Bu çalışmada, antijen tespit ve dijital PCR yöntemleri kullanılarak elde edilen 24 Helicobacter pylori (H. pylori) kültürlü bakteri süspansiyonunun tespit sonuçlarının karşılaştırılması yoluyla, H. pylori referans materyallerinin karakterizasyonu ve in vitro diyagnostik değerlendirmedeki önemlerini araştırmak amacıyla korelasyonlarını analiz ettik.
Araştırma makalesi
H. pylori Antijen Titresi ile Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kantifikasyonunun Korelasyonu: Kültürlenmiş, İnaktive İzolatların Analitik Değerlendirmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Helicobacter pylori (H. pylori) tanısının standartlaştırılması, heterojen saptama analizleri genelinde zorlu olmaya devam etmektedir. İmmünokromatografi, H. pylori-spesifik antijenleri saptar ancak yalnızca kalitatif sonuçlar verir ve spesifik olmayan bağlanma veya kompetitif inhibisyon yoluyla hedef dışı çözünür bakteriyel proteinlerin girişimine açıktır. Buna karşılık, dijital PCR (dPCR), hem canlı hem de canlı olmayan bakterileri tanımlayarak genomik DNA kopyalarının hassas şekilde nicelleştirilmesini sağlar. Bu çalışma, immünokromatografi kaynaklı uç nokta titrelerini (en yüksek saptanabilir iki katlı seri dilüsyona karşılık gelen ters değer olarak hesaplanan yarı-kantitatif değerler) dPCR ile nicelleştirilmiş nükleik asit kopya sayıları ile karşılaştırmıştır. Mikroaerofilik koşullar altında (85% N2, 10% CO2, 5% O2), %5 defibrine koyun kanı ile desteklenmiş Brucella agar üzerinde 37 °C'de 72 sa boyunca kültüre edilen yirmi dört H. pylori bakteriyel süspansiyonuna paralel olarak antijen testi ve dPCR ölçümü uygulanmıştır. İstatistiksel değerlendirme için Pearson korelasyonu ve doğrusal regresyon kullanılmıştır. Antijen titresi ile genomik kopya sayısı arasında anlamlı bir pozitif korelasyon gözlemlenmiştir (r = 0.536, n = 24, P = 0.007). Bununla birlikte, düşük belirleme katsayısı (R2 = 0.287), antijen titresinin dPCR ile ölçülen varyansın yalnızca %29'unu açıkladığını ve güçlü tek örneklem tahminlerini destekleyemeyeceğini göstererek sınırlı bir öngörü gücü ortaya koymuştur. Uyumsuz yüksek-dPCR/düşük-titre profilleri, canlı olmayan bakteriyel kalıntılardan veya serbest genomik DNA'dan kaynaklanabilir. Antijen tabanlı ve nükleik asit tabanlı analizler, biyolojik olarak ilişkili ancak birbirinin yerine geçemeyen analitleri nicelleştirir. Referans materyal geliştirme ve tanısal analiz validasyonu için koloni oluşturan birimler, antijen titreleri ve genom kopya sayılarını birleştiren çok parametreli karakterizasyon önerilmektedir. Bu çalışma, tanısal tutarsızlıkları gidermek için H. pylori-spesifik konsensüs kılavuzlarının gerekliliğini vurgulamaktadır.
Giriş
Helicobacter pylori (H. pylori), genellikle insan gastrointestinal sistemini, özellikle mide antrumunu kolonize eden mikroaerofilik, Gram-negatif bir basildir. Kronik gastrit, peptik ülserler ve mide kanserinin temel nedeni olarak kabul edilir1,2. İnsanlar arasında H. pylori iletimi temel olarak oral-oral veya fekal-oral yollarla gerçekleşir ve enfeksiyon oranları farklı bölgelerde değişkenlik göstermekle birlikte küresel olarak yaygındır. Gelişmiş ülkelerde enfeksiyon oranı yaklaşık %50 iken, bazı gelişmekte olan ülkelerde bu oran %80'e kadar çıkabilmektedir3. 1994 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO), H. pylori'yi mide kanseri için Grup 1 karsinojen olarak sınıflandırmıştır4. CagA (sitotoksinle ilişkili antijen A) ve VacA (vakuolize edici sitotoksin A) gibi temel virülans faktörleri, kronik inflamasyonu ve epitel hasarını tetikleyerek, bakterinin Grup 1 karsinojen olarak sınıflandırılmasının temelini oluşturan patojenik mekanizmalara katkıda bulunur. 2018 yılında, H. pylori enfeksiyonuna bağlı kanser vakaları sayısı 810.000'e ulaşarak; insan papilloma virüsü (HPV), hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsü (HCV) kaynaklı rahim ağzı ve karaciğer kanseri vakalarının toplam sayısını aşmıştır5. Bu istatistik, tedavi edilmediği takdirde bazı araştırmalara göre yaklaşık %1–3 olasılıkla mide kanserine yol açabilen H. pylori tarafından oluşturulan önemli kanser riskini vurgulamaktadır. H. pylori enfeksiyonunun dünya çapındaki yüksek yaygınlığı, sadece tespiti değil, miktar tayinindeki hassasiyeti de bir halk sağlığı önceliği haline getirmektedir; zira doğru bakteriyel yük değerlendirmesi tedavi kararlarına yön verebilir ve gereksiz veya başarısız eradikasyon tedavilerinin önlenmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, H. pylori'nin doğru şekilde tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi; epidemiyolojik araştırmalar, tedavi planlarının seçimi ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır.
... kaynaklanan önemli kanser yükü göz önüne alındığında H. pyloridoğru tespit ve kantifikasyon; epidemiyolojik sürveyans, tedavi seçimi ve terapötik izlem için kritik öneme sahiptir. Mevcut non-invaziv yöntemler arasında dışkı antijen testi (SAT), üre nefes testi ve moleküler assayler yer almaktadır. Dijital PCR (dPCR) yüksek hassasiyet ve absolut kantifikasyon sunsa da, klinik uygulamaları SAT ile karşılaştırıldığında daha yüksek maliyet, teknik karmaşıklık ve cihaz gereksinimleri nedeniyle kısıtlıdır. Bu farklılık, dPCR'ı kantitatif bir referans olarak kullanarak SAT standardizasyonunu geliştirme amacıyla, iki yöntem arasındaki korelasyonun incelenmesi gerekliliğinin nedenidir.
Gelişmekte olan bir mutlak kantifikasyon teknolojisi olan dijital PCR (dPCR), bir standart eğriye ihtiyaç duymadan hedef genlerin mutlak kopya sayısını doğrudan tespit edebilir. H. pylori araştırmalarında dPCR; gastrik mukoza, tükürük ve dışkı örneklerindeki bakteriyel kantifikasyon için kullanılmıştır6,7.
in vitro tanı reaktiflerinin geliştirilmesi, kalite değerlendirmesi ve regülasyonunda; referans materyallerin hazırlanması ve kalibrasyonu, sonuçların doğruluğunun, karşılaştırılabilirliğinin ve izlenebilirliğinin sağlanması için temeldir. Bakteriyel in vitro tanı reaktifleri için (örneğin H. pylori antijen/antikor tespit reaktifleri), referans materyallerin sıklıkla iyi tanımlanmış konsantrasyonlara veya aktivite birimlerine sahip suşlar veya klinik örnekler içermesi gerekir. Geleneksel bakteriyel sayım yöntemi, proliferasyon yeteneği olan canlı bakteri sayısını doğrudan yansıtan ve sıklıkla bakteriyel standart maddelerin değer belirlemesinde, reaktif hassasiyetinin değerlendirilmesinde ve metodolojik karşılaştırmalarda kullanılan Koloni Oluşturan Birim (CFU/mL) yöntemidir8. CFU hâlâ yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tespit süresi, materyal tüketimi ve iş gücü maliyetleri açısından belirgin sınırlamalara sahiptir9.
in vitro tanı teknolojilerinin daha yaygın kullanımıyla birlikte, dPCR gibi moleküler yöntemler artık patojenleri daha yüksek doğruluk ve hassasiyetle nicelleştirmektedir. Eş zamanlı olarak, antijen titrasyonu gibi immünolojik yöntemler klinik uygulamalarda giderek daha fazla yer bulmaktadır. Ancak, pratik operasyonlarda, toplanan klinik izolatların veya hazırlanan standart örneklerin çoğu inaktive edilmiş örnekler veya uzun süreli korunan örnekler olduğundan, canlı bakteri kültürü yapılması ve CFU sayımı gerçekleştirilmesi zor veya imkansız hale gelmektedir10. Referans materyaller hazırlanırken, biyogüvenlik gereksinimlerini karşılamak ve materyallerin uzun süreli stabilitesini sağlamak için inaktivasyon işlemi uygulanmalıdır. Bu nedenle, antijenlere veya nükleik asitlere dayalı nicel yöntemler, değer belirleme için temel araçlar haline gelmektedir8,11.
