Fare karaciğeri ve iskelet kaslarında glikojenin nicelendirilmesi için Anthrone Kolorimetrik Yöntemi

Özet

Bu protokol, farklı metabolik durumlar arasında fare karaciğeri ve iskelet kaslarında glikojenin nicelendirilmesi için anthrone kolorimetrik bir yöntemi tanımlar.

Özet

Glikojen, karaciğer ve iskelet kaslarında önemli bir hücre içi glikoz rezervidir ve karbonhidrat metabolizmasında temel bir rol oynar. Hepatik glikojen, sistemik glisemik homeostazın korunması için gereklidir, iskelet kası glikojeni ise fiziksel aktivite ve egzersiz performansını destekler. Bu nedenle, doku glikojeninin doğru nicelendirilmesi, glikojen metabolizmasının dinamik olarak düzenlendiği veya patolojik olarak değiştirildiği çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Burada, fare karaciğeri ve iskelet kasındaki glikojen içeriğini niceliklendirmek için güvenilir ve hassas bir anthrone kolorimetrik yöntemi tanımlıyoruz. Protokol, alkali sindirim, deproteinizasyon, glikojen çökeltme, alkol yıkama ve anthrone reaktif kullanılarak renk geliştirme gibi ardışık adımlardan oluşur. Bu yöntemin uygulanabilirliği, fizyolojik olarak üç önemli duruma maruz kalan sıçanlarda gösterilmiştir: ad libitum beslenme, gece boyunca oruç ve kısa süreli yeniden besleme. Bu deneysel paradigmalar, glikojen depolama, tüketme ve yeniden sentezle ilişkili anahtar metabolik durumları yakalar. Temel enzimler olan glikojen sentaz ve glikojen fosforilazın ortogonal western blot analizi, gözlemlenen metabolik değişikliklere mekanik destek sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği, epinefrin ile tedavi edilen hayvanlarda akut stres kaynaklı glikojen parçalanmasını modellemek için daha da gösterilmiştir. Toplu olarak, bu yöntem geniş bir dinamik aralık ve belirgin şekilde farklı fizyolojik durumlar arasında doku glikojenini niceliklendirmek için yeterli hassasiyet sağlar. Glikojen metabolizmasını in vivo araştırmak için güvenilir bir araç sunar ve ayrıca in vitro hücre kültür modellerine de uygulanabilir.

Giriş

Glikojen, memelilerin iskelet kasları ve karaciğerinde, daha az ölçüde ise beyin, böbrek, kalp ve yağ dokusu gibi diğer organlarda önemli bir enerji kaynağı olarak hizmet eden yüksek dallı bir^{polisakkarittir 1}. Beslenme sırasında, fazla glukoz polimerizasyon veya de novo lipogeneze uğrar ve glikojen veya lipid olarak depolanır. Ancak, oruç veya fiziksel eğme sırasında glikojen enzimatik bozulmaya uğrar ve enerji ihtiyaçlarını karşılamak için sürekli ve hızlı bir glukoz tedariği sağlanır. Bu glikojenin tamponlama kapasitesi, fizyolojik hızlı yeniden besleme döngülerinde glisemik homeostazın korunması için gereklidir².

Glikojen sentezi, iki memeli izoformunda bulunan glikojen sentazı (GYS) tarafından katalize edilir: GYS1 ve GYS2. GYS1 ağırlıklı olarak iskelet kasında ekspres edilirken, GYS2 karaciğer izoformudur. GYS'nin katalitik aktivitesi, Ser641 dahil birden fazla bölgede fosforilasyonla bastırılırken, beslenme koşullarında defosforilasyon sırasında etkisi uyarılır. Glikojen parçalanması, glikojen fosforilaz tarafından katalize edilir. Karaciğer izoformu PYGL, kas izoformu ise PYGM'dir. GYS'in aksine, katalitik aktiviteleri oruç sırasında Ser15'te fosforilasyon sırasında uyarır ve³ beslemeden sonra defosforilasyonda bastırılır.

Glikojen metabolizmasının doğru düzenlemesi birçok biyolojik süreç için temel olup, glikojen metabolizması düzensiz birçok hastalıkta neden olan bir faktör olarak tanımlanmıştır. Özellikle, karaciğer glikojen metabolizmasının değişmesi, glikojen depo^{hastalıkları 4}, tip 2^{diyabet 5}, metabolik disfonksiyon ile ilişkili steatotik karaciğer^{hastalığı 6,7} ve hipoglisemiye karşı regülasyon yanıtının bozulması gibi çeşitli metabolik^{bozukluklarla ilişkilidir 8}. Ayrıca, beyin glikojeni uzun vadeli hafıza oluşumu için gereklidir⁹, iskelet kası glikojeni ise dayanıklılık kapasitesinin önemli bir^{düzenleyicisidir 10}. Bu nedenle, doku glikojeninin doğru nicelleştirilmesi, glikojen metabolizmasının dinamik olarak düzenlendiği veya patolojik olarak değiştirildiği çalışmalar için kritik öneme sahiptir; bu çalışmalar hastalık mekanizmalarının incelenmesini ve glikojen modüle eden müdahalelerin değerlendirilmesini mümkün kılar.

Anthrone^{yöntemi 11,12}, amiloklukosidase^{yöntemi 13}, fenol-sülfürik asit yöntemi¹⁴ ve invaziv olmayan nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MRS)^{yöntemi 15} gibi çeşitli glikojen nicelendirme yöntemleri rapor edilmiştir; her yöntemin belirli avantajları ve sınırlamaları vardır. Burada, fare karaciğeri ve iskelet kasındaki glikojenin nicelendirilmesi için anthrone kolorimetrik yöntemi için ayrıntılı bir protokolü tanımlıyoruz (Şekil 1). Bu protokol, alkali sindirim, deproteinizasyon, glikojen çökeltme, alkol yıkama ve anthrone reaktif kullanılarak renk geliştirme gibi ardışık adımları içerir. Bu yöntem basit, ekonomik ve minimum özel enstrümantasyon gerektirir. Hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini göstermek için, bir dizi glikojen standardı kullanarak tespit sınırını (LOD), nicelendirme sınırını (LOQ) ve ayrıca analiz içi ve analiz arası varyasyon katsayısını (CV) hesapladık. Uygulanabilirliğini göstermek için, karaciğer ve iskelet kaslarındaki glikojen seviyeleri fizyolojik olarak ilgili üç koşulda değerlendirildi: ad libitum beslenme, 16 saat gece oruç ve kısa süreli yeniden besleme. Ayrıca, yöntem epinefrin ile tedavi edilen hayvanlar kullanılarak akut stres kaynaklı glikojen ayrışmasını modellemek için gösterilmiştir. Gözlemlenen metabolik değişiklikleri doğrulamak için glikojen metabolizmasında rol alan temel enzimlerin ortogonal western blot analizi yapıldı.

