Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Mollugin, Değişmiş İnflamatuar ve Oksidatif Yanıtlar ile İlişkili Olarak Zebrafish Kuyruk Rejenerasyonunu Destekler

46 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71181

⸱

18 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Burn and Wound Repair, Fuzhou No.1 Hospital Affiliated with Fujian Medical University, 2Fujian Key Laboratory of Medical Analysis, Fujian Academy of Medical Sciences, 3Department of Plastic and Burn, Shengli Clinical Medical College of Fujian Medical University, 4Department of Plastic Surgery, Fujian Shengli Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Zebrafishlarda, güvenli dozlardaki (≤200 µg/mL) Mollugin'in, apoptozla ilişkili gen ekspresyonu, inflamatuar belirteçler, antioksidan enzim aktivitesi ve makrofajla ilişkili belirteçlerdeki değişimlerin eşlik ettiği, iyileşmiş kuyruk rejenerasyonu ile ilişkili olduğu görülmüştür. Bu bulgular, Mollugin'in zebrafish kuyruk rejenerasyonu sırasında lokal yaralanma yanıtını modüle edebileceğini göstermektedir.

Özet

Mollugin, anti-inflamatuar ve antioksidan aktivitelere sahip olduğu bildirilen doğal bir naftokinon bileşiğidir, ancak doku rejenerasyonundaki rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada, Mollugin'in yara onarımı ve buna eşlik eden immün ve redoks yanıtları üzerindeki etkilerini araştırmak için bir zebra balığı kuyruk amputasyon modeli kullanılmıştır. Zebra balığı embriyoları, kuyruk yaralanmasının ardından 22 µg/mL, 66 µg/mL ve 200 µg/mL konsantrasyonlarda Mollugin ile tedavi edilmiştir. Mollugin tedavisi, doz bağımlı bir şekilde iyileştirilmiş kuyruk alanı toparlanması ile ilişkili olup, buna apoptozla ilgili genlerin ekspresyonunda azalma ve IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 ve NF-κB1 dahil olmak üzere pro-inflamatuar medyatörlerin baskılanması eşlik etmiştir. Paralel olarak, Mollugin süperoksit dismutaz ve katalaz antioksidan enzim aktivitelerini geri kazandırmıştır. Tg(mpeg1:GFP) zebra balıklarındaki floresan görüntüleme, Mollugin'in makrofaj birikimi üzerinde zamana bağlı bir etkisi olduğunu göstermiş; 24. saatte belirgin bir azalma görülmezken, 66 ve 200 µg/mL gruplarında yaralı model grubuna kıyasla 48. saatte makrofaj-pozitif alanın azaldığı saptanmıştır. qRT-PCR analizi ayrıca M1-ilişkili marker iNOS'un ekspresyonunda azalma ve M2-ilişkili marker arginaz-1'in ekspresyonunda artış olduğunu göstermiştir. Topluca, bu bulgular Mollugin'in inflamatuar, oksidatif stres, apoptozla ilgili ve makrofajla ilişkili markerlardaki değişikliklerle bağlantılı olarak zebra balığı kuyruk rejenerasyonunu destekleyebileceğini önermektedir. Altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Giriş

Doku rejenerasyonu, organizmaların hasarları onardığı; hücre proliferasyonu, diferansiyasyonu ve mikroçevresel homeostazın korunmasının karmaşık düzenlemelerini içeren kritik bir fizyolojik süreçtir1. Omurgalı modeller arasında zebra balıkları, dikkat çekici rejenerasyon kapasiteleri nedeniyle yara onarımı mekanizmalarını incelemek için temel bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle zebra balıklarında kuyruk yüzgeci rejenerasyonu; inflamasyon düzenlemesi, oksidatif yanıt dengesi ve apoptoz kontrolü dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik olayın spasyotemporal koordinasyonunu kapsar2,3. Son yıllarda, doğal ürünlerin farmakolojik aktiviteleri rejeneratif tıp araştırmalarında odak noktası haline gelmiştir. Özellikle naftokinon bileşikleri, çeşitli biyolojik etkileri nedeniyle yaygın olarak çalışılmıştır4. Mollugin, Rubiaceae bitkilerinden elde edilen bir naftokinon bileşiğidir ve önceki çalışmalarda anti-inflamatuar, antioksidan ve hücre döngüsü düzenleyici aktiviteler göstermiştir5,6. Ancak, doku rejenerasyonundaki etki mekanizması henüz netleşmemiştir ve inflamatuar mikroçevreyi ve immün hücre polarizasyonunu modüle etmedeki potansiyel rolü sistematik bir incelemeyi gerektirmektedir.