Bu durum, bu iki farklı kantitatif yaklaşımın korelasyonu ve eşdeğerliği ile ilgili pratik bir soruyu gündeme getirmektedir: Standart maddeleri değerlendirmek için antijen saptama ve dPCR kullanıldığında, bu iki yöntemin sonuçları arasında kararlı ve ölçülebilir bir ilişki var mıdır? Sınırlı sayıda inaktive edilmiş H. pylori örneği kullanılarak yapılan ön deneyler, immünokromatografik analizlerin sinyal yoğunluğu ile dPCR aracılığıyla belirlenen DNA kopya sayıları arasında tutarlı bir pozitif korelasyon olduğunu göstermiştir. İnative edilmiş bakteriyel örneklerde, immünokromatografik analizlerle ölçülen H. pylori antijen titresi ile dPCR ile belirlenen DNA kopya sayıları arasında anlamlı ve tutarlı bir pozitif korelasyon olduğu hipotezini kurduk. Böyle bir korelasyonun varlığı, antijen tabanlı kalitatif sonuçların kantitatif nükleik asit eşdeğerlerine dönüştürülmesine olanak tanıyacaktır. Bu durum; reaktiflerin performans değerlendirmesi, standartların oluşturulması, referans materyallerin atanması ve geleneksel kültürün mümkün olmadığı durumlarda klinik test sonuçlarının yorumlanması için önemli bir temel sağlayacaktır.
Günümüzde, H. pylori antijen sonuçları ile nükleik asit içeriği arasındaki ilişkiye dair araştırmalar yetersizdir ve inceleme, düzenleme ile standardizasyon çalışmalarını destekleyecek sistematik veri eksikliği bulunmaktadır. Bu hipotezi test etmek amacıyla, bu çalışmada H. pylori'nin 24 kültürlenmiş bakteri süspansiyonu üzerinde paralel testler yürütülmüş; kolloidal immünokromatografik yöntemle saptanan antijen titresi ile dPCR'ın mutlak kantitatif sonucu arasındaki korelasyon sistematik olarak analiz edilmiştir. Bulgularımıza dayanarak, H. pylori tespit reaktiflerinin performans değerlendirmesi ve standart materyal değerlerinin atanması konusunda referans görüşler sunmuşuzdur.
Protokol
Bu çalışmaya dahil edilen tüm Helicobacter pylori izolatları, başlangıçta Zhengzhou Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi tarafından insan gastrik biyopsi ve dışkı örneklerinden izole edilmiş olup; söz konusu hastane, in vitro deneylerimiz için tamamenle işlenmiş ve anonimleştirilmiş bakteriyel süspansiyonlar sağlamıştır. Tüm orijinal prosedürler (klinik örnek toplama, bakteriyel izolasyon ve ilk kriyoprezervasyon), Zhengzhou Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Etik Onay Numarası: KY2026080). Örnek toplama öncesinde tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alınmış ve tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu ile ilgili ulusal biyomedikal araştırma etik kılavuzlarına kesinlikle uygun olarak yürütülmüştür. Hasta kimliğini belirleyici tüm bilgiler, örnek transferinden önce kaynak hastane tarafından kalıcı olarak kaldırılmış olup; bu çalışmada bildirilen deneysel materyallerden veya sonuçlardan herhangi bir bireysel hasta kimliği çıkarılamaz.
Mevcut çalışma için ek bir bağımsız etik onay veya bilgilendirilmiş onam gerekmemektedir. Tüm deneyler, orijinal insan örneklerine, hasta klinik kayıtlarına veya özel kişisel bilgilere erişim olmaksızın, anonimleştirilmiş bakteri süspansiyonları kullanılarak gerçekleştirilen in vitro analizleri kapsamaktadır. Ulusal biyomedikal araştırma etiği yönetmelikleri uyarınca, tamamen anonimleştirilmiş mikrobiyal izolatların kullanıldığı girişimsel olmayan in vitro araştırmalar etik muafiyet kriterlerini karşılamaktadır. Zhengzhou Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi'nden alınan orijinal etik onay, bu anonimleştirilmiş suşların tüm meşru ikincil akademik uygulamalarını zaten kapsamakta olup, bu durum kurumsal etik komite tarafından resmi olarak onaylanmıştır.
Tüm H. pylori in vitro deneyleri, kurumsal standart çalışma prosedürleri izlenerek ve tüm biyogüvenlik inceleme ve yetkilendirme gereklilikleri karşılanarak, geçerli biyogüvenlik sertifikasına sahip laboratuvarlarda (Biyogüvenlik Düzeyi 2, BSL-2, Pekin Dongcheng Bölgesi Sağlık Komisyonu Laboratuvar Biyogüvenlik Kaydı [2020] No. 059) gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için alınan biyogüvenlik onayı, tamamen inaktive edilmemiş materyallerle (yani, canlılık PCR'ı ile karakterize edilen kalıntı canlı organizmalar içeren materyallerle) yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere, ısı ile inaktive edilmiş H. pylori materyallerini içeren tüm prosedürleri kapsamaktadır. Çalışma boyunca standart mikrobiyolojik uygulamalara, kişisel koruyucu donanım (KKD) gerekliliklerine ve atık dekontaminasyon prosedürlerine kesinlikle uyulmuştur. Tüm bakteri örnekleri, biyotehlikeli atık yönetimine ilişkin kurumsal kılavuzlar uyarınca bertaraf edilmeden önce uygun şekilde inaktive edilmiştir. Kullanılan tüm reaktiflerin, ekipmanların ve istatistiksel analiz için kullanılan yazılımların detayları Materyaller Tablosunda listelenmiştir.
Suş ve kültür
DİKKAT: H. pylori Risk Grubu 2 düzeyinde bir insan patojenidir. Canlı kültürlerle yapılan tüm işlemler (inokülasyon, inkübasyon ve süspansiyon hazırlama), laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması kullanılarak BSL-2 tesisleri içindeki sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
56 °C'de 25 dk boyunca uygulanan ısı inaktivasyonu, canlı organizmaları önemli ölçüde azaltır ancak tamamen yok etmez (bkz. bölüm 1); kısmen inaktive edilmiş süspansiyonlar BSL-2 koşulları altında işlenmeye devam edilmelidir. Tüm biyolojik atıklar ve kontamine sarf malzemeleri, bertaraf edilmeden önce otoklavlanmalı (121 °C, ≥30 dk) veya kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak dezenfekte edilmelidir. Burada açıklanan BSL-2 çalışması, aynı biyogüvenlik dosyası kapsamında yetkilendirilmiştir (Beijing Dongcheng District Health Commission Laboratory Biosafety Filing [2020] No. 059).
Bu çalışmada kullanılan Helicobacter pylori suşları, başlangıçta Zhengzhou Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi tarafından insan mide biyopsisi ve fekal örneklerinden elde edilen ve ardından bakteriyel süspansiyon formunda Pekin, Çin'deki Ulusal İlaç Kontrol Enstitüleri (NIDC) Bulaşıcı Hastalıklar In Vitro Tanı Bölümü suş koleksiyonuna aktarılan 24 kültürlenmiş bakteriyel süspansiyondur ve bu çalışmadaki tüm deneysel çalışmalar NIDC'de (Pekin, Çin) gerçekleştirilmiştir. Bu suşlar, %5 defibrine koyun kanı ile desteklenmiş Brucella besiyeri plaklarına inoküle edilmiş ve mikroaerofilik koşullar altında (85% N₂, 10% CO₂, 5% O₂) 37 °C'de 72 h boyunca kültürlenmiştir. Bu kültür süresi, her suşun antijen ekspresyonunun nispeten stabil olduğu stasyoner büyüme fazına karşılık gelmektedir. Ardından bakteriyel süspansiyonlar toplanmıştır.
Isı ile inaktivasyon, dijital bir benmari kullanılarak 56 °C'de 25 dk boyunca gerçekleştirilmiştir. Bu işlem, biyogüvenlik gerekliliklerini karşılamak ve referans materyallerin uzun süreli stabilitesini sağlamak amacıyla uygulanmıştır. 56 °C'de 25 dk süren ısı ile inaktivasyon, bakteriyel canlılığı önemli ölçüde azaltır ancak tüm canlı organizmaları tamamen ortadan kaldırmaz; bu durum, 24 kültürlenmiş bakteriyel süspansiyonda medyan kalıntı canlı fraksiyonunun %4,6 (aralık %0,00–%33,00) olarak ölçüldüğü ardışık canlılık PCR analizi ile doğrulanmıştır (bkz. Sonuçlar bölüm 6 ve Tartışma). Bu çalışma için alınan biyogüvenlik onayı, tamamen inaktive edilmemiş materyallerle yapılan çalışmaları kapsamaktadır (bkz. Etik ve Biyogüvenlik Beyanı). Isıl işlemin çoğu H. pylori yüzey antijeninin denatürasyon eşiğinin altında olması nedeniyle, ısı ile inaktivasyonun antijen tespiti üzerindeki potansiyel etkisinin minimal olduğu değerlendirilmektedir; ancak bu işlem, bazı ısıya duyarlı protein antijenlerinin bütünlüğünü etkileyebilir. DNA kantifikasyonu için ısı ile inaktivasyon, genomik DNA'yı degrade etmez ve hücre membranlarını parçalayarak ekstraksiyon verimliliğini aslında artırabilir.
