In vitro farmakolojik olarak kontraktil aktivite değerlendirmesi için İzole Tavşan Duodenal Düz Kasının Standartlaştırılmış Hazırlanması

Özet

Burada, izole tavşan onikili düz kasının in vitro farmakolojik değerlendirme için hazırlanmasını standartlaştıran bir protokol sunuyoruz; bu protokol, kasılıl aktivitenin gerçek zamanlı veri kaydı için Yatay Sabit Sıcaklık Düz Kas Deney Sistemi kullanılıyor.

Özet

Gastrointestinal düz kasın koordineli kasılma aktivitesi, normal sindirim, emilim ve taşıma fonksiyonlarının korunması için fizyolojik temel oluşturur; bu işlev bozukluğu ise hareketlilik bozukluklarıyla yakından ilişkilidir. İzole organ perfüzyon tekniği, sinirsel, endokrin ve hemodinamik faktörler gibi karmaşık in vivo girişimleri ortadan kaldırır ve farmakolojik çalışmalar için klasik bir model olarak hizmet verir. Bu amaçla, bu çalışma tavşan izole edilmiş onikili düz kasın standartlaştırılmış hazırlanması için adımlı bir protokolü detaylandırmaktadır. Prosedürel iş akışı, çözümler hazırlama, tavşanı ötenazi, hızlı doku kesimi için hassas aseptik orta karın laparotomisi yapma, düz kas şeritlerinin askıya alınması ve gerçek zamanlı gerilim kaydı için dönüştürücülerin kalibrasyonu gibi kritik adımları vurgular. Bu teknik platforma dayanarak, Huoxiang Zhengqi Oral Sıvısı (HXZQ-OL) spontan kasılmalar ve asetilkolin/baryum klorür kaynaklı tetanik kasılmalar üzerindeki etkilerini değerlendirerek yöntemi daha da doğruladık. Sonuç olarak, bu protokol sağlam ve yüksek tekrarlanabilir bir metodolojik çerçeve sunar ve gastrointestinal hareketliliği hedefleyen terapötik ajanların farmakolojik değerlendirmesi için geniş uygulanabilir bir in vitro tarama platformu sunar.

Giriş

Gastrointestinal düz kasın koordineli kasılma aktivitesi, normal sindirim, emme ve taşıma fonksiyonlarının korunması için fizyolojik temel^{oluşturur 1}. Fonksiyon bozukluğu, irritabl bağırsak^{sendromu 2}, fonksiyonel dispepsi³ ve ameliyat sonrası gastrointestinal motilite^{bozuklukları 4} gibi çeşitli yaygın klinik bozukluklarla yakından ilişkilidir. Düz kas aktivitesini düzenleyen moleküler ve farmakolojik mekanizmaların aydınlaştırılması, yeni prokinetik veya antispazmodik tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu araştırma alanında, izole organ perfüzyon tekniği klasik bir model olarak hizmet vermektedir. Sinirsel, endokrin ve hemodinamik faktörler gibi karmaşık in vivo girişimleri ortadan kaldırarak pratik değer sunar; böylece ilaçların veya aktif maddelerin düz kas tonuna etkilerinin doğrudan ve hassas değerlendirilmesini^{sağlar 5,6}.

In vitro doku hazırlığı ve veri kaydı için kararlı ve güvenilir protokoller oluşturmak, tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için gereklidir. Mevcut in vitro bağırsak kas deney yöntemleri, deneysel hayvanların standartlaştırılmış yönetimi, doku hasadı için titiz cerrahi teknikler, perfüzyon sistemlerinin tutarlı çevresel kontrolü ve standart analizle birlikte otomatik veri toplama gibi çeşitli alanlarda daha fazla optimizasyon ve standartlaştırma gerektirmektedir. Örneğin, perfüzyon sıvısı sıcaklığı ve pH seviyeleri, doku hasadı sırasında mekanik hasar ve doku ön yükleme ayarları, doku yaşamlılığını önemli ölçüde etkileyebilir ve deneysel hatalara yol açabilir. Bu faktörler, sonuçların güvenilirliğini zayıflatır ve farklı çalışmalar arasında karşılaştırılabilirliği engeller ^7,8.

