Mısır Meiositlerinde Üç Boyutlu İmmünolokalizasyon

Özet

Erkek mısır meyositlerindeki bu immünolokalizasyon protokolü, meyoz sırasında hücrelerin üç boyutlu bütünlüğünü korur. Bu yöntem, korunmuş paraformaldehit sabit materyalde üç bağımsız antikorun hücre içi lokalizasyonunun dinamik izlenmesine olanak tanır; ayrıca DNA boyayan DAPI'ye ek olarak.

Özet

Meiotik profaz I sırasında, kromozomların fiziksel konfigürasyonu gelişim evreleri arasında büyük ölçüde değişir; neyse ki bu aşamaya özgü konfigürasyonlar, sırasıyla leptoten (örneğin 'ince iplikler'), zigoten (örneğin 'bağlı iplikler'), pachiten (örneğin 'kalın iplikler'), diplotene (örneğin 'çift iplikler') ve diyakinez (örneğin 'itme hareketi') olarak bilinen klasik meyotik evrelerin doğru şekilde tanımlanmasına olanak tanır. Faz I sırasında meydana gelen rekombinasyon, eşleşme ve sinapsis gibi birkaç sitogenetik olgusunun görsel analizi, son derece güvenilir immünolokalizasyon teknikleri gerektirir. Tüm hücrealtı ve subnükleer bilgileri bastıran geleneksel yayma ve ezme tekniklerinin aksine, burada açıklanan 3D koruma prosedürü, temel meyotik proteinlerin doğal subhücresel konum bölgelerinde (sitoplazma, nükleer ve subnükleer: euchromatin, heterokromatin ve nükleolar) korunmasına olanak tanır. Bu nedenle, bu protokol, meyotik anterlerin etkin şekilde nasıl sabitleneceğini, anterlerden meyositlerin nasıl ayrılıp serbest bırakılacağını ve mısır erkek meyositlerindeki üç ana proteinin eşzamanlı immünolokalizasyonunu nasıl gerçekleştireceğini açıklar.

Giriş

Mayoz, model bitkiler ve ürünlerde özelliklerin aktarımını düzenleyen kilit bir süreçtir; Bu nedenle, protein lokalizasyonunun tutarlı ve güvenilir görselleştirilmesini sağlayan basit mikroskopi yöntemleri, bu özelliklerin nasıl daha verimli aktarılabileceğinin anlaşılmasını kolaylaştırır. Ne yazık ki, meiositler içindeki proteinlerin lokalizasyonunun görselleştirilmesi, kullanılan tekniğe^{bağlı olarak çok değişiklik göstermiştir 1,2}. Bu nedenle, protokolün amacı, meiositlerin gözlemi sırasında artefaktları ortadan kaldıran basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Örneğin, meyotik kromozomların gözleminin hücrelerin ya basit ezilmesi ya da daha da bozucu yayılma teknikleriyle (^3,4,5) kolayca ezilmesi yoluyla kolaylaştırılan hassas bir süreç olduğu uzun zamandır kabul edilmiştir. Arabidopsis thaliana'da, araştırmacılar genellikle Carnoy fiksatifini (etanol ve asetik asitin 3:1 karışımı) ile Lipsol, Tween-20 ve TritonX-100 gibi çeşitli deterjanlar ile birlikte cellülaz, pektinaz ve sitohelikazlar içeren enzim karışımlarını kullanarak hücreleri parçalayan ve küçük^{kromozomlarında etkili immünolokalizasyon sağlayan yayım yöntemleri kullanırlar 1,2}. Bu teknikler, 3D kromozom konformasyonunu 2D bir konformasyona dönüştürür ve yapay olarak dağılmış kromozomların tamamının tek bir görüntüde hızlı gözlemlenmesini sağlar. Bu sert tedavilere dayanan kromozomların bazı özellikleri belirgin olabilir; Ancak, genellikle hücrelerin ve kromozomların in^{vivo 6} davranışını temsil edemezler. Mısır 7,8,9,10,11 dahil olmak üzere çeşitli bitki türlerinde 2D yayma teknikleriyle iki antikorun hızlı ve çok geniş bir şekilde tespit edilmesi mümkündür.

