Yöntem makalesi

Hepatoma Hücrelerinde Mitoz Sırasında Lipid Damlası ve Organel Dinamiklerini Görselleştirmek İçin Flüoresans Tabanlı Bir Yöntem

DOI:

10.3791/71222

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, senkronize hepatoma hücreleri kullanılarak mitoz sırasında lipid damlacıklarının ve organel dinamiklerinin tekrarlanabilir görselleştirilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi lipid damlacıkları (LD) birçok hücre tipinde her yerde bulunur. LD'ler, triasilgliserol ve kolesteril ester gibi nötr lipidleri depolar ve enerji metabolizması, sinyal ve stres yanıtlarında önemli roller oynar. LD'ler hücre içi organeller olarak tanınsa da, hücre döngüsü ilerlemesi sırasında davranışları belirsizdir. Mitoz sırasında, mitokondri ve Golgi aygazı da dahil olmak üzere birkaç organel kapsamlı yeniden şekillendirme ve ardından yeniden birleştirme geçirir; bu da LD'lerin hücre döngüsüne bağlı değişiklikler geçirip geçirmediği sorusunu gündeme getirir. LD'ler enerji kaynağı ve sinyal merkezi olarak hizmet edebildiğinden, mitoz sırasında dinamiklerinin netleştirilmesi özellikle önemlidir. Bunu ele almak için, hepatom hücrelerinde hücre döngüsü senkronizasyonunu floresan LD boyama ile birleştiren bir protokol sunuyoruz. Hücreler, G2/M sınırında siklin-bağımlı kinaz 1 inhibitörü tabanlı bir yaklaşımla senkronize edilir, hücre döngüsüne salınır ve belirli zaman noktalarında toplanır. LD'ler nötr lipid boyası ile etiketlenir ve floresan mikroskopisiyle görselleştirilir. Bu yöntem, mitoz sırasında LD yeniden dağılımını incelemek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar ve organel biyolojisi, metabolik düzenleme ve kanser hücre fizyolojisi çalışmalarına geniş şekilde uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsü, kromozomDNA 1,2'nin doğru çoğaltılması ve ayrılmasını sağlayan son derece organize edilmiş bir olaydır ve bu süreçte hücre içi organeller dinamik olarak yenidendüzenlenir 3. Dört ana aşamadan oluşur: G1, S, G2 ve M 1,2. Mitoz sırasında, çoğaltılmış kromozomlar bipolar iğrenin ekvator düzleminde hizalanır ve ardından iki kızhücreye aktarılır 4. Mitokondri ve Golgi aygazı gibi organeller, mitoz 5,6,7,8 sırasında kapsamlı bir şekilde yeniden şekillendirilir. Bu organeller küçük veziküllere parçalandıktan sonra iki kız hücreye dağıtılır ve sonraki hücre döngüsü boyunca ilerleme sırasında yenidenbirleşirler 3.

Lipid damlacıkları (LD'ler), nötr lipid içeren organellerdir ve nötr lipid içeren organeller olup çevresinde fosfolipid monotabakası bulunur. Çeşitli protein setiyle ilişkilidirler ve çoğalan hücreler 9,10 dahil olmak üzere birçok hücre türünde yaygın olarak bulunurlar. LD'lerin protein ve lipid bileşimi, hücre ve dokutipi 11'e bağlı olarak değişir. Bu proteinler arasında perilipin (PLIN) ailesi kapsamlı şekilde incelenmiş olup, PLIN2,hepatositlerde LD'leri stabilize etmektedir 12,13. Yapısal stabilizasyonun yanı sıra, PLIN ailesi proteinleri LD dinamiklerinin düzenlenmesinde ve diğer hücresel bileşenlerle etkileşimlerde rol oynamıştır14. LD'ler sadece triasilgliserol ve kolesteril ester için depolama depoları olarak değil, aynı zamanda enerjimetabolizması 15, sinyal yolları16 ve stres adaptasyonu17 için de merkez olarak işlev görür. Metabolik işlevsizlikle ilişkili steatohepatit (MASH, önceden NASH olarak adlandırılan) gibi patolojik durumlarda, LD birikimi sağlıklı kontrol sistemine kıyasla belirgin şekilde artar ve hastalık biyolojisindeki önemini vurgular. Ancak, mitochondri, endoplazmik retikulum ve mitoz sırasında Golgi aygıtı üzerine kapsamlı araştırmalara rağmen, bölünen hücrelerde LD'lerin mekansal lokalizasyonuna dair sınırlı gözlem yapılabiliyordu. Burada sunulan yöntemle mitoz sırasında LD lokalizasyonunu analiz ettik. Daha önce LD'lerin diğer hücre içi organellerden farklı mekansal dağılım desenleri sergilediğinibildirmiştik 20.