Bu nedenle, bu çalışma, tavşanlardan izole edilen iki ikilili düz kas örnekleri hazırlamak ve gerçek zamanlı gerilim kaydı yapmak için standart bir protokol oluşturmayı ve geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol, deneysel hayvan etiği ve refahı, aseptik laparotomi ve hassas bağırsak segmenti izolasyonu, çevresel kontrol, standart gerilim ön yük ayarları ve entegre yatay sabit sıcaklık perfüzyon sistemi ile çok kanallı fizyolojik sinyal alım sistemi kullanılarak yüksek isabetli veri toplama gibi tüm süreci sistematik olarak tanımlar. Bu standartlaştırılmış teknik platforma dayanarak, Çin Farmakopeisi (2025 ^baskısı)9 kalite standartlarını karşılayan Huoxiang Zhengqi Oral Sıvısı (HXZQ-OL) izole duodenal düz kaslarda kendiliğinden kasılmalar ve asetilkolin ile baryum klorür kaynaklı tetanik kasılmalar üzerindeki etkilerini nicel olarak değerlendirmek için kümülatif dozlama yöntemleri uyguladık. Huoxiang Zhengqi Ağız Sıvısı (HXZQ-OL), klasik Huoxiang Zhengqi geleneksel Çin tıbbı formülünün ağızdan dozaj formu olup, Çin'de gastrointestinal bozukluklar için yaygın olarak kullanılır ve izole bağırsak düz kasları üzerindeki doğrudan etkilerinin değerlendirilmesini sağlar. Bu çalışma, HXZQ-OL'nin gastrointestinal düz kas düzenleyici etkilerini açıklayan doğrudan deneysel farmakolojik kanıtlar sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda deneysel protokol aynı zamanda gastrointestinal düz kas farmakolojik taraması ve in vitro doku çalışmaları için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir metodolojik model olarak hizmet vermektedir.

Protokol

Bu çalışmada her iki cinsiyetten sağlıklı yetişkin Yeni Zelanda Beyaz tavşanları (2,0–2,5 kg ağırlığında) kullanıldı. Tüm hayvan deney prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: [2026070]). Tüm çabalar hayvan acısını en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için gösterildi. İş akışı diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Çözelti hazırlığı

NOT: Tüm çalışan çözeltiler, Tyrode çözeltisi, asetilkolin (ACh), baryum klorür, atropin ve verapamil dahil, deneyden hemen önce taze hazırlanmalıdır.

1. 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.4 mM NaH₂PO₄, 1.0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃ ve 5.6 mM D-glikoz çözünerek 1 L Tyrode çözeltisi hazırlanır. Kullanımdan önce, %95 O₂ / %5 CO₂ karışımıyla 15–30 dakika boyunca doygun hale getirin, pH 7,3–7,4'e ayarlanır (bkz. Malzemeler Tablosu).
2. 1 mM ACh stok çözeltisi hazırlayın. 20 μL alın ve 20 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. 1 μM ACh çözelti elde etmek için iyice karıştırın.
3. 1 M baryum klorür (BaCl₂) stok çözeltisi hazırlayın. 20 μL alın ve 20 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. 1 mM BaCl₂ çözeltisi elde etmek için iyice karıştırın.
   NOT: BaCl₂ son derece toksik ve sinir bozucudur. Kullanırken kişisel koruyucu ekipman giyin ve atık sıvıyı düzenlemelere uygun şekilde bertaraf edin.
4. 10 mM'lik atropin sülfat stok çözeltisi hazırlayın. 20 μL alın ve 20 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. 10 μM atropin sülfat çözeltisi elde etmek için iyice karıştırın.
5. 1 mM verapamil hidroklorür stok çözeltisi hazırlayın. 2 μL alın ve 20 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. İyice karıştırarak 0.1 μM verapamil hidroklorür çözeltisi elde edin.
   NOT: Hazırlanan çözeltilerin konsantrasyonları, önceki çalışmalar ^6,10,11 referanslarıyla belirlenmiş ve en iyi deneysel koşulları sağlamak için ön deneylerimizle daha da optimize edilmiştir.

