Sırım Aort İçsel Sertliğinin Pin Miyografisi Kullanılarak Değerlendirilmesi: Dolaşan Çevrenin Etkisini Sorgulamak İçin Translasyonel Bir Çerçeve

Özet

Burada, pin miyografisi ile aort iç duvar sertliğini (elastik modül) değerlendirmek için bir protokol ve dolaşımdaki ortamın aort iç duvar sertliğini modüle etmedeki olası rolünü sorgulayan yaklaşımları sunuyoruz.

Özet

Aort sertleşmesi, kardiyovasküler hastalıklar ve bilişsel gerileme, böbrek fonksiyon bozukluğu, görme bozuklukları ve azalmış glukoz-insülin fonksiyonu gibi diğer kronik durumlar için bağımsız bir risk faktörüdür. In vivo, aort sertliği genellikle arterial dalga formlarını veya uzunlamasına arterial segmentleri görselleştiren tonometri veya ultrason tabanlı tekniklerle değerlendirilir. Ancak , in vivo ölçümler, aort sertliğinin nasıl ve neden değiştiğine dair mekanik anlayışı sınırlayan arter basıncı ve otonom girdi gibi birçok faktörden etkilenir. Aort dokusunun doğrudan alınmasına olanak tanıyan preklinik fare modelleri, hem in vivo aort sertliğini hem de aortanın içsel mekanik özelliklerini değerlendirmek için benzersiz bir deneysel çerçeve sunar; bu özellikler kafa karıştırıcı fizyolojik değişkenlerden arındırıcı değildir. Bu modeller ayrıca dolaşımdaki çevrenin (yani kan dolaşımında dolaşan biyoaktif moleküllerin toplanması) ve preklinikten klinike translasyon spektrumunda aort sertliğini modüle etmedeki rolünün doğrudan sorgulanmasını sağlar. Dolaşım ortamındaki değişiklikler, hem preklinik hem klinik çalışmalarda ve müdahalelerin etkilerinin aracılığında aort sertleşmesinin temel mekanik temellerinden biri olarak ortaya çıkmıştır — birincil yaşlanma ve kanser tedavileriyle ilişkili erken yaşlanma dahil. Bu makale, (1) preklinik fare modellerinde içsel aort sertliği (elastik modül) ve (2) hem preklinik hem de klinik biyoörnekler kullanılarak dolaşım ortamının (ve bileşenlerinin) aort sertleşmesine katkısı için adım adım bir rehber sunmaktadır.

Giriş

Aort sertleşmesi, kardiyovasküler hastalıklar ve diğer kronik hastalıklar için bağımsız bir risk^{faktörüdür 1,2}. Aort sertliğinin in vivo değerlendirilmesi, aortanın sertliğini in vivo düzenleyen entegre fizyolojik süreçler (örneğin, kan basıncı ve otonom girdi) göz önüne alındığında, mekanik çözünürlükten yoksun olabilir^. Bu nedenle, aort içsel sertliğinin (yani aort duvarı sertliği/elastik modül) pin miyografisi kullanılarak ex vivo değerlendirilmesi, kafa karıştırıcı fizyolojik değişkenlerden bağımsız olarak aort sertliğinin doğrudan değerlendirilmesine olanak^{tanır 2}. Ayrıca, ex vivo deneysel yaklaşımın kullanımı, aort duvarının sertleşmesini aracılık edebilecek potansiyel moleküler mekanizmaların sorgulanmasına olanak tanır. Basınç miyografisi, iki eksenli düzlemsel test ve döngüsel/pulsatil miyograf sistemleri gibi arteral sertliği ex vivo değerlendirmek için kullanılan diğer yerleşik yöntemlerin aksine, bunlar fizyolojik sistem modellemelerine (örneğin, intraluminal basınç ve pulsatile hemodinamik) dayanırken, pin miyografi, in vivo modelleme gerektirmeyen yüksek kontrollü ortamlarda izometrik kuvvetle aort duvarı sertliğinin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanır.