Şekil 1: Glikojen niceleme iş akışının genel görünümü. Karaciğer ve iskelet kaslarında glikojen nicelendirilmesi için deneysel iş akışının şematik temsili. Prosedür, doku toplama, alkali sindirim, protein çökeltme, glikojen izolasyonu ve anthrone tabanlı kolorimetrik tespiti içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Nanjing Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC; #1905019) tarafından onaylandı.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

1. Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler için Malzeme Tablosu'na bakabilirsiniz.
2. Tüm çözümleri deneylerin başlamasından önce hazırlayın.
3. Çözüm hacimlerini gerektiğinde ölçeklendirin.
4. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın
   1. 40 g NaOH pellet ağırlığında ol.
   2. NaOH pelletlerini 800 mL damıtılmış suya ekleyin.
   3. Çözeltiyi cam bir çubukla karıştırın, kabın tabanında çözünmemiş parçacıklar kalmayana kadar.
   4. Çözeltiyi 1 L hacimli bir şişeye aktarın.
   5. Hacmi tam olarak 1 litreye çıkar ve damıtılmış suyla yap.
   6. Çözeltiyi sıkı kapalı bir şişede oda sıcaklığında (RT; 18°C–23°C) saklayın.
      DIKKAT: NaOH aşındırıcıdır. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü takın. Ticari NaOH pelletleri %100 saf değildir ve suyu emer. Pelletlerin uzun süre havaya maruz kalmasından kaçının.
5. %20 lityum klorür (LiCl) stok çözeltisi hazırlayın
   1. 20 g susuz LiCl tozu ağırlığında olsun.
   2. LiCl tozunu 80 mL damıtılmış suya ekleyin.
   3. Çözeltiyi kabın tabanında çözünmemiş parçacık kalmayınca karıştırın.
   4. Çözeltiyi 100 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın.
   5. Hacmi damıtılmış suyla tam olarak 100 mL'ye getirin.
   6. Çözeltiyi RT'de sıkıca kapalı bir şişede sakla.
      NOT: LiCl cildi, gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü takın. LiCl oldukça higroskopiktir. Su emilimini önlemek için havaya maruz kalmayı en az tutun.
6. Anthrone reaksiyon çözeltisi hazırla
   1. 28 mL damıtılmış suyu 1 L'lik bir beaker'e yerleştirin.
   2. Suya 72 mL yüksek saflıkta konsantre (%98) kükürt asit (H₂SO₄) ekleyin.
   3. Karışımın RT'ye kadar soğumasına izin verin.
   4. Çözeltiye 50 mg anthrone ekleyin.
   5. Taht çözülene kadar karıştırın.
   6. Çözeltiye 3 g tiorea ekleyin.
   7. Thiourea eriyene kadar karıştırın.
   8. Çözeltiyi kehribar veya folyo kaplı cam şişeye aktarın.
   9. Çözeltiyi buzdolabında (2°C–8°C) en fazla bir hafta boyunca saklayın.
      DIKKAT: Sülfürik asit son derece aşındırıcıdır, ciddi kimyasal yanıklara neden olur ve suyla şiddetli reaksiyona girer. Laboratuvar önlüğü, kimyasal dirençli eldivenler ve yüz kalkanı giyin. Tüm adımları sertifikalı kimyasal bir buhar davlumbazında yapın. Sulandırma yoğun ısı oluşturur. Her zaman suya asit ekleyin.
7. %95 etanol ile %0,1 LiCl içeriyor
   1. Cam şişeye 95 mL mutlak etanol ekleyin.
   2. 4,5 mL damıtılmış su ekleyin.
   3. 0,5 mL %20 LiCl stok çözeltisi ekleyin.
   4. İyice karıştırın.
8. %80 metanol %0,1 LiCl içeren
   1. Bir cam şişeye 80 mL mutlak metanol ekleyin.
   2. 19,5 mL damıtılmış su ekleyin.
   3. 0,5 mL %20 LiCl stok çözeltisi ekleyin.
   4. İyice karıştırın.
9. %100 (w/v) trikloroasetik asit (TCA) çözeltisi hazırlayın
   1. Ağırlığı 100 g TCA tozu.
   2. TCA tozunu 80 mL damıtılmış suya ekleyin.
   3. Çözülene kadar karıştırın.
   4. Çözeltiyi 100 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın.
   5. Hacmi damıtılmış suyla tam olarak 100 mL'ye getirin.
   6. Çözeltiyi RT'de sıkıca kapalı bir cam şişede sakla.
10. Doymuş benzoik asit çözeltisi hazırlayın
    1. 250 mL cam bir beakerde 100 mL damıtılmış suya 0,5 g benzoik asit kristalleri ekleyin.
    2. Karışımı sıcak plakada sürekli manyetik karıştırma ile 90°C'ye kadar ısıtın.
    3. Kabın tabanında çözünmemiş parçacık kalmayana kadar ısıtmaya devam edin.
    4. Çözümün RT'ye kadar soğumasına izin verin.
    5. Görünür parçacıklardan arınmış şeffaf süpernatantı aspire edin.
    6. Çözeltiyi RT'de sıkı kapalı bir cam şişede sakla.
11. Glikoz standartları hazırla
    1. 50 mg glikoz tozunu 50 mL doymuş benzoik asit çözeltisinde çözerek 1 mg/mL stok çözeltisi hazırlanır.
    2. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde doymuş benzoik asit ile seri seyreltme yoluyla glukoz standartları (0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ve 1 mg/mL) hazırlanır.
       1. 1 mg/mL standardını hazırlamak için Tüp 1'e 500 μL 1 mg/mL stok çözeltisi ekleyin.
       2. Tüp 2'ye 250 μL stok çözeltisi ve 250 μL doymuş benzoik asit ekleyerek 0,5 mg/mL standardını hazırlayın.
       3. 0.2 mg/mL standardını hazırlamak için Tüp 3'e 200 μL Tüp 2 çözeltisi ve 300 μL doymuş benzoik asit ekleyin.
       4. 0.1 mg/mL standardını hazırlamak için Tüp 4'e 250 μL Tüp 3 çözeltisi ve 250 μL doymuş benzoik asit ekleyin.
       5. 0,05 mg/mL standardını hazırlamak için Tube 5'e 250 μL Tube 4 çözeltisi ve 250 μL doymuş benzoik asit ekleyin.
       6. 0.02 mg/mL standardını hazırlamak için Tube 6'ya 200 μL Tube 5 çözeltisi ve 300 μL doymuş benzoik asit ekleyin.
       7. 0.01 mg/mL standardını hazırlamak için Tüp 7'ye 250 μL Tüp 6 çözeltisi ve 250 μL doymuş benzoik asit ekleyin.
       8. Boşluğu hazırlamak için ayrı bir tüpe 500 μL doymuş benzoik asit ekleyin (0 mg/mL).
    3. Her tüpü ve girdapı 10 saniye boyunca kısa bir süre kaplayarak iyice karıştırın.

