Fare Akciğerinde Hücreye Nüfuz Eden Peptitlerle Transdüksiyon Verimliliği ve Hücre Hedeflemesinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, akciğer hedefleyen siklikleşmiş peptid R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) örnek olarak bulundu. Bu iş akışı, çiftli fraksiyon FACS'i ve ardından tek hücreli RNA dizilemesi, AT2 raporlayıcı farelerde akış sitometrisi ve AT2 ile ilişkili peptid hedefi bağlanmasını doğrulamak için konfokal z-yığını görüntülemeyi birleştirir.

Özet

Hücreye nüfuz eden peptidler (CPP'ler), hücre zarlarını çaplayabilen ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyaç duymadan makromoleküler yükler iletebilen kısa peptitlerdir (5–30 amino asit). Ancak, in vivo hücresel seçiciliği tanımlamak, hücre tipi düzeyinde doğrulama gerektirir. Farelerde retro-orbital intravenöz enjeksiyon sonrası alveolar epitel tip II (AT2) hücrelerinde Cy5.5 etiketli siklikleşmiş CPP, cR11A'nın transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için entegre bir iş akışı sunulmaktadır. Akciğerler, enjeksiyondan 15 veya 60 dakika sonra toplandı ve Cy5.5⁺ ve Cy5.5⁻ akciğer tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek için eşleştirilmiş fraksiyonlu floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) dahil olmak üzere tamamlayıcı okumalar kullanılarak analiz edildi; ardından Sftpc-CreERT2^(+/−)'dan akciğer tek hücrelerinin akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilenmesi; LSL-GFP^(+/−) AT2 raporlayıcı fareleri GFP⁺/Cy5.5⁺ olaylarını nicelikten ölçemek için ve akciğer kriyoseksiyonlarının konfokal z-stack görüntülemesi kullanılarak cR11A-Cy5.5'in AT2 ile ilişkili sinyalle kolokalizasyonunu doğrulamaktadır. Bu protokol, çoklu tamamlayıcı okumalar kullanarak hücre tipi etkileşime dair uyumlu kanıtlar sunar ve CPP'lerin hücre özgül hedeflenmesini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar; farklı hedef organlar için modifikasyonlarla.

Giriş

Hücreye nüfuz eden peptidler (CPP'ler), hücre zarlarını geçebilen ve transfeksiyon^{reaktiflerine ihtiyaç} duymadan makromoleküler yüklerin hücre içi teslimatını sağlam, tam işlevsel bir formda kolaylaştıran 5–30 amino asit peptididir ^1,2. In vitro ve in vivo faj gösteri kombinatoryal metodolojilerini kullanan önceki çalışmalar, kardiyomiyositler tarafından 5 dakika ^3,4 içinde özgün olarak alınan 12 amino asitli kalp hedefleyici peptidi (APWHLSSQYSRT) tespit etmiştir. Transdüksiyon mekanizmasını incelemek için alanin taraması yapıldı ve bu varyantlar beklenmedik şekilde in vivo akciğer zenginleşmesi gösteren S7A ve R11A (APWHLSSQYSAT) keşfedildi. ve bu nedenle akciğer hedefleyici peptitleler (LTP) olarak adlandırıldı^. Ayrıca, N-terminal lizin ekleme ve baştan kuyruğuna siklizasyon, lineer^{muadil 5'e} kıyasla serum stabilitesi ve hücre içi alımını belirgin şekilde artıran siklik bir R11A (cR11A) üretti.

LTP'ler, alveolar epitel tip II (AT2) hücreleri dahil olmak üzere distal akciğer epitel popülasyonlarına hassas bir şekilde tedavi uygulama potansiyeline sahiptir. Bu hücreler, yüzeyaktif homeostazın korunması için kritik öneme sahiptir ve alveolar^{rejenerasyon 6} için öncül görev yapar. Ancak, LTP gelişimindeki büyük bir zorluk, in vivo hücresel seçiciliğin titiz değerlendirilmesidir. Organ düzeyinde biyodağılım tek başına gerçek hücresel transdüksiyonu vasküler sinyal, ekstrahücre reksiyonu veya fagositik klirensten ayırt edemez ve bu nedenle tek hücre çözünürlüklü ölçümlerle tamamlanmalıdır⁷. Bu sınırlamayı gidermek için, bu iş akışı tek hücreli transkriptomik atama, raporlayıcı tabanlı akış sitometrisi ve konfokal z-yığın görüntülemeyi entegre ederek organ düzeyinde floresans veya biyodribülasyon okumalarının ötesinde hücre tipi seviyesinde peptid etkileşimi kanıtı^{üretir 8,9}.

Bu protokolün genel amacı, retro-orbital enjeksiyon sonrası AT2 hücrelerine odaklanarak, distal akciğerde Cy5.5 etiketli cR11A'nın in vivo transdüksiyon verimliliği ve hücre özgüllüğünü doğrulamak için tekrarlanabilir, çoklu okuma iş akışı sağlamaktır. Protokol, eşleştirilmiş fraksiyonlu floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻) dahil olmak üzere tamamlayıcı ve bağımsız okumalar kullanarak peptid ilişkili hücre kimliğini tanımlar; ardından peptid ilişkili popülasyonları haritalamak için tek hücreli RNA dizilemesi, akış sitometrisiyle AT2 raporlayıcı akciğerlerde nicel alım değerlendirmesi ve akciğer kriyoseksiyonlarının konfokal z-stack görüntülemesi ile cR11A-Cy5.5'in AT2 ile ilişkili sinyal ile kolokalizasyonunu doğrulamaktadır. Bu protokol, diğer LTP'lere veya doğum vektörlerine kolayca uyarlanabilir ve geliştirilmekte olan CPP'lerin hücre özgüllüğünü değerlendirmek için akciğer veya diğer organ sistemlerine uygulanabilir. Özellikle organ seviyesi birikiminin yalnızca organ seviyesi birikimin değerlendirilmesi yerine hücre tipi düzeyinde CPP hedeflenmesinin in vivo doğrulanmasını gerektiren uygulamalar için uygundur.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Mayo Clinic'teki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve protokol numarası A00006842-22-R25 kapsamında onaylandı. Tüm çabalar hayvanların acısını en aza indirmek ve ilgili ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun etik muamele sağlamak için gösterildi. Bu protokol için kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvanlar

1. Jackson Laboratuvarı'ndan (Strain #000664) alınan yetişkin karma cinsiyetli C57BL/6J fareleri (6–8 haftalık) kullanın.
2. AT2'ye özgü nicelik için Sftpc-CreERT2^(+/+) (Jax Strain #028054) ile LSL-GFP^(+/+) (Jax Strain #007906) çaprazlanarak Sftpc-CreERT2^(+/−) oluşturulur; LSL-GFP^(+/−) AT2 muhabir fareleri.
3. Bireysel havalandırmalı kafeslerde ev fareleri. Tüm hayvan protokollerinin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandığından emin olun.
4. Sftpc-CreERT2^(+/−) içinde tamoksifen indüksiyonu gerçekleştirin; LSL-GFP^(+/−) fareler. Fareler ≥6 haftalıkken, mısır yağında çözünmüş şekilde mısır yağında çözünmüş şekilde 7 gün boyunca üç doz uygulanır. Son dozdan en az 2 hafta sonra deneyler yapın ki maksimum rekombinasyon verimliliği sağlansın.

2. Reaktif ve ekipman hazırlığı

1. Anestezi hazırlayın (ketamin/ksilazin çalışma karışımı).
   1. 5 mL çalışma çözeltisi hazırlayın: ketamin (1 mL 50 mg/mL), ksilazin (50 μL 100 mg/mL) ve steril salin (3,95 mL).
   2. 1 μL/g vücut ağırlığını .intraperitoneal enjeksiyon (son doz: 10 mg/kg ketamin ve 1 mg/kg ksilazin).
2. Peptit (cR11A-Cy5.5) hazırlayın.
   1. CPP'leri liyofilize toz olarak alın. Tozları −20 °C'de 2 yıla kadar veya DMSO'da −80 °C'de stok çözelti olarak ışık korumalı tüplerde 6 aya kadar saklayabilirsiniz. Donma–erime döngülerinden kaçının ve ışığa maruz kalmayı en aza indirin. DMSO'da cR11A-Cy5.5 için 10 mM stok çözeltisi hazırlayın.
   2. Fareyi tartın, dozunu hesaplayın ve stoku nukleazsız suda 1 mg/kg'ya kadar seyreldin ve fare başına son hacmi 100 μL olarak elde edin.
3. Sindirim tamponu hazırlayın (taze; buzda kalın).
   1. 2 mg/mL Dispase II, 0.1 mg/mL DNaz I, DMEM/F12 ve %1 (v/v) penisillin-streptomisin içeren sindirim tamponu hazırlayın.
   2. Fare başına 3 mL kullanın.
4. Spesifik olmayan proteaz enzim yıkama tamponu hazırlayın (buzda kalın).
   1. DMEM/F12, 0,05 mg/mL DNaz I ve %1 (v/v) penisillin-streptomisin içerir.
   2. Fare başına 10 mL kullanın.
5. Kırmızı kan hücresi lizis tamponu hazırlayın (buzda kalın).
   1. 10× lizis tamponunu PBS ile 1× kadar seyreltin.
   2. Her örnek için 2 mL kullanın.
6. Perfüzyon tamponu hazırlayın.
   1. Buz gibi DMEM/F12 kullanın (fare başına 10 mL).
7. Yıkama tamponu hazırlayın.
   1. DMEM/F12 ile %2 FBS kullanın.
8. Santrifüjleri 4 °C'ye kadar önceden soğut.

