Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığının yüksek yağlı diyet kaynaklı fare modeli kullanılarak, bu çalışma dokosaheksaenoik asit (DHA) açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin etkilerini değerlendirir ve müdahalenin karaciğer lipid profillerini iyileştirdiğini ve bağırsak mikrobiyotası bileşimindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir.
Metabolik olarak, işlevsiz steatotik karaciğer hastalığı, bağırsak mikrobiyotası disbiyozu ve karaciğer lipid dengesizliğiyle ilişkili yaygın bir metabolik bozukluktur. Bu çalışmada, DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin etkilerini değerlendirmek için yüksek yağlı diyet kaynaklı bir fare modeli oluşturuldu. Fareler (n = grup başına 4) 8 hafta boyunca yüksek yağlı diyet aldı ve günlük oral olarak mikroalg yağı, probiyotikler veya DHA açısından zengin mikroalg yağı ile probiyotiklerin kombinasyonu verildi. Metabolik parametreler, bağırsak mikrobiyota bileşimi (16S rRNA dizilemesi), mikrobiyal fonksiyonel yollar ve hepatik metabolom profilleri değerlendirildi. Sonuçlar, DHA açısından zengin mikroalg yağının lipid homeostazını iyileştirdiğini, serum LDL-c ve hepatik trigliserit seviyelerinin azalması ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL-c) artışıyla gösterildiğini, karaciğer hasarı ve oksidatif stresin hafifletilmesiyle ilişkilendirildiğini gösterdi. Mikrobiyom analizi, Lactobacillus ve Bifidobacterium'un zenginlenmesi ve Clostridium ile Ruminococcus gibi yüksek yağlı diyetle ilişkili taksonların azalması gibi bağırsak mikrobiyal bileşiminde seçici değişiklikler ortaya koydu. Fonksiyonel profilleme, L-metyonin kurtarma döngüsü ve feniletilamin bozunması dahil olmak üzere mikrobiyal metabolik yollarda değişiklikler göstermiştir. Entegre mikrobiyom–metabolom analizi, mikrobiyal taksonlar ile yağ asidi metabolizması, safra asit dönüşümü ve amino asit yollarında rol alan karaciğer metabolitleri arasındaki ilişkileri ayrıca ortaya koydu. Bu bulgular, DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin, bu modelde karaciğer lipid metabolizması ve bağırsak mikrobiyota bileşimindeki iyileşmelerle ilişkili olduğunu, doğrudan nedensel bir mekanizma ima etmediğini göstermektedir.
Metabolik işlevsizlikle ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), dünya nüfusunun yaklaşık %32,4'ünü etkileyen son derece yaygın bir küreseldurumdur 1. MASLD, karaciğerdeki aşırı yağla tanımlanır ve bu da çeşitli ilişkili sağlık sorunlarına katkıda bulunur. İnsan sindirim sistemi, bakteriler, virüsler, mantarlar ve parazitler dahil olmak üzere gelişmiş ve dengeli bir mikrobiyaltopluluğa sahiptir 2. Bu mikrobiyal topluluk ile karaciğer arasındaki etkileşim nedeniyle, probiyotikler bu kritik bağlantıyı modüle ederek MASLD'yi önleme ve tedavi etmek için umut vadeden bir yöntemolarak görülmektedir 3. Gelişmekte olan araştırmalar, probiyotiklerin bağırsak mikrobiyomunu modüle ederek ve iltihabı azaltarak MASLD'yi olumlu etkileyebileceğini göstermektedir. Özellikle, probiyotik uygulanmasının bağırsak mikrobiyotasına dengeyi kazandırdığı ve karaciğer iltihabınıazalttığı gösterilmiştir 4. Ayrıca, özellikle safra asit metabolizmasını artırabilen bazı probiyotiklerin karaciğer steatozunu (yağlı karaciğer) hafiflettiği ve MASLD 5,6 hastası bireylerde genel metabolik sağlığı desteklediği gösterilmiştir. Ayrıca, güçlü kanıtlar MASLD hastalarının bağırsak ortamında önemli değişiklikler gösterdiğini göstermiştir; bu durum disbiyozolarak bilinir 7,8. Önemli bir bulgu alfa çeşitliliğinin azalmasıydı; bu da mikrobiyal türlerin toplam sayısı ve çeşitliliğinin azalması anlamına gelir. Ayrıca, MASLD hastalarının bağırsak mikrobiyotası genellikle bakteriyel filüm Firmicutes 9,10,11'in baskınlığı ile karakterize edilir. MASLD hastaları genellikle kötü diyetler tüketir; genellikle yüksek doymuş yağ alımı ve temel mikrobesinlerin düşük tüketimiiçerir 12,13. Bu sağlıksız beslenme alışkanlıkları, kentsel nüfuslarda sıkça gözlemlenen, kırsal ortamlarda yaşayan insanlara kıyasla Firmicutes-Bacteroidetes oranının yükselmesiyle korelasyondur14. Ayrıca, yüksek yağlı diyetler doğrudan daha derin bağırsak dengesizliğine neden oldu. Özellikle, hem hayvan modellerinde yapılan araştırmalar hem de ileri karaciğer hastalığı olan MASLD hastalarında yapılan çalışmalar, yüksek yağ alımının bağırsak viromu değişikliğiyle bağlantılı olduğunu göstermiştir. Bu değişiklikler arasında litik faj aktivitesinde artış da bulunuyordu ve bu da nihayetinde mevcut bağırsakdisbiyozunu kötüleştirdi 15,16.
