Method Article

Pluripotent kök hücrelerin ilkel germ hücre benzeri hücrelere ayırılması protokolü

DOI:

10.3791/71172

⸱

July 3rd, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3Ghent-Fertility and Stem Cell Team (G-FAST), Department of Reproductive Medicine, Ghent University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden, bazal membran ekstraktı kaplamalı 2D monolayer tabanlı bir yöntemle sağlam bir şekilde ilkel germ hücresi benzeri hücreler oluşturmak için adım adım bir rehber.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücre farklılaşmasının in vitro kullanımı, in vivo erken gelişim sırasında gerçekleşen soy tanım olaylarının anlaşılmasını önemli ölçüde genişletmiştir; bu dönemin araştırılması son derece zordur. İnsan embriyosunda belirtilen ilk embriyon hatlarından biri, ilkel germ hücrelerin (PGC) indüksiyonuyla işaretlenen germ hücre soyudur. PGC'ler, gametlerin sonraki yaşamdaki tek kurucu popülasyonudur ve bu özelliklerin belirlenmesi, organizmanın doğurganlığına doğru kritik bir ilk adımdır. Burada, insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) PGC benzeri hücreler (PGCLC) üretmek için sağlam bir protokol tanımlanır; bu protokol, etkili PGCLC farklılaşmasını sağlamak için hiPSC'lerin pluripotent durumu ve hücresel özelliklerinin ilk değerlendirmesinden başlamaktadır. Bunun için, farklı hücre yoğunluklarının, plaka kaplamalarının ve PGCLC farklılaşması için kullanılan hiPSC'lerin etkileri tartışılır. Son olarak, immünofluoresans ve akış sitometrisi kullanılarak hPGCLC'lerin karakterizasyonu ve nicelendirilmesi için bir iş akışı sağlanır. Farklılaştırma protokolü, çoğu laboratuvarda kolayca belirlenebilen ve test edilebilen ve gerektiğinde ayarlanabilen durumlara odaklanır. Ayrıca, bu protokol hızlıdır ve hiPSC'lerin PGCLC farklılaştırması için uygun olup olmadığının belirlenmesini sağlar. Protokol, farklı hiPSC hatları ve kültür platformları arasında hPGCLC sonuçlarında tutarlılık ve uyumluluğu teşvik etmeyi, insanlarda başarılı in vitro gametogenez'e doğru güvenilir karakterizasyonu ve aşağı akış farklılaşma adımlarının daha fazla optimize edilmesini destekleyen sağlam verimler sağlamayı amaçlamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan germline gelişimi, embriyonik gelişimin erken döneminde başlayan ve nihayetinde oositler ve sperm hücrelerinin oluşmasına yol açan ilkel germ hücrelerin (PGC) tanımlanmasıyla başlayan son derece koordineli birsüreçtir. In vivo, PGC spesifikasyonu komşu hücrelerden gelen tümevarımsal sinyallere yanıt olarak implantasyondan kısa bir süre sonra 2,3 gerçekleşir. PGC'lerin gelişimi, özellikle BMP, WNT ve TGFβ 6,7,8,9 gibi sinyal yollarının dahil olduğunu gösteren genetik çalışmalarla kemirgenlerde kapsamlı şekilde incelenmiştir. Spesifikasyonun ardından, PGC'ler epigenetik yeniden programlamadan geçer; genom çapında DNA demetilasyonu ve kromatin yeniden modellenmesi ile karakterize edilir; böylece daha sonra (cinsiyete özgül) germ hattıkimliği 10,11,12,13,14 belirlenir.

Memelilerde PGC spesifikasyonu, sinyal yolları arasında koordineli çapraz iletişim yoluyla yönlendirilir ve bazı unsurlar insanlar, insan dışı primatlar, domuzlar ve fareler arasında evrimsel olarak korunur; bunlar arasında POU5F1 ve NANOG 9,15,16,17,18 gibi pluripotensi faktörlerin katılımı da vardır . Ortak özelliklere rağmen, türe özgü farklılıklar, PGC farklılaşma mekanizmaları ve gen düzenleyici ağlar, hayvan modellerinden insanlara doğrudan geçişisınırlar 9,19,20,21.

İnsanlarda gametogenezi anlamak için insan materyali kullanılarak yapılan çalışmalar gereklidir, ancak erken insan embriyolarına sınırlı erişim nedeniyle hâlâ zordur. İnsan primordial germ hücre benzeri hücrelerin (hPGCLC) insan pluripotent kök hücrelerinden in vitro farklılaşmasını sağlayan protokollerdeki sürekli ilerlemeler, insan gonadal dokusuna olan bağımlılığı azaltırken, ölçeklendirme ve genetik çalışmaları mümkünkılmıştır 18,22. hPGCLC farklılaştırma için çoğu yerleşik strateji, üç boyutlu (3D) agregalara veya embriyoid cisimleredayanır 18. Bu platformları kullanarak, hPGCLC'lerin erken insan PGC'lerinin temel epigenetik özelliklerini özetlediğini göstermiştir; bunlar arasında germline transkripsiyonprogramları 23,24 ve genom çapında DNA metilasyon yenidenprogramlama 25 dahildir. Bu in vitro platformlar, insan PGC biyolojisi hakkında, soy bağlılığı ve epigenetik sıfırlama dahil olmak üzere önemli ölçüde gelişmiş bilgilere sahiptir. Ancak, toplama tabanlı hPGCLC farklılaştırma protokolleri zaman alıcı olmaktan hâlâ zordur ve sağlam epigenetik karakterizasyon, ek farklılaşma testleri veya yüksek verimli deneysel uygulamalarda kullanım için hPGCLC'lerin toplam verimini düşük kalır.