Aortayla doğrudan ve sık temas halinde olan dolaşımdaki çevre (yani kan dolaşımındaki biyoaktif moleküllerin toplanması), aort sertleşme ortamlarında (örneğin, kronolojik/birincil yaşlanma ve erken yaşlanma, örneğin kanser hayatta kalanlar veya kanser kurtuluş modelleri) genellikle ^{değişir.3,4}. Hem preklinik (fare) hem de klinik (insan) biyoörnekler (plazma ve serum) kullanılarak, dolaşımdaki ortamın hem birincil⁴ hem de erken^{yaşlanma 3} ile aort sertleşmesine doğrudan katkıda bulunduğunu ortaya koyduk. Ayrıca, dolaşan çevredeki seçilmiş bileşenlerin aort sertleşmesi üzerindeki etkisini arabuluculuk etmede doğrudan katkılarını belirlemek için deneysel bir çerçeve^{oluşturduk 3,5,6}. Burada, pin miyografisi kullanarak aort içsel sertliğini ve dolaşımdaki ortamın (ve bileşenlerinin) aort sertleşmesine katkısını değerlendirmek için adım adım deneysel yaklaşımları özetliyor ve tanımlıyoruz ve temsil eden sonuçlar (şekiller ve atıflarla birlikte) sunuyoruz.

Protokol

Bu çalışma boyunca erkek yabani tipli C57BL/6J genç yetişkin (4 aylık) fareler kullanıldı. Deneysel farelerle ilgili konutlar ve prosedürler, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Soğuk fizyolojik tuzlu çözeltinin (CPSS) hazırlanması

1. Ca²⁺ Ringer stok çözeltisini 1 L diH_2Oiçinde hazırlayın ve 4 °C'de saklayın (Tablo 1).
2. MOPS tampon stok çözeltisini hazırlamak için 100 mL_{diH 2O}içinde 13,9 g MOPS ekleyin ve 4 °C'de depolayın.
3. EDTA stok çözeltisini hazırlanmak için 100 mL_{diH 2}O içinde 0.186 g EDTA ekleyerek pH 8.0'a yükseldin ve oda sıcaklığında saklanın.
4. Yukarıda belirtilen stok çözeltilerini ve aşağıda listelenen kimyasalları içeren CPSS hazırlayın (Tablo 2). Toplam hacmi_{diH 2}O ile 2 L'ye, pH 34 °C'de 7.4'e getirin ve CPSS'yi ≤ 0,45 μm filtreyle filtreleyin. 50 mL konik tüplerde dağıtın ve -20 °C'de saklanın.

2. Fare aortasının diseksiyonu (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3)

1. Fareyi solunan izofluran (%2,5) ile anestezi edin ve fareyi dorsal yatan pozisyona yerleştirin (Şekil 1A-C).
2. Fare anestezi cerrahi düzlemi altına girdikten sonra, kalp ponksiyonu yaparak kan toplayın ve ikincil ötenazi yöntemini iki taraflı torakotomi ile tamamlayın (Şekil 1B–C).
3. Sonrasında, aort arkından karın aortasına dikkatlice aortu alın (Şekil 1D–F).
4. Aortu CPSS'ye yerleştirin ve tüm bağ ve perivasküler yağ dokularını Fine Science Tools Vannas Yay Makasları (2,5 mm) ile çıkarın (Şekil 2A–E).
5. Aort kemerinin hemen altındaki torakik bölgede dikkatlice üç 1 mm genişliğinde aort segmenti kesin (Şekil 3).
6. İki 1 mm aort segmentini CPSS ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve -80 °C'de gerilim-deformasyon pimi miyografi deneylerine kadar saklayabilirsiniz. 3^. segmenti aşağıda açıklandığı gibi sonraki histolojik ölçümler için uygun şekilde saklayın.

3. Stres-gerilme pin miyografi deneyleri

NOT: Pin Miografi Sistemi, aort sertliğinin in vitro testleri için kullanılacaktır (Şekil 4 ve Şekil 5).