Buna rağmen, eski 2B tekniklerin kolaylığına rağmen, bazı fenomenlerin bozucu yöntemlere karşı hassas olduğu ve hücre, çekirdek veya kromozomların yayılma veya ezilme sırasında zarar görmesiyle gözlemlenemedikleri artık kabul edilmektedir. Örneğin, leptoten evresinde veya centromere bağlanması sırasında (leptonema/zigonema) RAD50 proteininin sitoplazmadan çekirdeğe hareketi yalnızca sağlam 3D^{meiositlerde 12'de} tespit edilmiştir. Burada, okuyuculara, mısır erkek meyositlerindeki üç ana proteini immünolokalize etmek için %4 paraformaldehit ile sabitlenmiş anterleri kullanarak onların yapısal bütünlüğünü koruyan ayrıntılı 4 günlük bir 3D protokol sunulmaktadır. Benzer bir mısır 3D immünolokalizasyon^{metodolojisi 8} ile karşılaştırıldığında, araştırmacılar için pratik notlar ve sorun giderme ipuçları ekledik. Bu protokol, sinaptonemal kompleks tarafından meyotik rekombinasyonun kontrolü gibi çeşitli meyotik süreçleri incelemekle ilgilenen bitki biyologları ve bitki ısahçılarının çalışmalarına fayda sağlayacaktır.

Protokol

DIKKAT: Formaldehit ve akrilamid ile uygun kişisel koruyucu ekipman ve kimyasal bir başlık kullanarak kullanın; İkisi de toksiktir (akrilamid polimerizasyondan önce de nörotoksiktir). Çalışmada kullanılan tüm materyaller Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Meiositlerin sağlam yapısını korumak için mısır anterlerinin fiksasyonu