2. In vitro tavşan onikili düz kas örneklerinin hazırlanması

1. Tavşan ötenazi
   1. Tavşanı tavşan bağlama cihazına sabitleyin (Şekil 2A, B ve Şekil 3A). Tavşanlarda kulak damarı üzerinden sodyum pentobarbital (120 mg/kg) aşırı doz uygulanarak ötenazi uygulanır (Şekil 2C ve Şekil 3B).
      NOT: Tam ölüm şu kriterlerle doğrulanmalıdır: genişleyen gözbebekleri, pupiller ışık refleksinin olmaması, solunum ve kalp atışının durması ve plantar refleks kaybı.
2. Cerrahi bölgenin hazırlanması ve dezenfekte edilmesi
   1. Tavşanı ameliyat masasında sırtüstü pozisyona sabitleyin (Şekil 2D ve Şekil 3C). Cerrahi makas (Şekil 2E) veya elektrikli tıraş makinesi kullanarak, belirlenen cerrahi bölgedeki deriyi açığa çıkarmak için tüm karın tüylerini iyice çıkarın (Şekil 3D).
   2. Sünger forseps kullanarak (Şekil 2E), iyotla ıslatılmış bir pamuk topunu tutun (Şekil 2F,G). Planlanan cerrahi kesinin merkezinden başlayarak, antiseptik çözeltiyi içten dışa doğru konsantrik, dairesel bir desen halinde uygulayın (Şekil 3E).
      NOT: Dezenfeksiyon alanı, tüm cerrahi alan derisinin tam kapatılmasını sağlamak için kesi kenarlarının ötesine kadar uzanmalıdır. Dezenfeksiyondan sonra, antiseptiğin cilt yüzeyinde doğal olarak kuruması için en az 3 dakika bekleyin.
   3. Dezenfekte edilmiş karın bölgesinin üzerine steril bir perde (Şekil 2H) yerleştirilerek cerrahi alanı açığa çıkarın (Şekil 3F).
3. Karın kesisinin konumlandırılması ve kesisi
   1. Bir bistüri (bıçak #23) (Şekil 2E) kullanarak, karın orta hattı boyunca xiphoid sürecinin altından simfiz pubis'in üstüne kadar 8 cm boyuna bir kesi açın.
   2. Deri ve deri altı dokusunu katman katman disseksiye. Linea alba izinden sonra, rectus abdominis kasının ön kılıfı, kas lifleri ve peritoneum katman katman keserek karın boşluğuna girin (Şekil 3G).
   3. NOT: İşlem sırasında, cerrahi alan ve karın organlarının kan bulaşmasını önlemek için hemostazı garanti ederken karın organlarına zarar vermekten kaçının.
4. Onikili bağırsak ayrımı
   1. Kesi boyunca karın boşluğunu açın (Şekil 3H). Nemli tuzlu gazlı bez kullanarak karaciğer loblarını nazikçe geri çekerek mide ve onikili koşu tamamen açığa çıkarın (Şekil 3I).
   2. Onikili çapın ilk segmentini (bulbar veya üst iniş kısmı) doku toplama alanı olarak pylorus'tan 2–3 cm uzaklıkta seçin.
   3. NOT: Mekanik hasarı en aza indirmek için mümkün olduğunca hedef bağırsak segmentinin doğrudan çekiş veya sıkıştırılmasından kaçının. Bunun yerine, bitişik mezenteriyi nazikçe tutmak için küt forseps kullanın veya dokuyu nazikçe manipüle edip konumlandırmak için tuzlu nemli pamuk çubukları kullanın.
   4. Steril oftalmik makas kullanılarak (Şekil 2E), onikili tüpünün 1–2 cm (Şekil 2J) bir segmentini hızlı ve doğru şekilde rezeksiyonla (Şekil 3J,K).
   5. Kesilmiş bağırsak segmentini, önceden soğutulmuş (4 °C) Tyrode çözeltisi içeren bir kültür kabına (Şekil 2K) hemen aktarın ve bu çölü sürekli olarak karışık bir gazla (%95 O₂ / %5 CO₂) perfüze edilmiştir.
5. Bağırsak segmentinin kesilmesi, temizlenmesi ve geçici depolama
   1. Oftalmik forseps (Şekil 2E) kullanılarak, mezenteri ve bağırsak duvarına yapışan çevresindeki yağ dokusunu nazikçe disseksiye edin.
   2. Soğuk Tyrode çözeltisi (kör uçlu iğne ile donatılmış) dolu bir şırınga kullanarak (Şekil 2L), lavman çözeltisini bağırsak boşluğuna nazikçe enjekte edin. Bağırsak boşluğunun içini 2–3 kez yavaşça yuyuruyor ve içeriği iyice temizleniyor.
   3. Temizlenmiş bağırsak segmentlerini, sonraki deneylere kadar geçici olarak saklanmak üzere taze oksijenli soğuk Tyrode çözeltisine yerleştirin.