Antijen tespiti
Antijen tespit örneklerini hazırlamak için toplanan 24 bakteriyel süspansiyon PBS ile 100 kat seyreltilmiştir. 100 katlık başlangıç seyreltmesi, antijen konsantrasyonunu ticari kitlerin lineer tespit aralığına ayarlar ve matriks girişimini minimize ederek güvenilir ve doğru tespit sonuçları sağlar. Seyreltme işlemi aynı zamanda örnek hacmini korur. Bu örnekler; kolloidal altın yöntemi, lateks yöntemi ve immünokromatografik yöntem dahil olmak üzere kayıtlı sekiz H. pylori antijen tespit kiti (Tablo 1) kullanılarak test edilmiştir. Sonuç pozitif olduğunda, seyreltilmiş örnek seri olarak seyreltilmiş (1:2, 1:4, 1:8, vb.) ve sonuç negatif çıkana kadar test edilmiştir. Pozitif kalan en yüksek seyreltme oranı kaydedilmiş ve "antijenin nihai pozitif seyreltme oranı" (örneğin, 1:64) olarak tanımlanmıştır. İki katlı seri seyreltmeler fosfat tamponlu salin (PBS, 0.01 M, pH 7.2–7.4) içinde hazırlanmıştır. Örnek uygulamasının ardından, her şerit okumadan önce oda sıcaklığında 15–20 dk inkübe edilmiştir; sonuç, eğitimli bir operatör tarafından kontrol çizgisine karşı görsel olarak okunmuş ve bitiş noktası, görünür bir test çizgisi gösteren en yüksek seyreltme olarak kaydedilmiştir. Kolloidal altın şeritler görsel olarak okunduğundan, kesme değeri (cut-off) operatöre bağlıdır.
Birden fazla ticari antijen tespit kiti kullanılarak test edilen her örnek için uç nokta titresi, tüm bireysel kit titrelerinin medyanı olarak tanımlanır. Bu çalışmadaki sekiz kit heterojen hedef antijenler ve tespit prensipleriyle tasarlandığından, Cohen's Kappa veya CV% değerleri kitler arasındaki tutarlılığı nicelleştirmek için kullanılmamıştır; çünkü bu göstergeler ortak bir referans standardın varlığını varsayar. Bu nedenle, kitler arasında gözlemlenen değişkenlik, ölçüm hatalarından ziyade gerçek biyolojik ve analitik heterojenliği yansıtmaktadır. Merkezi eğilimin sağlam bir ölçüsü olan medyan, kite özgü sapmalara karşı etkili bir direnç gösterebilir. 24 örnek genelinde, en yüksek ve en düşük kit titreleri arasındaki örnek içi yayılım 2 kat ile 16 kat arasında değişmiştir (medyan, 4 kat): altı örnekte kitler arası fark 2 kat, on dördünde 4 kat, üçünde 8 kat ve birinde 16 kat olarak belirlenmiştir. Her örnek için kit başına minimum, medyan ve maksimum titreler Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
Dijital PCR kantitatif tespiti
Toplanan 24 bakteriyel süspansiyon, PBS ile 500 kat dilüsyona tabi tutulmuş ve ardından dPCR kantitatif tespiti için örnek olarak kullanılmıştır. Bu dilüe edilmiş örneklerin mutlak kantifikasyonu, dört dPCR laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir (Tablo 2). dPCR, korunmuş H. pylori genomik dizilerini hedefleyen platforma özgü tescilli primer ve prob setleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan dPCR tespit kitleri, birden fazla patojene ve birden fazla hedefe uygulanabilen evrensel reaktif kitleridir. Her platform, kendi temel fikri mülkiyeti olan spesifik primer/prob dizilerini ve hedef gen bölgelerini bağımsız olarak tasarlamış ve optimize etmiştir. Bu diziler son kullanıcılara açıklanmamıştır. Bize sadece H. pylori için spesifik tespit hedefinin, spesifik tespite uygun olduğu doğrulanmış korunmuş bir genomik bölge olduğu bildirilmiştir. 24 Helicobacter pylori suşunun 23S rRNA gen dizileri, PRJNA1520048 BioProject erişim numarası ile NCBI GenBank'a sunulmuştur. Bu diziler suş kimlik doğrulaması için sunulmuş olup dPCR kantifikasyon hedefi değildir. Primer/prob tasarımı, amplifikasyon kimyası ve Poisson tabanlı partisyon sayımı her platformun tescilli mülkiyeti olduğundan, bu adımlar platforma bağlıdır ve üretici erişimi olmadan tekrarlanamaz; buna karşılık, yukarıda açıklanan örnek dilüsyonu, ekstraksiyon replikasyonu ve veri agregasyon prosedürleri platformdan bağımsızdır ve tam olarak belirtilmiştir. Mutlak kopya sayıları, cihazın tescilli analiz yazılımında uygulanan Poisson dağılım algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Spesifik hesaplama parametreleri ve kaynak kodu üreticiye aittir ve son kullanıcılara açıklanmamıştır. Son olarak, orijinal çözeltideki hedef genin mutlak kopya sayısı (kopya/mL), Poisson dağılımı ve dilüsyon faktörü temel alınarak hesaplanmıştır.
Dört bağımsız dPCR laboratuvarı (Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., Ustar Biotechnologies Ltd. ve TargetingOne), her biri kendi cihaz platformu için optimize edilmiş tescilli ekstraksiyon kitlerini ve dPCR reaktiflerini kullanarak ve tamamı korunan H. pylori genomik sekanslarını hedefleyerek bu çalışmaya katılmıştır. Her platform, seyreltilmemiş bakteriyel süspansiyonu almış ve örnekleri kendi protokolüne göre hazırlamıştır: Ustar seyreltilmemiş süspansiyonu doğrudan kullanırken; Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. ve TargetingOne, ekstraksiyondan önce süspansiyonu PBS içinde 500 kat seyreltmiştir. Her platformda her izolat için, aynı 500 kat seyreltilmiş bakteriyel süspansiyondan iki bağımsız nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirilmiş ve her ekstrakt üç tekrar şeklinde test edilerek platform başına izolat başına altı ölçüm elde edilmiştir (Ustar'da bir ekstraksiyonun yalnızca iki geçerli tekrar vermesi istisnadır). Pozitif damlacıkların cihazın alt saptama sınırının altına düşmesi veya şablon içermeyen kontrolün spesifik olmayan amplifikasyon göstermesi durumunda reaksiyon geçersiz olarak sınıflandırılmış ve hariç tutulmuştur; geçersiz reaksiyonlar bir kez tekrarlanmış, başarısızlığın devam etmesi durumunda ise tüm ekstraksiyon hariç tutulmuştur. Platforma özgü ham veriler Ek Tablo 1'de sunulmuştur.
Veri toplama iki aşamalı bir prosedür izlemiştir: ilk olarak, her bir platformdaki tüm geçerli ham ölçümler (kopya/µL) ortalaması alınmış ve platforma özgü dönüştürme formülleri kullanılarak orijinal seyreltilmemiş bakteri süspansiyon konsantrasyonuna (kopya/mL) dönüştürülmüştür; ikinci olarak, her izolat için dört platformdan elde edilen konsantrasyonların ortalaması (aritmetik ortalama) alınarak nihai tek kopya sayısı değeri elde edilmiştir. Bu çerçeve, platform içi replika varyasyonlarından bağımsız olarak platformların eşit katkı sağlamasını garanti ederken, bireysel cihazlara veya reaktif sistemlerine özgü sistematik hataları azaltmaktadır.
Kültürlenen her bakteri süspansiyonu dört dPCR platformunda paralel olarak sayıldı ve laboratuvarlar arası değişkenliği değerlendirmek amacıyla her izolat için platformlar arasındaki log₁₀-dönüştürülmüş kopya sayılarının varyasyon katsayısı (CV) hesaplandı. İlgili sonuçlar Sonuçlar bölümünde raporlanmıştır.