Yaralanma sonrası inflamasyon hızla aktive olur ve doku onarımını doğrudan etkiler. Nekrotik dokunun temizlenmesi ve rejenerasyon programının başlatılması için orta düzeyde inflamatuar sinyal iletimi gereklidir; buna karşın aşırı bir inflamatuar kaskad, oksidatif stresi şiddetlendirebilir ve doku fibrozisine yol açabilir7. IL-1β, IL-6 ve TNF-α dahil olmak üzere sitokinler yaralanma sonrası belirgin şekilde artar ve buna TLR4/NF-κB sinyal iletiminin aktivasyonu eşlik ederek inflamatuar yanıtların güçlenmesine ve doku yeniden şekillenmesine neden olur8,9. Hücrelerarası adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve CC kemokin ligandı 2 (CCL-2) seviyeleri de yaralanma sonrası yükselir ve bu durum nötrofillerin ve makrofajların hasarlı dokulara artan göçü ile ilişkilidir10. Özellikle, oksidatif dengesizlik doku hasarını daha da kötüleştirir; süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) aktivitelerindeki azalma ise antioksidan kapasitenin bozulduğunu gösterir2,11.

Makrofajlar, inflamatuar mikroçevrenin temel düzenleyicileri olarak görev yapar ve fonksiyonel polarizasyonları rejenerasyon sürecini önemli ölçüde etkiler12. M1 makrofajlar, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekspresyonu ve inflamatuar aktivite ile ilişkilendirilirken; M2 makrofajlar arginaz-1 (Arg-1) eksprese eder ve doku onarımı ile bağlantılıdır13,14. Makrofaj polarizasyonu; lokal sitokinler, oksidatif stres ve apoptozla ilişkili sinyallerden etkilenir. Bu bağlamda, B-hücreli lenfoma-2 (Bcl-2) ailesi proteinleri ve kaspaz-3'ten oluşan apoptotik düzenleyici ağ, yalnızca yaralanma bölgesindeki hücre sağkalımını etkilemekle kalmaz, aynı zamanda "find-me" sinyallerinin salınımı yoluyla immün hücrelerin kemotaktik davranışını da dolaylı olarak modüle eder15. Bu nedenle, inflamatuar yanıtları, oksidatif stresi ve makrofaj polarizasyonunu eş zamanlı olarak modüle eden müdahale stratejilerinin araştırılması, doku rejenerasyonunun iyileştirilmesine yardımcı olabilir.

Doğal bileşikler, bu biyolojik süreçlerin modülasyonunda benzersiz avantajlar sergilemiştir. Güncel çalışmalar, naftokinon maddelerin konjuge yapıları sayesinde serbest radikalleri temizleme potansiyeline sahip olduğunu; benzoquinon çekirdeklerinin ise elektron transfer mekanizmaları aracılığıyla redoks-duyarlı sinyal yollarını etkileyebildiğini doğrulamıştır16,17. Mollugin'in, DSS ile indüklenen kolitte pro-inflamatuar sitokin üretimini azaltarak ve kolon dokularında TLR4 ekspresyonunu düşürerek inflamatuar yanıtları hafiflettiği bildirilmiştir18. Mollugin'in makrofajlarda TAK1-NF-κB/MAPK sinyalini inhibe ettiği ve Keap1-Nrf2 yolunu aktive ettiği de gösterilmiştir6; ancak, in vivo bir yara modelinde makrofaj polarizasyonu ve apoptoz–anti-apoptoz ağı üzerindeki etkisi henüz aydınlatılmamıştır. Ayrıca, Mollugin'in doza bağımlı biyolojik etkileri ve rejenerasyon süreci sırasındaki düzenleyici rolü sistematik olarak açıklanmayı beklemektedir.