Burada, hepatom hücrelerinde mitoz sırasında LD'ler ve diğer hücre içi organellerin dağılımını incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yöntem, hücre döngüsü senkronizasyonu ve floresan boyama içerir; böylece mitoz sırasında LD dinamiklerinin tekrarlanabilir görselleştirilmesini sağlar. Temsilci sonuçlar, LD'lerin interfaz ile mitoz arasında hücre döngüsüne bağlı mekânsal dağılımda değişiklikler gösterdiğini ve hücre bölünmesi sırasında LD lokalizasyonunun karşılaştırmalı analizini kolaylaştırdığını göstermektedir. Bu yaklaşım, organellerin lokalizasyonu, dinamikleri ve metabolik düzenlemesini hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda incelemek için geniş çapta uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bu protokol için gerekli stok çözümler

  1. %24 (w/v) yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (BSA) 150 mM NaCl'de çözünmüş şekilde hazırlayın.
  2. 10 mM RO-3306 (seçici siklin-bağımlı kinaz 1 (CDK1) inhibitörü) stok çözeltisi steril koşullarda DMSO'da çözünür.
    NOT: NaOH, NaCl ve fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) gibi yaygın kullanılan diğer çözeltiler standart laboratuvar uygulamalarına göre hazırlanmıştır. PBS, 2,6 g NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g NaCl ve 2,0 g KCl damıtılmış suda çözülerek ve son hacim 1 L'ye ayarlanarak hazırlandı.

2. BSA ile konjuge edilmiş oleik asidin hazırlanması

  1. 90 mg oleik asit 50 mL'lik bir beakere koyun ve 2 mL etanol (%99,5) ekleyerek çözer.
  2. Çözeltiye 100 μL 5 N NaOH ekleyin ve tamamen karışana kadar karıştırın.
  3. Etanolü azot gazı akışı altında buharlaştırın.
  4. 10 mL 150 mM NaCl ekleyin ve karışımı 60 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  5. 12,5 mL buzda soğutulan, %24 (w/v) BSA stok çözeltisini oleik asit çözeltisine (2,4) yavaşça, damla olarak ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca sürekli nazikçe karıştırın, böylece oda sıcaklığında yavaş ve homojen karıştırma sağlanır.
  6. pH değerini 7.4'e ayarlayın ve son hacmi 150 mM NaCl ile 25 mL'ye çıkarın. Oleik asitin nihai konsantrasyonu 12,8 mM olacaktır.
  7. Çözeltiyi steril koşullarda 0.22 μm filtreyle filtreleyin ve aliquotları 4 °C'de 2 haftaya kadar veya daha uzun süre saklamak için -20 °C'de saklayın.

3. Hücrelerin G2/M sınır senkronizasyonu

  1. Gerekli kontrolleri hazırla.
    1. RO-3306 tedavisi olmadan tedavi edilmemiş asenkron hücreleri başlangıç kontrol olarak hazırlayın.
    2. Oleik asitle işlenmiş koşullar için, senkronizasyon olmadan sadece oleik asitle işlenmiş hücreleri başlangıç kontrol olarak hazırlayın.
    3. Floresans boyama için, sinyal özgüllüğünü doğrulamak ve kanallar arasındaki spektral örtüşmeyi dışlamak amacıyla her florofor için tek boyama kontrolleri yapılabilir (Ek Şekil 1).
    4. Spektral örtüşme ve kanal çapraz konuşmasını en aza indirmek için ardışık alım ayarları veya uygun filtre konfigürasyonları kullanarak görüntü alın.
      NOT: Bu kontroller, hücre döngüsüne bağlı değişiklikleri başlangıç organel dağılımından ayırt etmek ve floresans özgüllüğünü doğrulamak için gereklidir.
  2. HuH7 hücrelerini, Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamında %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile 37 °C'de %5 CO₂ kuluçka içinde tutun.
  3. Cam kapakları 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Tohum 2, yukarıda tanımlanan ortamda 35 mm tabak başına 10-5 hücre × hücreleri gece boyunca 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde inkubasyon yapar.
  4. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve ardından 9 μM RO-3306 ve 0,5 mM oleik asit içeren taze ortamla kuluçka yapın.
  5. Hücreleri standart kültür koşullarında 20 saat kuluçka yapın.