İstatistiksel analiz
H. pylori antijen titresi, pozitif sonucun gözlemlendiği en yüksek numune dilüsyon faktörünün tersi olarak tanımlanmıştır (örneğin, 1:64'lük bir dilüsyon 64'lük bir titreye karşılık gelir). Sonraki korelasyon analizleri için izolat başına tek bir temsilci değer elde etmek amacıyla; her izolat için kitle özgü sekiz antijen titresinin medyanı alınmış ve platform özgü dört dPCR konsantrasyonunun aritmetik ortalaması hesaplanmıştır. Bu veri azaltma stratejisi metodolojik olarak şu nedenlerle gerekçelendirilmiştir: (i) sekiz antijen kiti, benzer immünolojik analiz ilkelerini kullanarak aynı analiti saptamaktadır ve medyan, rastgele uç değer okumalarına karşı dirençli, sağlam bir tahmin edici sağlar; (ii) dört dPCR platformunun her biri korunmuş bir H. pylori genomik lokusunu nicellendirir ve log-normal dağılımlı konsantrasyon tahminlerinin aritmetik ortalaması, yanlı olmayan bir merkezi eğilim sunar; ve (iii) bu birleştirme işlemi, kitler arası veya platformlar arası analitik performansı değerlendirmekten ziyade, çalışmanın temel amacı olan izolat düzeyinde antijen titresi tabanlı ve DNA tabanlı nicellendirme modaliteleri arasındaki uyumu değerlendirmekle örtüşmektedir. Antijen titresi ile dPCR nicellendirmesi (kopya/mL) arasındaki korelasyon öncelikle Pearson korelasyon analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. Her iki değişken log dönüşümünden sonra yaklaşık olarak normal dağılım göstermektedir (çarpıklık: log10 dPCR = −0.66; log2 antijen titresi = −0.60; regresyon kalıntısı çarpıklığı = −0.16) ve bu durum Pearson korelasyonu varsayımlarını karşılamaktadır. İki katlı seri dilüsyonun doğrusallaştırılmasını yansıtmak için antijen titresi log2-transforme edilmiş; dPCR sonuçları ise bakteriyel yük standardının raporlama formatına uygun olarak log10-transforme edilmiştir. Ardından, doğrusal ilişkiyi değerlendirmek için log2-transforme edilmiş antijen titresi ve log10-transforme edilmiş dPCR sonuçları kullanılarak Pearson korelasyon ve doğrusal regresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. Tüm analizler için 0.05 anlamlılık düzeyi (α) uygulanmış ve P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Tüm istatistiksel analizler SPSSPRO çevrimiçi istatistiksel analiz platformu kullanılarak yürütülmüştür.
Sonuçlar
Karşılaştırma of H. pylori antijen titre ve dPCR mutlak miktar belirleme sonuçları
Toplam 24 bakteri süspansiyonunun tamamında antijen titreleri 8 ile 256 arasında değişti ve ortanca değer 32 idi (Tablo 1). dPCR kantifikasyon sonuçları 2,67'den itibaren değişti × 107 kopya/mL'den 2,04'e × 109 kopya/mL, medyan log₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 kopya/mL) (Tablo 2). Ham verilerdeki ilişki doğrusal olmayan özellikler gösterdi ve bu durum, antijen titreleri ile dPCR kantifikasyon değerlerine uygulanan logaritmik dönüşümleri haklılaştıran bir kuvvet yasası ya da üstel ilişkiyi düşündürdü.
Logaritmik dönüşümlü antijen titreleri ile dPCR nicel sonuçları arasında doğrusal ilişki
İki tespit yönteminin sonuçları arasında anlamlı bir korelasyon olup olmadığını test etmek için logaritmik dönüşüm uyguladık ve her iki değişkenin log dönüşümünden sonra yaklaşık olarak normal dağıldığını göz önünde bulundurarak Pearson korelasyon analizi gerçekleştirdik. Gösterildiği gibi Şekil 1, transformasyonun ardından, antijen titreleri (log2 dönüşümlü) ile dPCR'nin mutlak kantitatif sonucu (log10 dönüşümlü) arasında önemli düzeyde orta şiddette pozitif doğrusal bir korelasyon gözlemlendi (r = 0.536, n = 24, P = 0.007).
Antijen titre ile dPCR kopya sayısı arasındaki ilişkinin nicel modellenmesi
İki tespit yöntemi arasındaki ilişkiyi nicel olarak belirlemek ve karşılıklı tahmin potansiyelini değerlendirmek amacıyla, gelecekte antijen titrelerinden bakteriyel yükü tahmin etmek üzere regresyon modelini kullanabilmek için logaritmik dönüşüm uygulanmış verilere doğrusal regresyon analizi uygulandı. Analiz, logaritma2 (antijen titreşimi) ve log10 (dPCR), denklemi verir: log10(dPCR) = 0.1588 × log2(titer) + 7,7988 (R2 = 0,287). Regresyon katsayıları (standart hatalar ve %95 güven aralıkları ile birlikte) şöyledir: eğim 0,1588 ± 0,053 (%%95 GA 0,048–0,270) ve kesim noktası 7,7988 ± 0,292 (%%95 GA 7,193–8,404); artıkların standart hatası log 0,318 idi10 birimler ve genel regresyon anlamlıydı (F(1,22) = 8,84, P = 0,007). Bu, antijen titreteki her iki kat artış için dPCR kopya sayısının sadece 1,441 kat arttığını gösterir (100.1588). Ancak, belirli bir antijen titre değeri için dPCR sonuçlarının %95'lik tahmin aralığı neredeyse iki kat büyüklük mertebesini kapsayabilir (örneğin, 1:32 lik bir titrede, tahmin aralığı yaklaşık 8,3'tür × 107 1,85'e × 109kopya/mL). Bu, pratik uygulamalarda antijen titreinin tek bir örnekteki nükleik asit kopya sayısını kesin olarak tahmin edemeyeceğini gösterir; ancak bu model, bireysel örnek tahmini açısından sınırlı olsa da (açıklayıcı gücün orta düzeyde olması nedeniyle, R2 = 0.287).
dPCR kantifikasyonunun platformlar arası değişkenliği ve korelasyonun duyarlılık analizi
Laboratuvarlar arası değişkenlik log'da değerlendirildi10-transforme edilmiş konsantrasyonlar, mikrobiyal kantifikasyon verilerinin log-normal dağılımını dikkate almak için kullanıldı. Dört platformdan elde edilen log değerlerine göre CV%10 konsantrasyonlar 24 izolat boyunca %0,9 ile %8,3 arasında değişti (medyan %1,8, ortalama %2,5). Bir aykırı değer (Hp06, CV = %8,3) gösterdi >30 kat fark, Sniper (5,93 × 108 kopya/mL) ve TargetingOne (1,50 × 107 kopya/mL); bu izolatın dışındaki varyasyon katsayıları (VK) %0,9 ile %6,4 arasında değişti. Gözlenen antijen üzerinde bu aykırı değerin etkili olmadığından emin olmak için–dPCR korelasyonu, Hp06'yı dışlayan bir duyarlılık analizi yapılarak r = 0.479, R elde edildi2 = 0,230 ve P = 0,021 (n = 23) — tüm 24 izolatı içeren birincil analize kıyasla karşılaştırılabilir — bunun, başlıkta belirtilen korelasyonun bu izolata bağlı olmadığını doğrulamaktadır. Bu dağılım, rastgele ölçüm hatası yerine, ekstraksiyon verimliliği, reaktif duyarlılığı ve enstrüman kalibrasyonu açısından platformlar arası sistematik farklılıklardan kaynaklanmaktadır ve platforma özgü yanlılığı azaltmak için çapraz platform ortalaması alınmasını desteklemektedir.
İkili yöntem eşikleri kullanarak sonuçların tanımlanması ve sınıflandırılması
Yukarıdaki analizler ve keşfedici, veri kümesine özgü kriterlere dayanarak, bu çalışma antijen titresi verilerinin normal olmayan dağılımı nedeniyle antijen tespitinin ortanca değerini 1:32 olarak yüksek antijen tespiti eşik değeri olarak belirledi ve gerçek ortanca log değerini seçti₁₀(dPCR) = 8,61 (≈4.09 × 108 kopya/mL) yüksek nükleik asit içeriği için eşik değer olarak belirlenmiştir. Bu eşik değerler, kültüre alınmış izolat verilerinden türetilen, veri kümesine özgü keşfedici kesme noktalarıdır ve doğrulanmış klinik tanı kriterlerini temsil etmez. Bu nedenle, bu kesme noktalarının diğer örnek koleksiyonlarına veya analitik bağlamlara uygulanması, doğrudan aktarım yerine ilgili verilerden yeniden türetilmesini gerektirir.
Araştırma eşiği değerlerini kullanarak (antijen titreşimi ≥ 1:32 kadar yüksek, ≤ 1:16 düşük; dPCR log₁₀ ≥ 8.61 yüksek nükleik asit yükü), 24 kültür bakteriyel süspansiyonun dört çeyrek sınıflandırılması (Şekil 2, Tablo 3) şu şekildedir: 9 örnek (Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25) yüksek antijen grubuna girer–yüksek nükleik asit kategorisi (%%37,5); 3 örnek (Hp09, Hp26, Hp27) düşük antijen olarak sınıflandırılır–yüksek nükleik asit (%%12,5); 8 örnek (Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) yüksek antijen sergiler–düşük nükleik asit (%%33,3); ve 4 örnek (Hp06, Hp07, Hp12, Hp20) düşük antijen grubuna aittir–düşük nükleik asit kategorisi (%%16,7). 24 izolat, ortalama 4 örnekten oluşan altı titr grubuna ayrıldığından, resmi gruplar arası karşılaştırmalar (örneğin Kruskal-Wallis testi) yeterli istatistiksel güce sahip olmayacaktır; bu nedenle titr grupları boyunca dPCR nicel sonuçlarının yalnızca tanımlayıcı özetleri rapor edilmiştir.