1. Mısır bitkilerini V13 aşamasında, gövde içinde hâlâ çiçek bitkileri büyüyen mısır bitkileri kullanın. Meiotik anter fiksasyonu haftasında, eldiven takın ve genişlemiş sapı yumuşak olup olmadığına nazikçe bastırarak yumuşak olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Bu fiksasyon ve immünolokalizasyon protokolü hem mısır hem de Arabidopsis thaliana meiotik çiçek tomurcukları (400 μm'den küçük) için kullanılabilir. Ancak mısır örneğinde, kullanılan çeşit ve yılın zamanına bağlı olarak (ilkbaharda daha hızlı büyüme olur), referans akraba akrabası çizgisi B73 için ekim yaklaşık 8 hafta sürerken, erken çiçek açan akraba evreli A344 hattı için sadece 6 hafta sürer.
2. Tamponların hazırlanması.
   NOT: Kimyasal fiksasyondan bir gün önce, aşağıdaki çalışma çözeltilerini hazırlayın, dikkatlice yapın ve tüm şişeleri düzgün şekilde etiketleyin.
   1. 100 ml 100 ml tampon A (BA) tuzu hazırlanır; 4,53 g PIPE (Piperazine-N, N′-bis (2-etansulfonik asit) nihai konsantrasyon 150 mM), 5,96 g KCl (nihai konsantrasyon 800 mM), 1,17 g NaCl (nihai konsantrasyon 200 mM), 0,74 g EDTA (nihai konsantrasyon 20 mM), 0,19 g EGTA (nihai konsantrasyon 5 mM) ve 90 mL_{H 2}O eklenerek hazırlanır. önce KOH ile pH 6.8–7'ye ayarlayın, ardından hacmi 100 mL'ye ayarlayın.
   2. Son olarak, 0,45 μm gözenekli tek kullanımlık hızlı akış steril filtre ünitesi ile filtre sterilize edin (4 °C'de tutun ama dondurmayın; birkaç ay saklayabilirsiniz).
   3. Hazırlanın:
      -50 mM BORU (pH KOH ile 7'ye ayarlandı).
      - 0,4 M konsantrasyonda spermin stokları (daha önce 50 mM BORULAR'da çözünmüş, pH KOH ile 7'ye ayarlanmış, -20 °C'de 50 μL alikotlar tutulmuştur).
      - 0,4 M konsantrasyonda spermidin stokları (50 mM PIPE'lerde çözünmüş, pH KOH ile 7'ye ayarlanmış, -20°C'de 125 μL donmuş aliquotları tutar).
      - Ditiothreitol (DTT) 1 M stokları (0,01 M sodyum asetatta çözünür, pH 5,2'ye kadar çözünür, -20 °C'de 100 μL donmuş aliquotları tutar).
      - 4 °C'de tutulan sorbitol 2 M.
3. Buz üzerinde 50 mL 2x Buffer A (BA) hazırlanır; 10 mL 10x Buffer A tuzu (4 °C'de tutulur), 50 μL spermin (0,4 M 50 mM BORULAR, pH KOH ile 7'ye ayarlanmış), 125 μL spermidin (50 mM BORULAR'da 0,4 M, pH KOH ile 7'ye ayarlanmış) kullanılır, 100 μL DTT (1 M 0,01 M sodyum asetat, pH 5,2) güçlü bir şekilde çözünür; Ve ısıtma.
   1. Sonra, 16 mL 2 M sorbitol ekleyin. Son hacmi steril suyla 50 mL'ye ayarlayın. Tek kullanımlık Hızlı Akış steril filtre ile filtre sterilizasyonu yapın ve 4 °C'de saklayın.
4. Plastik bir kutuya yerleştirilmiş 5–10 nemli kağıt havludan oluşan nemli bir oda hazırlayın. Kapağın iyi kapandığını kontrol edin. Fazla suyu tamamen ortadan kaldırın.
5. Sonra, bir tepsiye şu eşyaları yerleştirin: nemli bölme, jilet bıçagı, ince forseps (önceden %70 etanol ile sterilize edilmiş), küçük bir steril su şişesi ve maskeleme bantı. Tepsiyi ve içindekileri 1.1. adımda kontrol edilen mısır bitkilerine götürün.
6. Çiçek seviyesinde yumruklu sapı kesmek için jilet bıçağı kullanın. Ana püskül dalları ile çiçek çiçeklerinin yan dalları meiotik çiçeklerin hasadı için kullanılabilir.
