Akciğer Parenkimal ve Hava Yolu Yeniden Modelinin Kantitatif Mikro-BT Analizi, Bir Ferret Modelinde Pulmoner Fibrozis

Özet

Burada, bir ferret modelinde bleomisin kaynaklı akciğer fibrozisinin özelliklerini nicel olarak değerlendirmek için mikro-BT kullanımı için bir protokol sunuyoruz. Bu gelincik modeli, pulmoner fibrozu anlamak ve yeni tedavileri test etmek için güçlü translasyonel potansiyel göstermektedir.

Özet

Pulmoner fibroz (PF), tekrarlayan alveolar hasarlarla karakterize edilen, kronik ve ilerleyici bir akciğer hastalığıdır ve bu hastalık parenximal kalınlaşma, skorlaşma ve solunum bozukluğuna yol açar. Mevcut kemirgen modelleri, özellikle bleomisin (BLEO) kullananlar, solunum bronşiollerinin olmaması gibi anatomik farklılıklar nedeniyle insan idiopatik pulmoner fibrozisine (IPF) sınırlı translasyonel önem sahiptir. Bu sınırlamayı gidermek için, insanlardakilere benzer solunum bronşiyollarına sahip ferretlerde büyük hayvan akciğer fibrozisi modeli geliştirdik. Üç aylık vahşi tip gelinciklere intratrakeal BLEO instillasyonu yapıldı. Akciğerler, tedaviden 8 hafta sonra mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve histolojik değerlendirme için alındı. Gelincik küçük hava yollarını görselleştirmede çoklu detektörlü BT (MDCT) sınırlı uzanır çözünürlüğü nedeniyle, çıkarılan akciğerler mikro-BT tarayıcısıyla kontrollü hava yolu basınçlarında (0_{cmH 2}O ve 25 cmH₂O) exvivo görüntülenerek ekspirator ve spirator koşulları simüle edildi.

Mikro-BT görüntüleme, normal ve BLEO ile tedavi edilen ferret akciğerleri arasında belirgin yapısal farklılıklar ortaya koydu. Normal akciğerler düşük zayıflama ve koruma yapısı gösterirken, BLEO ile tedavi edilen akciğerler fibrozla uyumlu belirgin şekilde artan zayıflama göstermiştir. İnsan fibrotik akciğer hastalığına özgü özellikler, kistik boşluklarla bal peteği, kalınlaşmış interlobular septa ve erken fibrotik veya iltihap değişikliklere işaret eden zemin camı opasiteleri gibi belirgin hale geldi. Nicel mikro-BT analizi kullanılarak, BLEO ile tedavi edilen ferret akciğerlerindeki hava yollarının her iki uygulanan hava basıncında radyal genişleme, boylamasına gerilme ve hacim değişiminin anlamlı şekilde azaldığı gözlemlendi. Ayrıca, nesil eşliğinde yapılan analizler, görsel olarak görülen fibrozlu bölgelerde hava yolu duvarlarının önemli ölçüde kalınlaştığını ortaya koydu. Masson'ın trikrom boyama dahil olmak üzere histolojik değerlendirme, kapsamlı kolajen birikimi ve fibrozu doğruladı.

Bu çalışma, BLEO ile tedavi edilen gelinciklerin insan pulmoner fibrozunu andıran radyolojik ve mekanik özellikler geliştirdiğini göstermektedir. Ayrıca, mikro-BT, fibrotik dağılım, hava yolu dinamikleri ve akciğer hacmi değişikliklerinin yüksek çözünürlüklü değerlendirilmesini sağlar. Bu bulgular, gelinciğin PF patogenezini incelemek ve yeni tedavi stratejilerini değerlendirmek için translasyonel bir model olarak potansiyelini ortaya koymaktadır.

Giriş

Pulmoner fibroz (PF), tekrarlayan alveolar yaralanmaların parenximal kalınlaşmaya, fibrozlara ve ilerleyici solunum bozukluğuna yol açtığı kronik ve ilerleyici bir interstisyel akciğer^{hastalığıdır 1}. Pulmoner fibrozis, ilaçlar, çevresel toksinler, enfeksiyonlar, altta yatan otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli maruziyetlerle indüklenebilir veya idiopatik^olabilir. Hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak için özellikle idiopatik pulmoner fibroz (IPF) olan hastalar için ilaçlar geliştirilmiş olsa da, akciğer fibroz tedavi edilemez durumda kalmıştır ve teşhis ^1,2 sonrası hayatta kalma oranı 3–5 yıldır. Çoğu durumda, kesin tedavi akciğer nakli; Bu nedenle, yeni ve daha etkili terapötik seçenekler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.

Bleomisin, insanlarda yaygın olarak malignite tedavisinde kullanılan bir ilaçtır; ancak kullanımı akciğer toksisitesi nedeniyle sınırlıdır ve bu toksisite hızla pulmoner^{fibroz 3'e} ilerleyebilir. Bu yan etkinin keşfinin ardından, bleomisin akciğer fibrozis hayvan modelleri geliştirmek için araştırmalarda kullanılmıştır. Bu amaçla sıkça kullanılan ^{fareler 4,5,6} ve Bleomisin uygulamasında çeşitli yöntemlerle, damar içi ve intratrakeal^{intilasyon 7,8} dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle kullanılmıştır. Bu modellerde fibroz gelişse de, hiçbiri insanlarda görülen tüm akciğer fibrozunun ana özelliklerini^{kapsamıyor 8}. Pulmoner fibrozis kemirgen modelleri, bal peteği kisti oluşumu ve distal alveollerin bronşiolizasyonu gibi ileri hastalığın temel özelliklerini^{yansıtamaz 9}. Ayrıca, çalışmalar bleomisin kaynaklı akciğer hasarının kemirgenlerde yaklaşık 28 gün sonra kendiliğinden düzelmeye başladığını^{göstermiştir 10}. Ayrıca, bu modellerde fibrozisi engelleyen hiçbir ajanın insanlarda benzer etki yaratmadığı ve terapötik seçeneklerimizi^{sınırladığı belirtilmiştir 11}.