Omega-3 Çok doymamış yağ asitleri (PUFA'lar), balık yağında yaygın olarak bulunur ve lipid metabolizmasını iyileştirebilir ve bağırsak mikrobiyotasını düzenleyebilir. Mikroalg yağı, omega-3 PUFA'ların umut verici ve sürdürülebilir bir kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Schizochytrium mikroalg yağı, yüksek konsantrasyona saf dokosaheksaenoik asit (DHA) içerdiği için umut vadeden bir ticari kaynaktır. Bu grubun önceki çalışmaları, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı obezite fare modelinde, mikroalg yağının kilo verimini teşvik etmedeki etkinliğinin balık yağı ve kilo verme ilacı Orlistat'a benzer olduğunu bildirmiştir. Kritik olarak, mikroalg yağı bu kilo verme etkilerini balık yağı veyaOrlistat 17'den daha erken göstermiştir. Önceki bulgular ayrıca, mikroalg yağının ticari balık yağı ve Orlistat ile karşılaştırıldığında bağırsak mikrobiyotası üzerinde belirgin ve faydalı etkiler yarattığını göstermiştir. Mikroalg yağı, genel bakteri çeşitliliğini belirgin şekilde değiştirmese de, faydalı kısa zincirli yağ asidi (SCFA) üreten bakterilerin artan bolluğu ve obezite ile ilişkili Desulfovibrio cinsi dahil patojenik taksonların azalmasıyla ilişkilendirildi. Ayrıca, mikroalg yağı bağırsak mikrobiyotasının metabolik kapasitesini olağanüstü şekilde geri kazandı; amino asitler, SCFA'lar ve safra asidi metabolizmasıyla ilgili yolları güçlendirdi ve lipopolisakkarit (LPS) biyosentezini önemli ölçüde azalttı. Bu modülasyonlar, muhtemelen lipid metabolizmasının iyileşmesinden ve kolonik mukoza bariyerinin artmasından sorumluydu; bu da mikroalg yağının obeziteyi hafifletmek için üstün bir besin takviyesi olduğunugöstermektedir 17.
Bağırsak mikrobiyot disbiyozunu MASLD gelişimiyle ilişkilendirmedeki ilerlemelere rağmen, mikrobiyal bileşim, mikrob metabolik fonksiyonları ve hepatik lipid metabolizması arasındaki spesifik ilişkiler henüz tam olarak anlaşılmamaktadır. Özellikle, mikrobiyotadaki değişiklikler ile hastalık ilerlemesi arasındaki nedensel bağlantılar net değildir ve DHA açısından zengin mikroalg yağı gibi diyet müdahalelerinin, bağırsak mikrobiyal topluluklarında ve konak metabolik profillerindeki koordineli değişikliklerle ilişkili olup olmadığı sistematik olarak araştırılmamıştır. DHA açısından zengin mikroalg yağı, omega-3 yağ asitlerinin sürdürülebilir ve verimli bir kaynağıdır ve DHA açısından zengin mikroalg yağı içeriği balık kaynaklarıyla karşılaştırılabilir. Önceki çalışmalar, DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin karaciğer steatozunu ve metabolik parametreleri iyileştirebileceğiniöne sürmüştür 18,19. Ancak, MASLD bağlamında bağırsak mikrobiyotası bileşimi ve mikrobiyal metabolik fonksiyonla ilişkisi belirsizdir.