   NOT: Bu püskül dallar, meyotik anterleri toplamak için ilgi çekici çiçekleri içerir. Her çiçekte altı anter bulunur ve genellikle analiz için üç üst ve daha büyük olan anter kullanılır. Anterlerin yaklaşık boyutu ve rengi, her meyotik evreyle korelasyonludur. Yaklaşık 1 mm uzunluğundaki neredeyse şeffaf anterler leptoten evresinde, 1,5 mm uzunluğundaki saydam anterler zigoten evresinde, 2 mm uzunluğundaki beyazmsı anterler pachiten evresinde, sarı>msı anterler ise diplotende meiositler, tetradlar ve gametogenezi tamamlayan polen tanecikleri içerebilir. Mısır genetik geçmişleri arasında başka bir uzun-evre korelasyonu değişkenlik gösterebilir ve çevresel faktörler (örneğin yüksek sıcaklık) meyotik ilerlemeyi hızlandırabilir ve bu ilişkiyi değiştirebilir. Araştırmacıların, her belirli mısır genotipi ve büyüme koşulları için anter boyut-aşama korelasyonlarını doğrulamaları önerilir (asetokarmin ezme yoluyla, bkz. 1.6).
7. İnce forseps kullanarak çiçeklerin yan dallarını kesip dikkatlice toplayın ve nemli odadaki kağıt havluya sarın.
   NOT: Biraz pratik yapıldıktan sonra, meiotik püskülün dallarını çıkarmak için sapta sadece 3–4 cm uzunluğunda kısa bir doğrusal kesi yeterlidir. Bu kesiyi standart maskeleme bandıyla üç-dört kez sararak kapatabilirsiniz; böylece kalan diseksiyesiz çiçek ile aynı bitkiyi daha sonra hasat edebilirsiniz. Doku büyümeye devam eder ve daha sonra tozlaşma için kullanılabilir.
8. Odayı oda sıcaklığında tutun. Sadece meiotik aşamada anterler taşıyan çiçek dalları içeren çiçek dallarını kullanın. Dalları nemli havluların yarısınla örttüğünüzden emin olun, ancak onları suya batırmayın.
9. Havlular kuruyursa tekrar nemlendirin. Anterlerin diseksiyonuna kadar kutuyu kapatın, tercihen anter toplama başlamasına 30 dakika öncesine kadar.
10. Kalibre edilmiş bir ölçekli dürbünlü stereomikroskop kullanarak, çiçeklerden taze anterleri 35 mm Petri kabında 2 mL 1x BA'ya toplayarak anter boyutu ve rengi vekil olarak meyotik aşamaların doğru tanımlanmasını sağlar.
    NOT: Örneklenen anterlerde meyosit evresini doğru belirlemek için, her çiçek başına üç senkronize anterden biri 3:1 etanol-asetik asit fiksasyonu, asetokarmin boyama ve geleneksel kabak^{mikroskopisi 13} kullanılarak hızla analiz edilir.
11. %4 formaldehit fiksanti 1x BA ve %0.0025 Tween-20 ile hazırlayın
    NOT: 3 mL için %150 μL formaldehit 16%, 750 μL_{H 2}O, 1.5 mL 2x BA ve 7.5 μL Tween-20 eklenin.
12. İlk BA tamponunu çıkarın ve bu taze fiksatif çözeltinin 3 mL'sini aşamalı anterlere ekleyin; bunları yeni 35 mm Petri kabında 45 dakika boyunca sabitleyin; formaldehit buharlaşmasını önlemek için parafilm ile mühürlenmiş, ardından daha büyük bir Petri kabına yerleştirilmiş ve döner bir çalkalayıcıya (40–60 rpm'ye ayarlanmış, veya 0.2 x g). Oda sıcaklığında yapın. Anterler iyi bir sabitlik için hafifçe dönmeli. Genellikle yüzeyde yüzerler.
13. 3 ml 1x BA ile durulayın, ardından örneği küçük bir Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca döner bir silkeleyiciye (40–60 rpm) koyun.
14. Temiz forseps kullanarak, anterleri taze 3 mL 1X BA içeren küçük 35 mm Petri kabına aktarın. Petri kabını parafilm ile sıkıca mühürleyin. Sonra küçük Petri kabını bir Petri kabının içinde saklayıp üzerine alüminyum folyo ile kaplayın ki karanlıkta kalsın ve 4 °C'ye koyun, ta ki kullanılana kadar. Gerekirse birkaç ay boyunca saklayabilirsiniz.