Isı ile inaktivasyondan sonra kalan canlı fraksiyon (canlılık PCR'sı)
Isı ile inaktivasyon sonrası kalan canlı bakterileri nicel olarak belirlemek için tüm 24 izolat için bir canlılık PCR reaktif sistemi kullanıldı. Kısa olarak, her bir ısı ile inaktive edilmiş süspansiyon (200 µL) µL), membran geçirmez Canlılık PCR Reaktifi (10 µM son konsantrasyonu) 37 °C'de 75 dakika boyunca, paralel olarak reaktif içermeyen kontrol ile birlikte (−VR) aynı şekilde işlendi. Daha sonra, Canlılık PCR Nötralizasyon Tamponu (20 µL, 10×) ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyon yapıldı. Genomik DNA, +VR ve −VR alikotları alındı ve her ekstrakt üzerinde dPCR gerçekleştirildi; canlı fraksiyon, +VR'nin −VR kopya sayıları × %100. Ortanca canlı fraksiyonu %4,6 (aralık %0,00)–%33,00; izolat bazında tam sonuçlar Ek Tablo 2). Canlılık yüzdesi, antijen titreleriyle önemli ölçüde korele değildi (r = 0,03, P = 0,90) veya dPCR kopya sayısı ile (r = 0,37, P = 0.08).
VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
24 adet 23S rRNA geni dizileri Helicobacter pylori suşlar NCBI GenBank'ta BioProject erişim numarası PRJNA1520048 altında depolanmıştır. Bu diziler yalnızca suş kimlik doğrulaması için kullanılmıştır ve Protokol'de açıklandığı gibi üreticinin ticari olarak korumalı olan korunmuş genomik bölgesini temsil etmez, bu bölge dPCR kantifikasyon hedefini oluşturur.
Sekiz ticari kolloidal altın immünokromatografik kitinden elde edilen ham kit özel antijen titreleri ve dört dijital PCR cihazından elde edilen platform özel dPCR nicel değerleri, ticari hassasiyet, üretici gizlilik sözleşmeleri ve CE işaretli/Ulusal Tıbbi Ürünler İdaresi onaylı ürünlerle ilişkili düzenleyici kısıtlamalar nedeniyle kamuya açık bir depositorye gönderilemez. in vitro tanı ürünleri
Ek sınırlı veriler, ilgili gizlilik ve düzenleyici kısıtlamalara tabi olmak kaydıyla, gerektiğinde gizli olarak temin edilebilir.
Şekil 1: Korelasyon arasında Helicobacter pylori antijen titre ve dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kantifikasyonu 24 kültürde bakteriyel süspansiyon (n = 24) için antijen titreleri ile DNA kopya sayıları arasındaki ilişkiyi göstermek amacıyla bir regresyon doğrusu içeren dağılım grafiği sunulmuştur. Antijen titreleri, görsel okumalı kolloidal altın immünokromatografik analiz ile belirlenmiştir. Her örnek için seri dilüsyonlar incelenmiş ve titre, pozitif sonuç veren en yüksek seyreltme faktörü olarak ifade edilmiştir (x ekseni üzerinde log olarak gösterilmiştir)2dönüştürülmüş, boyutsuz değerler). DNA kopya sayıları dPCR ile nicelendirildi ve y ekseni üzerinde log olarak sunuldu10-log dönüşümü uygulanmış konsantrasyonlar (log10 kopya/mL). Her nokta, bireysel bir bakteri süspansiyon örneğini temsil eder. Mavi dolu çizgi, doğrusal regresyon uyumunu gösterir. Regresyon çizgisi etrafındaki gölgeli bant, uydurulmuş ortalama yanıtın %95 güven aralığını ifade eder. Kesikli dikey ve yatay çizgiler, keşfedici sınıflandırma eşiklerini gösterir (log₂ titre = 5, yani 1:32; log₁₀ dPCR = 8,61, yani 4,09 × 108 kopya/mL) Şekil 2 ve Tablo 3'te kullanıldı. Korelasyon, Pearson korelasyon katsayısı kullanılarak değerlendirildi ve r = 0.536 sonucu elde edildi, P = 0,007, R2 = 0,287, bu iki yöntem arasında istatistiksel olarak anlamlı pozitif bir korelasyon olduğunu gösterir. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Analitik sınıflandırma çerçevesi için H. pylori antijen testi sonuçlarını dPCR kantifikasyonuyla birleştirme testi. Bu şekil, immünokromatografik antijen titreleri ile dPCR nicel sonuçları arasındaki uyum temel alınarak 24 kültürlenmiş bakteriyel süspansiyonun (n = 24) dört çeyrek sınıflandırmasını göstermektedir. Keşfedici, veri kümesine özgü eşik değerler kullanılarak (antijen titeri ≥ 1:32 kadar yüksek, ≤ 1:16 düşük; dPCR log₁₀ ≥ yüksek nükleik asit yükü), örnekler: yüksek antijen–yüksek nükleik asit (n = 9, %37,5), yüksek antijen–düşük nükleik asit (n = 8, %33,3), düşük antijen–yüksek nükleik asit (n = 3, %12,5) ve düşük antijen–düşük nükleik asit (n = 4, %16,7). Bu eşik değerler, kültürle elde edilen izolat verilerinden türetilmiş keşfedici kesim noktalarıdır ve doğrulanmış klinik tanı kriterlerini temsil etmez. Sınıflandırma çerçevesi, immünolojik ve moleküler tespit yöntemleri arasındaki uyumu ve uyuşmazlığı gösterir. Uyuşmazlık içeren kategoriler, antijen stabilitesi, bakteriyel canlılık veya DNA kopya sayısı değişkenliği gibi faktörleri yansıtıyor olabilir. Bu çerçeve, analitik karşılaştırma amacıyla tasarlanmıştır ve klinik tanı veya tedavi önerileri oluşturmaz. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
| Hayır. | Tespit reaktifi | Üretici |
| 1 | Helicobacter pylori antijen tespit kiti (kolloidal altın yöntemi) | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | Gastrik Helicobacter pylori (HP) Antijen Tespit Kiti (Kolloidal Altın Yöntemi) | Shanghai Chemtron BIOTECH Co., Ltd |
| 3 | Helicobacter pylori antijen tespit kiti (kolloidal altın yöntemi) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd |
| 4 | Helicobacter pylori antijen tespit kiti (kolloidal altın yöntemi) | Hangzhou Genesis Biodetecton & Biocontrol Ltd |
| 5 | Helicobacter pylori antijen tespit kiti (kolloidal altın yöntemi) | JIANGSU COWIN BIOTECH CO., LTD |
| 6 | Helicobacter pylori antijen tespit reaktifi (lateks yöntemi) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co. Ltd |
| 7 | Helicobacter pylori (HP) antijen tespit reaktifi (immunokromatografik yöntem) | GUANGZHOU WONDFO BIOTECH CO., LTD |
| 8 | Helicobacter pylori antijen tespit kiti (kolloidal altın yöntemi) | Beijing Core Technology Co., Ltd |
Tablo 1: Liste Helicobacter pylori Antijen Tespit Reaktifleri ve Üreticileri Tablo, tespit için sekiz adet ticari olarak temin edilebilen immünokromatografik testi listeler H. pylori antijen, bu çalışmada değerlendirilen. Her bir ürün için, üretici tarafından verilen No., tespit reagentinin ticari adı ve üretici'adları sunulmuştur. Bu kitler, klinik tanı ve nokta-atımı testlerinde yaygın olarak kullanılması temel alındığından seçilmiştir. Tüm bilgiler üreticilerden alınmıştır' ürün bilgi formları ve resmi web siteleri (Mart 2026'da erişildi). Bu reaktiflerin eklenmesi bir onay anlamına gelmez; mevcut testlerin çeşitliliğinin temsilcisidir.
| Hayır. | Cihaz modeli | Dijital PCR Platformları |
| 1 | DQ24 | Sniper |
| 2 | Bio Rad QX200 Damla Dijital PCR | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd |
| 3 | DQ24 Pro | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd |
| 4 | TD-1 Dijital PCR Sistemi | HedeflemeBir |
Tablo 2: Dijital PCR (dPCR) Platformları ve Cihaz Modelleri Listesi. Bu tablo, dPCR sistemleriyle donatılmış dört laboratuvar platformunu ve testlerde kullanılan ilgili cihaz modellerini sıralar. Bu platformlar, teknolojik çeşitlilikleri ve dPCR'nin mevcut uygulamalarını temsil etmeleri dikkate alınarak seçilmiştir. Tüm bilgiler ilgili her bir platform tarafından sağlanmıştır. Bu platformların dahil edilmesi, bir onay ya da tavsiye anlamına gelmez; bunlar sadece mevcut dPCR sistemlerinin kapsamını temsil eder.