3. cR11A-Cy5.5'in retro-orbital uygulaması

1. Ketamin/ksilazin çalışan çözeltiyle fareyi anestezi edin. Parmak sıkıştırmasına yanıt olarak uzuv çekilmemesiyle yeterli anestezi doğrulayın.
2. İnsülin şırıngası kullanılarak retro-orbital intravenöz enjeksiyon yoluyla 100 μL cR11A-Cy5.5 (1 mg/kg) enjekte edilir.
3. Zamanlayıcıyı başlatın ve fareyi uygun izleme altında ısıtıcı pedde 15 veya 60 dakika boyunca tutun.

4. Akciğer hasadı ve perfüzyon

1. Fareyi onaylanmış protokollere göre ötenazi yapın (örneğin, CO₂ soluması ve ardından servikal dislokasyon). Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve göğsüne %70 etanol püskürtün.
2. Kalp ve akciğerleri açmak için torakal boşluğu açın.
3. Perfüzyon sırasında drenaj yapılması için sağ atriyumda bir kesi yapın.
4. Buz gibi soğuk DMEM/F12 içeren 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 26 G'lik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin. Perfüzyon boyunca sağ atriyal kesiyi açık tutun ki drenaj yapılsın.
5. Yaklaşık 1-2 dakika boyunca 10 mL DMEM/F12'yi yavaşça ve istikrarlı bir şekilde enjekte ederek şırınga pompası olmadan manuel perfüze yapın. Enjeksiyon sırasında düşük basıncı koruyun ve görünür akciğer aşırı şişmesi veya ventriküler duvardan sızıntı oluşmasını önleyin. Akciğerler eşit şekilde solgunlaşana kadar devam edin.

5. Akciğer enflasyonu ve sindirim

1. Trakeayı 20G IV kateter ile kanülle yapın ve 3-0 ipek dikişle sabitleyin. Akciğerleri şişirmek için 1 mL sindirim tamponu ile 1 mL bir şırınga ile yerleştirilin.
2. Akciğerleri tek bir sağlam birim olarak disseksiye edin ve hemen buz üzerinde önceden soğutulmuş 100 mm bir kaba aktarın.
3. Akciğer loblarını ayırın ve 2 mL soğuk sindirim tamponu içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın (tüp başına bir akciğer).
4. 4 °C'de döner bir sallayıcı üzerinde 20 saat boyunca kuluçka yapın (10–15 rpm).
   NOT: Detaylı metodoloji için Janas PP. ve ^ark.10'a bakınız.

6. Doku dissosiyasyonu

1. 100 μm hücre süzgecini 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve 1 mL spesifik olmayan proteaz enzim yıkama tamponu ile önceden ıslatın.
2. Akciğer dokusunu süzgeceye aktarın ve steril bir şırınga pistonu ile nazikçe ayrılın.
3. 10 mL spesifik olmayan proteaz enzim yıkama tamponu ile durulayın.
4. 130 × g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
5. Pelleti 2 mL 1× RBC liz tamponunda oda sıcaklığında 90 saniye boyunca tekrar askıya alın.
6. 10 mL yıkama tamponu ile lizisi söndürün.
7. 40 μm süzgeçten geçirin ve yıkama tamponu ile durulayın.
8. Santrifüj 300 × g. 'de 4 °C'de 5 dakika sürdü.
9. Hücreleri 500–1.000 μ00 μL PBS + %2 FBS (≥1 × 10⁶ hücre/mL) içinde yeniden süspansiyon hücreleri.
10. 35 μm filtre kapağından FACS tüpüne geçirin.
    NOT: Detaylı metodoloji için Konishi S. ve ^ark.11'e bakınız.

7. Çift kesirli FACS sıralaması

1. Akış sitometresi kullanarak sıralama yapın.
2. Cy5.5 kapısını tanımlamak için PBS enjekte edilmiş akciğerleri negatif kontrol olarak kullanın.
3. Standart gating'i uygulayın: enkaz dışlama, singletler ve Cy5.5⁺ hücreleri.
4. Cy5.5⁺ ve Cy5.5⁻ popülasyonlarını ayrı tüplere ayırın.

8. scRNA-seq örnek hazırlama

1. Sıralanmış örnekleri buzun üzerinde tutun.
2. Santrifüj 300 × g. 'de 4 °C'de 5 dakika boyunca devam ettirin ve 500 μL tamponda yeniden süzülürler.
3. Sadece yaşamlılık ≥80% iseyse devam edin.
4. Kütüphaneleri ve gerektiğinde sıralamayı hazırlayın.

9. AT2 Reporter Farelerinde Akış Sitometrisi

1. 5–6. bölümlerde açıklandığı gibi akciğer tek hücreli süspansiyonları hazırlayın.
2. Tamir edilebilir canlı/ölü boya (1:1.000) ile 30 dakika boyunca (ışıktan koruyun) boya yapın.
3. 300 × g. 'de 5 dakika boyunca 4 °C'de yıkayın ve santrifüj yapın.
4. Numuneleri filtreleyin ve buz üzerinde tutun.
5. Bir akış sitometresinde veri edinin.
6. Hücreleri tanımlamak, teklekleri seçmek, ölü hücreleri hariç tutmak ve GFP ile Cy5.5 popülasyonlarını tanımlamak için kapı yönetimi gerçekleştirin.
   1. GFP⁺/Cy5.5⁺ olaylarını GFP⁺ hücrelerinin yüzdesi olarak nicelikle ölçün.

10. Fiksasyon ve kriyokoruma

1. Akciğerleri 1 mL %4 PFA ile şişirin ve trakeayı güvence altına alın.
2. Gece boyunca 4 °C'de 10 mL 4% PFA ile sabitlen.
3. PBS ile yıkayın (3×).
4. Gece boyunca %15 sakarozda kuluçka yapın.
5. %30 sakaroza ~48 saat aktar.

11. Gömme ve kriyoseksiyon

1. OCT ile kriyo-kalıplar hazırlayın, akciğerleri konumlandırın ve OCT'ye yerleştirin.
2. Sıvı azot kullanarak dondurun. Depo 80 °C'de bulun.
3. Denge sonrası 10 μm kesit. Gece boyunca hava kurutma kaydırımları.

12. Görüntüleme ve analiz

1. Bölümleri PBS ile yıkayın (3×).
2. DAPI medium ile monte edin.
3. Konfokal z-stack edinin.
4. Uygun görüntüleme ayarlarını kullanın.
5. 3D yeniden yapılandırma yapın.
6. Ortak lokalizasyonu tutarlı eşikler kullanarak nicelikleştirin.
   Isteğe bağlı yöntemler:
   Bu isteğe bağlı yöntemler temsil iş akışına dahil edilmez, ancak akciğer hücrelerinin büyük bir kısmını oluşturan CD45⁺ bağışıklık hücre popülasyonunun tükenmesi veya analizini mümkün kılmak için dahil^{edilebilir 12}.
   NOT: Analizler bağışıklık dışı akciğer popülasyonlarına odaklandığında, CD45⁺ tükenmesi veya dışlanması kullanılır; çünkü bu adımlar bağışıklık hücresi alım sinyallerini çıkarır veya ayırır ve örneğin hücresel bileşimini değiştirir. CD45 boyama, CD45⁺ bağışıklık hücre popülasyonunu ayrı ayrı analiz etmek için de kullanılabilir.

13. Azalan CD45⁺ hücre popülasyonu

1. Doku ayrışmasından (Adım 6) sonra, manyetik bir boncukla konjuge edilmiş CD45 antikoru (Miltenyi Biotech 130-052-301) veya Cy5.5, GFP ve canlı/ölü leke ile uyumlu bir florofora konjuge edilmiş CD45 antikoru (örneğin CD45-BV605 (BioLegend #103140) kullanın. Karanlıkta 4°C'de 20 dakika boya koyun.
2. CD45-manyetik boncuk tükenmesi yapılıyorsa, üreticinin Soy Tükenme (LD) sütununun (Miltenyi Biotech 130-042-901) kullanım talimatlarına uyarak Manyetik Hücre Ayırma (MACS) (Miltenyi Biotech) ile devam edin. Sonra çiftli fraksiyonlu FACS sıralamasına geçin (adım 7).
3. CD45 tükenmesi floresan konjuge bir antikor kullanılarak yapılırsa, hücre süspansiyonunu önce fazla antikoru temizlemek için yıkama tamponu ile yıkayabilirsiniz. Sonra 7. adıma geçin. Çift kutuları ve döküntüleri dışlamak için kapılar kurulduktan sonra (Adım 7.3), CD45⁺ popülasyonunu dışlamak için ek bir kapı yerleştirin. Sonra 7.4. Adıma geçin.

14. Akış sitometrisi sırasında CD45⁺ hücre popülasyonunu analiz edin

1. Adım 9.3'ten sonra, Cy5.5, GFP ve canlı/ölü leke gibi CD45-BV605 (BioLegend #103140) ile uyumlu bir florofora konjuge edilmiş bir CD45 antikoru kullanın. Karanlıkta 4°C'de 20 dakika boya koyun.
2. Hücre süspansiyonunu yıkama tamponu ile yıkayarak fazla antikoru çıkarın. Sonra 9.4. adıma geçin. Çift topları ve döküntüleri dışlamak için kapılar kurulduktan sonra (Adım 9.6), ^GFP+ ve Cy5.5⁺ popülasyonlarını belirlemek için kapıdan önce CD45⁺ popülasyonunu dışlamak için ek bir kapı yerleştirin^.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı uygulanması, üç tamamlayıcı okumadan uyumlu kanıtlar üretmelidir: çiftli fraksiyon scRNA-dizi, raporlayıcı tabanlı akış sitometrisi ve konfokal z-yığın görüntüleme.

Çiftli fraksiyonlu scRNA-seq analizinde, sistemik cR11A-Cy5.5 uygulandıktan sonra Cy5.5⁻ ve Cy5.5⁺ akciğer tek hücreli fraksiyonları elde edildi ve ayrı ayrı analiz edildi. UMAP görselleştirmesi, bağışıklık sistemi, endotelyal, epitel ve mezenkimal bölmeler dahil olmak üzere başlıca akciğer hücresi popülasyonlarını tespit etti (Şekil 1A, B). Bağışıklık hücreleri her iki sıralanmış fraksiyonda da baskın popülasyonu temsil etse de, Cy5.5⁺ fraksiyonu, epitel hücreler dahil olmak üzere bağışıklık dışı bölmelerin göreceli zenginleşmesini göstermiştir (Şekil 1C). Epitel alt küme analizi, Cy5.5⁺ fraksiyonunda AT2 hücrelerinin Cy5.5⁻ fraksiyonuna göre daha fazla temsil edildiğini gösterdi; oysa AT1 hücreleri her iki fraksiyonda da düşük kaldı (Şekil 1D). Bu sonuçlar, çiftli fraksiyonlu scRNA-seq'in, cR11A-Cy5.5–pozitif akciğer hücresi fraksiyonu içindeki AT2 hücrelerinin zenginleşmesini tespit edebildiğini göstermektedir.

Akış sitometrisi, raporlayıcı tanımlı AT2 hücrelerinde cR11A-Cy5.5 sinyalini nicelendirmek için kullanıldı. Temsilci kapı seçimi ise FSC-A/SSC-A ile toplam hücrelerin seçilmesini, iki ardışık singlet kapıyı, canlı hücre gatingini ve nihai GFP karşılaştırmasını içeriyordu. Cy5.5 analizi (Şekil 2A–E). Kontrol örneğinde GFP⁺/Cy5.5⁺ olayları minimumdu ve arka plan floresans eşiğini belirledi. cR11A-Cy5.5 uygulamasının ardından, GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 raporlayıcı-pozitif olaylar bu temsilli veri setinde 15 dakikada %7,99'a ve enjeksiyon sonrası 60 dakikada %7,41'e yükselmiştir (Şekil 2E). Bu sonuçlar, in vivo olarak AT2 raporlayıcı pozitif hücrelerde tespit edilebilir cR11A-Cy5.5 sinyalini desteklemektedir.

Konfokal z-stack görüntüleme, akciğer dokusu kesitlerinde peptid ilişkili floresansın mekansal doğrulanmasını sağlar. Arka plan floresansını değerlendirmek için raporlayıcı olmayan bir kontrol dahil edildi ve GFP ile Cy5.5 kanallarında minimum sinyal gösterdi. cR11A-Cy5.5 ile tedavi edilen AT2 raporlayıcı akciğerlerde, GFP⁺ AT2 raporlayıcı-pozitif hücrelere yakın bir yerde Cy5.5 floresansı tespit edildi ve Imaris tarafından oluşturulan kolokalizasyon kanalı, GFP ile Cy5.5 sinyalleri arasında örtüşme tespit etti (Şekil 3A). Temsil eden Imaris kolokalizasyon analizi, GFP⁺ AT2 bölmesinde sırasıyla 15 ve 60 dakika içinde %89,6 ve %86,8 kolokalizasyon göstermiştir (Şekil 3B).

Optimal olmayan sonuçlar arasında kontrol örneklerinde yüksek arka plan Cy5.5 floresansı, kötü epitel hücre iyileşmesi, düşük hücre canlılığı veya GFP⁺/Cy5.5⁺ olaylarının zayıf ayrılması olabilir. Bu sorunlar genellikle eksik perfüzyon, aşırı doku bozulması, yetersiz telafi veya tutarsız görüntüleme eşiklerini gösterir.

Şekil 1: Çiftli fraksiyonlu scRNA-siq, cR11A-Cy5.5–pozitif akciğer fraksiyonunda alveolar epitelin zenginleşmesini tanımlar. Akciğer tek hücreli süspansiyonlar, cR11A-Cy5.5'in retro-orbital enjeksiyonunun ardından Cy5.5⁻ ve Cy5.5⁺ fraksiyonlarına ayrıldı ve her fraksiyon tek hücreli RNA dizileme ile analiz edildi. (A) UMAP grafikleri, temsil bir fareden eşleşen kesirlerde hücre tipi kümeleri gösterir. (B) UMAP üst örtüsü, Cy5.5⁻ ve Cy5.5⁺ hücrelerinin dağılımını gösterir. (A) ve (B)'deki dairesel bölgeler, epitel alt küme analizi için vurgulanan epitel bölmesini gösterir. (C) Bağışıklık popülasyonları her iki fraksiyonda da oldukça yaygındır ve her iki fraksiyonun %80'inden fazlasını temsil eder. Cy5.5⁻ fraksiyonuna kıyasla, Cy5.5⁺ fraksiyonu daha fazla endotelyal, epitel ve mezenkimal popülasyonlar içerir ve bu da bu popülasyonlarda cR11A alımını gösterir. (D) Epitel popülasyonu içinde, AT2 hücreleri Cy5.5⁺ fraksiyonunda Cy5.5⁻ fraksiyonuna göre daha yüksek şekilde temsil edilirken, AT1 hücreleri her iki fraksiyonda da düşük kalır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: AT2 raporlayıcı akciğerlerde cR11A-Cy5.5 alımının akış sitometrisi doğrulanması. AT2 raporlayıcı farelere retro-orbital intravenöz enjeksiyon yoluyla cR11A-Cy5.5 verildi ve enjeksiyondan 15 dakika veya 60 dakika sonra tek hücreli hazırlık için akciğerler alındı. PBS araç kontrol (Ctrl) ve cR11A-Cy5.5 ile işlenmiş örnekler için temsilli kapı gösterilmiştir: (A) hücreler FSC-A/SSC-A ile seçildi, (B, C) tekletler saçılma tabanlı çift hariç ile kapatıldı, (D) canlı hücreler canlılık boyası hariç tutulmasıyla tanımlandı ve (E) GFP (AT2 raporlayıcısı) ile karşılaştırıldı. Cy5.5, GFP⁺/Cy5.5⁺ olaylarını nicelendirmek için kullanıldı. Bu temsilci veri setinde, GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 olayları cR11A-Cy5.5 uygulamasından sonra hem 15 dakika hem de 60 dakika içinde yaklaşık %8 oranındadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AT2 raporlayıcı akciğerlerde cR11A-Cy5.5 alımının konfokal görüntüleme ve Imaris kolokalizasyon analizi. (A) Raporlayıcı olmayan kontrol (Ctrl) ve cR11A-Cy5.5 ile tedavi edilmiş AT2 raporlayıcı akciğerler için temsil alanlar, enjeksiyondan 15 dakika veya 60 dakika sonra kriyoseksiyon ve konfokal z-stack görüntüleme için alınmıştır. GFP sinyali (yeşil) AT2 hücrelerini işaretler ve cR11A-Cy5.5 floresansı (kırmızı) peptid ilişkili sinyali gösterir. "Coloc" paneli, Imaris (sarı) tarafından kolokalize edilmiş pikselleri veya nesneleri gösterir ve birleşmiş görüntüler iki kanal arasındaki mekansal örtüşmeyi gösterir. Raporlayıcı olmayan kontrol, GFP ve Cy5.5 kanallarında arka plan floresansını değerlendirmek için dahil edildi. (B) GFP⁺ AT2 bölmesinde kolokalizasyonun nicelendirilmesi, GFP sinyalinin %89,6 ve %86,8'inin sırasıyla 15 dakika ve 60 dakika içinde cR11A-Cy5.5 ile birlikte lokalize olduğunu göstermektedir. Bu veriler, her iki zaman noktasında da GFP⁺ AT2 hücreleriyle sağlam örtüşmeyi göstermekte olup, AT2 bölmesinin in vivo olarak tercihli katılımını desteklemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, belirli hücre popülasyonlarının peptid hedeflenmesini, tamamlayıcı çözünürlüklerde çalışan birden fazla bağımsız okuma kullanarak tanımlar: transkriptom seviyesinde haritalama (çiftli fraksiyon scRNA-dizi), nicel olay tabanlı ölçüm (raporlayıcı akış sitometrisi) ve mekansal doğrulama (konfokal z-yığınları). Bu yaklaşımlar birlikte, organ düzeyinde floresans veya toplu biyodağılım temelli çalışmalara özgü yaygın belirsizlikleri (örneğin damarların floresansı veya hücre dışı reksiyon gibi) ve peptid ile ilişkili sinyalin belirli akciğer hücre popülasyonlarına atamamasını^{azaltmaktadır 7}.

Birkaç adım özellikle dikkat gerektirir. Perfüzyon kalitesi, arka plan floresansını ve aşağı akış sıralama performansını güçlü şekilde etkiler; yeterli perfüzyon, tüm akciğer loblarının tekdüz, fildişi beyazı görünümüyle karakterize edilirken, eksik perfüzyon hedef dışı bölümlerde Cy5.5 sinyalini yükseltebilir. Doku ayrışması için, tipik sindirim koşulları (37 °C, 1–2 saat) yerine uzun süreli soğuk sindirim (4 °C, 20 saat) kullanılır; bu da epitel popülasyonlarını korumak ve özellikle alveolar tip I (AT1) hücrelerinin iyileşmesini iyileştirmek için tipik sindirim koşulları (37 °C, 1–2 saat) yerine kullanılır¹⁰. AT1 hücreleri, büyük ve ince morfolojileri nedeniyle mekanik sindirime karşı oldukça hassas olduğu için izolasyon sırasında kolayca kaybolur. Standart laboratuvar uygulamalarının ötesinde, tutarlı sindirim, telafi etme, gating ve eşik belirleme gibi, 3D kololokalizasyon analizi, peptid sinyalinin AT2 raporlayıcı sinyaliyle örtüşüp örtüşmediğini belirlemeye yardımcı olur; yalnızca iki boyutlu floresans örtüşmesine^{dayanmak yerine 13}.

CD45⁺ bağışıklık hücresi tükenme adımı, scRNA-seq veya akış sitometrisi nicelenmesinden önce düşünülebilir. İmmün hücreler, akciğer hücre popülasyonlarının büyük bir kısmını oluşturur ve yabancı parçacıklara karşı tipik bir bağışıklık yanıtının parçası olarak CPP'leri alabilirler. Endotelyal, epitelyal ve mezenkimal bölmeler dahil olmak üzere bağışıklık dışı popülasyonlarda CPP alımını daha doğru şekilde nicelemek için CD45⁺ hücre tükenmesi hassasiyeti artırabilir. Bu, ayırmadan önce boncuk tabanlı tükenme kullanılarak veya akış sitometrisi analizi sırasında CD45⁺ hücrelerinin dışlanmasıyla^{sağlanabilir. 12}. Ancak, bu değişiklik seçici olarak kullanılmalıdır çünkü bağışıklık hücresi alım bilgisini ortadan kaldırır ve analiz edilen numunenin hücresel bileşimini değiştirir.

Bu iş akışının birkaç sınırlaması göz önünde bulundurulmalıdır. Cy5.5 floresansı peptid ilişkili sinyali tanımlar, ancak içselleştirilmiş peptidi membrana yapışan veya perisellüler sinyalinden tek başına ayırt etmez. Çiftli fraksiyonlu scRNA-seq, doku ayrışması, hücre iyileşmesi, sıralama eşikleri ve her akciğer hücresi popülasyonunun göreceli bolluğundan da etkilenir. Bu nedenle, bazal hücreler veya iyonositler gibi nadir popülasyonlar az temsil edilebilir veya gözden kaçabilir. Reporter fare akışı sitometrisi, daha güçlü hücre tipi ataması sağlar ancak uygun bir raporlayıcı hattı veya doğrulanmış antikor paneli gerektirir. Ayrıca, raporlayıcı farelerle yapılan bir araç kontrolü, görüntüleme testlerinde GFP⁺ AT2 hücrelerinde arka plan kololokalizasyonunu daha iyi tanımlar. Bu nedenle yorum, tek bir okuma yerine scRNA-dizi, akış sitometrisi ve konfokal görüntüleme alanlarında uyumlu kanıtlara dayanmalıdır.

Bu iş akışı modülerdir ve alternatif floroforlara, raporlayıcı fare hatlarına, doz rejimlerine veya hasat zaman noktalarına uyarlanabilir. Ek hücre veya organ spesifik CPP'ler geliştiren çalışmalar için, eşleştirilmiş fraksiyon scRNA-seq tasarımı diğer organlara (örneğin karaciğer, böbrek veya beyin) modifikasyonlarla uygulanabilir. Bu protokol, aynı hayvandan alınan tek bir organ içindeki peptid ilişkili popülasyonları karşılaştırmak için verimli bir yaklaşım sunar; böylece yorumlanabilirliği artırırken hayvanlar arası değişkenliği azaltır. Gelecekteki uygulamalar arasında ek CPP'lerin taraması, CPP–kargo konjugatlarının test edilmesi, lineer ve döngüsel peptid tasarımlarının karşılaştırılması ve doku mimarisi veya hedef hücre bolluğunun değiştirildiği hastalık modellerine bu iş akışını uygulamak yer almaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	CD45+ hücrelerin tanımlanması veya dışlanması için kullanılır
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Strain #000664	Deneyler için kullanılan yabani tip fareler
CD45 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301	CD45+ hücrelerin manyetik olarak tüketilmesi için kullanılır
Cell counter	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Otomatik hücre sayımı
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Hücre inkübasyonu
Confocal microscope	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Z-stack görüntülerinin elde edilmesi için kullanılır
cR11A-Cy5.5 peptide	Mayo Clinic Proteomics Core	Özel sentez; katalog numarası yok	İçin floresan etiketli CPP, in vivo teslimat için kullanılır
Cryostats	Leica Biosystems	Leica CM1950	Dokunun kesilmesi için kullanılır
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Akciğer dokusunun sindirimi için kullanılan enzim
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Hücre ayrıştırma ve yıkama tamponu
DNase I	Roche	10104159001	DNA ile hücre kümelenmesini azaltır
FACS cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4 lazer sistemi	Cy5.5+ ve Cy5.5- hücrelerin sıralanması için kullanılır
FBS	Gibco	A52567-01	Hücre canlılığının iyileştirilmesi için tamponlara eklenir
FlowJo software	FlowJo	Versiyon 10.10.0	Akış sitometrisi veri analizi
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Versiyon 10	İstatistiksel analiz ve çizim
Imaris software	Oxford Instruments	Versiyon 9.9.1	3D görselleştirme ve kolokalizasyon analizi
Incubated orbital shaker	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Dokunun sindirimi için kullanılır
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	Manyetik hücre ayırma (MACS) için kullanılır
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
Live/dead fixable yellow dead cell stain kit	Invitrogen	L34968	Akış sitometrisinde canlılık boyaması için kullanılır
Live/dead fixable yellow dead cell stain kit	Invitrogen	L34968
LSL-GFP reporter mice	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Cre-indüklenebilir GFP raportör hattı
LSL-GFP reporter mice	The Jackson Laboratory	Strain #007906
Microcentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R	Numune santrifüjlenmesi
Microcentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R
Mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139	Görüntüleme için nükleer karşı boyama
Mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139
Nuclease-free water	Qiagen	175034992
Oral gavage needle	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Genel yıkama tamponu
PBS	Gibco	10010-023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Bakteryal kontaminasyonu önler
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Kontrollü sıcaklıkta hücre peletleme
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Saline	Baxter	2F7124
Sftpc-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	Strain #028054	AT2-spesifik indüklenebilir Cre hattı
Sftpc-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	Strain #028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter mice	In-house breeding	Sftpc-CreERT2(+/+) farelerin LSL-GFP(+/+) farelerle çaprazlanmasıyla oluşturuldu	AT2-spesifik GFP etiketleme için kullanılır
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter mice	In-house breeding	Sftpc-CreERT2(+/+) farelerin LSL-GFP(+/+) farelerle çaprazlanmasıyla oluşturuldu
Silk suture	Look	SP117
Single-cell RNA sequencing service	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Kütüphane hazırlanması ve sekanslama
Single-cell RNA sequencing service	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
Water bath incubator	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Sıcaklık kontrollü inkübasyon