Bu nedenle, bu çalışmada mevcut çalışma, DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin metabolik parametreler, bağırsak mikrobiyota bileşimi ve hepatik metabolomik profiller üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yüksek yağlı diyet kaynaklı fare modeli kullanmıştır. DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesinin, karaciğer lipid metabolizmasında iyileşmeler ve bağırsak mikrobiyota bileşimi ile mikrobiyal metabolik yollarda eşzamanlı değişikliklerle ilişkili olduğu varsayımlandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokolde kullanılan tüm hayvanlar, diyetler, reaktifler, kitler, aletler, yazılımlar ve hizmet sağlayıcıların detayları Materyal Tablosu'nda yer almaktadır. Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi ve Shandong İl Hastanesi Deneysel Hayvanlar Komitesi'nden onay aldı (etik onay no. 2022–007, 24 Ocak 2022'de onaylandı).
DIKKAT: Hayvan kanı, dışkı örnekleri ve dokular potansiyel biyolojik tehlikeli maddeler olarak ele alınmalıdır. Canlı hayvanlar, biyolojik örnekler, keskin maddeler, organik çözücüler ve kimyasal analiz reaktifleriyle ilgili tüm işlemler, kurumsal biyogüvenlik, hayvan bakımı ve kimyasal güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Hayvan leşleri, dokular, kanla kirlenmiş maddeler ve dışkı örnekleri belirlenmiş biyolojik tehlike atık konteynerlerinde toplanmalı ve kurumsal hayvan tesisi veya biyogüvenlik ofisi aracılığıyla bertaraf edilmelidir. İğneler, gavaj iğneleri, kapiller tüpler ve diğer keskin eşikler, onaylı keskin kaplarda kullanımdan hemen sonra atılmalıdır. Metanol, asetonitril ve formik asit içeren çözeltiler dahil organik çözücü atıkları, etiketlenmiş kimyasal atık konteynerlerinde toplanmalı ve kurumsal tehlikeli kimyasal atık programı kapsamında bertaraf edilmelidir. Biyokimyasal ve oksidatif stres testlerinden kaynaklanan atıklar, üreticinin güvenlik veri formları ve kurumsal kimyasal güvenlik kurallarına uygun olarak toplanıp bertaraf edilmelidir.
Deneysel hayvanlar
Altı haftalık erkek C57BL/6J fareleri (n = 4 her grupta) belirli patojensiz (SPF) koşullarda, 22 ± 2 °C sıcaklıklarda 12 saatlik ışık/karanlık döngü ve %50–60 göreli nem ile tutuldu. Hayvanların yiyecek ve suya ima kadar erişimi vardı, her kafeste en fazla beş fare barındırılıyordu. Kontrol fareleri, %70 karbonhidrat, %20 protein ve %10 yağ (kcal) içeren standart bir chow diyetiyle beslendi. MASLD fare modelini oluşturmak için, farelere 8 hafta boyunca %20 karbonhidrat, %20 protein ve %60 yağ (kcal) içeren yüksek yağlı bir diyet verildi. Tüm diyetler 4 °C'de saklanıyor ve haftada iki kez yenileniyordu. Fareler, rastgele sayı üreteci kullanılarak deneysel gruplara rastgele atandırıldı ve örneklem büyüklüğü (grup başına n = 4) benzer yüksek yağlı diyet fare modelleri ve ön deneyler kullanılarak yapılan önceki çalışmalara dayanarak belirlendi. Tüm tedaviler, sirkadiyen varyasyonu en aza indirmek için her gün aynı saatte uygulandı.
Mikroalg yağı, Shandong Tarım Bilimleri Akademisi tarafından yaklaşık %99 saflıkla çıkarılıp arındırıldı. Mikroalg yağı, ışıktan korunan −30 °C sıcaklıkta depolanıyordu. Uygulamadan önce, yağ bir emülgatörle hazırlanır ve homojenlik sağlamak için iyice karıştırılır. Özellikle, DHA açısından zengin mikroalg yağı, normal tuzlu salinde %0,5 Tween-80 içeren steril %0,5 karboksimetilselüloz sodyumda emülsasyon edilmiştir. Mikroalg yağı ve emülgatör aracı 1:9 (v/v) oranında karıştırıldı ve gavajdan hemen önce 2 dakika girdaba salınarak uniform süspansiyon elde edildi. Mikroalg yağı ile tedavi edilen gruptaki fareler, günde bir kez steril beslenme iğnesi ile 10 μL/g vücut ağırlığında oral garaj ile preparat almıştır. Doz tutarlılığını sağlamak için gavaj hacmi vücut ağırlığına göre günlük olarak ayarlandı. Kontrol grubundaki fareler aynı koşullarda eşdeğer miktarda steril normal salin aldı. Kullanılan tuzlu serişde %0,9 sodyum klorür enjeksiyonuydu.