Evcil gelincikler (Mustela putorius furo), insan solunum sistemine anatomik benzerlikleri nedeniyle solunum biyomedikal araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır¹². Ayrıca, insanları enfekte eden benzer solunum yolu patojenlerine, örneğin respretum sinsityal virüsü (RSV) ve grip gibi hastalıklara karşı duyarlıdırlar ve bu da fizyolojik benzerliklerini gösterir¹². Bleomisin ferret modelleri bronşiolizasyonu, fibrotik odakların oluşumunu ve anormal bazaloid benzeri (KRT7⁺/KRT17^+/KRT5–/TP63⁺) hücrelerinin varlığını^{göstermektedir 9}. Tek doz bleomisin, ferretlerde sürekli akciğer fibrozisine neden oldu; kısıtlayıcı fizyoloji ve fibrotik akciğer anormallikleri en az 22 hafta^{boyunca devam etti 13}. Bu bulgu, yaygın olarak kullanılan fare bleomisin modelinden büyük ölçüde farklıdır; burada fibroz genellikle kendi kendine sınırlanır ve yaklaşık 28 gün sonra düzelmeye başlar; 6–8 hafta içinde önemli bir gerileme yaşanır; bu da ferret modelinin insan akciğer fibrozunun kronik ve ilerleyici doğasını daha iyi şekilde yansıtabileceğini öne sürmektedir. Ayrıca, gelincikler son zamanlarda insanlara benzedikleri için solunum sistemini en sık etkileyen sistemik hastalık olan kistik fibroz araştırmalarında^{kullanılmıştır 14}. Bu nedenle, bu hayvanlar önceki kemirgen modellerinden daha iyi PF modelleri olabilir.

Bu güncel çalışma, insan durumuna daha yakın bir hayvan akciğer fibrozisi modeli geliştirmeyi amaçladı. Evcil gelinciklere intratrakeal bleomisin uyguladık. 8 hafta sonra, bu gelincikler akciğer fibrozlu insanlarda gözlemlenenlere benzer radyografik ve histolojik değişiklikler gösterdi.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) yönergelerine ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Hayvan protokolü onay no. PROTO202300066). Hayvan bakımı ve deneysel protokoller Michigan State Üniversitesi tarafından onaylandı ve araştırmalarda hayvanların etik kullanımı için kurumsal standartlara uygun şekilde gerçekleştirildi.

1. Ferretlerde bleomisin bronkoskopik aşılanması

1. 3–4 aylık yaş aralığında erkek gelincikler edinin. Bu yaşta bir erkek gelinciğin ortalama ağırlığı yaklaşık 0,9–1,6 kg olmalıdır. Hayvanları 21 °C sıcaklıkta, %40–%50 nem altında barındırın.
2. Hassas buharlaştırıcı anestezi makinesi kullanarak gelinciğe %3–%5 isofluran gazı verilmelidir.
3. Aesteziyi sürdürmek için gelinciklerin burnunu burun koni ile kapatın ve %3–%5 konsantrasyonda izofluran gazı verilmeye devam edin.
4. Gelincik yeterince sedasyon alıp yattığında, 2,7 mm dış çaplı bronkoskop kullanılarak bronkoskopiye başlayın.
5. Bleomisinin yayılmasını sağlamak için çalışma kanalı üzerinden distal trakeaya bleomisin (2 U/kg vücut ağırlığı) ve tuzlu su karışımı yerleştirilir. Toplam hacmin 1 mL'yi geçmediğinden emin olun. Gelincikleri ilgili konut birimlerine geri gönderin ve 8 hafta boyunca izlemeyi takip edin.
   NOT: Dambızlatmanın tamamlanması iki dakikadan fazla sürmemelidir.
6. İzofluran hassas buharlaştırıcı gaz anestezi makinesiyle uygulanır. Gelinciğin burnunu burun konisi ile kapatın ve gelincik yatana kadar %1–%5 izofluran verin. Görünür klinik ölüm doğrulanana kadar gaz maruziyetine devam edin. 90 mg/kg dozda damar içi ötenazi solüsonu uygulanır ve ölüm doğrulana kadar hayati değerleri takip eder.
7. Tedaviden 8 hafta sonra akciğerler mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve histolojik değerlendirme için alın.

2. Gelincik akciğerlerinin yüksek çözünürlüklü mikro-BT görüntülemesi

1. Görüntüleme için ekstra doku ve kan çıkararak kan boşaltımı için alt vena kava kesisiyle alın. Akciğerler hazırlandıktan hemen sonra BT yapılabilir.
2. Aşağıdaki görüntü alma ayarlarıyla mikro-CT sistemiyle tomografik mikro-CT görüntüleri alın: 90 keV, 88 μA, güç ayarı 60 μm Bakır ve 500 μm Alüminyum X-ışını kollimatör filtresi ile, 72 mm görüş alanı (FOV) ile 144 μm izotropik görüntü çözünürlüğünde.
3. Otomatik dikiş protokolü kullanarak 18 saniye standart gantry zamanlarında toplam 5 görüntü elde etmek; böylece yetkili dilimleri üst üste bindirmek, dikmek ve reddetmek için hava yolu boru hattı analizi için nihai bir dikişli görüntü oluşturulur; Bu, 144 μm voxel çözünürlükte 68 mm silindirik çapta FOV x 186 mm toplam dikişli görüntü derinliği (Z düzlem) elde edecek ve tüm ex vivo ferret akciğer bloğunun tam yakalanmasını sağlayacaktır.
   1. Bu görüntüleme protokolü, her bir ex vivo ferret akciğer seti için hem 0_{cmH 2}O hem de 25 cmH_2Oakciğer basınçlarında tekrarlayın.
   2. Görüntüleme sırasında hava yolu basıncını hassas şekilde kontrol etmek ve korumak için doğrudan akciğere bağlı bir basınç izleme sistemi kullanın.
   3. Basınç ölçerini düzenli bir hava akışı kaynağına bağlayarak akciğer içi basıncın sürekli ayarlanmasına olanak tanır.
   4. Görüntülemeden önce, sistemi istenen basınç seviyesine (0 cmH₂O veya 25 cmH₂O) ayarlayın ve akciğeri düzenli bir hava akışıyla şişirin.
   5. Görüntüleme yaparken, hava yolu basıncı hakkında gerçek zamanlı geri bildirim sağlamak ve hava akışı kaynağı kullanarak küçük basınç dalgalanmalarını dengelemek için basınç ölçerini kullanın.