4. RO-3306 reaktifinin senkronize hücrelerden çıkarılması ve mitotik faza girilmesi

  1. Hücreleri (adım 3.4) PBS ile üç ila beş kez yıkayın.
  2. Hücreleri bir kez taze kültür ortamıyla yıkayın.
  3. Hücreleri, %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçka içinde, mitoza giriş için inkubasyon yapın.
    NOT: RO-3306'nın çıkarılması, senkronize hücrelerin G2/M sınırından mitotik faza girmesine olanak tanır. Reaktif yıkandıktan sonra, hücrelerin önemli bir kısmı yaklaşık 1 saat içinde mitotik faza girer ve bu süre zarfında mitotik hücreler hücre yuvarlanması ve kromozom yoğunlaşmasıyla tanımlanabilir. Belirli bir mitoz evresinin gözlemlenmesi için en uygun zamanlama, hücre tipine ve kültür koşullarına bağlı olarak değişebilir.

5. Mitotik hücrelerin örnek hazırlaması

  1. Hücreleri %4 paraformaldehit ile PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
    DIKKAT: Mitotik hücreler genellikle tabaktan ayrılır; Fiksasyondan önce yıkamadan kaçının.
    NOT: PLIN3 boyama için hücreler %2 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit kombinasyonuyla sabitlenmiştir.
  2. Oda sıcaklığında PBS'de %0,1 (w/v) Triton X-100 ile sabit hücreleri 10 dakika boyunca permeabilize edin.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de %1 (w/v) BSA içeren blok hücreler.

6. LD'ler ve diğer hücresel organellerin boyanması

  1. Cam kapak kapaklarını ince forsepsle kültür kabından dikkatlice çıkarın ve kurumasını önlemek için hücre tarafı yukarı nemli bir odaya yerleştirin.
    NOT: Tüm sonraki boyama adımlarını nemli ve ışık korumalı bir ortamda gerçekleştirin; floresan sinyallerini korumak için.
  2. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla kuluçka yapın.
  3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla kuluçka yapın.
  4. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında nötr lipid floresan boya ile 10 dakika boyayın.
    NOT: Esnek çok renkli görüntülemeyi mümkün kılmak ve diğer organel belirteçleriyle spektral örtüşmeyi en aza indirmek için belirgin spektral özelliklere sahip boyalar seçildi.
  5. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve çekirdekleri DNA'ya bağlanan floresan boya (DAPI: uyarılma, 350–410 nm; emisyon, 420–450 nm) ile boyan, 1:1.000 oranında PBS ile 5 dakika boyunca boyan.
  6. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından görüntüleme sırasında floresansı korumak için antifade montaj ortamı kullanarak örtü kapaklarını cam slaytlara monte edin.
  7. Görüntüleme sırasında kurumayı ve hareket etmesini önlemek için örtü kirplerinin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.
    NOT: Flüoresan sinyaller yavaş yavaş solduğu için, boyamadan sonraki 1 hafta içinde görüntüler alın.