Probiyotik tedavi, Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) ve Bacillus coagulans (GIM 1.645) içeren kompozit bir formülasyondan oluşuyordu. Dört suş, 1:1:1:1 eşit canlı hücre oranında karıştırıldı. Her suş nihai formülasyona 2,5 × 107 CFU/mL katkı sağladı ve toplam bakteri konsantrasyonu 1 × 10,8 CFU/mL oldu. Probiyotik karışımı Shandong Tarım Bilimleri Akademisi tarafından sentezlenmiştir ve ticari olarak mevcut değildir. Probiyotik tedavi, Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC ve Bacillus coagulans GIM 1.645 içeren kompozit probiyotik fermantasyon çorbasından oluşuyordu. Formülasyonun bakteri konsantrasyonu 1 × 108 CFU/mL idi. Probiyotik fermantasyon suyu kullanımdan önce 4 °C'de saklandı. Probiyotikle tedavi edilen gruptaki fareler, deney dönemi boyunca günde bir kez oral garaj ile 0,01 mL/g vücut ağırlığı dozunda probiyotik formülasyonu aldılar.
Bireysel suşlar uygun koşullarda kültürlendi ve orta log büyüme aşamasında (OD₆₀₀ ≈ 0.6) hasat edildi, ardından belirtilen oranda birleştirildi. Bakteriyel kültürler santrifüjlenerek üst sıvıyı çıkardı ve pelletler steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile yeniden süspansiyona getirildi. Yeni hazırlanmış bakteriyel süspansiyon, uygulanabilirliği korumak için uygulamadan önce buzda tutuldu. Nihai bakteri konsantrasyonu uygulamadan önce 1 × 108 CFU/mL olarak ayarlandı. Probiyotik grubundaki fareler, deney dönemi boyunca günde bir kez vücut ağırlığı 0.01 mL/g dozda oral garaj ile formülasyonu aldı. Probiyotik uygulamasından önce antibiyotik ön tedavisi uygulanmadı. Deneysel yanlılığı azaltmak için, sonuç değerlendirmesi uygun olduğunda kör araştırmacılar tarafından yapıldı. MASLD kan biyokimyasal analiziyle doğrulandı.
Kan analizi
Deneysel dönemin sonunda, fareler gece boyunca (12 saat) açlık tutulur, glukoz ölçümü ve terminal kan alımı öncesinde suya serbest erişim sağlanır. Fareler, pedal refleksinin kaybı doğrulana kadar anestezi buharlaştırıcısı kullanılarak izofluran ile derin anestezi altına alındı. Terminal kan örnekleri retro-orbital kanama ile alındı. Kan alındıktan sonra, fareler derin anestezi altında servikal dislokasyon ile ötanazi edildi ve solunum ve kalp atışının kesilmesiyle ölüm doğrulandı. Kan oda sıcaklığında pıhtı oluşmasına izin verildi ve ardından serum elde etmek için 3.000 × g sıcaklıkta 10 dakika santrifüj edildi. Serum örnekleri aliquote edilip analiz yapılana kadar −80 °C'de saklandı. Serum glikozu, toplam kolesterol (TC), trigliseritler (TG), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-c), yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-c), aspartat aminotransferaz (AST) ve alanin aminotransferaz (ALT), üreticinin talimatlarına uygun olarak otomatik biyokimyasal analizör kullanılarak ölçüldü. Bu parametreler, analizör sistemine entegre edilmiş standart reaktif kitleriyle enzimatik kolorimetrik testler kullanılarak nicelendirildi. Tüm biyokimyasal parametreler serum hacmine normalleştirilmiş ve üretici tarafından belirtilen birimlerle ifade edilmiştir.
Oksidatif stres testleri
Oksidatif stres biyobelirteçleri, malondialdehit, süperoksit dismutaz ve katalaz için olanlar da dahil olmak üzere kitlerle ölçüldü. Testler üreticinin talimatlarına uygun olarak yapıldı. Kısa bir süreliğine, karaciğer dokuları buz gibi tampon içinde homojenleştirildi ve analiz için süpernatanlar elde etmek üzere santrifüjlendi. Malondialdehit (MDA) seviyeleri, tiyobarbiturik asit reaktif maddeler (TBARS) testi kullanılarak belirlendi; süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, süperoksit aracılı reaksiyonları engelleyebilme yeteneğiyle ölçüldü; ve katalaz (CAT) aktivitesi, hidrojen peroksitin ayrışma oranı izlenerek nicelendirildi. Ölçümler bir mikroplaka okuyucu kullanılarak yapıldı ve değerler standart eğriler veya kitlerde sunulan formüller kullanılarak hesaplandı. Oksidatif stres belirteçleri karaciğer dokusu ağırlığına normalize edilip, üreticinin spesifikasyonlarına göre ifade edildi.