1. İlk olarak, yaklaşık 6 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) içeren odaları 37 °C'ye kadar önceden ısıtın ve 1 mm donmuş aort segmentlerini çözebilirsiniz.
   NOT: Daha önce tarif edildiği gibi, uygun şekilde oksijenli ve pH kontrollü alternatif fizyolojik tuz çözeltileri de^{kullanılabilir 7}.
2. 37 °C alındıktan sonra, üreticinin kalibrasyon protokolünü takip edin.
   1. Kalibrasyon köprüsünü miyografa yerleştirin ki T-denge çubuğu pin miyografi odasının kuvvet dönüştürücüsüne bağlı pimle temas etmesin.
   2. Kuvvet dönüştürücü pininin herhangi bir kuvvete tabi olmadığından emin olun. Göreceli kuvvet stabil olduğunda, T-köprüsüne 2 g ağırlık yerleştirin, böylece T-denge çubuğu kuvvet dönüştürücü pinine ~2 g kuvvet uygular.
   3. Kuvvet gösteriminin 9.71–9.91 mN arasında olduğunu doğrulayın. Eğer öyleyse, kalibrasyon tamamlanmış olur.
3. Başlangıç mikrometre okumasını belirleyin ve değeri kaydedin (yani ilk okuma).
   1. Bir diseksiyon dürbününde, iki paralel pinin neredeyse birbirine değdiği temel mikrometre mesafesini belirleyin (Şekil 4).
      NOT: İki pin temas etmesine izin vermeyin, çünkü bu zarar verebilir veya miyograf odasındaki kuvvet dönüştürücüsünü bozabilir.
4. Bir diseksiyon mikroskobu altında, iki pimin üzerine 1 mm aort segmenti yerleştirilir ve mikro kaliperlerle segmentin genişliğini kaydeder (Şekil 6A). Sonra oda ünitesini pin miyografi sistemi arayüzüne bağlayın.
   NOT: Pim genişliğini artırarak aorta segmentine gerilim uygulayarak aortayı iki pile sabitleyerek aorta segmentinin yerinden çıkmasını önleyin.
5. Eğer aortaya gerilim konmuş ve oda pin miyografi sistemine bağlanıp monte edilmişse, mikro konumlayıcıyı yukarıdaki 3.3. adımda belirlendiği "başlangıç pozisyonuna" geri getirin.
6. Aortanın tam ön gerilmesi.
   1. Aortu iki pim arasındaki mesafeyi başlangıç mikro konumlandırıcı konumundan 1 mm artırarak esitin (Şekil 6B).
   2. Sonra, pimleri ilk mikro konumlandırıcı okumasına geri getirerek aortu gevşettirin. Bu esneme-gevşetme dizisini üç kez gerçekleştirin (Şekil 6A).
      NOT: Son esneme-gevşetme dizisinden sonra, mikro konumlandırıcı tekrar ilk ölçüme dönmelidir.
7. Pin miyografi sistemi arayüzünde, kullanılan her oda için sıfır kuvvet okuması (Şekil 7).
8. Stres-gerilme deneyine başlayın.
   1. Mikro konumlandırıcıyı ayarlayarak kuvvet okumasını yaklaşık 1 mN'ye çıkarın (Şekil 7).
   2. ~1 mN kuvvet dengesinden sonra (3–5 saniye), ~1 mN kuvvette yeni mikro konumlandırıcı okumasını kaydedin ve ilk kuvvet okumasını kaydedin.
   3. Mikro konumlayıcıyı 50 μm artırın (yani 5 tıklama/hash) ve aorta segmentinin 3 dakika boyunca gerilmesine izin verin. 3 dakika sonra, rekor kuvveti.
   4. Mikro konumlayıcıyı her 3 dakikada 50 μm artırmaya devam edin ve "akım noktası"na ulaşana kadar kuvveti kaydedin.
      NOT: Akma noktası, aortada geri döndürülemez yapısal hasar oluşmadan önce oluşan en yüksek kuvvet miktarıdır (yani, aortada bir yırtık veya kırılma, önemli bir kuvvet düşüşü).
   5. Akım noktasını aortayı ilk akım noktasından sonra ek 50 μm uzatarak doğrulayın. Kuvvet değerinin azaldığından veya akım noktasının biraz üzerinde olduğundan emin olun. Akım noktası kesinleşmezse, akım noktası sağlanana kadar 3 dakika artışla devam edin.
   6. Akım noktası doğrulandıktan sonra deneyler tamamlanır. Şimdi analize başlayın.