| Tür | Vaka sayısı | Oran | Örnek numarası |
| Yüksek antijen - Yüksek nükleik asit | 9 | 37.5% | Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25 |
| Düşük antijen - Yüksek nükleik asit | 3 | 12.5% | Hp09, Hp26, Hp27 |
| Düşük antijen - Düşük nükleik asit | 4 | 16.7% | Hp06, Hp07, Hp12, Hp20 |
| Yüksek antijen - Düşük nükleik asit | 8 | 33.3% | Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17 |
Tablo 3: Bu Çalışmada Antijen Testi ve Nükleik Asit Testi Sonuçlarının Sınıflandırılması ve Oranları. Bu tablo, antijen titrelerini (immunokromatografik analiz ile belirlenmiş, pozitif sonuç veren en yüksek seyreltme faktörü olarak ifade edilen) ve mutlak kantitatif dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) sonuçlarını (log olarak ifade edilen) karşılaştırarak 24 adet kültür ortamında üretilmiş bakteriyel süspansiyonu sınıflandırır.₁₀ kopya/mL). 1:32 (yüksek ≥ 1:32, düşük ≤ 1:16) ve dPCR kantifikasyon eşiği 4,09 × 108 kopya/mL (log₁₀ = 8,61), deneysel, veri kümesine özgü eşikler olarak kabul edilerek, izolatlar dört alt gruba ayrıldı: Yüksek Antijen-Yüksek Nükleik Asit, Düşük Antijen–Yüksek Nükleik Asit, Yüksek Antijen–Düşük Nükleik Asit ve Düşük Antijen-Düşük Nükleik Asit. 24 örnek arasında, 9'u Yüksek Antijen olarak sınıflandırıldı–Yüksek Nükleik Asit (37,5%; Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25), 3'ü Düşük Antijen–Yüksek Nükleik Asit (%12,5; Hp09, Hp26, Hp27), 8 tanesi Yüksek Antijen–Düşük Nükleik Asit (%%33,3; Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) ve 4'ü Düşük Antijen–Düşük Nükleik Asit (%%16,7; Hp06, Hp07, Hp12, Hp20). Her kategori için tablo, vaka sayısını (n), toplam örnek büyüklüğüne göre oranı (%%) ve her kategorideki örnek numaralarını göstermektedir. Bu sınıflandırma, immünolojik ve moleküler tespit yöntemleri arasındaki uyumu ve uyumsuzluğu ortaya koymaktadır; uyuşmazlık gösteren kategoriler, antijen kararlılığı, bakteriyel canlılık veya DNA kopya sayısı değişkenliği gibi faktörleri yansıtıyor olabilir ve analitik test sonuçlarının yorumlanması için bilgi sağlayabilir.
Ek Tablo 1: 24 örnek için antijen tespiti ve dPCR kantifikasyonunun birleştirilmiş veri seti Helicobacter pylori izolatlar. Sayfa 1 (Antijen Tespiti): Her bir izolat için sekiz ticari kolloidal altın immünokromatografik kiti kullanılarak elde edilen örnek başına son nokta titrasyon değerleri, örnek başına minimum, ortanca ve maksimum titrasyon değerleri ile örnek içi kat aralığı. Sayfa 2 (Dijital PCR Kantitatif Tespit): Her bir izolat için platforma özgü dPCR konsantrasyonları (kopya/mL) ve çoklu platform karşılaştırması için özet istatistikler (log değerlerinin medyanı, minimumu, maksimumu ve %CV)₁₀-dönüştürülmüş konsantrasyonlar). Sayfa 3 (Korelasyon ve Regresyon Analizi): suş düzeyinde log₂dönüştürülmüş antijen titreleri ve log₁₀-dönüştürülmüş dPCR konsantrasyonları, Pearson korelasyonu ve doğrusal regresyon sonuçları (r, R2, regresyon denklemi), aykırı değer Hp06'nın dışlandığı duyarlılık analizi ve ayrıntılı regresyon istatistikleri (standart hatalar, %95 güven aralıkları, artıkların standart hatası, F-istatistiği ve P-değeri). Ticari gizlilik nedeniyle kiti ve platforma özel tanımlayıcılar anonim hale getirilmiştir; veri kümesi Şekil 1'i yeniden üretmek için gerekli tüm değerleri içermektedir–2 ve Tablo 3.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: 24 için canlılık PCR sonuçları Helicobacter pylori izolatlar Canlılık boyasının izolata özgü dPCR kopya sayıları–tedavi edilen (+VR) ve reaktif içermeyen (−VR) aliquotları, 56'da ısı ile inaktive edildikten sonra °C'de 25 dakika boyunca, hesaplanan canlı fraksiyon (%) ve eşdeğer ΔHer izolat için Cq. Tüm izolatlar boyunca medyan canlı fraksiyonu %4,6 (aralık %0,00)–33.00%).Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Kültüre edilmiş 24 H. pylori izolatının incelendiği bu çalışmada, immünokromatografik antijen titresi ile dPCR genomik kopya sayısı arasında orta düzeyde ancak anlamlı bir pozitif korelasyon saptanmıştır (r = 0.536, P = 0.007); ancak antijen titresi, dPCR kopya sayısındaki varyansın yalnızca %29'unu açıklamıştır (R2 = 0.287), dolayısıyla bu iki ölçüm birbiriyle ilişkili olsa da birbirinin yerine kullanılamaz. Bu çalışmanın temel kısıtlılığı, istatistiksel gücü sınırlayan ve aşağıda kullanılan sınıflandırma eşiklerinin keşifsel doğasını açıklayan küçük örneklem boyutudur (n = 24).
Bu çalışma, H. pylori kültürlerindeki antijen titresini ve dPCR ile saptanan nükleik asit kopya sayılarını nicel olarak analiz ederek, bu iki yöntemin saptama sonuçları arasında orta düzeyde ancak anlamlı bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur (r = 0.536, P = 0.007). İki yöntem arasında popülasyon düzeyinde anlamlı bir korelasyon gözlemlense de, klinik uygulamalarda bireysel düzeyde farklılıklarla sıklıkla karşılaşılmaktadır. Bunun nedeni, farklı saptama hedeflerinin patojenlerin farklı biyolojik özelliklerini yansıtmasıdır. Özellikle, antijen testleri bakteriyel temizliğin ardından kalıcı olabilecek proteinleri saptarken, nükleik asit testleri canlı bakterilerin ortadan kalkmasından sonra bile düşük seviyelerde kalabilen DNA'yı saptar. Bu tür uyumsuzluklar, çeşitli enfeksiyon hastalıklarında iyi bir şekilde belgelenmiştir. Örneğin, Clostridioides difficile enfeksiyonunun klinik tanısında, bazı taşıyıcılar toksin geni saptamasında pozitif ancak toksin protein antijeni saptamasında negatif sonuçlar vermekte; bu durum, kişinin enfekte olduğu şeklinde yanlış tanı konulmasına yol açarak aşırı tedaviye ve ilaç direncinin ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, Amerika Enfeksiyon Hastalıkları Derneği (IDSA)12, kılavuzlarda Clostridioides difficile için "toksin saptama" ve "toksin geni saptama"nın klinik önemini net bir şekilde birbirinden ayırmıştır. Enfeksiyon tanısını yalnızca nükleik asit testi ile koymak yeterli değildir ve aktif toksin proteinini doğrudan saptayabilen yöntemlerin benimsenmesi önerilmektedir. Ek olarak, antibiyotik tedavisi sonrası toplum kaynaklı pnömonide, hastanın balgamındaki bakteriyel DNA yükü hızla azalırken, idrar antijeni iyileşmeden sonra pozitif kalmaya devam eder ve birkaç hafta ile birkaç ay boyunca sürer13. Benzer fenomenler H. pylori enfeksiyonunun tanı ve tedavisinde de gözlemlenmektedir. 2022 yılında Mayo Clinic Laboratories, antibiyotik tedavisi sonrası takip edilen 223 hastada, PCR'ın dışkı örneklerindeki düşük seviyeli kalıntı DNA'yı saptamada nispeten hassas olduğunu değerlendirmiştir. Bazı hastalar, klinik olarak iyileşmiş ve antijen-negatif olmalarına rağmen, birkaç hafta boyunca hala PCR-pozitif sonuçlar vermiştir14. Tüm bunlar, farklı saptama hedeflerinin biyolojik farklılıklarını daha da doğrulamaktadır.