3. Yatay, sabit sıcaklıklı düz kas deney sistemi başlatma ve çözelti infüzyonu

1. DSQG-1 Yatay Sabit Sıcaklık Düz Kas Deney Sistemi'nin ön ısıtma kabına Tyrode çözümünü ekleyin (Şekil 4B; Malzeme Tablosu'na bakınız).
2. Sistem gücünü açın, çalışma paneline dokunarak banyo sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve ön ısıtmaya başlayın (Şekil 4C).
3. İnfuzyon düğmesine bastığınızda, sistem otomatik olarak 20 mL Tyrode çözeltisini banyo tankına dağıtır.
4. Sıvıyı tamamen atık toplama konteynerine boşaltmak için Drenaj düğmesine basın.
5. Durulama düğmesine bastığınızda, sistem otomatik olarak önce içeriği boşaltıp sonra sıvıyla doldurma işlemini tamamlar.
6. Stop düğmesine basarak devam eden tüm infüzyon, boşaltma ve durulama işlemlerini hemen sonlandırın.
7. Şişme düğmesine basarak karışık gazı (%95 O₂ / %5 CO₂) banyoya sürekli olarak dahil edin. Gaz akış hızını 5 ölçekte ayarlayarak sonraki deneysel doku oksijenlenmesini sağlayın.
   NOT: 5. ölçek 100 mL/dakika gaz akışını gösterir. Aşırı yüksek gaz akış hızları, çözelti türbülansının artmasına neden olabilir ve gerilim kayıtlarının kararlılığını etkileyebilir.

4. Çok kanallı fizyolojik kayıt ve işleme sisteminin yazılım işletmesiyle bağlantılı

1. Yatay Sabit Sıcaklıklı Düz Kas Deney Sistemi dönüştürücüsünün veri kablosunu Çok Kanallı Fizyolojik Kayıt ve İşleme Sistemi'nin Kanal 1'ine bağlayın (Şekil 4D).
2. Çok Kanallı Fizyolojik Kayıt ve İşleme Sistemi'nin harici güç kaynağını açın ve bilgisayarı çalıştırın. Deneysel yazılım sistemini başlatmak için masaüstündeki RM6240XC Çok Kanallı Fizyolojik Kayıt ve İşleme Sistemi simgesine çift tıklayın (bkz. Materyaller Tablosu).
3. Menü çubuğunda Deney | Sindirim | Bağırsak Düz Kasının Fizyolojik Özellikleri , ilgili deneysel modülü yüklemek için.
4. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Kanal modu Gerilim, örnekleme frekansı 400 Hz, hassasiyet 1,5 g, zaman sabiti DC ve filtre frekansı 30Hz.
5. Yazılım arayüzünün sağ üst köşesindeki Başlat butonuna tıklayarak gerçek zamanlı sinyal alımı ve görüntülemeye başlayın. Kaydet butonuna tıklayarak osiloskopu aynı anda gösterebilir ve alınan sinyali gerçek zamanlı olarak sabit diske kaydedebilirsiniz.
6. Menü çubuğunda Deney | Gerilim sinyalini temel seviyeye ayarlamak için hızlı sıfırlama.
   NOT: Sinyal taban çizgisinden birden fazla dikey koordinat birimi sapırsa, gergin dönüştürücünün sıfır noktasını tornavida ile manuel olarak ayarlayın.
7. Menü çubuğunda Deney | Gerçek zamanlı veri görüntüleme yöntemi | Yüzen plaka. Görünen diyalog kutusunda, yüzen pencerede bağırsak kasının gerçek zamanlı gerilim verilerini göstermek için Normal Gerçek Zamanlı Ölçüm-Hızlıseçeneğini seçin.