Son zamanlarda, seyreltilmiş bazaz membran ekstraktı (BMEx) ile düşük BMP4 seviyeleri kullanılarak hiPSC'leri hPGCLC'lere ayırt etmek için 2D tek katmanlı besleyicisiz bir yöntem, doku kültür plakalarında nispeten kolay ölçeklendirilmiş ve kısa bir farklılaşma penceresi (5 gün) içinde yüksek verimlilik (~%55) elde edilmiştir.26. İndüksiyondan önce ara bir Activin A priming adımı gerektiren ve daha yüksek BMP4 konsantrasyonları (40–50 ng/mL)27,28 kullanan diğer 2B sistemlerle karşılaştırıldığında, bu BMEx yaklaşımı ön indüksiyon adımı gerektirmedi ve daha düşük BMP4 seviyeleri (10 ng/mL) kullandı, benzer verimlilik ve gelişmiş ölçeklenebilirliği korudu.

Burada, 2D hPGCLC BMEx-farklılaşma protokolünün ayrıntılı ve adım adım rehberi sunulur; hiPSC bakımının ilk değerlendirmesi, plüripojenlik ve hücresel özellikler dahil olmak üzere, ardından farklı hiPSC plaka kaplamaları ve hücre yoğunluklarının hPGCLC farklılaşması üzerindeki etkileri test edilir. Ayrıca, akış sitometrisi analizi ve immünofluoresans ile sonraki karakterizasyon da tanımlanır. Laboratuvar sapmalarını azaltmak için kritik işleme noktaları ve sorun giderme rehberliği sağlanır; bu da araştırmacıların hPGCLC farklılaşmasını bu 2D formatta tutarlı şekilde yeniden üretebilmelerini sağlar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC), LUMC Biobank & Biomaterials (TCBio) ve LUMC Leiden hiPSC Merkezi'nin (BB24.037 kapsamında) yönergelerini ve yönetmeliklerini takip etmektedir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve kontrol erkek (XY) hiPSC hatları (M54 ve M199) Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir. Tüm doku kültürü işlemleri, nemlendirilmiş normoksik kuluçka makinesi (37 °C, %5CO2), çok amaçlı tezgah santrifüjü (salıncak kovalı rotor) ve stereomikroskoplu Sınıf II biyogüvenlik kabini ile donatılmış özel bir Biyogüvenlik Seviye 2 doku kültür odasında gerçekleştirildi.

DIKKAT: Tüm hiPSC hatları hPGCLC 26,29'a ayrılamaz. Ancak, PGCLC farklılaştırması için başka hiPSC'ler kullanıldı ve PGCLC gözlemlendiyse, burada açıklanan yöntem (Şekil 1A) hPGCLC üretiminin ölçeklendirilmesine olanak tanır.

1. HiPSC kültürü için doku-kültür plakalarının kaplanması

Bu protokol, doku kültür plakalarını hem seyreltilmiş BMEx hem de vitronectin ile kaplamayı anlatır.

  1. Bazal membran ekstraktı (BMEx) kaplaması
    1. Buzda bir BMEx aliquotu erit. Bu Geltrex, Cultrex veya Matrigel olabilir.
    2. Bazal zar ekstraktının aliquotunu soğuk DMEM/F12'de son konsantrasyona (v/v) kadar seyreldin ve nazikçe tekrar süzültün.
    3. 6 kuyuyla bir plakanın istenen kuyu sayısını, her kuyu başına 1 mL seyreltilmiş BMEx ile kaplayın.
    4. Kaplamalı plakayı en az 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: Kaplı plakalar 2–8 °C sıcaklıkta 1 haftaya kadar saklanabilir. 2–8 °C sıcaklıkta saklanan kaplamalı plakalar kullanılırken, plakayı en az 10 dakika 37 °C'de kuluçka altına alın ve ardından daha fazla kullanın.
  2. Vitronectin kaplama
    1. Oda sıcaklığında (RT) bir vitronektin aliquotunu 10–15 dakika eritin.
    2. Vitronektini kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de son 5 μg/mL konsantrasyona kadar seyreldin ve nazikçe tekrar süzülürün.
    3. 6 kuyu plakasının istenen kuyu sayısını, her kuyu başına 1 ml seyreltilmiş vitronektin ile kaplayın.
    4. Kaplamalı 6 kuyu plakayı RT'de 1 saat kuluçka edin.

2. HiPSC'lerin bakımı için geçiş

  1. Kültür ortamı hazırlayın: serumsuz hücre kültürü ortamı mTeSR Plus, mikoplazma kontaminasyon-önleme çözeltisi (MycoZap (1:1000)) ile takviye edilmiştir.
  2. Geçiş için hazır hücrelerden kültür ortamını aspire edin.
  3. Her kuyuya 0,5 mL insan PSC seçimi ve geçiş ajanı (ReLeSR) ekleyin ve bunu 1 dakika içinde aspire edin. Hücrelerin üzerinde çok ince bir tabaka bırakıldığından emin olun.
  4. Hücreleri 37 °C'de 6 dakika kuluçka altına alın.
  5. 6 kuyu plakanın kenarlarına birkaç kez dokun.
  6. Hücreleri 1 mL kültür ortamı ile dikkatlice p1000 pipetiyle yukarı aşağı pipet ederek ayırın ve koloni parçalarının boyutlarını düzenli olarak kontrol ederek 50–200 μm arasında tutun.
  7. Önceden kaplanmış 6 kuyu plakalarını alın ve kaplama çözümünü çıkarın (Adım 1).
  8. Her kuyuya 2 ml kültür ortamı ekleyin.
  9. Ayrılmış hiPSC koloni parçalarını içeren kültür ortamını istenen oranda yeni kuyuya aktarın.
    NOT: HiPSC koloni parçalarını bölmek için ideal oran 1:6-1:50 olup, her 4–7 günde bir geçiş yapılmasına izin verir.
  10. Hücre kültür plakasını, geçit edilen hiPSC koloni parçalarıyla birlikte nemlendirilmiş normoksik kuluçka makinesine (37 °C, %5CO 2) yerleştirin.
  11. Kültür ortamını her iki günde bir 2 mL kültür ortamı ile yenileyin, ta ki hiPSC'ler tekrar geçişe hazır olana kadar.
    NOT: Hafta sonu tazeleme ihtiyacını önlemek için her 6 mL yerine 2 mL kültür ortamı ekleyin.
    DIKKAT: Birleşme çok düşük olduğunda hiPSC'leri geçmeyin ve birleşme çok yüksek olduğunda sağlıklı bir hiPSC kültürünü korumak ve kendiliğinden farklılaşmayı önlemek için kültürü atmayın.