3. Görüntü İşleme ve Segmentasyon

1. Yeniden oluşturulan mikro-CT görüntü hacimlerini, nörogörüntüleme teknolojisi girişimi (NIfTI) formatına dönüştürülen DICOM formatında hava yolu segmentasyon boru hattına yükleyin.
2. Mikro-BT görüntüsünde ilgi alanını (ROI) üst uçtaki aksiyel dilimleri manuel olarak kırparak tüp ve diğer trakeal ekleri hariç tutarak tanımlayın ( bkz. Şekil 1A).
3. Aşağıdaki ana adımlarda açıklanan otomatik Dondurma ve Büyüt^{algoritması 15,16} kullanarak hava yolu segmentasyonu gerçekleştirin.
   1. Bir tohumu trakeanın içine yerleştirin; ROI içindeki en üstteki eksenel görüntü dilimini; tüm voxeller '0'a atanan, giriş görüntü boyutuna sahip boş bir görüntü dizisi oluşturmak için giriş görüntü boyutuna sahip boş bir görüntü dizisi oluşturun; ve tohum voxelini CAV'ya '1' olarak ayarlayarak ekleyebilir.
   2. Hava yolu lümeninin segmentasyonu için başlangıçta konservatif mikro-KT yoğunluk eşiği t = -1000 HU ayarlanır.
   3. Tüm voxeller '0' olarak başlatılmış şekilde yasaklanmış hacim (FV) için giriş görüntü boyutunda boş bir görüntü dizisi oluşturun.
   4. İki bayraktan biri tarafından tanımlanan hava yolu lümen segmentasyonu yakınsayana kadar yinelemeli segmentasyonu tekrarlayın: 1) tüm eşik aralığı (-1000 ile -600 HU) kontrol edilir veya 2) CAV görüntüsünde '1' voksellerin yanında bulunan tüm '0' voxeller FV görüntüsünde '1' olarak işaretlenir.
      1. CAV merkez hattı^{ağacı 17'yi} hesaplayın ve terminal dal uç^{noktalarını 18'i} belirleyin.
      2. Mikro-CT görüntüsünde mevcut t değerinde ikili eşiklendirme uygulanır ve yeni lumen bağlantılı hacim^18'i, eşikli bölge üzerinde (voxel değeri ≤ t) CAV tohum olarak hesaplayın, ancak FV hariç tutulur.
      3. Her CAV uç noktası için, yeni lümen hacmi içindeki ilgili voxelleri hesaplayın; CAV hariç, diğer CAV uç noktalarına göre o uç noktaya daha yakın olanlar.
      4. CAV uç noktasını, yeni lumen hacminde potansiyel sızıntı noktaları olarak büyük hacmli voxel (>150 voxel, 0,5 mm^3'e eşdeğer) tespit edin.
      5. Nadeem ve ^ark.15'te tanımlanan otomatik kriterler kullanılarak olası bir lümen sızıntısı doğrulan.
      6. Lümen hacmindeki kaçakları çıkarmak, sızıntı köklerine distal alt ağaç hacmini silerek ve daha önce açıklanan algoritmalarla FV'yi artırmak için sızıntı köklerinin etrafına voxeller ekleyin¹⁵.
      7. Sızıntıdan kaldırılmış lümen hacmasını CAV'yi güncelletmek için daha önce açıklanan algoritmalarla^{atamak 15}.
      8. Eşik t'yi '1' artırın.
      9. 3.3.4 adımına geç.
4. Aşağıdaki ana adımlarda açıklanan daha önce doğrulanmış otomatik^{algoritma 17} kullanarak tek voxel kalınlığında bir hava yolu merkez hattı ağacının hesaplanmasını gerçekleştirin.
   1. Segmentli hava yolu ağacını ikili bir NIfTI görüntüsü olarak girin.
   2. Aşağıdaki ana adımlarda açıklanan medial olarak tercih edilen minimum maliyetli yol^{yaklaşımı 17} ile ilk hava yolu merkez hattı ağacını hesaplayın.
      1. Tüm voxeller '0'a atanan, giriş görüntü boyutuna sahip boş bir iskelet görüntü dizisi oluşturun; Adım 3.3.1'in otomatik tohumunu '1' değeriyle başlangıç iskelet voksel olarak ekleyin.
      2. Tüm voxellerin '0' olarak atandığı ve işaretlenmiş hava yolu hacmi görüntüsünü temsil etmek için giriş görüntü boyutunda boş bir görüntü dizisi oluşturun.
      3. Mevcut iskelete en uzak olan işaretsiz hava yolu hacmindeki voxeli belirleyin ve bu noktayı mevcut iskelete bağlayan medial tercih edilen minimum maliyetli yolu daha önce tarif edilen^{algoritmayı kullanarak hesaplayın 17}.
      4. Ortaya çıkan yolu iskelet görüntü dizisine yeni bir iskelet dal olarak ekleyin ve hava yolu işaretli hacmi daha önce açıklandığı gibi dal boyunca yerel ölçek adaptif genişleme uygulayarak^{güncelleye alın 17}.
      5. 3.4.2.3–3.4.2.4 adımlarını işaretlenmiş hava yolu hacmi doldurulana kadar tekrarlayın.
   3. Sahte topolojik dalları buda, gerçek hava yolu merkez hatlarını koruyarak, daha önce açıklandığı gibi dal uzunluğunda yerel ölçek tabanlı bir seçim stratejisi kullanmaktır¹⁷.
   4. Topolojik tutarlılığı sağlamak ve tek voxel kalınlığında bir merkez çizgisini korumak için hava yolu merkez hattındaki basit¹⁹ noktalarını (yani birden fazla merkez hattı vokselin bitişiği) ortadan kaldırın.
5. Gelincik akciğerlerinin mikro görüntülerinde 0_{cmH 2}O seviyesinde akciğer parenximasının segmentasyonu yapılacak.
   1. ITK-SNAP²⁰ içinde gömülü hesaplamalı algoritmalar ve grafiksel arayüzler kullanarak her beşinci koronal görüntü dilimide akciğer parenximasını manuel olarak ayırın.