5. Duodenal kas şeridinin süspansiyon ve gerilim ön yük ayarı

1. Duodenal kas şeridinin uzunluğuna göre yatay vida düğmesini döndürerek doku kancalarının önden arkaya aralığını, şeridin uzunluğuna uyduğundan emin olun.
2. Bağırsak segmentini doğal silindirik konfigürasyonunda tutmak ve görüş hattını bağırsak lümeninin dairesel kesitsel açıklığı ile hizalamak.
3. Oftalmik forseps kullanarak, açıklığı korumak için bağırsak açıklığını nazikçe geri çekin.
4. Doku kancasının ucunu nazikçe bağırsak lümenine sok.
5. Bağırsak kenarından 2–3 mm mesafede, üst tek katmanlı bağırsak duvarını içten dışa doğru doku kancasının ucu kullanılarak delin.
   NOT: Doku kancası, kas tabakasına nüfuz ederek sağlam sabitleme sağlamalıdır; yüzeysel olarak sadece serozal tabakaya tutunmayı önlemelidir; böylece ön yük uygulandığında kanca tarafından bağırsak duvarının mekanik kesilip yırtılması önlenir.
6. Bağırsak duvarının diğer tarafı ilk tarafla aynıdır. Paralel karşılık noktası belirlendikten sonra, o noktada yalnızca tek katmanlı bağırsak duvarını delin (Şekil 3L).
7. Yatay vida kolunu tekrar döndürerek kanca aralığını ayarlayın, böylece duodenal kas şeridinin doğal olarak rahat kalmasını sağlayın.
8. Tek boyutlu ince ayarlayıcıyı ayarlayarak gerginliği kademeli olarak uygulayın; ta ki duodenal kas şeridinin ortalama gerilimi 0,8 ± 0,1 g arasında stabil hale gelene kadar (Şekil 4A).
   NOT: Bağırsağın tüm uzunluğunu görsel olarak inceleyin; düz ve silindirik kaldığından, bükülme, dönme veya spiral kıvrımlardan arınmış olduğundan emin olun. Eğer durum böyle değilse, hemen gerilimi azaltın ve bir uçtaki montaj noktasını yeniden ayarlayın.
9. Deneye başlamadan önce, perfüzyon odasında onikili dalı kas şeridini 60 dakika boyunca dengeleyin. Bu denge döneminde, Tyrode çözeltisi her 15–20 dakikada bir taze tampon ile değiştirilerek spontan kasılma ritmi stabil hale gelene kadar.
   NOT: 60 dakikalık denge dönemi, izole bağırsak segmentleri en az 15 dakika ardışık stabil spontan kasılma aktivitesi gösterdiğinde tamamlanmış sayılır. Stabilizasyon için nesnel kriterler nicel olarak şu şekilde tanımlanmıştır: (1) temel dinlenme gerilimi kayması %< ±5, (2) ardışık 5 dakikalık aralıklarda ortalama kasılma genliğinde %< ±10% varyans ve (3) < ± 1 döngü/dakika frekans dalgalanması.
10. Onikili kas şeridinin spontan kasılma aktivite eğrisini, sonraki deneyler için temel referans veri olarak kaydedin.