3. hPGCLC farklılaşması

  1. hPGCLC farklılaşmadan önce hazırlık (0. Gün).
    1. hPGCLC farklılaştırmaya başlamadan önce hiPSC'lerin kültür ortamını 1 saat yenileyin.
    2. Kaplama çözeltisini hazırlayın: %1 BMEx çözeltisi soğuk DMEM/F12 içinde seyreltilmiş v/v.
    3. 12 kuyululu bir plakanın istenen kuyu sayısını 0,5 mL kaplama çözeltisi ile kaplayın.
    4. Kaplamalı plakayı 37 °C'de en az 30 dakika kuluçka altına alın, sonra farklılaştırmaya başlayın.
    5. Kaplama ortamını: %2 (v/v) BMEx çözeltisi soğuk kültür ortamında hazırlayın ve bunu erime sonrası iyileşme ortamı (RevitaCell) (1:100) ile takviye edin.
      DIKKAT: HiPSC'lerin hazırlanması ve kaplaması sırasında kaplama ortamını buz üzerinde tutun.
  2. hPGCLC farklılaşması için hiPSC kaplaması (0. Gün).
    1. hPGCLC farklılaştırma için kullanılmak üzere hiPSC'leri içeren 6-kuyruklu kültür ortamını çıkarın. %50–80 birleşimde yüksek kaliteli hiPSC'lerle başlayın, spontan farklılaşma belirtisi olmadan.
    2. Her kuyuya 1 mL tripsin çözeltisi (TripLE) ekleyin.
    3. HiPSC'leri 37 °C'de 5 dakika kuluçka edin.
    4. Tek hücreli bir askıya alma işlemi yapın; hiPSC kolonileri p1000 pipetiyle dikkatlice 2–3 kez yeniden süspansiyona alın.
    5. Tek hücreli süspansiyon elde edilip edilmediğini ters mikroskop altında kontrol edin. Eğer olmazsa, hiPSC kolonilerini p1000 pipetiyle 1–2 kez daha askıya alın.
    6. HiPSC hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    7. 15 mL tüpe 4 mL DMEM-F12 orta madde ekleyin.
    8. HiPSC hücre süspansiyonunu 200 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    9. Süpernatantı aspire edin ve hiPSC hücrelerini 0,5–1,0 mL kaplama ortamında dikkatlice yeniden süspansiyona yerleştirin.
    10. Hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hiPSC sayısını sayın ve hPGCLC farklılaşması için her kuyu başına gereken hiPSC sayısını hesaplayın.
      NOT: Başlangıç noktası olarak, 40–80K hücre/cm2 kaplama yoğunluğu kullanılabilir. Ancak, her hücre hattı ve her geçiş sayısında, optimal verim elde etmek için kaplama yoğunluğu optimizasyonu önerilir. Burada, hiPSC'ler 10K ila 100K hücre/cm2 kaplama yoğunluğunda kaplama yapıldı.
    11. Gerekli sayıda hiPSC'yi uygun hacimdeki kaplama ortamında dikkatlice yeniden askıya alın (12 kuyululu bir plaka için her kuyuya 1 mL) ve p1000 pipeti kullanılarak homojen bir hücre süspansiyonu elde edilmesinden emin olun.
    12. Kuluçka makinesinden kaplı 12 kuyu plakasını alın ve kaplama çözeltisini çıkarın.
    13. 12 kuyruklu plakanın her kuyusuna 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
    14. Hücrelerin kuyunun içinde eşit şekilde dağıtıldığından emin olmak için plakayı dikkatlice sallayın.
    15. 12 kuyu plakasını nemlendirilmiş, normoksik bir kuluçka makinesine (37 °C, %5CO2) 16–24 saat boyunca yerleştirin.
  3. hPGCLC farklılaşması (1–2. Gün)
    1. RB27 bazal ortamı hazırlayın: B-27 ile gelişmiş RPMI160 (1:100), 1X aminoasit ikamesi (Glutamax), 1X MEM temel olmayan amino asitler ve mikoplazma kontaminasyon önleme çözeltisi (1:1000).
    2. Soğuk RB27 bazal ortamında %2 (v/v) BMEx çözeltisi hazırlayın ve BMP4'ü son konsantrasyona 10 ng/mL ekleyin. Bazal zar ekstraktı, lumenogenezi tetiklemek ve in vivo PGCLC spesifikasyonunu tetiklemek için gereklidir.
      DIKKAT: Farklılaştırma ortamını buz üzerinde veya 4 °C'de tutun. Farklılaştırma medyası, farklılaştırma protokolünün 1. ve 2. günleri için hazırlanabilir.
    3. 1. gün (hiPSC'ler plata yapıldıktan sonra 16–24 saat içinde), tabağı kuluçka makinesinden alın ve kaplama ortamını çıkarın.
    4. Kuyu başına 0.5 mL RB27 bazal ortam ekleyerek kuyuları yıkayın.
    5. RB27 bazal ortamını aspire edin ve her kuyuya 1 mL farklılaştırma ortamı ekleyin.
    6. Plakayı hücrelerle birlikte nemlendirilmiş normoksik kuluçka makinesine (37 °C, %5CO2) yerleştirin.
    7. Farklılaşmanın 2. gününde, hücreleri her kuyu başına 1 mL farklılaşma ortamı ile yenileyin.
  4. hPGCLC farklılaşması (3–5. Gün)
    1. Anahtar ortamı hazırlayın: RB27 bazal ortam, BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) ve EGF (50 ng/mL) ile takviye edilmiş. Anahtar ortamı, hPGC spesifikasyonundan hayatta kalma ve çoğalmaya in vivo geçişi yansıtır. BMEx çıkarılmıştır çünkü lumenogenez artık gerekli değildir.
    2. 3. ve 4. günde, her birini 1 mL switch medium ile iyi yenileyin.
    3. Farklılaşmanın 5. gününde, hPGCLC'ler immünofluoresans veya Akış Sitometrisi kullanılarak karakterize edilebilir.