Bu çalışma, bir zebra balığı kuyruk yüzgeci rejenerasyon modelinde Mollugin'in etkilerini araştırmıştır. Özellikle, Mollugin tedavisi sonrası kuyruk yeniden büyümesini, apoptozla ilişkili gen ekspresyonunu, inflamatuar sinyallemeyi, antioksidan enzim aktivitesini ve makrofajla ilişkili yanıtları inceledik. Bulgularımız, Mollugin tedavisinin, bu zebra balığı modelinde iyileştirilmiş kuyruk rejenerasyonu ve çok sayıda yaralanma yanıt belirteçlerindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Fuzhou Birinci Genel Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay no. 202408002).

Zebrafish üretimi
Tüm deneyler, standart laboratuvar koşulları altında bakılan zebrafish (Danio rerio) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toksisite analizi ve kuyruk amputasyon rejenerasyon analizi için yabani tip AB zebrafish kullanılmıştır. Makrofaj görüntüleme için özel olarak Tg(mpeg1:GFP) zebrafish kullanılmıştır. Tg(mpeg1:GFP), GFP ekspresyonunun makrofaj tarafından eksprese edilen mpeg1 promotörünün kontrolü altında makrofaj soyundan gelen hücreleri etiketlediği bir makrofaj raporlayıcı hattır. Tüm zebrafish hatları, 14 s/10 s ışık/karanlık döngüsü altında 28.5 °C'de tutulmuştur. Deneylerde yalnızca morfolojik olarak normal embriyolar kullanılmıştır. Tüm deneyler için embriyolar; NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O ve pH 7.2'ye ayarlanmış HEPES dahil olmak üzere reaktif saflığındaki kimyasallar kullanılarak hazırlanan Danieau tamponunda inkübe edilmiştir.

İlaç hazırlama ve güvenlilik belirleme
40 mg/mL'lik bir stok oluşturmak için Mollugin (40 mg), 1 mL DMSO içinde çözülmüştür. Stok önce Danieau tamponu ile 1:10 oranında seyreltilerek 4 mg/mL'ye, ardından uygulamalar için 22, 66 ve 200 µg/mL konsantrasyonlarına getirilmiştir. Maksimum güvenli konsantrasyonu belirlemek için, döllenmeden sonraki 48. saatteki (hpf) AB suşuna ait embriyolar koryonlarından arındırılmış ve %0,003 sodyum hipoklorit ile sterilize edildikten sonra 6 kuyucuklu plaklara dağıtılmıştır (n=20, grup başına üç tekrarlı kuyucuk). Embriyolar, E3 ortamında 28,5 °C'de 48 saat boyunca Mollugin (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL veya 360 µg/mL) ile inkübe edilmiştir. Sağkalım bir stereomikroskop altında izlenmiş ve ≥%90 embriyo canlılığına sahip olan en yüksek konsantrasyon, sonraki deneyler için güvenli üst sınır olarak belirlenmiştir.