7. Hücre içi organellerin ve bunların hücre altı lokalizasyonunun gözlemi

  1. Geniş alan floresans mikroskobu ile floresan görüntüleri alın; böylece birden fazla hücreyi hızlıca taramak ve temsil edici ara faz ile mitotik hücreleri seçmek; düşük uyarılma yoğunluğu ve hızlı alım ayarları kullanarak fotobeyazmayı en aza indirin.
  2. Seçilen hücrelerin uygun büyütmede görüntülerini elde ederek floresans boyama analizi yapın.
    NOT: Ara faz hücreler genellikle sitoplazmada merkezi konumlanmış sağlam tek çekirdek gösterir. Buna karşılık, mitotik hücreler bipolar iğrenin ekvator düzleminde hizalanmış yoğunlaşmış kromozomlar gösterir. Bu morfolojik özellikler, interphase ve mitotik hücreleri ayırt etmek için görsel kriterler olarak hizmet edebilir.
  3. Nötr lipid floresan boyalar ve DNA'ya bağlayan floresan boya için uygun filtre setleri kullanarak geniş alan floresan mikroskopisiyle LD'leri ve nükleer morfolojiyi görselleştirin.
    NOT: Kullanılan mikroskop sisteminin özelliklerine göre filtre setlerini seçin.
  4. Daha yüksek çözünürlüklü doğrulama için, yüksek sayısal açıklıklı objektif lens (örneğin, 60×, NA ≥1.2) ile donatılmış konfokal mikroskopi kullanarak floresans görüntüleri alın. Uygun uyarılma lazerleri ve emisyon filtresi ayarlarıyla nötr lipid floresan boyalar ve DNA bağlayan floresan boya için floresan sinyallerini tespit etmek. Yaygın olarak kullanılan görüntü alma ve analiz yazılımları kullanılarak görüntüleri işlemek.
    NOT: Mikroskop sistemine bağlı olarak, suya veya yağa batırılan objektif lensler kullanılabilir. Daldırma ortamının seçimi, üreticinin önerilerine ve deneysel amacına uygun olmalıdır. Geniş alan floresan mikroskopisi, interphase ve mitotik hücreler arasında LD dağılımının rutin gözlemi ve karşılaştırılması için uygundur; konfokal mikroskopi ise daha yüksek mekansal çözünürlük gerektiğinde önerilir.

8. LD'lerin sayısı ve boyutunun nicelendirilmesi

  1. Tüm koşullar için aynı görüntüleme ortamlarında hücrelerin floresan görüntülerini alın.
  2. Alınan görüntüleri görüntü analiz yazılımı ile açın.
  3. LD'leri tanımlamak için uygun eşikler belirleyin ve lipid damlacık sayısı ile alanını niceliklendirmek için parçacık analizi yapın.
    NOT: LD sayısı ve alanının doğru karşılaştırılması için görüntüleme parametreleri tüm koşullarda sabit tutulmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RO-3306 kullanılarak hepatoma hücrelerinin G2/M sınırında senkronizasyonu