2. Hayvan Tedavisi

1. Genel hayvancılık
   1. Ev erkek Sprague–Dawley fareleri (230–270 g) hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında (VAF/Plus sağlık durumu, Charles River Laboratuvarları), Sendai virüsü, Mycoplasma pulmonis ve fare parvovirüsleri gibi yaygın kemirgen patojenlerinden arınmış sertifikalandırılmıştır.
   2. Standart bir yemek diyeti sağlayın ve suya ücretsiz erişim izni verin.
   3. Hayvanları 12 saat ışık/karanlık döngüde tutun (ışıklar 08:00'de açık, ışıklar 20:00'de kapalı).
   4. RT 22°C–23°C arasında kalın.
   5. Göreli nemi %30–%70 arasında koruyun.
2. Gece orucu
   1. Fareleri normal konut kafeslerine aktarın.
   2. Yiyecekleri çıkarın ve suya ücretsiz erişim sağlayın.
   3. Ertesi sabah 16:30'dan 08:30'a kadar 16 saat oruç tutun.
3. Yeniden besleme
   1. Gece oruç tutan farelere düzenli yemek (200 g) ver.
   2. Hayvanların 2 saat boyunca imtiyaz olarak beslenmesine izin verin.
4. Epinefrin meydan okuması
   1. Epinefrin hidroklorür çözeltisi hazırlayın.
      1. 5 mg epinefrin hidroklorür tozunu kalibre edilmiş analitik bir tartı ile tartın.
      2. Tozu 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 10 mL tuzlu su ekleyin.
      3. Tüpü kap ve 10 kez ters çevirerek 0.5 mg/mL stok çözeltisi hazırlanın.
   2. Oruçsuz sıçanlara intraperitonal olarak 1 mL/kg vücut ağırlığı (0,5 mg/kg vücut ağırlığı) hacimde epinefrin hidroklorür çözeltisi enjekte ^edilir.
      1. Karın içeriğinin kafa içinde hareket etmesini sağlamak için hayvanı başı aşağı pozisyonda tutun.
      2. 25 kalibre bir iğneyi karın alt sağ kvadrantına 45° açı ile sokun.
      3. Enjeksiyondan önce kan veya enterik içeriğin yokluğunu doğrulamak için aspirasyon yapın.
   3. Kontrol hayvanlarına intraperitoneal olarak 1 mL/kg hacimde salin enjekte edin.
   4. Kuyruk damarından kan örnekleri alın.
      1. Kuyruğu ortaya çıkarmak için fareyi tutun.
      2. Kuyruğu 10 saniye sıkıştırıp ısıtarak kan akışını kolaylaştırın.
      3. Lateral kuyruk damarını ucundan 3 cm uzakta, steril 25 gauge bir iğne ile delin.
      4. İlk damla kanı temiz gazlı bezle atarak doku sıvısı kontaminasyonunu önleyin.
      5. Glikoz ölçümü için ikinci damla kanı toplayın.
   5. Kan şekerini her 15 dakikada bir glukometre ile 60 dakika boyunca ölçün.
      1. Glikometreyi üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
      2. Kontrol çözümleriyle glukometre doğruluğunu aylık olarak doğrulayın.
      3. Test şeritlerini orijinal kablarında saklayarak nem maruziyetini önleyin.
      4. Kabtan çıkardıktan hemen sonra test şeritleri kullanın.
      5. Göstergeyi otomatik olarak etkinleştirmek için glukometreye bir test şeridi yerleştirin.
      6. Kan örneğinin kapiller hareketle şeride girmesine izin verin.
      7. Gösterilen kan şekeri değerini kaydedin.