4. hPGCLC'lerin immünoflüoresans ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu

  1. İmmünofluoresans ile karakterizasyon.
    1. Permeabilizasyon çözeltisi hazırlayın: %0,3 Triton X-100, PBS ile seyreltilmiş.
    2. Yıkama çözeltisi hazırla: %0,05 Tween 20 PBS (PBST)
    3. Bloklama çözeltisi hazırlayın: %1 sığır serum albümini (BSA) PBST içinde.
    4. hPGCLC farklılaştırma için kullanılan kuyulardan anahtar ortamını çıkarın.
    5. Hücreleri 1 mL DPBS (-/-) ile yıkayın.
    6. Hücreleri 1 mL ile birlikte 1 mL ile sabit yapın, PBS içinde %4 paraformaldehit (PFA) ile RT ile 15 dakika boyunca.
    7. Hücreleri PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, her kuyuya 1 mL kullanın.
      NOT: Bu noktada, plakalar immünoflüoresans başlamadan önce 4 °C'de saklanabilir.
    8. Hücreleri permeabilizasyon çözeltisiyle RT'de 15 dakika boyunca permeabilize edin, her kuyu başına 1 mL kullanarak.
    9. Hücreleri yıkama solüsyonuyla 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, her kuyuya 1 mL kullanın.
    10. Blok hücrelerini RT'de 1 saat boyunca bloklama çözeltisi ile kullanın, her kuyu başına 1 mL kullanarak.
    11. Birincil antikor çözeltisi hazırlayın: İlgi duyan primer antikorları bloke çözeltisinde seyreltin.
      NOT: Burada, PGC belirteçleri için aşağıdaki iki antikor kombinasyonu kullanılmıştır: keçi anti-SOX17 ve tavşan anti-TFAP2C, keçi anti-SOX17 ve fare anti-POU5F1 (Materyal Tablosu).
    12. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın, her kuyuya 0,4 mL primer antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: Spesifik olmayan antikor bağlanmasını değerlendirmek için negatif kontrollerin dahil edilmesi önemlidir. Bunun için, bir kiyi bir gece boyunca blok edici çözeltide koyun, birincil antikorlar çıkarın, sonra o kuyunu ikincil antikor çözeltisiyle boyanın.
    13. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri PBST ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkalayın.
    14. İkincil antikor çözeltisi hazırlayın: İlgi duyduğunuz ikincil antikorları (Materyal Tablosu) ve DAPI'yi (1:500) bloklama çözeltisinde seyreltin.
      NOT: İkincil antikor solüsyesi ışığa duyarlıdır ve karanlıkta tutulmalıdır.
    15. PBST'yi çıkarın ve karanlıkta RT'de 1 saat boyunca her kuyu başına 0,4 mL ikincil antikor çözeltisi ekleyin.
    16. Hücreleri PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, her kuyuya 1 mL kullanın.
    17. Hücrelerin görüntülemesini yapın (20x objektif lens).
      NOT: İmmünoflüoresans görüntüleri Airyscan mikroskopunda 20x objektif kullanılarak alındı, parlak alan görüntüleri ise EVOS mikroskobunda 4x ve 10x objektif kullanılarak alındı.
  2. Akış sitometrisiyle karakterizasyon
    1. FACS tamponu hazırla: DPBS'de %0,5 BSA (-/-)
    2. hPGCLC'lerle birlikte kuyulardan anahtar ortamını çıkarın.
    3. Hücreleri 1 mL DPBS (-/-) ile yıkayın.
    4. Her kuyuya 0,5 ml önceden ısıtılmış Accutase ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. Dissosiyasyon için, hPGCLC'ler dissosiyasyona karşı son derece hassas olduğu için tripsin çözeltisine göre Accutase tercih edilir.
    5. Hücreleri dikkatlice 2–3 kez p1000 ile yeniden süspansiyon yaparak tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.
    6. Tek hücreli süspansiyon elde edilip edilmediğini ters mikroskop altında kontrol edin. Eğer yoksa, hücreleri p1000 pipetiyle 1–2 kez daha tekrar süsle bırakın.
    7. Hücre süspansiyonunu 40 μm süzgeçten 15 mL'lik bir tüpe filtreleyin.
    8. 40 μm süzgeçi 5 mL FACS tampon ile yıkayın.
    9. Hücre süspansiyonunu 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. Üst yüzeyi çıkarın.
    11. Hücre pelletini 0.3 mL FACS tamponunda 1.5 mL bir tüpte yeniden süspansiyona alın.
      NOT: Hücre sayacı veya hemositometre kullanılarak hücreleri saymak isteğe bağlıdır. Hücreler sayılırsa, 12 kuyuluğa ait bir plakanın her kuyusu için yaklaşık 1 milyon hücre bekleniyor.