2. Mısır meiositlerinin poliakrilamid sandviç pedlerine gömülmesi

1. GÜN: 3D slayt hazırlığı

1. 2 mL akrilamid çözeltisi akrilamid ve 2x BA karıştırarak eşit hacimde (1:1) hazırlayın. Sodyum sülfit (NaS) ve amonyum persülfat (APS) eklenmeden önce, akrilamid çözeltisi vakumda 5–10 dakika boyunca gazdan çıkarılır.
2. Aliquot akrilamid ve 2x BA 1:1 oranı 100 μL pipetini 1.5 mL tüplere pipetleyerek karıştırır.
   Hazırlayacağınız tüp sayısı, hazırlayacağınız slayt sayısına bağlıdır.
3. 1 ml 1x BA yapın.
4. 2 cm x 2 cm boyutunda parafilm parçalarını bir Petri kabının üzerine yerleştirin, ardından bunları bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. 50 μL BA çözeltisi anterlerle parafilme pipet yapın. Pipet ucunu makasla kesin, böylece daha kolay teslimat yapın.
   1. 25 μL BA çözeltisini başka bir parafilme pipet koyun.
5. Anterleri tutmak için forseps kullanarak, anterlerin ucunu bir bistürpelle kesin ve meiositleri nazikçe sıkın. Pipetle meiositleri nazikçe 25 μL BA damlasına aktarın ve nazikçe karıştırın.
6. Meiocyte karışımından 10 μL pipetini ayrı bir kapak kılıfına koyun.
7. Hızlıca, %20 (0.2g/ 1mL) NaS 5 μL (0.2g/1mL) APS ve %20 (0.2g/1mL) APS akrilamid/2x Buffer A ile 1.5 mL bir tüpe pipetleyin.
8. Yukarıdaki karışımdan 5 μL'yi hızlıca bir kapak üzerine pipetleyin ve meiositlerle karıştırın. Üstüne poli-L-lizin kapalı bir örtü koyun, ancak 45 derece döndürün. Yalnızca bir poli-L-lizin örtü kayağı (ticari olarak elde edilen veya örtü kapaklarının birkaç dakika boyunca bir Petri kabında poli-L-lizin çözeltisine batırılıp yeni, temiz bir Petri kabının kenarında kurumasına bırakılarak elde edilen) kullanılması, polimerizasyondan sonra tam bir pedin ortaya çıkmasına yardımcı olur. Kaplama kapağı hızla çözeltiden çıkarılır ve kullanımdan önce kurutulur. Süper çözünürlüklü mikroskopi için, standartlaştırılmış kalınlıkta (≤170 nm) yüksek performanslı kapak kapakları^{kullanılmalıdır 14}.
9. Numunenin oda sıcaklığında tam polimerizasyonu sağlanması için lütfen örtü kapaklarına 30–50 dakika dokunmayın (Daha hızlı polimerizasyon süreci padın kuruma süresini azaltır ve ortaya çıkan kalite optimalin altında kalır).
10. Hazırlamak istediğiniz her slayt için '2.6–2.9' adımlarını tekrarlayın.
11. Tüm örtükleri ustayla dikkatlice ayırın. Tüm örtü kapaklarını, ped yüzü yukarıda, poliakrilamid bir pedin (veya pedin çoğunun) üzerine 6 yuvalı bir plakaya yerleştirin.
12. Her örtü örtünü 1 mL 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) bir pedle 10 dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın, oda sıcaklığında toplam 20 dakika yıkama süresi olur.
13. 49.4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0.5 m ve 500 μL Triton karıştırarak 50 mL hazırlayın.
14. Her örtü kapağını 1 mL bu 1x PBS ile 1 mM EDTA ve %1 Triton ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir ped ile durulayın.
15. 1x PBS, 1 mM EDTA, %0,1 Tween-20 ve %3 BSA (slayt başına 1 mL) içeren yeni bir bloklama tamponu partisi hazırlayın. 50 mL bloklama tamponu için, 44 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0.5 M, 5 mL %1 Tween-20 çözeltisi ve 1.5 g BSA karıştırın. BSA, çoklu birincil ve ikincil antikor kullanıldığında spesifik olmayan sinyalleri en aza indirmeye yardımcı olduğu için eşek serumuna göre bloklayıcı ajan olarak tercih edilir.

3. İmmünolokalizasyonlar

1. Birincil antikor (veya antikorları) istenen seyreltme noktasında bloklayıcı tampon kullanarak hazırlayın. Birincil antikorları, birlikte kullanıldığında belirgin sinyaller üretme yeteneklerine göre birleştirin. Bunlar tavşan, sıçan, kobay veya tavuk gibi farklı organizmalardan gelmelidir; bu organizmalar belirli floresan işaretli ikincil antikorlarla tanınabilir. Eşek veya keçi antikorlarının kullanımı kaçınılır çünkü bunlar ikincil antikor olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Tek bir ikincil antikor türü (örneğin, Şekil 1'de gösterilen deneyde keçi) kullanılmasını öneriyoruz.
2. Bu seyreltilmiş birincil antikordan 50 μL her coverslip'in ortasına bir ped ile ekleyin.
   Kuyular arasına su ekleyin, buharlaşmayı yavaşlatın. Plakayı nemli bir kambaya (kapağı olan plastik bir kutu) koyun. Gece boyunca ayrıl.

2. GÜN: Yıkama

3. 500 mL Yıkama Tamponu (1x PBS + %0,1 Tween-20 + 1 mM EDTA) hazırlayın.
4. Gece boyunca kuyulardan pipetinizle aspirasyon yoluyla alın.
5. Her örtü örtünü iki kez bir ped ile 1 mL yıkama tamponu ile hızlıca yıkayın, sonra kuyulardan çıkarın.
6. Pad ile bir 1 mL/coverslip daha pipet yapın ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
   7 kez daha tekrarlayın. (Toplam 8 saat)
7. Son yıkamadan sonra, kuyular arasına su ekleyin, tabağı kapatın ve gece boyunca nemli bir odada bırakın.

3. GÜN: İkincil antikor, yıkamalar ve montaj kaydırmaları

8. İkincil antikorları bloklama tamponu içinde 1:50 oranında seyreltilerek hazırlayın.
   Yıkama çözeltisini aspire edin. Sulandırılmış ikincil antikordan 50 μL her padın merkezine pipet ile verin.
   NOT: Her ikincil antikor, örtüşmeyen emisyon dalga boylarına sahip farklı floresan boyalarla birlikte kullanılmalıdır. Örneğin, bir ikincil antikor AlexaFluor488 (yeşil), diğeri AlexaFluor555 (turuncu) ve üçüncüsü AlexaFluor647 (uzak kırmızı) ile etiketlenmelidir; bu da DAPI ile (uyarılma 461 nM, mavi) ile birleştirilebilir. DyLight (Dyomics GmbH tarafından) gibi diğer floresan boyalar da kullanılabilir. Ayrıca, tüm bu ikincil antikorlar, birincil antikor karışımında kullanılan diğer türlerle çapraz reaksiyona girmemelidir. Örneğin, anti-tavşan ikincil antikoru tavşan antikorları için seçici olacak şekilde çapraz uyarlanmalıdır ve ne fare ne de kobaya antikorlarını tanımamalıdır. Tüm ikincil antikorlar için de aynı durum geçerlidir. İyi tasarlanmış bir deney, ko-immünolokalizasyon yapılırken tüm bu gereksinimleri aynı anda doğrulamak için kullanılmalıdır.
9. Kuyular arasına su ekleyin, nemli odaya bir tabak yerleştirin ve oda sıcaklığında 2 saat bekleyin.
10. Çözeltiyi kuyulardan aspire edin.
11. Her kuyu başına 1 mL kullanarak, oda sıcaklığında 1 saat (toplamda 4 saat) dört yıkama yapın.
12. Her kuyuyu 1 mL 1x PBS ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. (Toplam 30 dakika)
13. DAPI'yi 1x PBS ile seyrelt.
14. Son konsantrasyonda 1 μg/mL DAPI (SUDA ÇÖZÜNMÜŞ DAPI tozu) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boya yapın ve 500 μL/kuyu yerine yerleştirin.
15. ProLong™ Gold antitifi'ni 4 °C dondurucudan çıkarın, böylece eriyip oda sıcaklığına ulaşmasını sağlayın.
16. Sürgüleri 1x PBS ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1 mL/kuyu ile yıkayın. Tekrar iki kez yap. (Toplam 1 saat 30 dakika)
17. Son yıkamayı çıkarın.
18. Sonra her padin ortasına iki damla ProLong™ Gold antiifade ekleyin.
19. Her kaydıra kapak kaymalarını monte edin, her sürgü etiketleyin, ince forsepslerle kapak kaymalarını kuyruktan kaldırın ve yavaşça kaydırmaya yerleştirin. İnce forseps kullanarak, ikinci bir coverslip'i yavaşça birinciye indirin. Vakum kullanarak, örtü kapaklarının kenarlarından fazla gliserol alın. Kapak kapaklarının kenarlarını iki kat oje ile kapatın.
20. Eğer slaytlar hemen floresan mikroskop altında incelenmezse. Gözleme kadar ışıktan korunarak -20 °C sıcaklığında dondurucuda saklayın. Daha sonra, kaydırakları oda sıcaklığında yatay ve karanlıkta 1 saat bekletmek için kondensat oluşmasını önler.

4. GÜN: Mikroskobik gözlemler

21. Doğru uyarılma dalga boyları ve filtreler altında kaydırmayı gözlemler. Standart konfokal mikroskopi yeterlidir, ancak her 0,2 μm aralıkta bir z-yığını kullanarak tüm hücrenin üç boyutlu görüntülemesini mümkün kılmak için 60x hedefli bir mikroskop kullanılması, ardışık görüntü alımları ve dekonvolüsyon işlemleri ile Applied Precision SoftWoRx^® yazılımı kullanılarak tavsiye edilir.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, mısırdaki üç ana meiotik proteinin lokalizasyon desenlerini aynı anda gözlemleyebiliriz (Şekil 1). Meiotik protein YOKLUĞU İLK BÖLÜNME 1 (AFD1), meiotik kohezin kompleksinin alfa-Kleisin REC8 alt biriminin homologudur. ASYNAPTIK 1 (ASY1) kritik bir eksenel elemandır, ZYPPER1 (ZYP1) ise sinaptonemal kompleks^15'in enine elemanıdır. DAPI boyama, meiotik alt evrelerin tanınmasına olanak tanıyan net bir çekirdek ve...

Tartışma

Bu protokol, meiotik kromozom protein yüklenmesiyle ilgili temel üç boyutlu verileri koruyarak diğerlerine göre önemli bir avantaj sunar. Bu özellikler düzenli yayım^{teknikleriyle korunamaz 1,2}. Buna rağmen, bu protokolün iki sınırlaması vardır: bir gün içinde yapılan normal yayma tekniklerine kıyasla yavaş ve teknik olarak zorludur. Buna karşılık, protokolümüz dört gün çalışma gerektiriyor; bunun esas olarak kapsamlı yıkama aşama...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tüpler	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tüpler	Thermo Fisher Scientific	339652
6 kuyuluk Falcon polistiren mikroplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Asetik asit, %60	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Akrilamid %30  ve bis-akrilamid çözeltisi, 29:1	Biorad	1610157
Alüminyum katlama	Reynolds	U07211R0
Amonyum Persülfat (APS)	Merck	A3678
Binoküler stereomikroskop	NA	NA
Bovine Serum Albumini (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision mikroskobu	Olympus	NA
Damıtılmış H2O	NA	NA
PES filtreli 0,45 µm gözenekli tek kullanımlık filtre üniteleri	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
İnce forseps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
keçi (IgG H+L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş  anti-rat, AlexaFluor647 ile etiketli	Invitrogen	A-21247
keçi (IgG H+L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş anti-tavşan, AlexaFluor568 ile etiketli	Invitrogen	A-21428
keçi (IgG H+L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş anti-ginea domuzu, AlexaFluor488 ile etiketli	Invitrogen	A-11073
Eldivenler	Merck	Z412392
Büyütme odaları / sera / veya tarla	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Maskeleme bandı 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Mısır tohumları	NA
Mikroskop 22 x 22 mm-1,5 cam kapakçıklar	Fisher Scientific	12-542-B
Mikroskop 22 x 22 mm-H kapakçıklar	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Mikroskobik cam slaytlar	Fisher Scientific	22-230-900
Mikroskop slayt kutusu	Fisher Scientific,	03-448-9
Mikropipetler P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Tırnak cilası	Electron Microscopy Science	72180
Kağıt havlu	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehit %16 çözeltisi	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Kapakla plastik kutu	Tupperware	NA
Poly-L-Lizin	Merck	P4707
Birincil antikorlar (rat anti-ZmAFD1, tavşan anti-ZmASY1, guinea-domuzu anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri kabı (D x Y: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Normal boyutlu Petri kabı	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet uçları (0,5-10 uL) steril	Merck/Corning	AXYT300
Pipet uçları (200 uL) steril	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet uçları (1000 uL) steril	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Tek kenarlı tıraş bıçağı	Fisher Scientific	12-640
Sallanan platform şekerleyici	NA	NA
Spermin	Merck	85590
Spermidin	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra saf Akrilamid	Invitrogen	15512023
Vakuum