      NOT: 25 cmH₂O enflasyon durumunda akciğer parenkiması ile çevresindeki arka plan arasındaki mikro-BT yoğunluk kontrastı yetersiz oldu ve bu da akciğer hacminin güvenilir şekilde segmentasyonunu engelledi.
   2. Ara görüntü dilimlerinde akciğer parenximasının segmentasyonunu oluşturmak için görüntü interpolasyonu uygulanır.
   3. Hem eksenel hem de sagittal yönlerde parenkimal segmentasyonun yapısal sürekliliğini sağlamak için ikincil bir kalite kontrol incelemesi gerçekleştirin.
   4. Akciğer parenximinden hava yolu lümenini ve duvar bölgelerini yerel ölçekli lümen hacmi genişletmesiyle çıkarın ve ardından genişlemiş hacmi akciğer parenkiminden çıkarın.
6. Hava yollarının mekanik ölçümlerini nicelikle^{ölçmek 21}.
   1. Bireysel hava yollarının solunum bağlantılı radyal genişlemesini, spiratorik (25 cmH₂O şişirme) ve ekspiratorik (0 cmH₂O şişme) akciğer hacimleri arasında mekansal olarak eşleştirilmiş hava yolu lümen kesit alanındaki değişiklikleri ölçerek niceliklerini nicelikle ölçmek. Δ_air-R(b) ile belirtilen bir hava yolu dalındaki radyal genleşmeyi şu şekilde hesaplayın:
      (1)
      burada CSA_ins(b) ve CSA_exp(b) hava yolu lümeninin CSA'sını spirator ve ekspirator akciğer hacimlerinde gösterir. b noktasındaki CSA, b ²² dalının merkezi yarısı üzerinde radyal çizgi izleme ve yerel olarak uyarlanabilir yarı-max yöntemleriyle hesaplanır.
   2. Bireysel hava yollarının nefesle ilgili boylamasına gerilmesini aşağıdaki şekilde nicelikle ölçemek:
      (2)
      burada L_ins(b) ve L_exp(b), hava yolu dalının b jeodezik yol uzunluklarını sırasıyla spirator ve ekspirator akciğer hacimlerinde gösterir. Bir dalın jeodezik yol uzunluğu, karinadan dal^21'in distal uç noktasına kadar olan merkez çizgi yolunun izlenmesiyle hesaplanır.
7. Akciğer parenkimasının yoğunluk temelli ölçümlerini nicelikle ölçmek.
   1. Sağlıklı ve fibrotik gelinciklerde akciğer parenximasının mikro-BT yoğunluk dağılımını, hava yolu ağacı bağlamında akciğer parenkim hacminin "3D bakışlı hacim gösterimi" oluşturarak mekansal olarak görselleştirin. Mikro-CT yoğunluğu tanımlı şeffaflık eşlemesi ve renk kodlaması kullanarak göz atma etkisini gerçekleştirin. Aynı şeffaflık haritalama ve renk kodlama ölçeklerini hem sağlıklı hem de fibrotik gelincik akciğerlerine uygulayın. Aşağıdaki adımlar 3D hacim görüntüsünü oluşturmak için uygulanır.
      1. 3D Dilimleyici^23'ü kullanarak 0 cmH₂O şişlikte hava yolu segmentasyonunun üç boyutlu (3D) NIfTI görüntüsünü "Segmentasyon" olarak açın.
      2. Segmentations modülünü kullanarak 3D hava yolu temsili oluşturun. Giriş olarak hava yolu hacmini seçin ve Temsiller sekmesinde Kapalı yüzey seçeneğinden Oluştur'a tıklayın.
      3. Mikro-BT yoğunluk görüntüsünü ayrı akciğer parenkimiyle 3D Dilimleyiciye Hacim olarak aktarın. Bu görüntüde, akciğer vokselleri için orijinal mikro-BT yoğunluk değerleri korunurken, tüm akciğer dışı voksellere -2000 HU değeri verilmiştir.
      4. Volume Rendering modülünü kullanarak akciğer parenkimal yoğunlukları için renk ve şeffaflık eşlemesini yapılandırın. -1500 HU, -600 HU, 0 HU ve 1500 HU yoğunluk değerlerini siyah, yeşil, sarı ve kırmızıya haritalayın; opatiteler sırasıyla 0, 0.15, 0.3 ve 1'dir.
   2. Bu çalışmada geliştirilen algoritmayı kullanarak mikro-BT görüntülemeden gözlemlenen yoğunluk dağılımını analiz ederek akciğer parenkimasındaki hastalıklı dokunun oranını tahmin edin. Yöntem, sağlıklı parenkimal bölgelerin yoğunluk değerlerinin Gauss dağılımına uyduğunu varsayar. Buna karşılık, karakteristik olarak daha yüksek yoğunluklara sahip fibrotik bölgeler, gözlemlenen histogramın sağ tarafının Gaussianlığını çarpıtır. Bu görevi aşağıdaki adımlarda gerçekleştirin.
      1. Izole akciğer parenkimal görüntüsü için 3.7.1.3 adımında -1500 HU ile 500 HU yoğunluk aralığında 50 binle histogram hesaplayın.
      2. Hedef Gauss dağılımının ortalamasını histogramın modu olarak hesaplayın ve histogramdaki modun solundaki yoğunluk değerleriyle standart sapma parametresini türetin.
      3. Gözlemlenen histogramın sağ tarafındaki ve 3.7.2.2. adımda elde edilen ortalama ve standart sapma parametreleriyle tanımlanan beklenen Gauss dağılım eğrisinin üzerinde bulunan fazla alan olarak fibrotik doku hacmini nicelikle ölçün.
      4. Hastalıklı doku fraksiyonunu, fibrotik doku hacminin parenkimal bölge hacmini temsil eden toplam histogram sayısına oranı olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Beş gelincikten, sağlıklı bir gelincik ve bir fibrotik gelincikten çıkarılan akciğerler, sırasıyla 0 cmH₂O ve 25 cmH₂O kontrollü hava yolu basınçlarında mikro-BT tarayıcı ile görüntülenerek ekspirator ve spiratorik akciğer şişliklerini simüle etti.