4. Kolajen ve elastin bölgesi elastik modülünü belirlemek için stres-deformasyon pimi miyografi deneylerinin analizi

1. Miyograftan elde edilen kuvvet okumalarını kullanarak, aşağıdaki denklemleri kullanarak bir gerilme-gerilme eğrisi oluşturulur:
   Deformasyon (λ)=∆d/[d(i)]
   Burada d çapı, d_i ise başlangıç çapıdır ve;
   Stres (t)=λL/[2(HD)]
   burada L tek boyutlu yük, H intima ortam kalınlığıdır ve D kap uzunluğudur. Gerilme-gerilme eğrileri oluşturulduktan sonra, daha önce^{tanımlandığı gibi yüksek} kuvvet ve düşük kuvvet bölgelerini hesaplamak için kullanın (^8,9 (Şekil 8).
2. Yüksek kuvvet bölgesini (Kolajen bölgesi) hesaplayın (Şekil 8B).
   1. Gerilme-gerilme eğrisinin elastik modülü, doğrusal regresyon eğimi gerilme-gerilme eğrisinin son dört noktasına uyum sağlar. Gerilim-gerilme grafiğinden yüksek kuvvet ölçümü elde etmek için aşağıdaki adımları izleyin.:
      1. Grafikte bir veri noktasına sağ tıklayın ve Veri Seç > Ekle > Seri adını girin: Elastik modül.
      2. X Serisi değerleri: Süýşüm değerlerinden 4 veri noktası seçin. Bunlar, kuvvet "akım noktasına" yaklaştığında 3 nokta olmalıdır. Akım noktasını dördüncü nokta olarak belirttiğinizden emin olun.
      3. Seri Y değerleri: Gerilme değerlerinden 4 veri noktası seçin. Bunlar, kuvvet "akım noktasına" yaklaştığında 3 nokta olmalıdır. Akım noktasını dördüncü nokta olarak belirttiğinizden emin olun.
      4. Tamam'a tıklayın ve grafikte Trend Çizgisi > Doğrusal > Gösteri Denklemini ekleyin > Grafikte R kare değerini gösterin.
   2. Denklemin eğimi yüksek kuvvet elastik modülüdür. Elastik modülün doğru olması için R-kare değerinin ≥ 0.99 olduğundan emin olun.
3. Düşük kuvvet bölgesini (elastin bölgesi) hesaplayın (Şekil 8C)
   1. Gerilme–deformasyon eğrisinin elastin baskın bölgesinin (eğriliği ~0 olduğu düşük kuvvet bölgesi) sınırlarını, veriye yedinci dereceden polinom denklemi (r² > 0.99) yerleştirerek ve ardından denklemin köklerini hesaplayarak belirleyin. İlk kökü ele alalım; çok düşük kuvvetli bölge ile elastin bölgesi arasındaki sınırı ve ikinci kökü ise elastin bölgesi ile kollajen lifi bağlanmasının başlangıcı arasındaki sınırı ele alalım.
   2. Sonra, iki kök arasındaki gerilim-gerilme verilerine uygun olarak düşük kuvvet bölgesinin elastikiyet modülü^{belirlenir; doğrusal} denklemin eğimi ^8,9 arasındaki gerilme-gerilme verilerine uydurur. Bunu elde etmek için:
      1. Ek Tablo 1'de gösterildiği gibi sütunları içeren bir tablo oluşturun.
      2. Bunu bir "txt" belgesine dönüştürün ve R kod yazılımı "Modulus of Elasticity" R bebesinde açın.
      3. Veriyi kullanmak için normal eğimleri kontrol edin - R çıktısındaki 3^. türevi grafiği "M" şeklinde olmalıdır.
      4. Sonuçlar sekmesinde, eğim sütununun altındaki sayısal değer elastikiyet modülüdür. Elastikiyet modülünün doğru olması için R-kare değerinin 0.99'dan büyük veya eşit olduğundan emin olun.
      5. Bu değeri elektronik tabloda elde etmek için, R kodu sonuçlar sekmesinden elde edilen birinci ve ikinci türev arasındaki gerilme değerlerini (ve onlara karşılık gelen gerilim değerlerini) seçin.
      6. Hesap tablosu grafiğinde denklemi ve R² değerini elde etmek için 4.2. adımda belirtilen adımları takip edin.