16S rRNA dizilemesi ve mikrobiyom analizi
Deney döneminin sonunda bireysel farelerden steril koşullarda doğrudan dışkı örnekleri toplandı, hemen sıvı azotta donduruldu ve DNA çıkarımı yapılana kadar −80 °C'de saklandı. Mikrobiyal DNA, üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanılarak çıkarıldı. Bakteriyel 16S rRNA geninin V3–V4 bölgesi, 341F/806R primerleri kullanılarak amplifikasyon yapıldı. PCR amplifikasyonu, şablon DNA, 2x PCR master karışımı ve her primerden 0,2 μM içeren 25 μL reaksiyon sisteminde gerçekleştirildi. Amplifikasyon programı, ilk denatürasyondan oluşuyordu ve 95 °C'de 3 dakika sürdü, ardından 30 saniye için 95 °C, 30 saniye için 55 °C ve 45 saniye 72 °C ile 25 döngü, son uzatma ise 72 °C'de 10 dakika yapıldı. Amplicon kütüphaneleri, ticari bir dizileme hizmet sağlayıcısı tarafından çiftli uçlu 2 × 250 bp stratejisiyle bir Illumina MiSeq platformunda oluşturulmuş ve sıralanmıştır. Kütüphane kalitesi dizelemeden önce değerlendirildi ve havuza alınan kütüphaneler üreticinin önerdiği küme yoğunluğunda yüklendi. Düşük kaliteli okumalar, belirsiz temeller, yetersiz uzunluk veya Q20'nin altında ortalama kalite puanı olan okumalar, sonraki analizden önce kaldırıldı.
Ham dizileme okumaları QIIME 2 sürüm 2019.420 kullanılarak işlendi. Kısaca, eşleştirilmiş uç okumaları, varsayılan parametrelerle DADA2 kullanılarak demultiplex, kalite filtreli, gürültü giderilmeli, birleştirilmiş ve kimera filtresi ile filtrelenmiştir, aksi belirtilmedikçe. Tekil olmayan amplikon dizisi varyantları (ASV'ler) aşağı akış analizi için tutuldu. Taksonomik atama, QIIME221'de uygulanan Greengenes veritabanı 13_8 sürümü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 16S rRNA gen dizilemesinin doğal çözünürlük sınırlamaları göz önüne alındığında, özellikle Greengenes veritabanı kullanılırken, taksonomik açıklamalar yalnızca cins düzeyinde yorumlanmıştır. Tür düzeyinde sınıflandırma güvenilir görülmediği için herhangi bir sonraki analizde, istatistiksel karşılaştırmada veya biyolojik yorumlarda kullanılmadı. Tüm mikrobiyal özellikler görselleştirme ve analiz öncesinde cins seviyesine indirildi.
Alfa-çeşitlilik metrikleri (Chao1, Gözlemlenen tür, Shannon, Simpson, Faith'in PD'si ve Pielou'nun eşitliği) kullanıldı. Gruplar arasındaki alfa çeşitliliğinin istatistiksel karşılaştırmaları, uygun parametrik olmayan testler (örneğin Kruskal–Wallis testi) kullanılarak gerçekleştirildi. Jaccard mesafesi ve Bray-Curtis farklılığı beta çeşitliliği ölçütleri olarak kullanıldı. Mikrobiyom topluluklarındaki değişiklikleri göstermek için Ana Koordinat Analizi (PCoA) grafikleri, metrik olmayan çok boyutlu ölçeklendirme (NMDS) ve doğrusal ayrımcı analiz etkisi boyutu (LEfSe) kullanılarak LDA puan eşiği 2.0 oldu. Beta çeşitliliğinde istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için permütasyonel çok değişkenli varyans analizi (PERMANOVA) kullanıldı. Veri görselleştirme ve istatistiksel analizler GenesCloud platformu (https://www.genescloud.cn) kullanılarak gerçekleştirildi.
Mikrobiyal fonksiyonel profiller, doğrudan pompalı metagenomik veya transkriptomik dizileme ile ölçülmek yerine 16S rRNA dizileme verilerinden çıkarılmıştır. Normalize edilmiş yol veya fonksiyonel grup bolluk tablosuna dayanarak, öngörülen fonksiyonel birimler KEGG, MetaCyc ve COG gibi yaygın kullanılan veritabanlarına eşlendi. KEGG yol bolluğu, hiyerarşik fonksiyonel kategorilerine göre özetlenmiş, aşağı akış karşılaştırması için seviye 2 yol sınıflandırmaları kullanılmıştır. Her yol kategorisinin ortalama bolluğu R yazılımı kullanılarak hesaplandı.
Karaciğer örneklerinin hedefsiz metabolomik analizi
Karaciğer dokuları, ölüm doğrulandıktan hemen sonra hızla çıkarıldı, hemen sıvı azotta donduruldu ve analiz öncesi −80 °C sıcaklıkta saklandı. Yaklaşık 50 mg donmuş karaciğer dokusu, buz gibi metanol:suda (4:1, v/v) ve iç standartlarla desteklenerek homojenize edildi. Doku-ekstraksiyon çözücü oranı 1:10 (w/v) idi. Örnekler 1 dakika girdabla geçirildi, 10 dakika buzda soniklendi ve ardından protein çökelmesini artırmak için −20 °C'de 30 dakika kuluçka altına alındı. Homojenatlar iyice karıştırıldı, buz üzerinde sonikasyona maruz kaldı ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatanlar dikkatlice toplanmış, hafif bir azot akışı altında buharlaştırılmış ve sonraki analiz için %50 metanol içinde yeniden oluşturulmuştur.
Kalite kontrol (QC) örnekleri, her örnekten eşit hacimlerin toplanmasıyla oluşturuldu ve analiz boyunca aralıklı olarak analiz edilip, analitik kararlılık ve tekrarlanabilirlik değerlendirildi. Hedefsiz metabolomik analizi, ticari bir hizmet sağlayıcısı tarafından işletilen, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Metabolitler, %0,1 formik asit içeren su ve %0,1 formik asit içeren asetonitril içeren ikili çözücü sistemiyle ters faz C18 kolonunda ayrılmıştır. Enjeksiyon hacmi 2 μL, kolon sıcaklığı 40 °C'de tutuldu ve akış hızı 0,30 mL/dakika olarak ayarlandı. Geniş metabolit ayrımı sağlamak için gradyan elüsyon programı kullanıldı. Kütle spektrometrik tespiti, geniş metabolit kapsamı sağlamak için 70–1.000 m/z aralığında hem pozitif hem de negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında gerçekleştirildi. İyon püskürtme voltajı pozitif modda 3,5 kV, negatif modda −2,5 kV olarak ayarlandı. Kapiller sıcaklık 320 °C'de tutuldu ve veriler, metabolit açıklaması için veriye bağlı MS/MS toplama ile tam tarama MS modunda alındı. Ham veriler, özellik tespiti, hizalama ve normalizasyon için özel metabolomik yazılımı (MassLynx v4.1) kullanılarak işlendi. Metabolit tanımlaması, doğru kütle, tutma süresi ve MS/MS parçalanma desenleri doğrultusunda, İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) (v2023) dahil olmak üzere kamu veri tabanlarıyla karşılaştırıldığında gerçekleştirilmiştir.
Çok değişkenli ve yol analizi
İşlenen metabolomik veriler, deneysel gruplar arasındaki metabolik farkları görselleştirmek için ana bileşen analizi (PCA) ve kısmi en küçük kare diskriminant analizi (PLS-DA) dahil olmak üzere çok değişkenli istatistiksel analizlere tabi tutuldu. Diferansiyel metabolitler, projeksiyon (VIP) puanlarında değişken önemi (>1.0) ve istatistiksel anlamlılık (p < 0.05) kombinasyonuna dayanarak tanımlandı. Tanımlanan metabolitler, DHA açısından zengin mikroalg yağı takviyesiyle ilişkili biyolojik süreçleri aydınlatmak için KEGG yol zenginleştirme analizi kullanılarak metabolik yollara daha da haritalandı.
İstatistiksel analiz
Veriler, ortalama ± SEM olarak sunuldu ve tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi, ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı. Karaciğer metabolitlerinin zenginleştirme analizi R (versiyon 4.4.1) kullanılarak gerçekleştirildi. Mikrobiyal cinsler ile karaciğer metabolitleri arasındaki çiftli ilişkiler, Spearman sıralama korelasyonları kullanılarak analiz edilmiştir. Yalnızca |ρ| ile anlamlı korelasyonlar (yanlış keşif oranı, FDR < 0.05) ≥ 0.6 entegre ağ analizlerine dahil edildi. Mikrobiyom ve metabolomik veri işleme yukarıdaki gibi gerçekleştirildi; GenesCloud platformunun kullanımı ve kalite kontrol prosedürleri dahil olmak üzere.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
DHA açısından zengin mikroalg yağı, HFD kaynaklı MASLD farelerinde lipid metabolizması, karaciğer hasarı ve karaciğer oksidatif stresini iyileştirir
Diyet takviyelerinin glikoz ve lipid homeostazı üzerindeki etkisini değerlendirmek için biyokimyasal parametreler beş grupta değerlendirildi: düzenli chow (RC), yüksek yağlı diyet (HFD), DHA açısından zengin mikroalg yağlı, probiyotik takviyeli ve birleşik DHA zengin mikroalg yağı + probiyotik tak...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Son yıllarda, MASLD ile bağlantılı mikrobiyomdaki değişiklikleri araştıran birkaç çalışma. Ancak, bu çalışmaların çoğu, sağlıklı bireyleri MASLD hastalarıyla karşılaştırmaya veya farklı steatosisdereceleri 24'ü incelemeye odaklanmıştır. Sonuç olarak, MASLD'de karaciğer fibrozisiyle ilişkili spesifik bağırsak mikrobiyotası değişikliklerini detaylandıran hâlâ sınırlı kanıt vardır; ancak fibroz hasta sonuçlarını tahmin etmede en kritik faktördür. Bu çalışmada, HHD ka...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Bu araştırma, Çin'in Shandong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ("Çin Ulusal Ana Ar-Ge Programı" No. 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) ve Çin'in Shandong Eyaleti Modern Tarım Teknolojisi Sanayi Sistemi (Hibe numarası: SDAIT-26) tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japonya | RR902A | 16S rRNA PCR amplifikasyonu için kullanılır |
| Asetonitril | Merck, Almanya | 100030 | UHPLC mobil faz için kullanılan çözücü |
| Anestezi buharlaştırıcısı | RWD Yaşam Bilimleri | R580 | Farelere izofloran anestezisi vermek için kullanılır |
| Otomatik biyokimyasal analizör | Jian Cheng Biyolojik Mühendislik Enstitüsü, Nanjing, Çin | A110-1 & A111-1 | Serum parametrelerini (glikoz, TC, TG, LDL-c, HDL-c, AST, ALT) ve karaciğer lipid seviyelerini ölçür |
| Bacillus koagulans (GIM 1.645) | Guangdong Mikrobial Kültür Toplama Merkezi, Çin | GIM 1.645 | Probiyotik formülasyonun bileşen suşu |
| Karboksimetilselüloz sodyum (CMC-Na) | Sigma-Aldrich, ABD | C4888 | DHA açısından zengin mikroalg yağı hazırlamak için emülgatör bileşeni olarak kullanılır |
| Katalaz (CAT) test kiti | Nanjing İnşaat Ltd. | A007-1-1 | Karaciğer dokusunda antioksidan kapasite göstergesi olan CAT aktivitesini tespit eder |
| DADA2 yazılım paketi | DADA2 Geliştirme Ekibi | QIIME 2 v2019.4'e dahil edilmiştir | Dizileme okumalarında ses kalitesi azaltma ve chimera filtreleme için kullanılır |
| DHA açısından zengin mikroalg yağı (Schizochytrium sp. türemiş) | - | - | Dokosaheksaenoik asit (DHA) açısından zengin; 10µ'da her gün gavage ile uygulanır; Deneysel müdahale olarak L/g |
| Deneysel hayvanlar (Erkek C57BL/6J fareleri) | Pekin Vital Nehri Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi Şirketi. | - | 6 haftalık, n = her grup için 4; HFD beslemesi yoluyla MASLD modelinin kurulması için kullanılır |
| Formik asit | Sigma-Aldrich, ABD | F0507 | Metabolomik analizi için mobil faz ekleme |
| Greengenes veritabanı | Greengenes | Sürüm 13_8 | Mikrobiyal taksonomik atamada kullanılır |
| Yüksek Yağlı Diyet (HFD) | Research Diets Inc., ABD | D12492 | %20 karbonhidrat, %20 protein, %60 yağ (kcal) içerir; MASLD tetiklemek için 8 hafta beslendi |
| Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi | Thermo Fisher Scientific, ABD | Q Exactive Orbitrap | Pozitif ve negatif iyon modlarında metabolit algılamasında kullanılır |
| İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB) | Alberta Üniversitesi, Kanada | 2024 sürümü | Kamuya açık metabolit açıklama veritabanı |
| Illumina MiSeq platformu | Illumina, Inc., ABD | MiSeq Sistemi | Çiftli uçlu 2 ve Times için kullanılır; 250 bp dizileme |
| İzofluran | Merck, Almanya | PHR2874 | Farelerde inhalasyon anestezisi için kullanılır |
| Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) | Kanehisa Laboratuvarları, Japonya | Sürüm 2023 | Yol zenginleştirme ve metabolit açıklaması için kullanılan veritabanı |
| Lactobacillus acidophilus (KDB-03) | Shandong Tarım Bilimleri Akademisi, Çin | - | Probiyotik formülasyonun bileşen suşu |
| Lactobacillus casei (KDB-LC) | Shandong Tarım Bilimleri Akademisi, Çin | - | Probiyotik formülasyonun bileşen suşu |
| Lactobacillus plantarum (DY-1) | Shandong Tarım Bilimleri Akademisi, Çin | - | Probiyotik formülasyonun bileşen suşu |
| Sıvı azot | Air Liquide | - | Hızlı dondurma ve dışkı ile karaciğer örneklerinin korunması için kullanılır |
| Malondialdehit (MDA) test kiti | Nanjing İnşaat Ltd. | A003-1 | Karaciğer dokusunda MDA (lipid peroksidasyon/oksidatif hasarın bir belirteci) tespit eder |
| MassLynx yazılımı | Waters Corporation, ABD | Sürüm 4.1 | Metabolomikte ham veri işleme, özellik çıkarma ve normalleştirme için kullanılır |
| Metanol | Merck, Almanya | 106035 | Metabolit ekstraksiyonu için kullanılan çözücü |
| Mikrobiyom veri analiz platformu | Genescloud | V1 | Çevrimiçi platform: https://www.genescloud.cn/home; PCoA, NMDS, LEfSe ve diğer mikrobiyom görselleştirme analizleri için kullanılır |
| OMEGA Toprak DNA Kiti | Omega Bio-Tek, Norcross, GA, ABD) | (M5635-02) | DNA İzolasyonu |
| OTU'nun referans dizileri | Genescloud | McDonald ve ark. 2012'den kaynaklıdır; amplikon dizisi varyantlarının (ASV) taksonomisi atamasında kullanılır | |
| Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, ABD | 10010023 | Bakteriyel pellet yeniden süspansiyonu için kullanılır |
| Astar 341F/806R | Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Çin | - | 16S rRNA V3&ndash'ın amplifikasyonu için kullanılmıştır; V4 bölgesi. 341F: 5′-CCTACGGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| Probiyotikler | - | - | Açıkça belirtilmemiş belirli suşlar; karşılaştırmalı bir müdahale olarak kullanılır (esas olarak glukoz homeostazını iyileştirir) |
| QIIME 2 yazılımı | - | 2019.4 | Mikrobiyom biyobilişim analizi için kullanılır (ASV işleme, alfa/beta çeşitlilik hesaplaması) |
| R yazılımı | - | 4.4.1 | Karaciğer metabolit zenginleştirme analizi ve mikrobiyal-metabolit ilişkilerinin Spearman korelasyon analizi için kullanılır |
| Soğutmalı santrifüj | Eppendorf, Almanya | 5810R | Serum ve metabolomik örnek santrifüjasyonu için kullanılır |
| Ters faz C18 kolonu | Waters Corporation, ABD | 186002350 | Metabolitlerin kromatografik ayrımı için kullanılır |
| Salin | Shijiazhuang No.4 İlaç | 2211112304 | Kontrol grubuna her gün gawage ile uygulanır (mikroalg yağı tedavisi yerine |
| Standart chow diyeti | Keao Xieli Feed Ltd., Çin | 1016706714625204224 | %70 karbonhidrat, %20 protein, %10 yağ (kcal) içerir; kontrol (RC) grubuna beslenir |
| Steril besleme iğnesi | Instech Laboratuvarları, ABD | FTP-20-38 | Oral gavaja uygulaması için kullanılır |
| Süperoksit dismutaz (SOD) test kiti | Nanjing İnşaat Ltd. | A001-3 | Karaciğer dokusunda antioksidan kapasite göstergesi olan SOD aktivitesini tespit eder |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, ABD | P4780 | DHA açısından zengin mikroalg yağı hazırlamak için emülgatör bileşeni olarak kullanılır |
| Ultrasonik homojenizer | Scientz Biotechnology, Çin | JY92-IIN | Metabolit ekstraksiyonu sırasında karaciğer dokusu sonikasyonu için kullanılır |
| Hedefsiz Hepatik Metabolomik | Metabo-Profile Biyoteknoloji (Şanghay) Şirketi, Ltd. | Proje Kodu: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| Vortex mikser | Thermo Fisher Scientific, ABD | LP Vortex Mikser | Örnek homojenizasyonu ve emülsifikasyonu için kullanılır |
Bu makale yayımlandı
Video yakında