    12. Akış sitometrisi için yeterli kontrol örnekleri hazırlayın (lekelenmemiş ve tek boyalı kontroller). Bunun için, hücre süspansiyonunun 15–30 μL kısmını 1.5 mL tüplere aktarın ve FACS tamponu ile 100 μL doldurulur.
      NOT: Bu çalışma için 3 tek boya hazırlandı: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) ve 7AAD (1:200). Konjuge antikorlar ve 7AAD içeren çözeltiler ışığa duyarlıdır ve karanlıkta tutulmalıdır.
    13. İlgilenecek konjuge antikorları doğrudan hücre süspansiyonuna ekleyerek yeterli seyreltme sağlanır. Burada, PGC belirteçleri için aşağıdaki konjuge antikorlar birlikte kullanılmıştır: EPCAM-PEcy7 (1:200) ve ITGA6-BV421 (1:200) (Materyal Tablosu).
    14. Hücreleri konjuge antikorlarla karanlıkta buzda 30 dakika boyunca kuluçka edin.
    15. Örneklere 1 mL FACS tamponu ekleyin, lekesiz kontrol ve tek antikor kontrolleri ile 300 x g 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    16. Üst yüzeyi çıkarın.
    17. Örnekleri 0,5 mL'de, kontrol örnekleri ise 0,2 mL'de 1 mM EDTA içeren FACS tamponunda yeniden askıya alın. Bu, hücrelerin tokelenmesini önler.
    18. Örnekleri ve kontrolleri, hücre süzgeci kapağıyla 5 mL FACS tüpüne ekleyin, sonra süzgeçten geçirin.
    19. Akış sitometresinde ölçümden birkaç dakika önce her numuneye doğrudan 7AAD ekleyin.
    20. Akış Sitometresi kullanarak örnekleri ölçün. Burada, örnekleri ölçmek için floresans tabanlı hücre analizörü kullanıldı, veriler FACSDiva yazılımı (v9.0) kullanılarak toplandı ve veri analiz etmek için FlowJo yazılımı (v10.10.0) kullanıldı.
    21. Kontrol örneklerini (lekelememiş ve tek antikor kontrolleri) kullanarak kapı stratejisini kurabilir ve gerekirse telafi yapar.
    22. Numuneleri makineye koymadan önce vortex yapın.
    23. Tüm olaylardan hücre popülasyonunu çıkarmak, önce alana göre bir kapı ayarlayarak [ileri saçılım alanı (FSC-A) ve yan saçılım alanı (SSC-A)].
    24. Bu hücre popülasyonundan, boyut [FSC-width (FSC-W) ve FSC-yüksekliği (FSC-H)] ve granülerliğe [SSC-W ve SSC-H]] göre tek hücreler alın.
    25. 7AAD-negatif hücreler için bir kapı ayarlayarak ölü hücreleri daha fazla analizden dışlayın.
    26. Kapıların doğru ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol etmek için örneği kullanın ve gerekirse ayarlayın.
    27. Bu canlı hücre popülasyonundan ilgi çeken belirteçleri analiz edin. Burada, hem EPCAM hem de ITGA6 için pozitif olan kapalı hücreler hPGCLC'lere karşılık geldi.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HiPSC'lerin kalitesi ve kararlı durumu, daha fazla farklılaştırma için önemlidir
HiPSC'ler, farklı kaplamalarda (farklı kaplamalarda) en az 3 geçiş boyunca 6 kuyu plakalarında tutuldu, ardından farklılaştırma deneyleri ve analizleri yapıldı. hücre kolonileri %70–80 birleşimine ulaştığında hiPSC'ler geçti (Şekil 1B), bu aynı zamanda hPGCLC farklılaşmasını başlatmak için optimal hiPSC birleşimidir. Sağlıklı hiPSC kültürleri, parlak alan görüntülerinde görülen koyu veya farklılaşmış alanlar olmadan uniform koloni morfolojisi sergilemiştir (Şekil 1B). Ancak, hücre kolonileri optimal birleşimlerinde tutulmadığında veya farklılaşma belirtileri gösterdiğinde hiPSC'lerin kalitesi etkilenmiştir (Şekil 1B). Düşük birleşimde, hiPSC çoğalmaya devam etti ve birleşim geçiş veya farklılaşma deneyleri için uygun hale gelene kadar koloni oluşumu için daha fazla zaman gerekiyordu. Yüksek birleşimde, hiPSC'ler üst üste büyürken, farklılaşmış bölgeler ortaya çıkar. HiPSC'lerin pürüpotensi durumu,hiPSC'ler 30'da pluripotensi ve kendini yenilemeyi sürdürmek için gerekli transkripsiyon faktörleri olan SOX2 veya POU5F1'in ifade edilmesiyle doğrulandı ve en önemlisi, SOX2 hPGCLC31 ile ifade edilmez. Falloidin boyama, hiPSC'lerin kalitesini gösteren sitoskelet organizasyonu ve koloni morfolojisini değerlendirmek için kullanıldı. Hücre morfolojisindeki farklılıkların SOX2 veya POU5F1'in indirgenmesiyle ilişkili olduğunu unutmayın (Şekil 1B).

hiPSC bakım substratının hPGCLC farklılaşmasına etkisi
HiPSC'lerin farklı kaplama substratlarında tutulmasının hPGCLC'lere farklılaşmayı etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, hiPSC'ler farklı substratlarda (Geltrex, Matrigel, Cultrex ve vitronectin) kültürlendi (Şekil 2). Tüm substratlarda, hiPSC'ler pluripotent durumlarının göstergesi olarak sağlam ve uniform nükleer SOX2 veya POU5F1 seviyeleri göstermiştir. Geltrex, Matrigel ve Cultrex'te tutulan hiPSC kolonileri, vitronektin üzerindeki yuvarlak kolonilere kıyasla iyi tanımlanmış koloni sınırları ve düzensiz genel koloni şekilleri dahil olmak üzere benzer morfolojiye sahipti (Şekil 2). %70–80 birleşmeye ulaşan hiPSC'ler, 40K hücre/cm2 yoğunlukta kaplama yapıldı ve Geltrex26 üzerinde hPGCLC'lere farklılaştı. 5. Günde, parlak alan görüntüleri tüm koşullarda karakteristik hPGCLC kolonilerini gösterdi (Şekil 3). Ayrıca, tüm koşullarda üçlü pozitif SOX17/TFAP2C/PDPN veya çift pozitif SOX17/POUF51 hPGCLC'leri tespit edilmiştir (Şekil 3). Bu, farklılaştırma protokolünün farklı koşullar altında kültürlenen hiPSC'lerle kullanılabileceğini gösterdi.

Başlangıç hiPSC hücre yoğunluğunun hPGCLC farklılaşmasına etkisi
Geltrex üzerinde, farklı hiPSC'lerin farklı proliferasyon oranlarına sahip olması nedeniyle, optimal hPGCLC farklılaşması için optimal tohumlama yoğunluğunu kontrol etmek önemlidir. Ayrıca, hiPSC'ler sürekli geçiş yaptıkça hPGCLC farklılaşma verimliliği düşerse, hiPSC tohumlama hücre yoğunluğunun ayarlanması tavsiye edilir. Tohumlama hücre yoğunluğunun hPGCLC farklılaşma verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için, hiPSC'ler farklı yoğunluklarda, 10K ile 100K hücre/cm2 arasında tohumlanmıştır (Şekil 4A). 5. günde, hPGCLC yüzdesi, insan PGC-belirteçleri için iki farklı konjuge antikor olan EPCAM ve integrin α6 (ITGA6)32 kullanılarak akış sitometrisiyle değerlendirildi. Akış-sitometri analizi, 40K hücre/cm2 tohumlanmış M199 hiPSC'ler için standart ardışık kapı stratejisini izledi (Şekil 4B). Kısaca, toplam hücre popülasyonu (tüm olaylar) parçacık alanı (parçacık alanı) dışında bırakılarak kapatıldı, ardından boyut (FSC) ve granülerlik (SSC) temelinde tek hücreler seçildi ve son olarak 7AAD boyama ile ölü hücreler dışlandı. Daha sonra, EPCAM-cy7 ve ITGA6-BV421 eksprese eden hücrelerin niceliklerini ölçmek için kapı boyalı ve lekelenmemiş örneklerle ayarlandı (Şekil 4B).

hPGCLC farklılaşma verimliliğinin farklı tohumlama hücre yoğunlukları ve farklı substratlar üzerinde kültürlenmiş hiPSC kullanılarak karşılaştırılması, yoğunluğa bağlı bir eğilim ortaya koymuştur (Şekil 4C). 20–40K hücre/cm2 tohumlama yoğunluğunda, M54 ve M199 hiPSC'leri, Geltrex ve Cultrex üzerinde tutulan hiPSC'lerle elde edilen EPCAM+/ITGA6+ çift pozitif hPGCLC oranlarının en yüksek oranını gösterdi. İlginç bir şekilde, daha yüksek yoğunluklar daha düşük farklılaşma verimliliğine yol açtı. HGCLC'lerde PGC belirteçleri SOX17/TFAP2C/PDPN veya SOX17/POUF51 kullanılarak yapılan immünoflüoresans sonuçları akış sitometrisi sonuçlarını doğruladı (Şekil 4D). Bu sonuçlar, tohumlama yoğunluğunu belirli hiPSC'lere göre ayarlamanın optimal farklılaşma verimliliği için önemli olduğunu göstermiştir. İmmünoflüoresans ve akış sitometrisinin birleştirilmesi, hPGCLC farklılaşma testinin dayanıklılığını artırır.