5. Aort çapı ve duvar kalınlığının değerlendirilmesi

1. Son 1 mm aort segmentini, optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle doldurulmuş bir kriyomolda yerleştirin. Halka, lümenin düz ve kalıbın alt kısmında, luminal ekseni kesme yüzeyine dik olacak şekilde konumlandırarak enine kesitler elde edin.
2. Sıvı azotla soğutulmuş 2-metilbütan kapı hazırlayın ve ardından kriyomoldu soğuk 2-metilbütanla batırın, ta ki OCT opak beyaza dönsün.
3. Kriyomodu -80 °C'de kesitlenene kadar sakla. Kriyostat sıcaklığını uygun OCT kesme sıcaklığına (≈-20 °C) ayarlayın ve ardından donmuş bloğu numune tutucusuna monte edin.
4. Montaja sabitlendikten sonra, bloğu dikkatlice kesin ve kalınlığını 7 μm olarak koruyarak doku ortaya çıkana kadar.
5. Fare ID'si ile bir slayt etiketleyin ve 7 μm kalınlığında aort dokusunun 4–5 enine kesitini kesin.
6. Dilimlenen dokuyu slaytlara aktarmak için, tüm kesilen parçaları kriyostat aşamasına (bıçak aşaması olarak da adlandırılır) yerleştirin, ardından etiketlenmiş slaytı doğrudan üzerine yerleştirin.
7. Transfer tamamlandıktan sonra, kaydırmalar hava ile kurutulur.
8. Görüntü kesitleri parlak alan mikroskopunda 10x büyütme altında. Resimleri JPG/TIFF formatında kaydedin ve fotoğrafın altında bir ölçek çubuğu bulunuyor.
9. Analiz için ImageJ'yi açın, File > Open sayfasına gidin ve aort görselini seçin.
10. Aort görüntüsü açıldıktan sonra, Control + + simgesini kullanarak ölçek çubuğuna yakınlaştırın ve ardından çizgi aracıyla ölçek çubuğunun uzunluğunu ölçün. Sonucu doldurmak için Control + M tuşuna basın. Uzunluk altında hesaplanan ölçüm, ölçek çubuğunun ölçüsüdür.
11. Yazılımı kalibre etmek için Analyze > Set Scale sayfasına gidin. Piksel cinsinden Mesafe için, 8. adımda ImageJ tarafından hesaplanan çizginin uzunluğunu girin. Bilinen mesafe için ölçek çubuğunun gerçek uzunluğunu girin ve birimlerin altına ölçüm birimi (μm, mm, cm vb.) yazın.
12. Tüm sonraki görüntüleri otomatik olarak kalibre etmek için küresel kutuyu işaretleyin. Diğer görsellerdeki ölçek çubuğunun farklı olup olmadığını veya ImageJ'nin kapalı olup olmadığını not edin; Eğer öyleyse, yeniden kalibrasyon gereklidir.
13. Duvar kalınlığı için düz çizgi aleti kullanın ve luminal kenardan dış adventisyal kenara dik bir çizgi çizin. Sonuçlar sekmesinde uzunluğu otomatik olarak doldurmak için Control + M tuşlarına basın.
14. 5.13. adımı tekrarlayarak aortanın çevresinde 6 eşit aralıklı konumda ölçümler yapın ve her bir değeri kaydedin.
15. Fare aortası başına ortalama kalınlığı hesaplamak için, aynı farenin 4–5 örneğinden elde edilen tüm kalınlıkların ortalaması alınır.
16. Luminal çapı ölçmek için çokgen aracını seçin ve iç ışık sınırını saat yönünde izleyin. Çevreyi (μm) Control + M tuşlarıyla kaydedin.
17. Saat yönünün tersine izlemeyi tekrarlayın, farklı bir noktadan başlayın. İki çevre değerinin birbirine yakın olduğundan emin olun ve o aort halkası için ortalamanızı yapın.
18. Aynı farenin 4–5 aort örneği için 5.16. adımı tekrarlayın ve tüm çevre değerlerinin ortalamasını alın.
19. Çapı hesaplamak için şu denklemi kullanın: Çapta (μm) = Çevre/3.14.