Şekil 1, 0 cmH₂O basıncında ex vivo gelincik akciğerinin mikro-CT görüntüsü (Şekil 1A) görüntü işleme boru hattının ara sonuçlarını göstermektedir. Şekil 1B, 0 cmH₂O şişirilmiş kesilmiş bir gelincik akciğerinin mikro-CT görüntüsünde iterasyonlar ve buna karşılık gelen eşik parametreleri arasında hava yolu ağacı hacmi segmentasyonunun ara sonuçlarını sunmaktadır. Şekil 1B, FG algoritmasının sonraki yinelemelerde parametre gevşetme yoluyla küçük hava yollarını yakalamadaki etkinliğini göstermektedir. Şekil 1C, sahte dalların budanmasından önce ve sonra hava yolu merkez hattı ağaç algısının sonuçlarını göstermektedir.

Beşinci nesilin ötesinde, fibrotik akciğerlerdeki tespit edilen hava yollarının sayısının, sağlıklı akciğerde eşleşen nesle tespit edilenlere göre belirgin şekilde daha az olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 2A). Özellikle, beşinci nesil sonrası sağlıklı akciğerlerde 161 hava yolu dalı tespit edildiken, eşleşen nesillerde fibrotik akciğerlerde sadece 91 hava yolu tespit edildi. Genel olarak, fibrotik akciğerlerde hava yolu duvarları sağlıklı akciğerlere göre daha kalındı (Şekil 2B). Hesaplamalı analiz, görsel olarak görülen fibrozis olan bölgelerde sağlıklı akciğerdeki eşleşen bölgelere kıyasla lümen çapı normalize edilmiş hava yolu duvarı kalınlığında anlamlı bir artış olduğunu ortaya koydu.

Fibrotik akciğerler, bal peteği, interlobular septaların kalınlaşması ve zemin camı opaklığı bölgeleriyle uyumlu küçük, kalın duvarlı kistik hava boşlukları göstermiştir. Zemin camı opaklıkları, kalınlaşmış akciğer dokusu ve kısmen doldurulmuş hava boşluklarının BT görüntülerinde bölgenin bulanık ve gri görünmesine neden olduğu akciğer bölgelerini ifade eder. Fibrotik akciğerlerin, fibrotik bölgelere karşılık gelen parenkimde daha yüksek BT yoğunluk değerlerine sahip olduğu gözlemlenmiştir. Şekil 3A, segmentli akciğer parenkim hacminin ve segmentli hava yolu ağacının "bakışlı 3D hacim versiyonu"nu sunmaktadır. Fibrotik ferret akciğerlerinde (-502 ± 238 HU) parenkima üzerindeki mikro-BT yoğunluk değerleri, sağlıklı ferret akciğerindekilere göre (-588 ± 167 HU) anlamlı derecede yüksekti (p < 0.001). Bölgesel yoğunluk yükselme analizi (Şekil 3B), fibrotik akciğerin %27,8 parenkimal hacmi ve yüksek BT yoğunluğuna sahip olduğunu göstermiştir (histogramdaki mor alanla belirtilmiştir). Buna karşılık, sağlıklı akciğerin parenkimal hacminin yalnızca %1,24'ü ve yüksek BT yoğunluğu vardır.

Normal ve hasta akciğerler arasındaki hava yolu mekaniğinin görsel karşılaştırması, sağlıklı ve fibrotik gelincik akciğerlerde hava yolu dalları arasında hava yolu solunum mekaniği biyobelirteçlerinin dağılımını göstermektedir (Şekil 4). Sağlıklı gelincik akciğerlerde %66,8 ± %9,8 oranında hava yolu radyal genişlemesi gözlemlendi; bu durum, fibrotik gelincik akciğerlerde gözlemlenenin (%32,4 ± %7,6) oranından anlamlı şekilde daha yüksekti (p < 0,001). Sağlıklı (%35,7 ±%5,3 ± %4,9) arasında da hava yolları boyununa esnemede anlamlı bir fark (p < 0,001) gözlemlendi.