figure-results-1
Şekil 1: hPGCLC farklılaştırma iş akışı ve hiPSC'lerin kalitesi. (A) Bu çalışmada kullanılan iş akışının şeması. HiPSC'ler (kültür ortamında) korundu ve farklılaşma gününde (Gün 0, D0) %60–80 birleşime ulaştı. D0 üzerinde hiPSC'ler tek hücrelere ayrılmış ve istenen tohumlama yoğunluğunda (kaplama ortamında) kaplamaya yerleştirilmiştir. Ertesi gün hücreler farklılaşma ortamı (D1–D3) ile işlendi, ardından anahtar ortamı (D3–D5) uygulandı. D5 üzerinde ise immünoflüoresans veya akış sitometrisi için hPGCLC'ler kullanıldı. (B) Parlak alan görüntüleri (üst sıra - 4x büyütme); SOX2, PHALLOIDIN boyama ve DAPI boyama için immünoflüosans (orta sıra); POU5F1, PHALLOIDIN boyama ve DAPI boyama (alt sıra) için farklı birleşimlere sahip hiPSC'ler gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Şekil 1A'daki çizimler, Adobe Illustrator'daki temel çizim araçlarıyla yazarlar tarafından oluşturulmuştur; Ücretli yazılım veya araç kullanılmadı. Bu nedenle, telif hakkı lisansı gerekmiyordu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: HiPSC kültürü sırasında çeşitli kaplama substratlarının etkisi. Brightfield görüntüleri (üst sıra); SOX2, PHALLOIDIN boyama ve DAPI boyama için immünoflüosans (orta sıra); ve POU5F1, PHALLOIDIN boyama ve DAPI boyama (alt sıra) için farklı kaplama substratlarında kültürlenmiş hiPSC'ler gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: HiPSC kültürü sırasında çeşitli kaplama substratlarının hPGCLC farklılaşması üzerindeki etkisi. Parlak alan görüntüleri (üst sıra-10x büyütme); SOX17, TFAP2C, PDPN ve DAPI boyama için immünofloresans (orta sıra); ve 5. günde farklı kaplama substratlarında kültürlenen hiPSC'lerden başlayarak POU5F1, SOX17 ve DAPI boyama (alt sıra) için hPGCLC farklılaşması (Geltrex kullanılarak). Sarı kesik çizgi, hPGCLC olan bölgeleri vurgular. Ölçek çubukları = 25μm (üst sıra) ve 50 μm (orta ve alt sıralar). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: hiPSC tohumlama yoğunluğunun hPGCLC farklılaşması üzerindeki etkisi. (A) Farklı hiPSC tohumlama yoğunlukları kullanılarak (40K hücre/cm2, 60K hücre/cm2, 80K hücre/cm2) hPGCLC'lerin farklılaşmasının 1. (D1) ve D3'teki Brightfield görüntüleri. Ölçek çubukları = 250 μm. 4x büyütme. (B) EPCAM+/ITGA6+ hPGCLC yüzdesini niceltmek için kapı stratejisini gösteren temsil akış sitometri grafikleri. Bunun için, Geltrex üzerinde M199 hiPSC'ler 40K hücre/cm2 tohumlama yoğunluğunda kullanıldı. (C) Farklı kaplamalarda kültürlenmiş ve farklı yoğunluklarda tohumlanmış hiPSC'ler (M199 ve M54) kullanılarak EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLC'lerin D5'teki yüzdelerini gösteren çubuk grafik. (D) SOX17, TFAP2C, PDPN ve DAPI-boyama (sol paneller) için immünofluoresans; ve SOX17, POU5F1 ve DAPI boyama (sağ paneller) D5'te hPGCLC farklılaşmasının D5'inde (Geltrex üzerinde M199 ve M54) 40K ve 80K hücre/cm2 tohumlanmış. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro gametogenez, kontrollü kültür koşullarında ve hastaya özgü bir temelde insan germ hattı gelişimi, üreme toksisitesi ve kısırlığı incelemek için güçlü bir deneysel platform oluşturur. hPGCLC'leri hiPSC'lerden ayıran birden fazla protokolbildirilmiş olsa da 18, laboratuvarlar arasında standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir yaklaşımların sınırlı erişilebilirliği alandaki ilerleme engellemiştir. Son çalışmalar, hPGCLC indüksiyonu için basitleştirilmiş ve verimli yaklaşımlar tanımlamıştır; bunlar arasında BMP4 tabanlı mikrodesenli farklılaşma27, hPGCLC üretimini 3,5 güniçinde mümkün kılan hızlı 2D tek katmanlı platform ve peri-implantasyon gelişimi ile parakrin niş sinyalizasyonu modelleyen 3D kültürsistemi bulunmaktadır. Bu protokoller hPGCLC farklılaştırmasını etkili bir şekilde desteklese de, yüksek verimli platform olarak hizmet verme yeteneğinden yoksunlar. hPGCLC tabanlı çalışmalar, özellikle üreme toksikolojik taramaları için geniş çapta uygulanabilmesi için, protokollerin sağlam, teknik olarak erişilebilir ve sonraki nicel testlerle uyumlu olması gerekir. Burada, hPGCLC'nin BMEx-farklılaştırma protokolünün adım adım analizi sunulmakta olup, tekrarlanabilirlik ve performansı belirleyen kritik teknik parametreler vurgulanır.

Başarılı farklılaşmanın önemli belirleyicilerinden biri, hiPSC'lerin başlangıçtaki çoğulma durumudur. Geçiş sayısı, hücresel sağlık, hatt-spesifik özellikler ve differensiyon öncesi kültür koşulları hPGCLC farklılaşma sonuçlarını etkileyebilir. Başlangıçta, hiPSC bakımı sırasında dikkat kaplama substratı, tohumlama hücre yoğunluğu ve kültür plakası formatına yönelebilir; bunlar birlikte koloni mimarisi ve hPGCLC farklılaşmasının başlangıcındaki sinyal ortamlarını tanımlar. Mevcut çalışma, farklı kaplamalar ve farklı tohumlama yoğunlukları üzerinde kültürlenmiş hiPSC'lerin hPGCLC farklılaşması üzerindeki etkisini (Geltrex üzerine) göstermektedir. Burada test edilen her iki hiPSC hattı da maksimum farklılaşma verimliliğini 20.000–40.000 hücre/cm2 tohumlama yoğunluğunda göstermiştir. Bu, yeni hücre hatları tanıtılırken, uzun süreli geçişin ardından veya deneysel düzenleri veya kültür plaka formatlarını değiştirirken optimal tohumlama yoğunluklarının belirlenmesi gerekliliğini vurgular. Yüzey alanı-hacim oranlarında veya büyüme kinetiğinde küçük görünen değişiklikler bile, yüksek farklılaşma verimliliğini korumak için optimizasyon gerektirebilir. Buna göre, kullanıcıların önce hPGCLC farklılaşması için optimal koşulları belirlemek amacıyla küçük ölçekli pilot deneyler yapmaları önerilir.

Dayanıklılığına rağmen, yöntemin kabul edilmesi gereken sınırlamaları vardır. Birden fazla kaplama ve yoğunlukla uyumlu olmasına rağmen, farklılaşma verimliliği epigenetik durum ve geçiş geçmişi gibi hiPSC'nin içsel özelliklerine duyarlıdır; bunlar tam olarak kontrol edilemez. Test edilen birkaç hiPSC hPGCLC26'ya ayırt edemiyor gibiydi. En önemlisi, tam tanımlanmış bir ürün olan vitronektinin aksine, BMEx hayvandan kökenli bir üründür ve partiden partiye varyasyonlara tabi olabilir ve bu da tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Matrigel, Cultrex ve Geltrex'in farklı partileri daha önce test edilmiş ve tutarlı sonuçlarvermiş olsa da, bu durum hâlâ bir endişe kaynağı ve gelecekte tekrarlanabilirlik ve aktarılabilirlik için BMEx'e tam tanımlanmış alternatifler düşünülmelidir. Burada iki erkek (XY) hiPSC hattı kullanıldı, ancak bu protokol hem dişi (XX) hem de erkek (XY)26 hatlarıyla test edilmiştir. Son olarak, protokol hPGCLC'lere transkripsiyonel olarak benzer ve daha fazla gelişim için yeterli olduğu gösterilen hPGCLC'lerortaya çıkarsa da burada daha sonraki germ hücre evrelerine daha fazla olgunlaşma ele alınmadı. Tarama tarzı uygulamalar için ölçeklenebilirlik gösterilmiş olsa da, otomasyona dayalı uyarlama ve laboratuvarlar arası doğrulama, daha geniş bir hiPSC hatları panelinde translasyonel faydayı daha da güçlendirecektir.

Mevcut hPGCLC farklılaştırma stratejilerine göre, bu protokol çeşitli avantajlar sunmaktadır. Yüksek uzmanlaşmış veya matriks kısıtlı yaklaşımların aksine, yaygın kullanılan hiPSC bakım substratları ve kültür plaka formatlarını karşılayarak teknik engelleri azaltır. Yoğunluk optimizasyonu ve erken aşama kalite kontrolüne verilen önem, in vitro gametogenez alanında kalıcı bir zorluk olan tekrarlanabilirliği daha da artırır.

Burada açıklanan metodolojik çerçeve, üreme toksikolojisi, kısırlık modellemesi ve gelişim biyolojisi için özellikle önemlidir. Ölçeklenebilir formatlarla uyumluluğu, orta ve yüksek verimli bileşik taramayı sağlarken, tekrarlanabilirliği çapraz karşılaştırmalar ve iş birliği yapan konsorsiyum çalışmalarını destekler. Daha geniş anlamda, laboratuvarlar arasında hPGCLC indüksiyon protokollerinin sistematik standartlaştırılması, karakterizasyon ve fonksiyonel son noktalarınkarşılaştırılması, in vitro gametogenezi, öngörülebilir insanla ilgili platformlara ilerletmek için hayati öneme sahiptir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin hazırlanmasında yapay zeka araçlarının kullanılmadığını açıklayacak ve teyit etmek için çıkar çatışması içermemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlham verici tartışmalar için Chuva de Sousa Lopes grubunun mevcut ve eski üyelerini teşekkür etmek isteriz; LUMC'nin Akış Sitometri Çekirdek Tesisi, LUMC hiPSC Oteli ve LUMC'nin Görüntüleme Tesisi'ne uzmanlıkları nedeniyle katkıda bulundu. Bu çalışma Novo Nordisk Vakfı (NNF21CC0073729, EK, CLdM ve SMCSL'ye reNEW), EC (HORIZON-MSCA-2023-DN MSCA 101169308-IMPLANTEU to SL ve SMCSL) tarafından desteklendi; Çin Burs Konseyi (CSC 20230920054 CF ve CSC 202308410196 DW) ile Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Organizasyonu (ZonMW PSIDER-2021-10250022120001) MP ve SMCSL'ye kadar hizmet verdi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7AAD Viability Staining SolutionBioLegend420403Dilution 1:200
AccutaseSTEMCELL Technologies7920
Advanced RPMI 1640 MediumGibco12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA21202Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgGInvitrogenA21207Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgGInvitrogenA21447Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594InvitrogenA12381Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647InvitrogenA30107Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421Biolegend313624Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7Biolegend324222Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonalMerckab5603Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonalR&D SystemsAF1924Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonalSanta Cruz BiotechnologySC-5279Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonalAbcamab256561Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonalCell Signaling Technology2320SDilution 1:300
B-27 Supplement, serum freeGibco17504044Diltuion 1:100
BD FACSCantoBD BiosciencesEquipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0BD BiosciencesSoftware
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie VRoche10735086001Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture PlateGreiner665180
CELLSTAR 15 mL TubeGreiner188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture PlateGreiner657160
Corning 40 µm Cell StrainersCorning431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixR&D systems3434-101-02Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)InvitrogenD3571Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplementGibco31331028
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
EVOS M5000InvitrogenEquipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548InvitrogenSoftware
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning352235
FlowJo software version 10.10.0BD BiosciencesSoftware
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualifiedGibcoA1413302Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX SupplementGibco35050061Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0BD BiosciencesSoftware
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualifiedGibcoA1413302Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX SupplementGibco35050061Dilution 1:100
hiPSCs M54LUMC hiPSC Core FacilityLUMC0054iCTRL03hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199LUMC hiPSC Core FacilityLUMC0199iCTRL01hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell CounterLogos BiosystemsEquipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5Logos BiosystemsSoftware
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-freeCorning354277Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050Dilution 1:100
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
MycoZap Plus-CLLonzaVZA-2011Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich1040051000Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal EjectorGilsonF144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal EjectorGilsonF144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal EjectorGilsonF144055M
Recombinant Human BMP4, CFR&D Systems 314-BP-050Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CFR&D Systems 236-EG-200Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIFGibco300-05Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CFR&D Systems 11010-SC-100Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872
RevitaCell SupplementGibcoA26445-01

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Developmental Biologyhuman pluripotent stem cells primordial germ cells stem cell based model in vitro gametogenesis early human development differentiation assay

Related Articles