6. Dolaşımda ortam aracılı aort elastik modülü

NOT: Dolaşımdaki faktörlerin veya spesifik bileşiklerin içsel aort sertliğini değiştirip değiştirmediğini belirlemek için, müdahalede naif farelerden alınan torasik aort halkaları tanımlanmış standart kültür koşulları altında (37 °C, %5_CO2, %20 O₂, nemlendirilmiş) ex vivo kuluçka edilebilir (Şekil 9).

1. Toraks aortunu disseksiye edin ve her koşulda iki adet 1 mm halka segmenti kesilin. Tüm perivasküler yağ dokusunu çıkarın.
2. 96 kuyu ölçülü bir plakada, aort halkaları standart ortamda kuluçka yapın; bu ortam DMEM + %1 penisillin-streptomisin içerir.
3. Medyaya deneysel tedavi ekleyin. Plazma veya serum için (bu amaçla işlememiş plazma/serum kullanılabilir), toplam medya hacminin %10'unu kullanın. Preklinik ve klinik (insan) plazma veya^{serum 3,4,6} kullanın (Şekil 9).
4. Çalışma grupları arasında farklı olduğu gösterilen dolaşımdaki faktörün nedensel rolünü belirlemek için, plazma/serum maruziyeti tekrarlanırken, gruplar arasındaki gözlemlenen konsantrasyon farkını düzelterek (yani ilgi duyulan faktörün konsantrasyonunu normalleştirerek), ilgi çeken faktörün ortalama grup farkını temsil eden bir konsantrasyonda doğrudan etkisini belirleyin, veya dolaşımdaki ortamın etkisini aracılık etmekten sorumlu olduğuna inanılan faktörün sinyalini engellemek.
   NOT: Son iki yaklaşım daha önce sırasıyla Trimetilamin-N-Oksit (TMAO⁾⁵ ve ileri glikasyon son ürünleri için reseptörün blokajıyla^{uygulanmıştır 3}.
5. Aşırı süperoksit kaynaklı oksidatif stresin veya mitokondrilerin rolünü açıklamak için-
   spesifik süperoksit ilişkili oksidatif stres bu model sisteminde, aort halkalarını kuluçkalarken aşağıdaki konsantrasyonlar kullanılır: TEMPOL: 1^{μM 5,10} ve MitoQ: 1 μM⁶.
6. 48–72 saat kuluçkadan sonra, aort halkalarını pin miyografına yükleyin ve yukarıda belirtilen adımları takip edin.

Sonuçlar

Yaşa bağlı aort sertleşmesi

İçsel mekanik sertlik için, her esneme aralığına karşılık gelen kuvvet kaydedilir ve hesaplamalar için kullanılır. Daha önce tartışılan hesaplamalarda, yukarıda açıklandığı ve Gioscia-Ryan ve^{ark. 9} tarafından gösterildiği gibi, bu eğrilerin 1) kolajen bölgesi ve/veya 2) elastin bölgesi için gerilme-deformasyon eğrileri oluşturulur ve elastik modül hesaplanacaktır. Gerilme-gerilme eğrisinin d...

Tartışma

Aort içsel sertliğinin ex vivo değerlendirilmesi için pin miyografinin kullanımı, kan basıncı ve otonom girdi gibi potansiyel olarak karıştırıcı in vivo fizyolojik değişkenlerden bağımsız olarak aort içsel sertliğini değerlendirme fırsatı^sunar. Ayrıca, bu ex vivo deneysel yaklaşım, aort içsel sertliğindeki farklılıkların altında yatabilecek potansiyel moleküler mekanizmaların taraması için fırsat sunar. Burada, pin miyografisi kullanarak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-methylbutane	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucose (Dekstroz)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Monosodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (Na tuzu)	Sigma-Aldrich	M9024
Multi Pin Myography System	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE antikoru	R&D System	AF1145
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT bileşiği	Sakura	4583
Trimethylamine N-oksit (TMAO)	Sigma Aldrich	317594