6. Deneysel veri toplama

1. Devam eden deneyler için, menü çubuğunda Tools | Yakalanan dalga formu verilerinde gerçek zamanlı istatistiksel analiz yapmak için bölünmüş görünüm.
2. Depolanan veri dosyaları için, araç çubuğundaki Aç butonuna tıklayın, .lsd uzantısına sahip bir kayıtlı veri dosyası seçin ve geçmiş deney kayıtlarını yükleyin.
3. Araç çubuğundaki Ölçüt simgesine tıklayın, Bölge modunu seçin. Fare imlecini dalga formu alanı üzerinde hareket ettirin, sol fare düğmesini basılı tutup istediğiniz iki noktayı seçin; sistem o segment içindeki ortalama gerilim değerini gösteren bir veri paneli gösterir.
4. Araç çubuğundaki Ölçü simgesine tıklayın, Dönem modunu seçin. Sol fare tuşunu kullanarak dalgaform boyunca ardışık beş farklı dalga zirvesine (zirve noktasına) tıklayın. Fareyi sağ tıklayın, veri paneli kasılma frekansını (bpm cinsinden) hesaplayıp gösterecektir (Ek Şekil S1).

Sonuçlar

Bu deneysel protokol, izole edilmiş tavşan onikili kas şeritleri için standartlaştırılmış hazırlık yöntemini ve izole organ perfüzyon sistemi kullanılarak dinamik gerilim ve frekans değişimlerinin gerçek zamanlı kaydedilmesi sürecini açıklar. Bu protokole göre, HXZQ-OL 20 mL Tyrode çözeltisi banyosuna kümülatif dozlama yoluyla sıralı olarak eklendi ve banyoda 10, 20, 30, 40 ve 50 μL/mL nihai hacim konsantrasyonları elde edildi. Çin Farmakopesi (2025 baskısı) standartlarına referans olarak, bu konsantrasyonlar sırasıyla 6...

Tartışma

İzole organ perfüzyonu ve gerilim kaydı teknikleri, düz kas fizyolojisi ve farmakolojisini incelemek için klasik yöntemlerdir. Bulguları, gastrointestinal motilite bozuklukları, damar hastalıkları ve rahim işlev bozukluğunun altında yatan patofizyolojik mekanizmaların aydınlatılması açısından önemli^{önem taşır. 12,13,14,15}. Standartlaştırılmış bir tavşan ex ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette uçları	LABSELECT	T-001-10
10 mL Hacimli şişe	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Hacimli şişe	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette uçları	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Hacimli şişe	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette uçları	LABSELECT	T-001-200
50 mL Konik santrifüj tüpü	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Asetilkolin klorür	Supelco	PHR1546
Hepsi Bir Arada Laboratuvar Bilgisayarı	Lenovo	R5-3500U
Atropin sülfat	Macklin	A822893
Baryüm klorür	Sigma-Aldrich	342920
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	499609
D-Glükoz	Sigma-Aldrich	G5767
Donma noktası ozmometresi	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Yatay Sabit Sıcaklıklı Düz Kas Deney Sistemi	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Sıvı	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M8266
Çok Kanallı Fizyolojik Kayıt ve İşleme Sistemi	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
Yeni Zelanda Beyaz tavşanları	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (Lisans No.: SCXK[Su]2022-0004)	her iki cinsiyet (2.0–2.5 kg ağırlığında)
pH ölçer	Shanghai Leici	PHS-25
Potasyum klorür	Sigma-Aldrich	P5405
Povidon-iyot	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Hassas terazi (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Tuzlu su çözeltisi	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S6014
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S9888
Sodyum dihidrojen fosfat	Supelco	1063700250
Sodyum Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hidroklorür	Macklin	V820460
Vortex karıştırıcı	Kylin-Bell	XW-80A