Kuyruk amputasyonu ve rejenerasyon modelinin oluşturulması
Rejenerasyon çalışmaları için, 48 hpf yabani tip AB embriyoları, embriyo ortamında hazırlanan %0,03'lük trikayn ile anesteziye alınmış ve bir stereomikroskop altında yan konumlandırılmıştır. Kuyruk amputasyonu öncesinde embriyolar Danieau tamponunda tutulmuştur. Stereomikroskobik yönlendirme altında standardize bir transvers kuyruk amputasyonu gerçekleştirilmiştir. Amputasyon hattı, notokord ucunun hemen posterioruna, notokordun posterior ucu anatomik işaret olarak kullanılarak yerleştirilmiştir. Örnekler arasında tutarlı bir yaralanma seviyesi sağlamak amacıyla, bu işaretin distalinde kalan kuyruk yüzgeç kıvrımı bir mikroskalpel kullanılarak çıkarılmıştır. Amputasyonu takiben hemen (0 sa), stereo floresan mikroskop ile görüntüler elde edilmiştir. Amputasyondan sonra embriyolar, rejenerasyon deneyi için ilgili E3 bazlı tedavi ortamına aktarılmıştır. Mollugin çalışma çözeltileri, Mollugin stok çözeltisinin E3 ortamı ile 22, 66 ve 200 µg/mL nihai konsantrasyonlara seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Mollugin, rejenerasyon süresince banyo maruziyeti yoluyla uygulanmıştır. Taşıyıcı maruziyeti ile eşleştirmek için, yaralanmamış kontrol grubu ve yaralı model grubu, 200 µg/mL Mollugin grubundaki nihai DMSO konsantrasyonuna karşılık gelen %0,5 DMSO içeren E3 ortamında tutulmuştur. Embriyolar, ilgili E3 bazlı tedavi ortamının günlük olarak yenilenmesiyle 2 gün boyunca 28,5 °C'de 6 kuyucuklu plakalarda tutulmuştur. Rejenerasyon, kuyruk yeniden büyümesini ve makrofaj dağılımını değerlendirmek için amputasyon sonrası 24 ve 48. saatlerde hem beyaz ışık hem de floresan ayarları altında görüntüleme yapılarak belgelenmiştir. Görüntü ölçümleri ImageJ programında gerçekleştirilmiştir.

Rejenerasyon kantifikasyonu için, geri kazanılan kuyruk alanı µm2 cinsinden mutlak alan olarak ölçülmüş ve embriyo boyutuna veya orijinal kuyruk boyutuna göre normalize edilmemiştir. Değişkenliği minimize etmek için tüm embriyolar, notokord ucunun hemen arkasındaki aynı anatomik işaret noktasından ampute edilmiş ve gruplar arasındaki ölçüm bölgesini tanımlamak için aynı işaret noktası kullanılmıştır. İlgi bölgeleri, kuyruk ana hattına dayanarak ImageJ'de manuel olarak belirlenmiş ve analiz, tedavi gruplarından habersiz bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilmiştir. Makrofaj-pozitif alan kantifikasyonu için Tg(mpeg1:GFP) embriyolarının GFP floresan görüntüleri ImageJ'de analiz edilmiştir. Kuyruk yaralanması/rejenerasyonu bölgesi, kuyruk alanı ölçümü için uygulanan aynı anatomik işaret noktası kullanılarak ilgi bölgesi olarak manuel olarak tanımlanmıştır. Görüntüler 8-bit gri tonlamaya dönüştürülmüş ve aynı deney içindeki tüm görüntüler için aynı arka plan düzeltme ayarları kullanılarak arka plan floresansı çıkarılmıştır. Ardından, GFP-pozitif makrofajla ilişkili sinyalleri belirlemek için her deneydeki tüm görüntülere tekdüze bir sabit floresan eşik değeri uygulanmıştır. Makrofaj-pozitif alan, tanımlanan ROI içindeki eşik-pozitif GFP alanı olarak hesaplanmıştır. Ölçümler, floresan yoğunluğu veya manuel hücre sayımı yerine floresan-pozitif alana dayandırılmıştır. Tüm görüntü analizleri, tedavi gruplarından habersiz bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilmiştir.

RNA Ekstraksiyonu ve Kantitatif Real-Time PCR (qRT-PCR)
Rejenerasyon deneyi tamamlandıktan sonra, RNA analizi için her deneysel koşuldan embriyolar toplandı ve birleştirildi (grup başına en az 20 embriyo). Her koşul için bir biyolojik replika, aynı deneysel gruptan en az 20 embriyo içeren birleştirilmiş bir örnekten oluşmuştur. Her koşul için üç bağımsız birleştirilmiş biyolojik replika hazırlanmış ve istatistiksel analizler için kullanılmıştır. Toplam RNA, fenol/guanidin bazlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi ile mekanik homojenizasyon sonrası izole edilmiştir. RNA kalitesi ve konsantrasyonu, A260/A280 oranları ölçülerek spektrofotometrik olarak değerlendirilmiştir. cDNA, ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak sentezlenmiştir. PCR amplifikasyonu SYBR Green reaktifleri ile gerçekleştirilmiştir. qRT-PCR döngü koşulları şu şekildedir: 95 °C'de 30 s başlangıç denatürasyonunu takiben, 95 °C'de 5 s denatürasyon ve 60 °C'de 30 s bağlanma/uzama şeklinde 40 döngü. Apoptoz (caspase-3 ve Bcl-2), inflamasyon (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 ve ICAM1) ve makrofaj fenotipi (iNOS ve arginase-1) ile ilgili genlerin ekspresyon seviyeleri ölçülmüştür. Referans gen olarak β-Actin kullanılmıştır. Gen ekspresyonundaki kat değişimleri 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Primer bilgileri Tablo 1'de listelenmiştir.

SOD ve CAT için aktivite analizleri
Kuyruk yaralanması sonrası antioksidan durumunu değerlendirmek için SOD ve CAT seviyeleri kullanılmıştır. Amputasyondan 48 saat sonra, her gruptan zebrafish'ler toplandı ve soğuk PBS içinde homojenize edildi. Santrifüj işleminden sonra, berraklaşmış ekstraktlar ticari aktivite analiz kitleri ile SOD ve CAT ölçümleri için kullanıldı. SOD aktivitesi, üretici talimatlarına uygun olarak WST-1 tabanlı bir analiz kiti kullanılarak ölçüldü. Örnekler, standartlarla birlikte 96 kuyucuklu analiz plakalarına yüklendi ve absorbans bir mikroplaka okuyucuda okundu. Enzim aktiviteleri standart eğrilerden elde edildi. Tüm analizler üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi.

İstatistiki analiz
Veriler, en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. Toksisite testi için her bağımsız deney, grup başına 20 embriyodan oluşan bir embriyo grubundan ve üç tekrarlı kuyucuklardan oluşmuştur. Rejenerasyon görüntülemesi ve Tg(mpeg1:GFP) zebra balıklarında makrofaj görüntülemesi için ölçüm birimi olarak tekil embriyolar kullanılmış ve grup başına 10 embriyo analiz edilmiştir. qRT-PCR analizi için bir biyolojik replika, aynı deney grubundan en az 20 embriyo içeren havuzlanmış bir örnekten oluşmuş ve durum başına üç bağımsız havuzlanmış biyolojik replika analiz edilmiştir. SOD ve CAT aktivite analizi için durum başına beş bağımsız havuzlanmış biyolojik replika analiz edilmiştir. Gruplar arasındaki farklar, Tukey post hoc testi ile birlikte tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edilmiştir. İstatistiki analizler GraphPad Prism programında gerçekleştirilmiştir. p < 0.05 olan farklar anlamlı kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Toksisite ve güvenli doz belirleme
Mollugin'in etkilerini araştırmak için öncelikle toksisite testleri gerçekleştirdik. Sonuçlar, 200 µg/mL'ye kadar olan konsantrasyonlarda zebra balığı embriyosu mortalitesinin düşük kaldığını, ancak 200 µg/mL'nin üzerindeki konsantrasyonlarda mortalitenin arttığını göstermiştir (Tablo 2). Bu nedenle, en yüksek güvenli doz 200 µg/mL olarak belirlenmiş; düşük ve orta dozlar ise sırasıyla 22 ve 66 µg/mL olarak ayarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, Mollugin'in zebrafish kuyruk rejenerasyonu üzerindeki etkilerini inceledik. Test edilen doz aralığında, Mollugin tedavisi, yaralanma sonrası kuyruk alanı iyileşmesinin artmasıyla birlikte apoptozla ilişkili gen ekspresyonunda, inflamatuar belirteçlerde, antioksidan enzim aktivitesinde ve makrofajla ilişkili belirteçlerdeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir.