Her akciğer için iki farklı hava yolu basıncında (0 cmH₂O ve 25 cmH₂O) temsil eden BT görüntüleri mikro-CT tarayıcı kullanılarak alındı. Şekil 5, normal (Şekil 5B,C) ile BLEO ile tedavi edilmiş gelincik akciğerler arasındaki farkları göstermektedir (Şekil 5E,F). Normal akciğerlerde, BT taramaları tipik akciğer yapısı ile düşük zayıflama ve fibroz belirtisi yok (Şekil 5B,C). Buna karşılık, BLEO ile tedavi edilen gelincik akciğerler, doku fibrozisine işaret eden akciğer zayıflaması gibi önemli patolojik değişiklikler gösterir (Şekil 5E,F). Ayrıca, belirgin bal peteği gözlemlenmiştir; bu boşluklar kalınlaşmış ve kalınlaşmış interlobular septa ile karakterize edilmiştir (Şekil 5E,F). BLEO ile tedavi edilen akciğerlerde de iltihaplanma veya erken fibrotik değişiklikleri temsil eden ground cam opasiteleri (GGO) görülür (Şekil 5E,F).

Histolojik analiz (Şekil 6), bleomisin ile tedavi edilen gelincik akciğerlerinde önemli doku yeniden modellenmesi ve fibrozis olduğunu doğrulamıştır. Hematoksilin ve eozin (HE) boyamaları, normal akciğerlerde korunmuş alveolar yapıyı ortaya koydu (Şekil 6A, C), fibrotik akciğerler ise geniş yapısal bozulma, artan hücresellik, hava yolu duvarı kalınlaşması ve belirgin fibrotik lezyonlar sergiledi (Şekil 6B,D). Masson'ın trikrom boyaması, normal akciğerlerin hava yollarında ve parankimasında minimal kolajen birikimi gösterdi (Şekil 6E,G), fibrotik akciğerler ise hem hava yollarında (Şekil 6F) hem de parankimal bölgelerde belirgin kolajen birikimi gösterdi (Şekil 6H). Kantitatif görüntü analizi (Şekil 6I,J), hem hava yolu hem de parenkimal bölmelerdeki normal kontrollere kıyasla fibrotik akciğerlerde kollajen pozitif alanda anlamlı bir artış olduğunu (P < 0.0001) doğruladı; bu da kapsamlı ekstraselüler matriks birikintisi ve ilerleyici doku yeniden modellenmesini gösterdi.

