması, yeniden eğitimden sonra otomatik ve manuel olarak oluşturulan konturlar arasında yakın uyum sağladığını gösterdi (Şekil 5D), bu da temsil eden görüntülerde doğru kontur yerleşimine karşılık geldi (Şekil 5C). Buna karşılık, orijinal eğitim modeli yanlış-negatif piksellerin (Şekil 5G) ve kontur uyumsuzluğunun (Şekil 5F) artan oranını gösterdi; bu da ilgili adacık boyutu histogramlarında daha küçük adacık kategorilerine kaymaya yol açtı (Şekil 5E vs 5H).

Şekil 5. Üç görüntüleme sistemi ve sıçan adacığı hazırlıkları kullanılarak platformun yeniden eğitiminin değerlendirilmesi. (A) Üç görüntüleme sistemi kullanılarak yeniden eğitimden sonra IsletNet ve manuel adacığı eşdeğeri (IEQ) tahminlerinin karşılaştırılması. (B) Orijinal kamu eğitim modeli kullanılarak IsletNet ve manuel IEQ tahminlerinin karşılaştırılması. (C, F) Modeli yeniden eğitmeden sonra ve öncesinde vQC aracı kullanılarak temsil edici kontur yerleştirmesi. Beyaz ok uçları doğru kontur yerleşimini, magenta ok uçları ise yanlış kontur yerleşimini gösterir. (D, G) Yeniden eğitimden sonra ve orijinal eğitim modeliyle birlikte piksel karşılaştırması. Gerçek pozitif, yanlış pozitif, yanlış negatif ve gerçek negatif bölgeler bu efsanede belirtilmiştir. (E, H) Yeniden eğitimden sonra ve orijinal eğitim modeliyle temsil eden adacığı boyutları histogramları, manuel sayma ile karşılaştırıldığında. Görüntüleme kurulumu 1 = LED aydınlatma; görüntüleme kurulumu 2 = halojen aydınlatma; görüntüleme kurulumu 3 = LED karanlık alan aydınlatması. Ölçek çubukları = 100 μm. Kutu grafikleri Tukey konvensiyonuna göre gösterilir; bıyıklar, birinci ve üçüncü çeyrekler arasında 1,5 × arası veri noktalarına kadar uzanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Klinik İnsan Adacığı Hazırlıkları

İkinci deneyde, platformun halka açık versiyonu kullanılarak tek bir insan adacığı izolasyon prosedürünü temsil eden 17 görüntü, üç saflık-fraksiyon çifti kullanılarak analiz edildi. Bir örnek kayboldu. vQC'den sonra, orta ve düşük saflıkta fraksiyonları temsil eden tüm görüntüler, sahte adacık tespiti nedeniyle (veri gösterilmemiştir) hariç tutulmuştur. Platform daha sonra temsil eden yerel görüntülerle yeniden eğitildi.

Yeniden eğitimden sonra, üç manuel ayırma hattı eklendikten sonra tüm görüntüler vQC üzerinden geçti. Parti bazında manuel sayımla karşılaştırıldığında, toplam adacığığı sayısı ve hacim tahminlerinde genel olarak %≤5 olarak eksik tahmin edildiğini göstermiştir. 2.000 ile 4.000 kat arasında seyreltilmiş örnekler, saflık fraksiyonuna bağlı olarak 80 ila 4 adacık içerirdi. Bireysel saflık fraksiyonlarının nihai hazırlığa göreceli katkısı Şekil 6A'da gösterilmiştir. Yüksek saflıkta olan 1VC2, orta saflıktaki fraksiyon 2SC1'e kıyasla ağırlıklı olarak daha küçük adacıklara katkıda bulundu. Platform tarafından otomatik olarak üretilen toplam adacık boyutu histogramı Şekil 6B'de gösterilmiştir.

Şekil 6. İnsan adacığı izolasyon örneklerinin nicelendirilmesi ve analizi. (A) IsletNet ve manuel sayım yöntemleri kullanılarak adacık sayısı ve adacığı eşdeğer hacim tahminleri, tam greftin saflık fraksiyonları üzerinde kullanılır. (B) IsletNet tarafından toplu ortalama değerleri kullanılarak oluşturulan son adacık boyutu histogramı. (C) 17 bireysel görüntü için IsletNet ve sayı ile hacim için manuel tahminlerin karşılaştırılması. (D) Örnek 3NC1'den temsil görüntü detayı, yeniden eğitilen IsletNet tarafından oluşturulan orijinal görüntü ve kontur yerleşimini gösterir. (E) Elle sayan uzman ile IsletNet eğitim uzmanı (GT1 vs. GT2) tarafından oluşturulan temel gerçekle IsletNet segmentasyonunun piksel bazında karşılaştırılması. Gerçek pozitif, yanlış pozitif, yanlış negatif ve gerçek negatif bölgeler bu efsanede belirtilmiştir. (F) Aynı görüntü için IsletNet ile manuel sonuçları karşılaştıran temsil eden adacığı boyutu histogramı. Magenta ok uçları, kontur ve adacığı boyutu kategorisinin kaymasını gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. Kutu grafikleri Tukey konvensiyonuna göre gösterilir; bıyıklar, birinci ve üçüncü çeyrekler arasında 1,5 × arası veri noktalarına kadar uzanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm bireysel görüntüler için otomatik ve manuel tahminler daha sonra karşılaştırıldı (Şekil 6C). Otomatik ve manuel tahminler arasındaki medyan oranlar adacığığı sayısı için 1,00, adacığığı hacmi için ise 0,93 idi; birkaç istisna değer gözlemlendi. Temsil eden düşük saflıkta bir örneklemde (3NC1), platform manuel sayımda yapılan adacığın sayısına (beş adacık) benzer şekilde tespit edildi ancak adacık hacminin %29 daha düşük olduğunu tahmin etti. Bu veri noktaları, Şekil 6C'deki ok uçlarıyla gösterilmiştir.

Bu temsilci görselden kısmen ekzokrin dokuda hapsolmuş en büyük adacığı Şekil 6D'de gösterilmiştir; orijinal görüntü ve otomatik olarak oluşturulan kontur örtüsü dahildir. İki uzman tarafından bağımsız olarak üretilen GT segmentasyonlarıyla piksel karşılaştırması Şekil 6E'de gösterilmiştir. İlgili adacık boyutu histogramları, manuel ve otomatik segmentasyonlar arasında boyut dağılımında bir değişim göstermiştir (Şekil 6F).

Otomatik Analizin Operasyonel Performansı

Basit Karşılaştırma ve Klinik Adacığı İzolasyonu araçlarının operasyonel performansı, ortalama indirme ve yükleme hızları sırasıyla 50 Mbps ve 30 Mbps olan standart internet koşullarında değerlendirildi. Her biri 12 görüntü içeren beş görüntü partisi, 0,5 MB JPEG dosyalardan 20 MB TIFF dosyalarına kadar değişen görüntü boyutları kullanılarak analiz edildi. Tam ZIP sonuç paketleri için indirme süresi ölçüldü.

Analiz görselleştirme süreleri ve indirme süreleri, her iki araç için görüntü boyutuyla kademeli olarak arttı (Tablo 4). Klinik Adacık İzolasyonu aracı, eşdeğer görüntü setleri için Basit Karşılaştırma aracına göre daha uzun işlem süreleri gerektiriyordu. Bu sonuçlar, rutin işlem sırasında görüntü çözünürlüğü, dosya formatı ve analiz verimliliği arasındaki pratik ilişkiyi göstermektedir.

Tablo 4: Klinik Adacığı İzolasyonu ve Basit Karşılaştırma araçları için analiz görselleştirme süreleri ve indirme süreleri. Farklı dosya boyutları ve formatlarındaki resim grupları kullanılarak sonuç görselleştirme ve dosya indirme için gereken işlem sürelerinin karşılaştırılması. Ölçümler, 12 görüntü içeren partiler kullanılarak alındı ve toplu gönderimden sonuç görselleştirme veya indirme tamamlanmasına kadar geçen süre olarak rapor edildi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, platformun iki kritik özelliğine vurgu yaparak, IsletNet'in potansiyel ve yerleşik kullanıcıları için pratik iş akışını tanımlar; platformun iki kritik özelliği olan uzman vQC ve sinir ağı yeniden eğitimi. Temsilci sonuçlar, doğru otomatik niceleme yalnızca görüntü segmentasyon performansına değil, aynı zamanda kullanıcının sonuçları kabul etmeden önce kontur yerleşimi ve görüntü uygunluğunu eleştirel şekilde değerlendirme yeteneğine de bağlı olduğunu göstermektedir. Seçilmiş doğrulama sonuçları oluşturmak için iki ek gelişmiş araç olan Piksel-Piksel Karşılaştırması ve Segmentasyonlar'ım kullanıldı; ancak bu araçlar öncelikle sinir ağı eğitim desteği için tasarlanmıştır ve bu nedenle protokol iş akışına dahil edilmezler.

IsletNet, laboratuvarlar arasında standartlaştırılmış adacık görüntü analizi için iş birliğine dayalı ve geniş erişilebilir bir referans aracı olarak geliştirilmiştir. Sinir ağı, izole insan ve fare adacıqlarının orijinal iki boyutlu mikroskobik görüntülerinin manuel notasyonlu GT segmentasyonları kullanılarak eğitildi ve doğrulandı 14,15,16. Ditizon-boyalı preparatlar için iki ayrı model ve lekelenmemiş fare adacıkları için ek bir araştırma modeli oluşturuldu ve talep üzerine erişim sağlandı. Platform sürümü ve eğitim tarihi kullanıcı arayüzünde gösterilir. IsletNet, adacıkları ve ekzokrin dokuları otomatik olarak segmentlere ayırır ve ardından kullanıcı tanımladığı piksel boyutu ve minimum adacık boyutu eşiği kullanılarak adacık sayısını, hacmini ve saflığını hesaplar. Adacık boyutu eşik seçimi, türlerden ziyade görüntü kalitesine ve analizin amacına (manuel sayım ile yan yana karşılaştırma ile küçük adacıqların incelenmesi) bağlıdır. Geleneksel mikroskopinin çözünürlüğü göz önüne alındığında, anlamlı minimum adacığı boyutu 50 μm 7,8,9,12'dir, ancak uygun bir ^{cihazla elde edilen görüntüler için 10} μm'ye kadar azaltılabilir 10. Adacık hacim tahminleri, standart küre tabanlı dönüşüm^{tablosu 13} ile alternatif dönüşüm^{tabloları 7,18,19} kullanılarak oluşturulur; bunlar arasında uyumlu ellips^{yaklaşımları 5,6} ve kontur tabanlı Spinacle ile Sphiracle^{modelleri 17} bulunur. Ortaya çıkan değerler adacığı eşdeğerleri ve nanolitre cinsinden raporlanırken, saflık ya doku alanından ya da tahmini doku hacminden hesaplanır. Protokolün kritik bir adımı, otomatik segmentasyona uygun standartlaştırılmış mikroskobik görüntülerin elde edilmesidir. IsletNet, çeşitli tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kameralar ve aydınlatma sistemleriyle donatılmış stereo ve ters mikroskoplarla alınan görüntüler kullanılarak eğitildi. Düşük büyütme hedefleri (1–2×) avantajlıdır çünkü tüm örneklemin görüş alanında kalmasını sağlarken, küçük adacıkların güvenilir tespitiyle uyumlu piksel boyutunu korur. Düzenli aydınlatma, istikrarlı beyaz dengesi ve görüntü aşırı pozlamadan kaçınmak güvenilir kontur üretimi için gereklidir. Temsilci sonuçlar, temsilli yerel görüntülerle yeniden eğitimin heterojen görüntüleme koşullarında segmentasyon performansını önemli ölçüde iyileştirebileceğini göstermektedir. Pratik bir rehber olarak, isletNet eğitimi için genellikle adacık ve ekzokrin doku sınırları deneyimli bir gözlemci tarafından açıkça ayırt edilebildiğinde görüntüler uygundur. Kümelenmiş veya yoğun şekilde üst üste binen adacıklar içeren görüntülerden mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.

Protokol ayrıca otomatik görüntü analiziyle ilgili çeşitli sınırlamalar ve sorun giderme konularını vurgular. IsletNet, tamamen manuel saymaya kıyasla veri verimliliği, nesnelliği ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde artırsa da, yöntem görüntü kalitesine karşı hassas kalır. Yanlış kontur yerleşimi (sahte adacığığı tespiti ve bitişik adacıqların ayrılma hızının başarısızlığı) zaman zaman meydana gelebilir ve aşağı akış niceliğini etkileyebilir. Otomatik sonuçları kabul etmeden önce rutin bir vQC gereklidir. IsletNet'e anında yerinde uygulama avantajlıdır çünkü uygun olmayan görüntüler ayarlanmış görüntüleme parametreleriyle yeniden alınabilir. Otomatik konturların manuel düzeltmesi, Denetim penceresi içinde mümkün olabilir, eksik adacik veya birden fazla sahte adacık hariç. Ayrıca, otomatik ayırma algoritması kontur geometrisi ve adacığı boyutu dağılım istatistiklerine dayanır ve bu nedenle bireysel bir uzmanın ilk yorumundan farklı olabilir ancak analitik olarak kabul edilebilir kalabilir.

IsletNet'in güvenilirliği, yalnızca türlere göre değil, öncelikle yerel görüntü kalitesi ile eğitim veri seti arasındaki tutarlılıkla belirlenir. Mevcut eğitim seti farklı saflıkta insan adacıkları ve yüksek saflıkta fare adacıkları içerse de, görüntü özellikleri eğitim verileriyle tutarlı kalırsa platform diğer türlere de genişletilebilir. Örneğin, kültürle arındırılmış domuz adacıkları, eğitim veri setinde bulunan gömülü insan adacıqlarına benzeyebilir. Buna karşılık, zayıf dithistan boyası olan yaygın şekilde kültürlenmiş adacıklar eğitim sırasında temsil edilmemiş ve ek eğitim gerektirebilir. Bu nedenle Basit Karşılaştırma aracı, yeni kullanıcılar veya yeni görüntüleme yapılandırmaları için önemli bir doğrulama adımını destekler. Burada sunulan sonuçlar, gömülü adacıkların farklı uzman yorumlarının GT üretimi ve aşağı akış hacim tahminini nasıl etkileyebileceğini vurgulamaktadır. Gelecekteki çok merkezli çalışmalarda geniş uzman uzlususu eksikliğini gidermek için, IsletSwipe uygulaması²⁰, uzlaşma temelli görüntü açıklamasını kolaylaştırmak amacıyla geliştirilmiştir.

Mikroskop altında geleneksel manuel sayma ile karşılaştırıldığında, IsletNet operatöre bağlı değişkenliği azaltırken önemli ölçüde daha yüksek veri verimliliği, kalıcı dijital dokümantasyon ve standartlaştırılmış nicel çıktılar sağlar. Manuel sayım, sınırda vakalarda doku tanımlamasında daha fazla güven sağlayabilir, ancak öznel boyut tahmini, daha düşük ölçeklenebilirlik ve kapsamlı personel eğitim gereksinimleri nedeniyle sınırlıdır. Web tabanlı bir hizmet olarak IsletNet , merkezi ama anonim analizle laboratuvarlar arası karşılaştırılabilirliği sağlar. Analiz hızı, yerel internet bant genişliği, görüntü dosyası boyutu ve görüntü karmaşıklığına bağlıdır. Daha büyük TIFF dosyaları görüntü kalitesini artırabilir ancak sıkıştırılmış JPEG görüntülere kıyasla daha uzun yükleme ve indirme süreleri gerektirir.

Genel olarak, burada sunulan sonuçlar, yerel görüntü alımı tekrarlanabilir ve eğitim setiyle tutarlı kaldığında güvenilir otomatik niceleme elde edilebileceğini göstermektedir. Kullanıcılar, rutinlerine vQC'yi dahil etmeleri ve yerel görüntüleme koşullarında önemli değişiklikler olduğunda yeniden eğitim vermeleri teşvik edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Unsterile
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Staining öncesi adaçayı süspansiyon dağıtımı için
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC sınıfı veya hücre kültürü sınıfı
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Toz
Ethanol, 70%	Yerel tedarikçi	N/A	(v/v) H2O içinde; DTZ hazırlığı için
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	Isı ile inaktive edilmiş, kalifiye
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Fenol kırmızısı ile veya onsuz (teste göre belirtilir)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	Yüksek konsantrasyonlu çözelti (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Standart görüntü alma yazılımı
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	1.25x ve 2x objektifler
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED ışık kaynağı; çift gooseneck kılavuzu
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Halojen ışık kaynağı (14.5 V, 90 W); manuel yoğunluk kontrolü; çift gooseneck kılavuzu
Laboratory essentials	Çeşitli	N/A	Pipetler, tüpler, iğneler, şırıngalar, laboratuvar zamanlayıcıları, standart KİK
MicroCam software	Bresser	N/A	Standart görüntü alma yazılımı
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3.1 MP kamera
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0.22 µm gözenek boyutu, PES membran
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 MP, yüksek dinamik aralıklı kamera
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Standart görüntü alma yazılımı
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Yerel tedarikçi	N/A	DTZ hazırlığı sırasında pH ayarlaması ve çözünme için
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm uzunluğunda; kalibasyon için 50 µm bölmeler
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	1x apokromatik objektif