Bu çalışmada, immünokromatografik yöntemle tespit edilen H. pylori antijen titresi ile dPCR kantifikasyon değerleri arasında kantitatif bir korelasyon ve eşdeğerliğin belirlenmesi, H. pylori referans materyallerinin karakterizasyonu ve in vitro diyagnostik reaktiflerin değerlendirilmesi için pratik bir rehberlik sunmaktadır. 1) Ürün performans değerlendirme modelinin güncellenmesini teşvik etmek: Günümüzde, H. pylori antijen tespit reaktiflerinin klinik trial değerlendirmeleri; histoloji, kültür veya üre nefes testi15 gibi klinik "altın standartlar" ile kör senkron karşılaştırmalar şeklinde yürütülmektedir. Bu araştırma, düzenleyici kurumların, inceleme süreci sırasındaki başvuru belgelerinde işletmelerden test sonuçları ile nükleik asit kantitatif yöntemleri arasındaki ilgili korelasyon verilerini sunmalarını talep etmeleri ve ürünlerin "tutarsız sonuç aralığındaki" performansını net bir şekilde tanımlamaları gerektiğini önermektedir; böylece ürünün karmaşık klinik senaryolardaki tespit yeteneği daha gerçekçi bir şekilde yansıtılabilir ve reaktifin LOD değeri daha kapsamlı bir şekilde tanımlanabilir. 2) Bu çalışma, bakteriyel referans materyallerin atanması için yeni bir yaklaşım sağlamaktadır: Kalite kontrol ve kalibrasyon için kullanılan referans materyaller, tek bir "CFU" değerinden, antijen titresi ve nükleik asit kopya sayılarını içeren "çok boyutlu karakteristik değerlere"8 dönüştürülebilir. Bu çalışmada oluşturulan regresyon modeli, bu iki değer arasındaki ilişkinin büyüklük mertebesine dair kaba bir tahmin sağlayarak, referans materyallerin kullanımı ve laboratuvarlar arası karşılaştırmalar için kantitatif bir temel oluşturabilir.
Üreticilerin, sonuçların farklı laboratuvarlar ve platformlar arasında karşılaştırılabilmesi ve uyumlu hale getirilebilmesi için, analiz birimleri (örneğin, CFU/mL veya antijen titresi) cinsinden tespit limitinin (LOD) yanı sıra, dijital PCR (dPCR) ile belirlenen genomik kopya eşdeğerini de belirtmelerini öneriyoruz. Bu tür çift birimli raporlama, ISO 175118 metrolojik izlenebilirlik gereklilikleri ve CLSI EP17-A216 tespit kapasitesi değerlendirme çerçevesi ile uyumludur.
"Düşük antijen–yüksek nükleik asit" örneklerinin ortaya çıkmasının potansiyel nedenleri şunlardır: 1) Suşun genetik varyasyonu: Antijenik epitoptaki amino asit yer değiştirirse veya sekresyon proteini taşıma ve sekresyon sırasında engellenirse, antijen tespitinde bir "kaçış" fenomeni meydana gelebilir17. 2) dPCR, konserve gen dizilerini hedeflemek ve çoğaltmak için tasarlanmıştır. Bu çalışmada dPCR tarafından hedeflenen spesifik gen, üretici belgelerinde açıklanmamıştır. Ancak, ticari antijen tespit kitleri farklı H. pylori antijenlerini (örneğin VacA, üreaz, flageller proteinler veya tüm hücre antijenleri) hedefleyebilir ve dPCR hedef geni ile belirli bir kit tarafından tanınan antijen arasındaki herhangi bir uyumsuzluk, ikili pozitif/negatif tutarsızlıklardan ziyade, saçılım grafiğinin dört kuadrantında kantitatif uyumsuzluklar (yüksek dPCR/düşük antijen, düşük dPCR/yüksek antijen, yüksek-yüksek uyumu veya düşük-düşük uyumu) olarak ortaya çıkabilir18. 3) Tespit yönteminin sınırlamaları: Antijen tespit teknolojisi, antikorlarla yetersiz afinite veya aşırı doygunluk nedeniyle sinyali zayıflatacak olan aşırı düşük veya aşırı yüksek antijen konsantrasyonları ile sınırlıdır ve ayrıca örnek matrisinden etkilenir. 4) Tespit limiti performansının asimetrisi: dPCR'ın alt tespit limiti (LOD) 10–100 copies/mL değerine ulaşabilirken, üreaz için kolloidal immünokromatografik yöntemin tespit limiti yaklaşık 104–105 CFU/mL'dir. Bakteri miktarı kritik değerde olduğunda, "düşük antijen–yüksek nükleik asit" fenomeninin meydana gelme eğilimi vardır. 5) Enfeksiyon durumunun klinik sonuçlar üzerindeki etkisi, özellikle bakteriyel enfeksiyonların viral olanlardan ayırt edilmesinde anlamlıdır. Enfeksiyon sürecinde, gen kopya sayısı ve antijen ekspresyon seviyesi sabit bir karşılıklı ilişki sergilemez. Başarılı tedavinin ardından nükleik asit seviyeleri hızla düşebilirken, antijen temizlenmesi bir süre gecikebilir19.
Bu çalışmada kullanılan bakteriyel süspansiyonlar, farklı girişim profillerine sahip farklı matriks ortamlarını temsil eden hem gastrik biyopsi örneklerinden hem de fekal örneklerden elde edilmiştir. Gastrik biyopsi kaynaklı izolatlar, büyük ölçüde dışkı kaynaklı PCR inhibitörlerinden arınmıştır ancak örnek işleme sırasında kalıntı pepsin maruziyetine tabi olabilirler. Buna karşılık, fekal örnekler, amplifikasyon verimliliğini azaltabilen ve dPCR kantifikasyonunun olduğundan düşük hesaplanmasına yol açabilen PCR inhibitörlerinin (örneğin, safra tuzları, kompleks polisakkaritler, hemoglobin degradasyon ürünleri) yanı sıra, bakteriyel DNA sağlam kalsa bile hedef antijenleri degrade edebilecek bağırsak proteazlarını içerir. Bu matriks spesifik etkiler, yukarıda açıklanan hedef bölge uyumsuzluk mekanizmalarından bağımsız olarak işler ve klinik örnekler arasındaki kantitatif uyumsuzluklar yorumlanırken hazırlama protokollerinin ve yöntem validasyonunun örnek tipine uygun olması gerektiğini göstermektedir.
Isıl inaktivasyon sonrası canlı ve canlı olmayan bakteri oranını deneysel olarak nicelleştirmek için, kültüre edilmiş tüm 24 izolat üzerinde bir canlılık PCR reaktif sistemi kullanılarak canlılık PCR'ı gerçekleştirildi. Bu reaktif, propidyum monoazid (PMA) ile benzer şekilde çalışır: membranları hasar görmüş hücrelere seçici olarak nüfuz eder ve sonraki amplifikasyonu engellemek için genomik DNA'larını kovalent olarak modifiye eder. Canlı bakteri yüzdesi şu formülle hesaplandı: Canlı % = (canlılık reaktifi (VR) ile işlem görmüş DNA kopya sayısı/µL) / (VR uygulanmamış DNA kopya sayısı/µL) × 100. Tüm izolatlar genelinde, ısıl inaktivasyon sonrası medyan canlı fraksiyon %4,6 (aralık: %0,00–%33,0) olarak belirlendi; bu sonuç, 56 °C'de 25 dakikalık ısıl inaktivasyon işleminin bakteriyel canlılığı büyük ölçüde azalttığını ancak canlı organizmaları tamamen ortadan kaldırmadığını doğrulamaktadır. Bu canlılık verileri, uyumsuz yüksek-dPCR/düşük-antijen-titresi profillerinin temel olarak bütün canlı H. pylori'den ziyade, kalıntı hücre dışı DNA ve canlı olmayan bakteriyel partiküller içindeki DNA'dan kaynaklandığı yönündeki yorumumuzu güçlü bir şekilde desteklemektedir. Tüm 24 suş için tam canlılık nicelleştirme sonuçları Ek Tablo 2'de özetlenmiştir.
Bu çalışmada, dörtlü kadran sınıflandırması (keşifsel, veri setine özgü eşikler temel alınarak), 8 örneğin yüksek antijen–düşük nükleik asit sergilediğini ve 4 örneğin düşük antijen–düşük nükleik asit grubuna ait olduğunu ortaya koymuştur; bunlara ek olarak 9 yüksek–yüksek ve 3 düşük–yüksek uyumlu kategori belirlenmiştir. Yüksek antijen–düşük nükleik asit örneklerinin (n = 8) varlığı, saf kültürlerde bile antijen ekspresyonu ile nükleik asit içeriğinin her zaman örtüşmediğini göstermektedir. Tüm 24 izolat, stasyoner büyüme fazında (72 sa. kültür; bkz. Protokol bölüm 1) hasat edilmiştir. Stasyoner fazda, DNA replikasyonu büyük ölçüde durmuşken, yapısal ve metabolik antijenler kalmaya ve hatta birikmeye devam eder; bu büyüme fazı kopukluğu, yüksek antijen düşük nükleik asit sınıfının (n = 8) yoğunluğu ile düşük antijen–yüksek nükleik asit sınıfının (n = 3) azlığı arasındaki asimetri için makul bir biyolojik temel sunmaktadır; ancak bu durum, antijen ekspresyonundaki suşlar arası farklar veya ısı ile inaktivasyon sırasında meydana gelen kısmi lizis gibi diğer mekanizmaları tek başına dışlamaz. Düşük antijen–yüksek nükleik asit örneklerinin (n = 3) mevcut olması, düşük bir antijen titresinin kaçınılmaz olarak düşük bir nükleik asit yüküne karşılık gelmediğini doğrulamakta ve belirli senaryolarda nükleik asit testinin antijen testini tamamladığını göstermektedir. Bu eşikler keşifsel ve veri setine özgüdür ve valide edilmiş klinik tanı kriterlerini temsil etmemektedir.
Bu çalışma, sağlam alt grup analizlerini desteklemek için istatistiksel gücün yetersiz kalmasına neden olan küçük örneklem boyutuyla (n = 24) sınırlıdır. Örneklem altı farklı titre grubuna ayrılmış olup, her grupta ortalama olarak sadece 4 örnek bulunmaktadır; bu nedenle, gruplar arası resmi karşılaştırmalar anlamlı farklılıkları tespit edebilecek yeterli istatistiksel güce sahip değildir. Bu nedenle, yetersiz güce sahip çıkarımsal istatistiksel sonuçlar sunmaktan kaçınmak amacıyla Kruskal-Wallis testi uygulanmamıştır. Ayrıca, tüm örnekler kültür izolatlarıdır ve mide mukozası, dışkı veya tükürük gibi klinik örneklerde bulunan daha karmaşık matriks etkilerini kapsamamaktadır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu makalenin yazımında, düzenlenmesinde, istatistiksel analizinde, kod geliştirmesinde veya şekillerin hazırlanmasında hiçbir yapay zeka aracı kullanılmamıştır.
YAZAR KATKILARI:
Tüm yazarlar bu çalışmaya yaptıkları ilgili katkıları onaylamıştır. Bireysel yazar rolleri aşağıda listelenmiştir. Tüm yazarlar, nihai olarak sunulan taslağı okuyup onaylamışlardır ve araştırma verilerinin doğruluğu ile bütünlüğünün tüm sorumluluğunu üstlenmişlerdir. Wenwen Sun: Araştırma, Veri kürasyonu, Formal analiz, Metodoloji, Taslak yazımı, Finansman temini; Xiaona Han: Araştırma, Metodoloji; Jin Zhang: Araştırma, Metodoloji; Xinxin Duan: Araştırma, Metodoloji; Tingting Li: Kavramsallaştırma, Denetim; Manyu Li: Kavramsallaştırma, Denetim, Yazım – inceleme ve düzenleme; Haiwei Zhou: Kavramsallaştırma, Denetim, Yazım – inceleme ve düzenleme.
Teşekkürler
Bu çalışma, National Institutes for Drug Control (NIDC) Gençlik Gelişim Araştırmaları Vakfı tarafından finanse edilmiştir (Hibe No. 2025C5).
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR Probe Master Mix Plus (Rox) | Sniper | RT021096A | Dijital PCR kantitatif tespit reaktifi |
| Bakteriyel Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. | Y2213/DP302-02 | Bakteriyel nükleik asit ekstraksiyonu |
| Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR Sistemi | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | QX200 | Dijital PCR kantitatif tespiti |
| Entegre Dijital PCR Cihazı | Sniper | DQ24 | Dijital PCR kantitatif tespiti |
| Entegre Dijital PCR Cihazı | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd. | DQ24 | Dijital PCR kantitatif tespiti |
| Dijital Benmari | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Bakteriyel süspansiyonların 56 °C'de ısı ile inaktivasyonu |
| İleri primer (Forward primer) | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Dijital PCR nükleik asit amplifikasyonu |
| Gastrik Helicobacter pylori Antijen Tespit Kiti (Koloidal Altın Yöntemi) | Shanghai Chemtron Biotech Co., Ltd. | B202301020 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori Agar Besiyeri (katı) | Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. | HB8647 | H. pylori kültür besiyeri |
| Helicobacter pylori antijen tespit kiti (koloidal altın yöntemi) | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit kiti (koloidal altın yöntemi) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd. | 20240310 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit kiti (koloidal altın yöntemi) | Hangzhou Genesis Biodetection & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit kiti (koloidal altın yöntemi) | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd. | 28223 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit kiti (koloidal altın yöntemi) | Beijing Core Technology Co., Ltd. | 2415810 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit reaktifi (immünokromatografik yöntem) | Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd. | W028402001 | H. pylori antijen tespiti |
| Helicobacter pylori antijen tespit reaktifi (lateks yöntemi) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co., Ltd. | 0000805308 | H. pylori antijen tespiti |
| Heracell Tri-Gas İnkübatör | Thermo Fisher Scientific | N/A | Mikroaerobik kültür; gaz bileşimi: %5 O2, %10 CO2, %85 N2 |
| Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 mL / 2 mL) | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | Örnek seyreltme ve nükleik asit ekstraksiyonu |
| Nükleik asit ekstraksiyon veya saflaştırma reaktifleri | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | SDK60105 | Bakteriyel nükleik asit ekstraksiyonu |
| Nükleik asit ekstraksiyon reaktifi | TargetingOne | Pathogens TNA-B1 (11019) | Bakteriyel nükleik asit ekstraksiyonu |
| PBS, 1X (pH 7.2-7.4, 0.01 M, hücre kültürü) | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1020 | Örnek seyreltme |
| Petri Kapları (90 mm) | Beekman Biotech | N/A | Bakteriyel izolasyon ve alt kültür için steril kültür plakaları |
| Pipet Uçları (10 uL / 200 uL / 1000 uL) | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | Örnek seyreltme ve reaktif dağıtımı için steril filtrelenmiş uçlar |
| Prob | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Dijital PCR nükleik asit amplifikasyonu |
| Geri primer (Reverse primer) | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Dijital PCR nükleik asit amplifikasyonu |
| SPSSPRO Çevrimiçi İstatistiksel Analiz Platformu | SPSSPRO | Web tabanlı (https://www.spsspro.com/; erişim Ağustos 2026) | İstatistiksel analiz: Pearson korelasyonu, doğrusal regresyon |
| Steril Defibrine Koyun Kanı | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | TX0030-100 mL | H. pylori kültür plakaları için takviye |
| TD-1 Dijital PCR Sistemi | TargetingOne | TD-1 | Dijital PCR kantitatif tespiti |
| Viability PCR Reaktif Sistemi | Promega | A8881 | Isı ile inaktive edilmiş H. pylori'nin canlılık PCR değerlendirmesi |
| Vorteks Karıştırıcı | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | Bakteriyel süspansiyonların homojenizasyonu |
Kaynaklar
- Ndip RN, et al. Helicobacter pylori isolates recovered from gastric biopsies of patients with gastro-duodenal pathologies in Cameroon: current status of antibiogram. Trop Med Int Health. 2008;13(6):848-54.
- Malfertheiner P, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut. 2022;71(9):1724-62.
- Hooi JKY, et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology. 2017;153(2):420-9.
- International Agency for Research on Cancer. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.
- de Martel C, et al. Global burden of cancer attributable to infections in 2018: a worldwide incidence analysis. Lancet Glob Health. 2020;8(2):e180-90.
- Wang YK, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: current options and developments. World J Gastroenterol. 2015;21(40):11221-35.
- Hindson BJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-10.
- International Organization for Standardization. ISO 17511:2020, In vitro diagnostic medical devices—requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. International Organization for Standardization; Geneva; 2020.
- Morisset D, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013;8(5):e62583.
- World Health Organization. WHO international standard for SARS-CoV-2 RNA, NIBSC code 20/146. World Health Organization; Geneva; 2020.
- Forootan A, et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif. 2017;12:1-6.
- Johnson S, et al. Clinical practice guideline by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA): 2021 focused update guidelines on management of Clostridioides difficile infection in adults. Clin Infect Dis. 2021;73(5):e1029-44.
- Hyams C, Williams OM, Williams P. Urinary antigen testing for pneumococcal pneumonia: is there evidence to make its use uncommon in clinical practice? ERJ Open Res. 2020;6(1):00223-2019.
- Marrero Rolon R, et al. Erratum for Marrero Rolon et al., “Clinical evaluation of a real-time PCR assay for simultaneous detection of Helicobacter pylori and genotypic markers of clarithromycin resistance directly from stool.” J Clin Microbiol. 2022;60(2):e0245221.
- China Food and Drug Administration. Technical review guidelines for registration of Helicobacter pylori antigen/antibody detection reagents. China Food and Drug Administration; Beijing; 2018.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. EP17-A2, Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures; approved guideline. 2nd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; Wayne, PA; 2012.
- Yamaoka Y, Graham DY. Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis. Future Oncol. 2014;10(8):1487-500.
- Leal YA, et al. Utility of stool sample-based tests for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;52(6):718-28.
- Devonshire AS, et al. The use of digital PCR to improve the application of quantitative molecular diagnostic methods for tuberculosis. BMC Infect Dis. 2016;16:366.