Şekil 1: BT görüntü işleme ve segmentasyon. (A) Mikro-BT görüntüsünde ilgi alanının (ROI) seçilmesi. Kırpma hattı, kesilen gelincik akciğerlerini şişirmek için kullanılan tüp ve diğer trakeal insertleri hariç tutmak üzere manuel olarak seçildi. (B) Dondurma ve büyütme (FG) algoritması kullanılarak 0 cmH₂O ile şişirilmiş bir ferret akciğerinin mikro-CT görüntüsünde hava yolu ağacı segmentasyonunun ara sonuçları. (C) 0 cmH₂O mikro-CT görüntüsünden alınan hava yolu segmentasyon hacmine uygulanan sahte iskelet dallarının budamasından önce ve sonra merkez hattı tespit sonuçları. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hava yolu ağaç oluşumunun hesaplamalı analizi. (A) Sağlıklı ve fibrotik akciğerlerde tespit edilen hava yolu sayısı. (B) Sağlıklı ve fibrotik akciğerlerdeki hava yolu duvarı kalınlığındaki farklar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Renk kodlu mikro-BT yoğunluğunun görselleştirilmesi. (A) 0 cmH2O şişlikte sağlıklı ve fibrotik gelincik akciğerler için parenkimde renk kodlu mikro-BT yoğunluk dağılımlarının 3D görsel görselleştirmesi. (B) Gauss modellemesine dayanarak sağlıklı ve fibrotik gelincik akciğerlerinin mikro-BT yoğunluk histogramları, histogram alanı mor ile işaretlenmiş ve yüksek BT yoğunluklarına sahip bölgeleri gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sağlıklı ve fibrotik gelincik akciğerler için hava yolu solunum mekanik biyobelirteçleri. Her biyobelirteç için (A hava yolu radyal genişlemesini gösterir, B ise hava yolu boylamasına gerilmesini gösterir), μ_x ± 3σ_x aralığını kapsayan normalize bir renk kodlama şeması uygulanmıştır; burada her metrikin ortalama (μ_x) ve standart sapması (σ_x) sağlıklı gelincik akciğerindeki tüm dallarda hesaplanmıştır. Nicel karşılaştırmalı sonuçlar için metne bakınız. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Mikro-BT görüntüleme, bleomisin kaynaklı fibrotik gelincik akciğerlerde kapsamlı yapısal yeniden modelleme ve havalandırılmış akciğer hacmi kaybını göstermektedir. (A–F) 25 cm H₂O şişlik basıncında alınan temsil edici mikro-BT görüntüleri, sağlıklı kontrol ferretleri (A–C) ile bleomisin ile tedavi edilmiş fibrotik gelincikler (D–F) karşılaştırmaktadır. Üç boyutlu (3D) hacimli rekonstrüksiyonlar (A,D) sağlıklı akciğerlerde akciğer mimarisinin korunduğunu ve homojen genişlemeyi gösterirken, fibrotik akciğerler (D) akciğer genleşmesinin azaldığını ve belirgin parenximal bozulma gösterir. Transvers (B,E) ve koronal (C,F) BT kesitleri gruplar arasındaki farkları daha da vurgular. Sağlıklı akciğerler, normal hava yolu dallanması ve minimal doku yoğunluğu (B,C) ile eşit havalı parenkim gösterir. Buna karşılık, fibrotik akciğerler geniş çaplı bilateral subplevral ve baziler baskın opacifikasyon, artan parenkimal yoğunluk, mimari bozulma ve bal peteği benzeri yeniden yapılanma (kırmızı oklar) ile uyumlu kistik hava sahası genişlemesi gösterir (E,F). Akciğer sınırlarını sarı kesik çizgiler belirler. Bu görüntüleme bulguları, ferretlere bleomisine maruz kaldıktan sonra ciddi fibrotik yeniden modellenme ve fonksiyonel havalı akciğer hacminde önemli bir azalma göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: BLEO kaynaklı ferret akciğer fibrozisinin doğrulanması. (A–H) Temsil parlak alan hematoksilin ve eozin (HE) ile boyanmış kesitler, normal akciğerler (A,C) ile fibrotik akciğerler (B,D) arasında farklılıklar göstermektedir. Düşük büyütme HE görüntüleri, normal akciğerlerde korunmuş alveolar mimariyi (A) ve fibrotik akciğerlerde (B) kapsamlı doku yeniden yapılanma ve fibrotik lezyonları göstermektedir. Daha yüksek büyütmeli HE görüntüleri, normal akciğerlerde normal alveolar yapıyı (C) ve fibrotik akciğerlerde (D) hücresellik, hava yolu kalınlaşması ve mimari bozulmayı daha da vurgular. Masson trikromu ile boyanmış ferret akciğer kesitlerinin temsil eden parlak alan görüntüleri, normal akciğer hava yollarında (E) ve parenkimde (G) minimal kolajen birikimi, fibrotik akciğer hava yollarında (F) ve parenkimde (H) artan kolajen birikirini (mavi) göstermektedir. (I,J) Kolajen pozitif alanın nicelendirilmesi, hem hava yolu bölgelerinde (I) hem de akciğer parenkiminde (J) normal akciğerlere kıyasla fibrotik akciğerlerde kolajen birikiminin anlamlı şekilde arttığını gösterdi. P < 0.0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, ferretlerde intratrakeal bleomisin uygulamasını, yüksek çözünürlüklü ex vivo mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) ile birleştiren bir protokolü açıklayarak pulmoner fibrozun yapısal ve mekanik özelliklerini karakterize etmektedir. Mikro-CT, 0,2 mm kadar küçük hava yollarını tespit edebilir ve hacimleri, hava yolu kalınlığını, yoğunluğunu ve morfolojisini ölçebilir. Artan doku yoğunluğu, hacim kaybı ve bölgesel heterojenlik, histopatolojiye yakından karşılık gelir. Ana hedef, bu büyük hayvan modelinin gelişmiş görüntüleme analizleriyle birlikte insan akciğer fibrozunu andıran radyolojik ve hava yolu ve histopatolojik özellikleri yakalayabildiğini göstermek ve fizibiliteyi ortaya koymaktı. Protokoldeki birkaç adım, tekrarlanabilirlik ve yorumlanabilirlik açısından kritiktir. İlk olarak, bronkoskopik olarak yönlendirilen intratrakeal bleomisin instillasyonu, küçük hayvan modellerinde bilinen bir sınırlama olan proksimal hava yolu havuzunu en aza indirirken diffuz akciğer maruziyetini sağlar^(4,7,11). Bu yaklaşım, bölgesel yaralanma dağılımındaki değişkenliği azaltabilir; bu da özellikle daha karmaşık hava yolu dallanmalarına sahip büyük akciğerlerde önemlidir. İkincisi, intilasyon sonrası 8 haftalık bir zaman noktası seçmek, akut iltihaba göre yerleşik fibrozisi tercih eder. Fare modellerinde, bleomisin kaynaklı fibroz genellikle zamanla kısmen çözülür ve translasyonel^{önemi sınırlar 4,8,11}. Buna karşılık, bu çalışmadaki ferret akciğerleri kalıcı radyolojik ve histolojik fibrotik özellikler göstermiştir.

Ex vivo görüntüleme sırasında kontrollü akciğer şişmesi başka bir kritik unsurdur. Standart hava yolu basınçlarında (0 cmH₂O ve 25 cmH₂O) görüntüleme, hava yolu radyal genleşmesinin ve boylamasına gerilmenin nicelendirilmesini sağladı, böylece değişken akciğer hacmi ve uyumun karıştırıcı etkilerini azalttı. Bu hava yolu mekanik biyobelirteçleri, otomatik, nesil eşleştirme algoritmaları kullanılarak türetilmiştir ve sadece geleneksel histolojiyle değerlendirilmesi zor olan nesnel hava yolu disfonksiyon ölçümleri^{sağlar 15,21}.

Birkaç protokol değişikliği dayanıklılığı daha da artırabilir. Bleomisin dozu, kronik epitel yaralanmasını daha iyi modellemek için tekrar edilen düşük dozlarda titrlenebilir veya uygulanabilir; bu durum günümüzde pulmoner fibroz patogenezi ^1,3 paradigmalarının merkezinde yer alır. Segmental yerleştirme stratejileri, fibrotik ve nispeten korunmuş bölgeler arasında hayvan içi karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanıyabilir. Görüntüleme açısından, ex vivo tarama sırasında doku deformasyonunu en aza indirmek için hava yolu basıncı, fiksasyon koşulları ve sıcaklığın dikkatli standartlaştırılması gereklidir. Şiddetli fibroz, hava yolu yok oluşu ve yüksek doku yoğunluğu nedeniyle otomatik hava yolu segmentasyonunu zorlaştırabilir; Bu nedenle, adaptif eşik belirleme ve manuel kalite kontrolü, otomatik boru hatlarının temel katkıları^{olmaya devam eder 15}.