3. Doku Hasadı.

1. Ötenazi ve hazırlık
   1. Hayvanları isofluran aşırı dozuyla ötenazi. Hayvanları bir indüksiyon odasına yerleştirin ve %5 isoflurane, %100 oksijenle 2 L/dakika en az 3 dakika boyunca maruz bırakın.
   2. Solunumun durduğunu doğrulayarak ölümü doğrulayın.
   3. Kornea refleksi ve parmak sıkıştırma refleksinin kaybını doğrulayın.
      1. Göz kırpma tepkisi olmadığını doğrulamak için steril pamuk uçlu aplikatör kullanarak korneaya nazikçe dokunun.
      2. Motor tepki olmamasını doğrulamak için arka patinin parmakları arasındaki perdeye sıkı bir sıkıştırma uygulayın.
   4. Fare ventral tarafını diseksiyon tepsisine yukarı koyun.
   5. Karın cildini %75 etanol ile sprey şişeyi kullanarak ıslatın.
      NOT: Ölüm sonrası iskemi nedeniyle oluşan glikojen bozulmasını azaltmak için ötenazi ile doku koruma arasındaki zamanı en aza indirin.
2. Karaciğer diseksiyası
   1. Xiphoid sürecine yaklaşık 1 cm kuysal deride küçük bir kesi yapın.
   2. Kesiyi göğsüne doğru uzatın.
   3. Deriyi alttaki kastan ayırın.
   4. İki taraflı transvers laparotomi yapılarak yaklaşık 1 cm kaudal kesik olarak xiphoid sürecine kadar uzanır ve sol ve sağ subkostal kenarlara lateral olarak uzanarak karın boşluğunu tamamen ortaya çıkarır.
   5. Karaciğeri tanımlayın.
   6. Sağ median lobu kesin (Şekil 2A).
   7. Dokuyu 1 dakika içinde tartın.
   8. Dokuyu polipropilen plastik bir kapa yerleştirin.
   9. Mendiliyi kuru buzda snap-dondurun.
3. İskelet kası diseksiyası
   1. Gastroknemius kasını temsil eden örnek olarak kullanın çünkü bu kas, arka uzuvun metabolik ve kasılma özelliklerini yansıtan hızlı ve yavaş seğiren liflerden oluşan karışık bir popülasyon^{içerir 16}.
   2. Fareyi karnının üzerine konumlandır.
   3. Popliteal fossa'dan kalkaneal tüberoziyete kadar arka uzuvun arka tarafı boyunca uzunlamasına bir deri kesisi yapın.
   4. Deriyi ayırın.
   5. Biceps, femoris ve semitendinosus kaslarını tanımlayın ve yansıtın.
      1. Biceps femoris'i, arka uyluğun üst yarısını kaplayan büyük, yan pozisyonlu kas olarak tanımlayın.
      2. Semitendinosus, arka uyluk boyunca medial olarak uzanan ve diz yakınında yerleşen dar kayış benzeri kas olarak tanımlanır.
   6. Gastroknemius kasını açığa çıkar.
   7. Aşil tendonunu, kalkaneusa distal yerleştirilmesinde ince cerrahi makas ile kesin.
   8. Soleus kasını ayırın.
   9. Femurun medial ve lateral epikondillerinde gastroknemius kasının proksimal tutumunu serbest bırakın.
   10. Tüm gastroknemius kasını çıkarın (Şekil 2B).
   11. Dokuyu 1 dakika içinde tartın.
   12. Dokuyu polipropilen plastik bir kapa yerleştirin.
   13. Mendiliyi kuru buzda snap-dondurun.

Şekil 2: Karaciğer ve iskelet kas için doku diseksiyon prosedürleri. (A) Karın boşluğunun açığa çıkarılması ve karaciğer dokusunun alınması için ardışık adımlar; bunlar arasında deri kesisi, kesinin uzatılması, derinin alttaki kaslardan ayrılması ve enine laparotomi dahil. (B) Gastroknemius kasının izole edilmesi için ardışık adımlar; bunlar arasında uzunlamasına kesi, üst kasların yansıması, anatomik yapıların tanımlanması ve kas çıkarılması dahil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Glikojen Kolorimetrik Testi

1. 1. Gün: Alkalin sindirim
   1. 50 mL'lik santrifüj tüpüne 0.4 g doku ekleyin. Hızlı işleme ve doku bozulmasını en aza indirmek için 0,1 g ± tolerans izni verilir.
   2. Tüpe 10 mL 1 M NaOH çözeltisi ekleyin.
   3. Dokuyu steril bıçaklar veya makasla yaklaşık 1–2 mm boyutunda doku parçalarına kadar doğran.
   4. Tüpü 95°C ± 5°C arasında su banyosuna yerleştirin.
   5. 30 dakika kuluçka yapın.
   6. Kuluçka sırasında örneği 2.500 rpm'de her 10 dakikada 10 saniye boyunca girdabla geçirin.
   7. Tüpü su banyosundan çıkarın.
   8. Numunenin RT olarak soğumasına izin verin.
2. Protein testi için lizat hazırlama
   1. 1 mL alkali lizat, kalibre edilmiş bir P1000 pipetörü kullanarak mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Santrifüj sıcaklığında 8.000 × g'de 10 dakika boyunca kullanın.
   3. Süpernatantı topla.
   4. Süpernatantı BCA protein testi için ayırın.
3. TCA aracılı deproteinizasyon
   1. 3 mL alkalin lizatı 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.
   2. 1 mL %100 (v/v) TCA çözeltisi ekleyin.
   3. 6 mL damıtılmış su ekleyin ve toplam hacmi 10 mL'ye çıkarabilirsiniz.
   4. Karışımı 2.500 rpm'de 10 saniye girdablandırın.
   5. Tüpü buzun üzerine koyun (0°C–4°C).
   6. Proteinleri çökeltmek için 1 saat kuluçka yapın.
4. Deproteinize süpernatan koleksiyonu
   1. Karışımın 1 mL miktarını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. 8.000 × g ile 10 dakika RT'de santrifüj yapın.
   3. Süpernatantı ayırın.
5. Glikojen çökeltmesi
   1. Süpernatanttan 0.4 mL yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. %0,1 LiCl içeren %95 etanol 0,8 mL ekleyin.
   3. Karışımı iyice girdabla karıştırın.
   4. RT'de 16 saat kuluçka yapın.
6. 2. Gün: Glikojen pelletleme
   1. Numuneyi 1.000 × g ile 15 dakika boyunca RT'de santrifüjlenerek sert, yarı saydam beyaz glikojen pelleti elde edin (Şekil 3A ve Şekil 3B).
   2. Üst yüzeyi at.
7. İlk glikojen yıkaması
   1. Pellete %0,1 LiCl içeren %80 metanol 1,5 mL ekleyin.
   2. Örneği 2.500 rpm'de 10 saniye girdabına getirin.
8. Yıkamadan sonra santrifüjleme
   1. 1.000 × g'de 5 dakika RT'de santrifüj yapın.
   2. Üst yüzeyi at.
9. İkinci glikojen yıkaması
   1. Yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
   2. Kalan sıvıyı dikkatlice çıkararak, glikojen peletinin bozulmamasını sağlamak için ince uclu P200 pipetörü dikkatlice aspirasyon yapın.
10. Glikojen çözünürlüğü
    1. Pellete 0.8 mL damıtılmış su ekleyin.
    2. 2.500 rpm'de girdabı tutun, görünür partiküller olmadan net, homojen bir çözüm elde edilene kadar.
11. Standartların ve örneklerin hazırlanması
    1. Glikoz standartları, blank ve bilinmeyen örnekler için 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri üçlü olarak hazırlanır.
       NOT: Her tüpe Tablo 1'e göre reaktifler ekleyin.
    2. Belirlenen tüplere her bir glikoz standardından 50 μL ekleyin.
    3. Boş tüpe 50 μL damıtılmış su ekleyin.
    4. Her bilinmeyen örnek tüpüne 50 μL glikojen örneği ekleyin.
    5. Her tüpe 200 μL anthrone reaksiyon çözeltisi ekleyin.
12. Anthrone renk gelişimi ve soğurma ölçümü
    1. Tüm tüpleri iyice girdablandırın.
    2. Tüpleri 95°C ± 5°C sıcaklıklarda su banyosuna yerleştirin.
    3. 15 dakika kuluçka yapın.
    4. Tüpleri çıkarın ve soğumalarına izin verin.
    5. Her tüpten 200 μL 96 kuyu taşıyan bir plakaya aktarın.
    6. 620 nm'de mikroplaka okuyucu (uç nokta modu, 25°C) kullanarak otomatik yol uzunluğu düzeltmesi ile 1 cm'ye kadar ölçün.
    7. Standart eğrinin (R 2) belirleme katsayısı (R²) doğrusal regresyonla belirlenmiş olarak ≥kabul edilebilir sayılması gerekir.
    8. Üçlü ölçümlerde %>20 CV ile çoğalan herhangi bir standart veya örnek güvenilmez sayılıp tekrar yapılmalıdır.