Rejenerasyon çalışmalarında önde gelen bir model olan Zebrafish, birden fazla sinyal yolunun koordineli etkileşimini içer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin'in Fujian Eyaleti Sağlık Komisyonu tarafından desteklenmiştir (Hibe No. 2022QNA085).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyucuklu doku kültürü plakalarıCorning3516
Katalaz (CAT) analiz kitiNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
KloroformSigma-Aldrich288306
CMax Plus mikroplaka okuyucuMolecular DevicesiD3s
Danieau’s tamponu – Ca(NO3)2·4H2OGuangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., ÇinN/ADanieau’s tamponundaki final konsantrasyon: 0.6 mM.
Danieau’s tamponu – HEPESGuangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., ÇinN/ADanieau’s tamponundaki final konsantrasyon: 5 mM; pH 7.2'ye ayarlanmıştır.
Danieau’s tamponu – KClGuangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., ÇinN/ADanieau’s tamponundaki final konsantrasyon: 0.7 mM.
Danieau’s tamponu – MgSO4·7H2OGuangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., ÇinN/ADanieau’s tamponundaki final konsantrasyon: 0.4 mM.
Danieau’s tamponu – NaClGuangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., ÇinN/ADanieau’s tamponundaki final konsantrasyon: 58 mM.
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
E3 embriyo medyumuLaboratuvar hazırlamalı (standart reçete)N/AStandart reçete.
Gene özgü qPCR primerleri (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin)Sangon BiotechN/A
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CA, ABDN/AVersiyon 8.0.
ImageJ yazılımıNational Institutes of Health (NIH)N/AVersiyon 1.52n.
Mollugin (≥98%, HPLC)Sigma-AldrichSMB00431Rubia cordifolia'dan elde edilen aktif bileşik, 40 mg/mL olacak şekilde DMSO'da çözülmüş ve E3 medyumunda 22, 66 ve 200 µg/mL'ye seyreltilmiştir.
Motorlu doku homojenizatörüIKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (veya eşdeğeri)N/A
NovoScript 1st Strand cDNA Sentez SuperMixNovoproteinabs60077
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Real-time PCR sistemi (Archimed X4)Sansure Biotech Inc.Archimed X4
Soğutmalı mikrocentrifüjSCILOGEXCF1524R
RNA'sız uçlar (tips)Sangon BiotechF603222-0010
RNAiso PlusTakara Bio Inc.9109Fenol/guanidin bazlı RNA ekstraksiyon reaktifi.
RNase'siz mikrocentrifüj tüpleri, 1.5 mLAxygen / EppendorfN/A
SMZ800N floresan stereomikroskopNikonSMZ800NTg(mpeg1:GFP) larvalarını görüntülemek ve makrofaj agregasyonunu nicelleştirmek için kullanılan floresan stereo mikroskop.
Sodyum hipoklorit çözeltisiMcLean, ABDN/A%0.003'lük çalışma çözeltisi.
SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix)NovoproteinE096
SZX16 stereomikroskopOlympusSZX16Larvaların morfolojik gözlemleri, toksisite değerlendirmesi ve kuyruk yüzgeci amputasyonu için kullanılmıştır.
Total Süperoksit Dismutaz (T-SOD) analiz kitiNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-3
Transgenik zebra balığı Tg (mpeg1:GFP)Anburui, Fujian, Çin (veya kurum içi koloni)N/AMakrofaj raporlayıcı hattı.
Trikain metansülfonat (MS-222)Sigma-AldrichE10521%0.03'lük çalışma çözeltisi.
UltraPure DNase/RNase-Free distile suInvitrogen10977023
Yabani tip zebra balığı, CZ98 suşu (Danio rerio)Anburui, Fujian, ÇinN/ADöllenmiş embriyolar ve larvalar yetişkin damızlık stoktan elde edilmiştir.

Kaynaklar

  1. Sousa-Victor P, Garcia-Prat L, Munoz-Canoves P. Control of satellite cell function in muscle regeneration and its disruption in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:204-226. doi:10.1038/s41580-021-00421-2
  2. Paredes LC, et al. Distinct macrophage phenotypes and redox environment during the fin fold regenerative process in zebrafish. Scand J Immunol. 2021;94:e13026. doi:10.1111/sji.13026
  3. Parente V, et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 2013;8:e53748. doi:10.1371/journal.pone.0053748
  4. Shen X, et al. Structural and pharmacological diversity of 1,4-naphthoquinone glycosides in recent 20 years. Bioorg Chem. 2023;138:106643. doi:10.1016/j.bioorg.2023.106643
  5. Ke XG, et al. Mollugin induced oxidative DNA damage via up-regulating ROS that caused cell cycle arrest in hepatoma cells. Chem Biol Interact. 2022;353:109805. doi:10.1016/j.cbi.2022.109805
  6. Liu X, et al. Mollugin prevents CLP-induced sepsis in mice by inhibiting TAK1-NF-kappaB/MAPKs pathways and activating Keap1-Nrf2 pathway in macrophages. Int Immunopharmacol. 2023;125:111079. doi:10.1016/j.intimp.2023.111079
  7. Tu C, et al. Promoting the healing of infected diabetic wound by an anti-bacterial and nano-enzyme-containing hydrogel with inflammation-suppressing, ROS-scavenging, oxygen and nitric oxide-generating properties. Biomaterials. 2022;286:121597. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121597
  8. Liu Q, Chen J, Zeng A, Song L. Pharmacological functions of salidroside in renal diseases: facts and perspectives. Front Pharmacol. 2023;14:1309598. doi:10.3389/fphar.2023.1309598
  9. Ma J, et al. Phillyrin: A potential therapeutic agent for osteoarthritis via modulation of NF-kappaB and Nrf2 signaling pathways. Int Immunopharmacol. 2024;141:112960. doi:10.1016/j.intimp.2024.112960
  10. Peyronnel C, et al. Effects of local cryotherapy on systemic endothelial activation, dysfunction, and vascular inflammation in adjuvant-induced arthritis rats. Arthritis Res Ther. 2022;24:97. doi:10.1186/s13075-022-02774-1
  11. Gwozdzinski K, Pieniazek A, Gwozdzinski L. Reactive oxygen species and their involvement in red blood cell damage in chronic kidney disease. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:6639199. doi:10.1155/2021/6639199
  12. Xu H, et al. Bioactive glass-elicited stem cell-derived extracellular vesicles regulate M2 macrophage polarization and angiogenesis to improve tendon regeneration and functional recovery. Biomaterials. 2023;294:121998. doi:10.1016/j.biomaterials.2023.121998
  13. Sha W, et al. Astragalus polysaccharide ameliorates vascular endothelial dysfunction by stimulating macrophage M2 polarization via potentiating Nrf2/HO-1 signaling pathway. Phytomedicine. 2023;112:154667. doi:10.1016/j.phymed.2023.154667
  14. Shi JH, et al. TRAF3/STAT6 axis regulates macrophage polarization and tumor progression. Cell Death Differ. 2023;30:2005-2016. doi:10.1038/s41418-023-01194-1
  15. Xiao L, et al. “Find Me” and “Eat Me” signals: tools to drive phagocytic processes for modulating antitumor immunity. Cancer Commun (Lond). 2024;44:791-832. doi:10.1002/cac2.12579
  16. Chen X, et al. Characterization of naphthoquinones as inhibitors of glutathione reductase and inducers of intracellular oxidative stress. Redox Rep. 2024;29:2432830. doi:10.1080/13510002.2024.2432830
  17. Nowicka B, Walczak J, Kapsiak M, Barnas K, Dziuba J, Suchon A. Impact of cytotoxic plant naphthoquinones, juglone, plumbagin, lawsone and 2-methoxy-1,4-naphthoquinone, on Chlamydomonas reinhardtii. reveals the biochemical mechanism of juglone toxicity by rapid depletion of plastoquinol. Plant Physiol Biochem. 2023;197:107660. doi:10.1016/j.plaphy.2023.107660
  18. Li J, et al. Anti-inflammatory activity of mollugin on DSS-induced colitis in mice. Curr Med Sci. 2020;40(5):910-916. doi:10.1007/s11596-020-2262-5
  19. Hong T, Park J, Song G, Lim W. Brief guidelines for zebrafish embryotoxicity tests. Mol Cells. 2024;47:100090. doi:10.1016/j.mocell.2024.100090
  20. He X, et al. APMCG-1 attenuates ischemic stroke injury by reducing oxidative stress and apoptosis and promoting angiogenesis via activating PI3K/AKT pathway. Biomed Pharmacother. 2024;180:117506. doi:10.1016/j.biopha.2024.117506
  21. Ye P, et al. ACNO hydrogel enhances diabetic wound healing by modulating the Bcl-2/Bax/Caspase-3/PARP pathway. Int Immunopharmacol. 2025;147:113997. doi:10.1016/j.intimp.2024.113997
  22. Wenying S, Jing H, Ying L, Hui D. The role of TLR4/MyD88/NF-kappaB in the protective effect of ulinastatin on the intestinal mucosal barrier in mice with sepsis. BMC Anesthesiol. 2023;23:414. doi:10.1186/s12871-023-02374-9
  23. Xu Y, et al. Gegen Qinlian Decoction attenuates colitis-associated colorectal cancer via suppressing TLR4 signaling pathway based on network pharmacology and in vivo/in vitro experimental validation. Pharmaceuticals (Basel). 2024;18:12. doi:10.3390/ph18010012
  24. Caso F, et al. Analysis of rheumatoid- vs psoriatic arthritis synovial fluid reveals differential macrophage (CCR2) and T helper subsets (STAT3/4 and FOXP3) activation. Autoimmun Rev. 2022;21:103207. doi:10.1016/j.autrev.2022.103207
  25. Liu H, et al. Dexamethasone upregulates macrophage PIEZO1 via SGK1, suppressing inflammation and increasing ROS and apoptosis. Biochem Pharmacol. 2024;222:116050. doi:10.1016/j.bcp.2024.116050
  26. Jomova K, Alomar SY, Alwasel SH, Nepovimova E, Kuca K, Valko M. Several lines of antioxidant defense against oxidative stress: antioxidant enzymes, nanomaterials with multiple enzyme-mimicking activities, and low-molecular-weight antioxidants. Arch Toxicol. 2024;98:1323-1367. doi:10.1007/s00204-024-03696-4
  27. Petrie TA, et al. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Development. 2014;141(13):2581-2591. doi:10.1242/dev.098459
  28. Nguyen-Chi M, et al. TNF signaling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae. Cell Death Dis. 2017;8:e2979. doi:10.1038/cddis.2017.374
  29. Morales RA, Allende ML. Peripheral macrophages promote tissue regeneration in zebrafish by fine-tuning the inflammatory response. Front Immunol. 2019;10:253. doi:10.3389/fimmu.2019.00253
  30. Denans N, et al. An anti-inflammatory activation sequence governs macrophage transcriptional dynamics during tissue injury in zebrafish. Nat Commun. 2022;13:5356. doi:10.1038/s41467-022-33015-3
  31. Tesoriere A, et al. Tail fin regeneration in zebrafish: the role of non-canonical crosstalk between STAT3 and vitamin D pathway. Int J Biol Sci. 2025;21(1):271-284. doi:10.7150/ijbs.96400

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mollugin Tedavisiİnflamatuar YanıtOksidatif StresAntioksidan EnzimlerMakrofaj AkümülasyonuApoptoz BelirteçleriPro-inflamatuar MedyatörlerqRT-PCR AnaliziFloresan Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.