Bu yöntemin birkaç sınırlaması vardır. En önemlisi, mikro-BT ile görüntülenen az sayıda hayvan istatistiksel çıkarımı sınırlar ve bulgular betimleyici olarak yorumlanmalıdır. Bu çalışma, bleomisin kaynaklı bir akciğer fibrozisi modelinin nicel mikro-BT kullanılarak karakterize edilmesinin fizibilitesini belirlemek için pilot çalışma olarak tasarlandı. Bu bulguları doğrulamak ve istatistiksel gücü artırmak için daha büyük gruplarla gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Ancak, tanım görüntüleme biyobelirteçleri ve ölçümlerinde belirgin bir fark göstermektedir.

Ayrıca, yaygın olarak kullanılsa da, bleomisin kaynaklı fibroz toksin kaynaklı bir yaralanma modeli olmaya devam eder ve idiopatik pulmoner fibrozun yaşlanma, genetik duyarlılık ve çevresel maruziyetler dahil olmak üzere çok faktörlü etiyolojisini tam olarak özetlemez ^3,6,11. Görüntüleme ex vivo yapıldı ve gaz değişimi, damar katkıları ve hastalık ilerlemesinin doğrudan değerlendirilmesini engelledi. Buna rağmen, ex vivo mikro-BT üstün mekansal çözünürlük sunar ve küçük hava yollarının ayrıntılı üç boyutlu analizini mümkün kılar; bu, gelinciklerde klinik çoklu detektörlü BT ile şu anda elde edilemiyor.

Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol mevcut modellere göre çeşitli avantajlar sunmaktadır. Gelincikler, kemirgenlere göre insanlara daha çok benzeyen solunum bronşiollerine ve hava yolu dallanma desenlerine sahiptir; bu da onları fibrozin hava yolu merkezli özelliklerini incelemek için^{özellikle uygundur 6,12}. İnsan için uygun bir hava yolu anatomisinin mikro-BT tabanlı nicel görüntüleme ile birleşmesi, parenkimal yoğunluğun, hava yolu duvarı kalınlığının, hava yolu kaybının ve bozulmuş hava yolu mekaniğinin eşzamanlı değerlendirilmesini sağlar. Bu özellikler, insan fibrotik akciğer hastalıklarında gözlemlenen radyolojik desenleri yansıtır; arı peteği, septal kalınlaşma ve bölgesel^{heterojenlik 1,2}.

Yüksek çözünürlüklü bilgisayarlı tomografi (HRCT), klinik uygulamada idiopatik pulmoner fibrozun (IPF) tanısı ve uzunlamasına izlemesi için temel bir görüntüleme yöntemidir. HRCT, mikro-bilgisayarlı tomografiye (mikro-BT) benzer prensiplere dayanır ve parenkimal akciğer anormalliklerini tespit ederken hastalara radyasyon maruziyetini en aza^{indirmek üzere optimize edilmiştir 24}. Önemli olarak, HRCT'deki gelişmeler tanı doğruluğunu artırmıştır ve karakteristik görüntüleme özellikleri bulunduğunda cerrahi akciğer biyopsisi genellikle IPF tanısı için gerekli değildir²⁵. IPF'nin tipik radyografik bulguları, mimari bozulma, traksiyon bronşektazi, bal peteği ve kistik hava boşlukları gibi tipik radyografik bulgular, HRCT ile hastalarda tanımlanabilir. Bu klinik gözlemlerle uyumlu olarak, ferret modelimiz mikro-CT ile tespit edilebilen hava yolu bozulmaları ve kistik hava sahası oluşumunu göstererek, insan hastalığına yakın bir görüntüleme fenotipi sağlamaktadır.

HRCT'ye ek olarak, endobronşiyal optik koherens tomografi (EB-OCT) IPF değerlendirmesi için değerli bir görüntüleme^{yaklaşımı olarak ortaya çıkmıştır 26}. EB-OCT, standart bir bronkoskop 26 aracılığıyla çevresel akciğerin in vivo yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülerini üretmek için ışık dalgalarını kullanan minimal invaziv bir^tekniktir. HRCT'ye benzer şekilde, EB-OCT cerrahi biyopsi gerektirmeden fibrotik yeniden şekillendirmeyi tespit etme konusunda umut vaat eden bir yaklaşım göstermiştir. Gelek modelimizin BT tabanlı görüntüleme ile tespit edilebilecek yapısal anormallikler geliştirebilme yeteneği, EB-OCT gibi yeni klinik görüntüleme yöntemleriyle gelecekte değerlendirilmesi için de uygun olabileceğini göstermektedir.

Önemli olarak, kemirgen modellerinde fibrozisi zayıflatan birçok tedavi insanlarda benzer bir etkinlik gösterememiştir¹¹. Burada açıklanan yaklaşım, hem yapıyı hem de işlevi yansıtan duyarlı, mekânsal olarak çözülen görüntüleme biyobelirteçleri sağlayarak bu translasyonel boşluğu kapatmaya yardımcı olabilir. Bu tür biyobelirteçler, küresel kolajen yükünün ötesinde terapötik yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir; hava yolu mekaniğindeki veya parenximal yeniden yapılandırmadaki bölgesel iyileşmeleri yakalayabilir.

Sonuç olarak, bu çalışma gelinciklerde pulmoner fibrozisin modellemesi ve mikro-BT kullanılarak hastalıkla ilgili yapısal ve mekanik değişikliklerin nicel olarak değerlendirilmesi için uygulanabilir bir protokol oluşturmaktadır. Ön hazırlık olmasına rağmen, yaklaşım büyük hayvan modellerinin gelişmiş görüntüleme analitiği ile birleştirilerek translasyonel önemi artırma, pulmoner fibrozis mekaniksel anlayışını geliştirme ve yeni terapötik stratejilerin preklinik değerlendirmesini destekleme potansiyelini vurgulamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Göz makyajı
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI