Kalibreli Diferansiyel RNA Düzenleme Tarayıcısı kullanılarak RNA Düzenleme Alanlarının Yüksek Hassasiyetli Tespiti

Özet

Bu protokol, DNA–RNA ortak varyant çağrısı, sinyal optimize edilmiş yeniden kalibrasyon ve çoğaltma farkında istatistiksel modellemeyi entegre ederek yüksek hassasiyetle ayırt edilen RNA düzenleme alanlarını entegre eden hesaplamalı bir iş akışı olan Kalibreli Diferansiyel RNA Düzenleme Tarayıcısının (CADRES) kullanımını tanımlar.

Özet

RNA düzenlemesinin doğru tanımlanması teknik olarak zordur çünkü gerçek transkripsiyon sonrası değişiklikler genomik varyantlar ve dizileme artefaktlarından ayırt edilmelidir. Bu zorluk, özellikle APOBEC enzimleri tarafından katalize edilen sitidinden uridine düzenleme için belirgindir; burada DNA ve RNA değişiklikleri gerçek düzenleme sinyalini gizler. Kalibreli Diferansiyel RNA Düzenleme Tarayıcısı (CADRES), entegre DNA–RNA varyant sorgulaması ve otantik düzenleme imzalarının hedefli korunması yoluyla bu sınırlamaları ele almak için yapılandırılmış bir hesaplama çerçevesi sağlar. Bu protokol, veri hazırlama, ortak RNA varyantı çağrısı, sinyal koruyan temel kalite yeniden kalibrasyonu, artefakt filtreleme ve deneysel koşullar arasında RNA düzenlemesinin diferansiyel değerlendirmesini içeren CADRES iş akışını sunar. CADRES, çiftleştirilmiş RNA-dizisini ve tam genom veya tam ekzom dizilemesini biyolojik çoğaltma ile destekler.  Homopolimer çıkarımı ve PBLAT tabanlı paralog taramasını içeren çok aşamalı bir filtreleme stratejisi, düşük frekanslı düzenleme olaylarını korurken yanlış pozitifleri sistematik olarak azaltır. Kalibrasyonu çoğaltma farkında modelleme ile birleştirerek, CADRES RNA düzenleme analizinin hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini artırır ve çeşitli biyolojik bağlamlarda düzenleme dinamiklerinin sorgulanmasını mümkün kılar. Yerleşik yöntemlerle karşılaştırıldığında, CADRES, özellikle APOBEC aracılı C-to-U olayları için RNA düzenleme algılamasında hassasiyeti artırmak için tasarlanmıştır.

Giriş

RNA düzenlemesi, altta yatan DNA dizisini değiştirmeden RNA transkriptlerinde siteye özgü nükleotit ikamelerini mümkün kılan dinamik bir transkripsiyon sonrası düzenleme katmanı oluşturur. Metazoanlarda, ADAR enzimleri aracılığıyla adenozin-inosin (A>I) deaminasyonu baskın biçimdir ve transkript çeşitlenmesine, mRNA stabiliteline, doğuştan bağışıklık modülasyonuna ve nöron^{fonksiyonuna katkı sağlar 1,2}. Sitidinden uridine (C>U) (biyolojik bağlamda bundan sonra "C>U"; "C>T" dizileme bağlamında) deaminasyon, APOBEC ailesinin üyeleri tarafından katalizlenir ve bu ....

Protokol

Bu protokol, CADRES çerçevesi kullanılarak C>U RNA düzenleme olaylarını tanımlamak için tamamen hesaplamalı bir biyoinformatik iş akışını tanımlar. Tüm adımlar bir Linux ortamında komut satırı kullanılarak gerçekleştirilir. Yalnızca kamuya açık dizileme veri setleri kullanılır ve insan veya omurgalı denek dahil değildir.

1. Ortam kurulumu ve yazılım kurulumu

NOT: CADRES iş akışı için minimum hesaplama gereksinimleri şunlardır: CPU ≥ 8 çekirdek (16 çekirdek önerilir), RAM ≥ 32 GB (tam genom veri setleri için 64 GB önerilir) ve disk alanı ≥ 100 GB.

1. Linu....

Sonuçlar

CADRES'i gerçekçi deneysel koşullarda değerlendirmek için 293T hücrelerinde indüklenebilir APOBEC3B (A3B) sistemi kullandık. 293T hücrelerine A3B-GFP ifade eden doksisiklin duyarlı lentiviral bir yapı getirildi ve puromisin ile stabil integrantlar seçildi. 72 saat boyunca doksisiklin ile indüksiyon, GFP floresansı ve artan A3B mRNA seviyeleriyle doğrulanan sağlam A3B-GFP ekspresyonu sağladı. Eşleştirilmiş indüklenmiş ve indüklenmemiş örnekler, gözlemlenen RNA-DNA farklılıklarının teknik .......

Tartışma

Burada sunulan CADRES iş akışı, özellikle APOBEC enzimleri tarafından katalize edilen C>U deaminasyonu olmak üzere, yüksek spesifikliğe sahip diferansiyel RNA düzenleme olaylarını tespit etmek için kalibre edilmiş ve içsel tutarlı bir strateji sunar. Protokol içindeki birkaç adım, doğruluğu için çok önemlidir. Eşleştirilmiş genomik ve transkriptomik dizileme, gerçek RNA düzenlemelerini altta yatan DNA polimorfizmlerinden ayırmak için gereklidir; boost yeniden kalibrasyon prosedürü, temel.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BCFtools	Samtools projesi	N/A	Sürüm 1.21. Varyant çağrısı ve VCF manipülasyonu. URL: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	Sürüm 2.31.1. Genom aritmetik işlemleri. URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Biopython projesi	N/A	Sürüm 1.85. Moleküler biyoloji için Python araçları. URL: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	Sürüm 0.7.18. DNA-seq hizalama. URL: https://github.com/lh3/bwa
CADRES kaynak kodu	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	Sürüm 1.0.0. CADRES boru hattı komut dosyaları. URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda veya Miniconda	Anaconda Inc.	N/A	Sürüm 23.1. Paket ve ortam yöneticisi. URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	Sürüm 155. Yaygın germline varyantları veritabanı. URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	Sürüm 4.3.0.0. Genom Analiz Araç Takımı. URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	Sürüm 2.39. Sürüm kontrol sistemi. URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	Sürüm 3.1. Populasyon alel frekansları. URL: https://gnomad.broadinstitute.org
GTF açıklama dosyası	Ensembl	N/A	Sürüm 109. GRCh38 için gen açıklaması. URL: https://www.ensembl.org
İnsan referans genomu GRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	Sürüm 109. Referans genom montajı. URL: https://www.ensembl.org veya https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Linux iş istasyonu veya sunucusu	Çeşitli	N/A	Ubuntu 20.04. x86_64 mimarisine ihtiyaç duyulur. URL: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genom Tarayıcısı	N/A	Sürüm 2.5.1. Paralel BLAT yeniden hizalama. URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	Sürüm 2.20.8. NGS veri manipülasyonu. URL: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Yazılım Vakfı	N/A	Sürüm 3.9.19. Programlama dili. URL: https://www.python.org
R	R Vakfı	N/A	Sürüm 4.5.2. İstatistiksel hesaplama. URL: https://www.r-project.org
R paketi: forcats	CRAN	N/A	Sürüm 1.0.0. Faktör manipülasyonu. URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
R paketi: ggplot2	CRAN	N/A	Sürüm 4.0.1. Veri görselleştirme. URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
R paketi: ggrepel	CRAN	N/A	Sürüm 0.9.5. Metin etiketi itme. URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
R paketi: lme4	CRAN	N/A	Sürüm 1.1.35. Doğrusal karışık etkiler modelleri. URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
R paketi: readr	CRAN	N/A	Sürüm 2.1.5. Hızlı dosya okuma. URL: https://cran.r-project.org/package=readr
R paketi: stringr	CRAN	N/A	Sürüm 1.6.0. Dize manipülasyonu. URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
REDIportal referansı	Bologna Üniversitesi	N/A	Sürüm 2.0. A-to-I RNA düzenleme siteleri veritabanı. URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
RefGene açıklaması	UCSC Tablo Tarayıcısı	N/A	Sürüm 109. Gen yapısı açıklaması. URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtools projesi	N/A	Sürüm 1.21. BAM dosyası manipülasyonu. URL: https://github.com/samtools/samtools
STAR hizalayıcı	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	Sürüm 2.7.11b. RNA-seq hizalama. URL: https://github.com/alexdobin/STAR