Mitoz sırasında hücre içi organellerin dinamiklerini araştırmak için, G2/Msınırı 20,21'deki hücreleri senkronize etmek için seçici bir CDK1 inhibitörü olan RO-3306 kullanıldı. Hücreler CDK1 inhibitörüyle 20 saat ve ardından taze bir ortamda ek 1 saat işlendiğinde, hücrelerin %50'sinden fazlası G2/M sınırında senkronize edildi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitoz sırasında gözlemlenen LD'lerin yeniden dağılımı, konumlanmalarının rastgele olmadığını, ancak sitoskelet yeniden organizasyonu ve hücre döngüsü ilerlemesiyle uyumlu olduğunu gösterir. Özellikle, LD'lerin iğren bölgesinden dışlanması, hücre bölünmesi sırasında organellerin ayrılmasını koruyan mitotik iğne montajı veya aktif taşıma mekanizmalarının getirdiği mekansal kısıtlamaları yansıtabilir. Bu çalışmada, mitotik hücreleri immünoflüoresans boyamaya hazırlamak için basit ve tekrarl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle ilgili çıkar çatışmaları olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Showa Üniversitesi Genç Araştırmacılar için Bursu ve JSPS KAKENHI Hibe Numarası 24K10084 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25% Trypsin/EDTAWako201-16945Hücre disosiyasyonu
10 cm tabakCorning430167Hücre kültürü
35 mm doku kültürü tabağıIWAKI3000-035Hücre kültürü
6 cm doku kültürü tabağıIWAKI3010-060Hücre kültürü
Anti-PLIN2 (ADRP) antikoruProteintech15294-1-APLipid damlacık belirteci
Anti-PLIN3 (TIP47) antikoruProteintech10694-1-APLipid damlacık belirteci
Anti-α-tubulin antikoruSigma-AldrichT6199Mitoz eğik iplikçik belirteci
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Nötr lipid boyama
Şişe üstü filtre (0.22 μm)NESTWNB343001OA–BSA çözeltisinin steril filtrasyonu
Bovin serum albümini (BSA)Sigma-AldrichA8022Engelleme reaktifi
Berrak ojeTicari olarak temin edilebilirUygulanamazKapaklarda sızdırmazlık
Konfokal mikroskopOlympusFV1200Yüksek çözünürlüklü görüntüleme
DAPIDojindo340-07971Nükleer boyama
D-PBS (–)Wako049-29793Hücre kültürü
Dulbecco’s Modifiye Eagle’s Ortamı (DMEM)Wako041-30081Hücre kültürü ortamı
Etanol (99.5%)Wako057-00456Oleik asit için çözücü
Yağ asidi–serbest BSASigma-AldrichA7030Oleik asit için taşıyıcı protein
Fetal Bovin SerumGibco10270-106Ortam takviyesi
Floresan ikincil antikorlar (Alexa Fluor–konjuge)Ticari olarak temin edilebilirUygulanamazTür spesifik immünofloresan için ikincil antikorlar
FV10-ASW yazılımıOlympusUygulanamazGörüntü alımı ve işleme
Cam kapakçıklar (φ15 mm)Matsunami2-176-03Mikroskopi için hücre ekimi
Cam mikroskobu slaytlarıMatsunamiSFF-001Kaplamaları monte etmek için cam slaytlar
Glutaraldehit (%25 çözelti)Wako073-00536PLIN3 için alternatif fiksasyon
HuH7 hücreleriJCRB Hücre BankasıJCRB0403İnsan hepatoma hücre hattı
LipidTOX Kırmızı Nötr Lipid BoyasıInvitrogenH34476Alternatif lipid damlacık boyası
Nitrojen gazı (N2)Ticari olarak temin edilebilirUygulanamazEtanolün buharlaştırılması
Oleik asitSigma-AldrichO1383Oleik asit–BSA konjugatlarının hazırlanması için
Paraformaldehit, PBS içinde %4Nacalai Tesque09154-85Fiksasyon
Penisilin–StreptomisinGibco15140-122Antibiyotikler
Fosfat tamponlu salin (×10)UygulanamazUygulanamazHerhangi bir tedarikçi ile değiştirilebilir
RO-3306Sigma-AldrichSML0569G2/M senkronizasyonu için CDK1 inhibitörü
SlowFade Diamond Antifade Montaj MaddesiInvitrogenS36963Montaj maddesi
Sodyum klorür (NaCl)Wako191-01665150 mM NaCl hazırlanması
Sodyum hidroksit (NaOH)Wako080-01061Oleik asidin sabunlaştırılmasında kullanılır
Tali Hücresel Analiz SlaytlarıThermoT10794Hücre döngüsü analizi için kullanılır
Tali Görüntü Tabanlı SitometreThermoUygulanamazHücre döngüsü analizi için kullanılır
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Hücre geçirgenleşmesi
Geniş Alanlı Floresan MikroskobuKEYENCEBZ-9000Mitoz hücrelerin hızlı taraması

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).
  2. Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly. Front Oncol. 5, 283(2015).
  3. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis. Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).
  4. Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction. Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).
  5. Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
  7. Makiyama, T., et al. Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex. Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).
  8. Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly. Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).
  9. Xia, Y., et al. Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring. Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).
  10. Makishima, M., et al. Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets. PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).
  11. Krahmer, N., et al. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).
  12. Takahashi, K., et al. Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver. J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).
  13. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).
  14. Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. Lipid droplet contact sites in health and disease. Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).
  15. Krahmer, N., et al. Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis. Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).
  16. Ramosaj, M., et al. Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation. Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).
  17. Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks. Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).
  18. Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver. Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).
  19. Minami, Y., et al. Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion. Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).
  20. Makiyama, T., et al. Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells. Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).
  21. Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner. Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).
  22. Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice. J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).
  23. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).
  24. Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1. Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).
  25. O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. Mitotic regulation by nima-related kinases. Cell Div. 2, 25(2007).
  26. Xie, K., et al. MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lipid Damlac DinamikleriFloresan MikroskobuH cre D ng s SenkronizasyonuMitoz G rselle tirmeN tral Lipid BoyamaOrganel Yeniden ekillenmesiEnerji MetabolizmasH cre D ng s lerlemesi

İlgili makaleler