Şekil 3: Farklı beslenme durumları altında glikojen izolasyonu ve niceliklendirme. (A) Karaciğer örneklerinden beslenmiş, oruç ve refleks koşullarında çökeltilmiş glikojen peletlerinin temsil eden görüntüsü. (B) Iskelet kası örneklerinden alınan çökelmiş glikojen pelletlerinin beslenmiş, oruçlu ve refed koşullarında temsil eden görüntüsü. (C) 620 nm'deki emilimle glikoz konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiyi gösteren glukoz standartlarından oluşturulan standart eğri. (D) Beslenme, oruç ve refed koşullarında kan şekeri seviyeleri. (E) Beslenme, oruç ve ref koşullarında hepatik glikojen içeriği. (F) Beslenme, oruç ve refleksiyon koşullarında iskelet kası glikojen içeriği. Veriler ortalama ± SEM (n = 6 grup başına sunulur) olarak sunulur. İstatistiksel analiz, Benjamini–Hochberg yöntemiyle düzeltilmiş çoklu karşılaştırmalarla sıradan tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns: anlamlı değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktifler	0 mg/mL	0.01 mg/mL	0.02 mg/mL	0.05 mg/mL	0.1 mg/mL	0.2 mg/mL	0.5 mg/mL	1 mg/mL	Boş	Bilinmeyen Örnek
Glikoz standart çözeltisi	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Damıtılmış su (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Glikojen örneği	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Anthrone reaksiyon çözümü	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tablo 1: Glikojen kolorimetrik testi için reaksiyon kurulumu. Anthrone kolorimetrik testinde kullanılan glikoz standartları, blank ve bilinmeyen glikojen örnekleri için reaksiyon kurulumu. Tanımlanmış hacimlerde glukoz standartları, damıtılmış su veya glikojen örnekleri, kuluçka ve soğurma ölçümü öncesinde anthrone reaksiyon çözeltisi ile birleştirildi.

5. Doku Glikojen İçeriğinin Hesaplanması

NOT: Ölçülen glikojenin doku yaş ağırlığı veya toplam protein kütlesi olarak normalleştirilmesi.

1. Standart eğri ve konsantrasyon belirleme
   1. Sekiz glukoz standart tüpten absorbans ölçümlerini kullanın.
   2. Soğurma ölçümlerinden boş değerleri çıkarıp sonra bunları glikoz konsantrasyonlarına karşı çizin.
   3. Excel'de sıradan en küçük kareler regresyonunu kullanarak doğrusal bir regresyon eğrisi uydurun (Şekil 3C).
   4. Her bilinmeyen glikojen örneğindeki (C_bilinmiyor) glikoz konsantrasyonunu, 5.1.3. adımda elde edilen regresyon denklemini kullanarak boş çıkarılmış absorbansını doğrusal standart eğriye interpolasyon ederek hesaplayın.
2. Doku ıslak ağırlığına normalleşme
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak glikojen içeriği hesaplayın:
      
   2. _{C'yi, bilinmediğini}, bilinmeyen glikojen örneğindeki glikoz konsantrasyonu (mg/mL) olarak tanımlayın; bu konsantrasyon 5.1.4'te belirlenir.
   3. 0.8'i, 4.10.1. Adımda çözünmüş glikojen örneğinin (mL) hacmi olarak tanımlayın.
   4. 0.9'u glikoz değerini glikojen değerine dönüştürmek için kullanılan faktör olarak tanımlayın.
   5. 2.5'i, Adım 4.5'te glikojen çökelmesi sırasında eklenen seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   6. 10'u, Adım 4.3.3'te hazırlanan toplam 10 mL karışımdan analiz edilen 1 mL aliquot'u hesaba katan seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   7. 10/3'ü, Adım 4.1.2'de hazırlanan toplam 10 mL alkali sindirimden kullanılan 3 mL aliquot'u hesaba katan seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
3. Toplam protein kütlesine normalleşme
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak glikojen içeriği hesaplayın:
      
   2. _{C'yi, bilinmediğini}, bilinmeyen glikojen örneğindeki glikoz konsantrasyonu (mg/mL) olarak tanımlayın; bu konsantrasyon 5.1.4'te belirlenir.
   3. 0.8'i, 4.10.1. Adımda çözünmüş glikojen örneğinin (mL) hacmi olarak tanımlayın.
   4. 0.9'u glikoz değerini glikojen değerine dönüştürmek için kullanılan faktör olarak tanımlayın.
   5. 2.5'i, Adım 4.5'te glikojen çökelmesi sırasında eklenen seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   6. 10'u, Adım 4.3.3'te hazırlanan toplam 10 mL karışımdan analiz edilen 1 mL aliquot'u hesaba katan seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   7. 1/3'ü, Step 4.3.1'de alkali sözümden kullanılan 3 mL aliquot için düzeltme faktörü olarak tanımlayın.
   8. Protein konsantrasyonu, BCA testiyle Step 4.2.4'te belirlenen alkali sindirimdeki toplam protein konsantrasyonu (mg/mL) olarak tanımlayın.

6. Glikojen metabolizmasını katalize eden ana enzimlerin Western Lekesi

1. Genel değerlendirmeler
   1. Standart western blot prosedürleri için daha önce tanımlanan^{protokollere bakınız, 17,18}.
2. Protein ekstraksiyonu
   1. 75 mg snap-dondurulmuş doku ağırlığındadır. Hızlı işleme ve doku erimesini en aza indirmek için ± 25 mg tolerans izni verilir.
   2. 1 mL buz gibi soğuk RIPA lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; %1 Triton X-100; %0.5 sodyum deoksikolat; %0.1 SDS; ve 1 mM EDTA) proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle takviye edilmiş.
   3. Dokuyu elde taşınan rotor-stator homojenizatörü kullanarak homojenleştirin.
3. Lizat presleri
   1. Homojenleri buzda 30 dakika kuluçka yapın.
   2. Inkubasyon sırasında örnekleri 2.500 rpm'de her 10 saniyede bir 10 saniye girdabla geçirin.
   3. 10.000 × g sıcaklıkta sabit açılı rotor kullanarak 4°C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Protein niceliklendirmesi
   1. Süpernatantı toplam protein lizatı olarak toplayın.
   2. Protein konsantrasyonunu belirlemek için bir BCA testi yapın.
   3. RIPA lizis tamponu içinde seyreltilmiş 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 ve 1 mg/mL BSA standartları hazırla.
   4. 96 kuyruklu bir mikroplakada, her standart veya bilinmeyen örnekten 20 μL ayrı kuyulara yüklenin.
   5. Her kuyuya 200 μL BCA çalışma reaktifini (50 parça Reagent A ile 1 parça Reaktif B karıştırılarak hazırlanmış) ekleyin.
   6. Reaksiyon plakasını 37°C'de 30 dakika kuluçka yapın.
   7. RT'ye (18°C–23°C) soğuduktan sonra, mikroplaka okuyucu (son nokta modu, 25°C) ile 562 nm'de soğurma noktası ölçün ve otomatik yol uzunluğu düzeltmesi ile 1 cm'ye kadar düzeltilin.
5. SDS-SAYFA
   1. 15 μg protein SDS-PAGE yükleme tamponu ile karıştırın.
   2. Örnekleri 95°C'de 5 dakika ısıtın.
   3. Numuneleri buz üzerinde soğut.
   4. Örnekleri %10 SDS-PAGE jeline yükleyin.
   5. Proteinleri elektroforezle koşturan tamponda çözer (25 mM Tris, 192 mM glisin ve %0,1 SDS).
   6. Jeli sabit 100 V'da çalıştırın, bromofenol mavi boya ön kısmı jelin altına ulaşana kadar.
6. Protein transferi ve bloklama
   1. Proteinleri nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın.
   2. Nitroselüloz zarları için, membranı transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM glisin, %20 metanol, pH 8.3) 10 dakika boyunca dengelendirin.
   3. PVDF zarları için, membranı %100 metanol içinde 30 saniye daldırarak aktive edin, ardından transfer tamponunda 10 dakika dengeleyin.
   4. Transfer sandviçi şu sırayla birleştirin: sünger, filtre kağıdı, jel, membran, filtre kağıdı, sünger.
   5. 4°C'de 90 dakika boyunca 200 mA sabit akımda protein transferi gerçekleştirin.
   6. TBST'de %3 (w/v) BSA hazırlanır (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; ve %0.1 Tween-20).
   7. Zarı RT pozisyonunda 1 saat boyunca sürekli sallanma ile bloklayın.
      NOT: Fosforile proteinleri tespit ederken yağsız süt yerine BSA kullanın.
7. Birincil antikor kuluçka
   1. Birincil antikor çözeltisi bloklayıcı tamponda 1:1.000 seyreltme ile hazırlanır.
   2. Membranı gece boyunca 4°C'de primer antikorla inkubasyon yapın ve sürekli sallanın.
8. Yıkama
   1. Zarı TBST ile yıkayın.
   2. Yıkamayı üç kez tekrarlayın, her biri 10 dakika sürer.
9. İkincil antikor kuluçka
   1. 1:10.000 seyreltme oranında bloklama tamponu içinde HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikor hazırlayın.
   2. Zarı RT rejiminde 1 saat boyunca sürekli sallanma ile inkubasyon yapın.
10. Yıkama
    1. Zarı TBST ile yıkayın.
    2. Yıkamayı üç kez tekrarlayın, her biri 10 dakika sürer.
11. Kemilyünesan tespit
    1. Kemimilüminesans substratı, eşit hacimde luminol/güçlendirici ve stabil peroksit çözeltileri karıştırarak hazırlayın.
    2. Alt tabakayı 0.1 mL/^{cm 2} membran yüzey alanında uygulayın ve yörge sallayıcısında RT hızında 2 dakika kuluçka yapın (100 rpm).
    3. Kimyasal lüminesans görüntüleyici kullanarak sinyalleri yakalayın.
    4. 10 ile 300 saniye arasında olan pozlama sürelerini test edin ve her leke için doğrusal algılama aralığında bir pozlama seçin.
    5. Sinyal doğrusal olması, cihazın yerleşik yazılımını kullanarak piksel doygunluğunun olmadığını doğrulayın.
12. Görüntü analizi
    1. ImageJ yazılımı (sürüm 1.51, NIH) kullanarak bant yoğunluğunu analiz edin.
    2. Görüntüleri 8 bit gri tonlamaya dönüştürün ve 50 piksel yarıçaplı yuvarlanan arka plan çıkarımı uygulayın.
    3. Her bandı, aynı boyutlara sahip bir dikdörtgen ilgi alanı kullanarak tanımlayın ve bitişik boş alandan yerel arka plan çıkararak ham entegre yoğunluk değerleri elde edin.
13. Toplam protein boyama
    1. Zarı %0,1 Hindistan mürekkep çözeltisinde TBST'de RT'de 1 saat boyunca sürekli sallanarak inkübe edin.
    2. Zarı TBST ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    3. Birden fazla boyalı bantı, immünoblotasyon sinyallerini normalleştirmek için yükleme kontrolleri olarak niceliklerini ölçemek.
       NOT: HKG ekspresyonu farklı deneysel koşullarda değişebileceği için ev genleri (HKG) yerine toplam protein boyama kullanın¹⁹.

7. Yöntemin Duyarlılığı ve Tekrarlanabilirliği

1. Glikojen standartlarının hazırlanması
   1. 1 M NaOH'da 20 mg/mL glikojen stok çözeltisi hazırlayın.
   2. 15 mL santrifüj tüplerinde, aşağıda açıklandığı gibi 1 M NaOH ile adım adım seyreltilerek bir dizi glikojen standardı (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ve 1 mg/mL) hazırla.
      1. Tüp 1'i (1 mg/mL) 500 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,5 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      2. 250 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,75 mL 1 M NaOH karıştırarak Tüp 2'yi (0,5 mg/mL) hazırlayın.
      3. Tüp 3'ü (0,2 mg/mL) 100 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,9 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      4. Tüp 4'ü (0,1 mg/mL) 50 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,95 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      5. Tüp 5'i (0,05 mg/mL) 25 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,975 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      6. Tüp 6'yı (0,02 mg/mL) 10 μL glikojen stok çözeltisi ile 9,99 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      7. Tüp 7'yi (0,01 mg/mL) 100 μL Tüp 1 çözeltisi ile 9,9 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      8. Tüp 8'i (0,005 mg/mL) 50 μL Tüp 1 çözeltisi ile 9,95 mL 1 M NaOH karıştırarak hazırlayın.
      9. Boş (0 mg/mL) 15 mL'lik santrifüj tüpüne 10 mL 1 M NaOH ekleyerek hazırlayın.
   3. Her tüp ve girdap 2.500 rpm'de 10 saniye boyunca karıştırın.
2. Anthrone kolorimetrik testi
   1. Glikojen alın ve Adım 4.1.4–4.12.6'ya göre anthrone kolorimetrik testi yapılacaktır.
   2. 620 nm'de (A₆₂₀) emilimcilik ölçümleri kaydedildi.
3. Glikojen konsantrasyonunun hesaplanması
   1. Glikoz standart eğrisini oluşturun ve her standart örnekte (C_standardı) Adım 5.1'de belirtildiği gibi glukoz konsantrasyonunu hesaplayın.
   2. Her standart tüpteki glikojen konsantrasyonunu aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın:
      
   3. C_standardı , her standart örnekte belirlenen glikoz konsantrasyonu (mg/mL) olarak tanımlayın.
   4. 0.8'i glikojen örneğinin hacmi (mL) olarak tanımlayın.
   5. 0.9'u glikoz değerini glikojen değerine dönüştürme faktörü olarak tanımlayın.
   6. 2.5'i bir seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   7. 10'u, Adım 4.3.3'te hazırlanan toplam 10 mL karışımdan analiz edilen 1 mL aliquot'u hesaba katan seyreltme faktörü olarak tanımlayın.
   8. 1/3'ü, Step 4.3.1'de alkali sözümden kullanılan 3 mL aliquot için düzeltme faktörü olarak tanımlayın.
   9. Bir gün içinde tam prosedürü üç kez daha tekrarlayın, toplamda dört kez tekrarlayın.
   10. Dört gün boyunca dört koşuyu tekrarlayın, toplamda 16 koşu elde edilir.
4. LOD ve LOQ'nun Hesaplanması
   1. Y eksenindeki tüm 16 absorbans ölçümünü x eksenindeki her glikojen standart konsantrasyonuna karşı çizin.
   2. Doğrusal regresyon eğrisini ve R^2'yi hesaplayın. R² ile ≥0.995 doğrusal regresyon kabul edilebilir kabul edilir.
   3. LOD ve LOQ'u aşağıdaki denklemlerle hesaplayın:
      
      
   4. σ yanıtın standart hatası (y-kesişme) olarak tanımlanır.
   5. S'yi doğrusal regresyon eğrisinin eğimi olarak tanımlayın.
5. Analiz içi ve analizler arası CV% hesaplanması
   1. Her glikojen standardı için, 1. Günde dört denemeden hesaplanan değerlerin analiz içi CV%'sini aşağıdaki denklekle hesaplayın:
      
   2. s_1'i , 1. Gündeki dört koşudan gelen değerlerin standart sapması olarak tanımlayın.
   3. 1. Gündeki dört koşudan elde edilen ortalama değer olarak tanımlanır .
   4. Bu hesaplamayı 2. Gün, 3. Gün ve 4. Gün için tekrarlayarak CV₂, CV₃ ve CV_4'ü elde edin.
   5. Aşağıdaki denklemi kullanarak nihai analiz içi CV% hesaplayın:
      
   6. Aşağıdaki denklemi kullanarak analizler arası CV% hesaplayın:
      
   7. S_inter'i CV₁, CV₂, CV₃ ve CV_4'ün standart sapması olarak tanımlayın.
   8. CV₁, CV₂, CV₃ ve CV_4'ün ortalama değeri olarak tanımlanır.

Sonuçlar

Farklı beslenme durumları altında karaciğer ve iskelet kası glikojen seviyeleri

Gece boyunca açlıkta, ad libitum ile beslenen farelerde kan şekeri seviyelerini (ortalama ± standart hatası [SEM]) oranından 7,9 ± 0,4 mM'den 5,4 ± 0,3 mM'ye anlamlı şekilde düşürdü. Kan şekeri seviyeleri, 2 saat yeniden besleme sonrası 8,3 ± 0,1 mM seviyelerine geri getirildi (Şekil 3D). Bu değişikliklerle uyumlu olarak, beslenen koşullarda karaciğer glikojen...

Tartışma

Bu makalede, hayvan dokularında glikojenin nicelendirilmesi için modifiye edilmiş bir anthrone kolorimetrik yöntemi tanımlıyoruz. Doku hasamı, alkali sindirim, glikojen çökeltme, alkol yıkama ve anthrone tabanlı renk gelişimi gibi geleneksel ardışık adımların yanı sıra, arka plan girişimini azaltmak için bir deproteinizasyon adımı da ekledik (Şekil 1). Daha sonra bu yöntemi, karaciğer ve gastroknemius kasındaki glikojen içeriğindeki değişiklikleri farklı fiz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri	LABGIC	BS-15-M	Numune işleme ve reaksiyon kurulumunda kullanılır
15 mL mikrosantrifüj tüpleri	LABGIC	BS-150-M-S	Lizat işleme ve çökeltme adımlarında kullanılır
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Western blot'ta membran yıkama için tampon
37 oC İnkübator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	BCA analiz plakası inkübasyonu
50 mL santrifüj tüpleri	LABGIC	CT-112-50A	Dokunun sindirimi ve ekstraksiyonu için kullanılır
96 kuyu plakası	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Plaka tabanlı absorbans ölçümü
Analitik terazi	Changzhou Xingyun	FA2204N	Kimyasal tozları tartma
Antron	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Glikojen renkli tespiti için reaktif
Anti-GYS1 antikoru	Proteintech	10566-1-AP	Glikojen sentaz 1 tespiti
Anti-GYS2 antikoru	Proteintech	22371-1-AP	Glikojen sentaz 2 tespiti
Anti-fosfo-GYS1/2 (Ser641) antikoru	Cell Signaling Technology	47043S	Fosforile edilmiş GYS tespiti
Anti-fosfo-PYGL (Ser15) antikoru	Abcam	ab227043	Fosforile edilmiş glikojen fosforilazının tespiti
Anti-PYGL antikoru	Proteintech	15851-1-AP	Karaciğer glikojen fosforilazının tespiti
Anti-PYGM antikoru	Novus Biologicals	NBP2-16689	Kas glikojen fosforilazının tespiti
BCA analiz kiti	Beyotime	P0012	Protein kantitasyonu
Benzoik asit	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Standartlar için doymuş çözelti hazırlanmasında
Blunt maşa	Shanghai Jinzhong	J42010	Ayak parmağı sıkma; doku dilimleme
BSA Fraksiyon V	Beyotime	ST023	Western blot'ta engelleyici ajan
Kimilüminesan görüntüleyici	Tanon	Tanon 5200 Multi	Western blot sinyallerinin tespiti
Kimilüminesan substrat (ECL)	Beyotime	P0018S	Western blot'ta sinyal gelişimi
Damıtılmış su	Beyotime	ST872	Reaktif hazırlamada çözücü
Epinefrin hidroklorür	Sigma-Aldrich	E4642	In vivo glikojen parçalanması indüksiyonu
Etanol	Macklin	E809065	Glikojen çökeltme ve yıkama
İnce cerrahi makas	Shanghai Jinzhong	JA2601	Doku dilimleme
Fresco 17 santrifüj	Thermo Fisher Scientific	75002402	Numune santrifüjlendirme
Glukometre	i-SENS	CareSens N	Kan şekeri ölçümü
Glukometre	i-SENS	CareSens N	Kuyruk damarından kan şekeri seviyesini ölçme
Glukometre şeritleri	i-SENS	CareSens N Şeritleri	Kuyruk damarından kan şekeri seviyesini ölçme
Glikozu	Macklin	G6172	Standart eğri hazırlanmasında
Glikojen stoğu	Beyotime	D0812	Bir dizi glikojen standardı hazırlama
Keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru	Thermo Fisher Scientific	31462	Birincil antikorların tespiti
El tipi homojenizatör	GreenPrima	PB100	Doku homojenizasyonu
Hindistan mürekkebi	Sigma-Aldrich	198285	Normalizasyon için toplam protein boyama
Izofluran	RWD Life Science	R510-22-10	Hayvan ötenazisi
Laboratuvar ısıtma bloğu	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Testler sırasında numune ısıtma
Lityum klorür	Macklin	767397	Glikojen çökeltmeyi artırır
Metanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Glikojen yıkama adımı
Mikroplate okuyucu	BioTek	ELx800	620 nm'de absorbans ölçümü
Nitroselüloz membran	Millipore	HATF04700	Protein transfer membranı
Orbital çalkalayıcı	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Kimilüminesan substrat inkübasyonu
P1000 Pipettör	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Çözelti transferi
P200 Pipettör	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Geri kalan sıvının çıkarılması
Fosfataz inhibitörleri (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Protein fosforilasyonunun korunması
Plastik kaplar (doku depolama için)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Hasat edilen dokuların depolanması
Proteaz inhibitörleri kokteyli	MCE	HY-K0011	Protein bozulmasının önlenmesi
RIPA lizis tamponu	Beyotime	P0013B	Protein ekstraksiyonu
SDS-PAGE jel kiti	Beyotime	P0012A	Protein ayrımı
SDS-PAGE yükleme tamponu (6X)	Beyotime	P0015F	Protein örneklerini SDS-PAGE jel kuyularına yüklemeden önce karıştırın
SDS-PAGE çalışma tamponu (5x)	Beyotime	P0014D	SDS-PAGE elektroforesisi
Küçük Hayvan Anestezi Makinesi	RWD Life Science	R500	Hayvan ötenazisi
Sodyum hidroksit	Macklin