Yöntem makalesi

Laboratuvar Ortamlarında Carausius morosus (Phasmatodea, Insecta) Yetiştirilmesi İçin Standartlaştırılmış Bir Protokol

0 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71225

⸱

1 Ekim 2026

 ,  ,  , 
1Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 3Howard Hughes Medical Institute

Bu makalede

Özet

Bu makale, hayvan bakımı, yumurtaların işlenmesi, yeni çıkan yavruların bakımı, temsili performans metrikleri ile türün yaşam süresi ve biyolojik özelliklerine genel bir bakış dahil olmak üzere, bir Carausius morosus laboratuvar kolonisinin sürdürülmesine yönelik ayrıntılı protokolleri özetlemektedir.

Özet

Carausius morosusHindistan sopa böceği olan , Hindistan'a özgü, ince dal benzeri bir böcektir. Dünya çapında esaret yoluyla yaygın olarak tanıtılmış olmasına ve laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmasına veya evcil hayvan olarak beslenmesine rağmen, standardize edilmiş hayvan yetiştirme laboratuvar protokolleri eksiktir. Burada, şunlar için ayrıntılı laboratuvar kültürü koşullarını rapor ediyoruz C. morosusStokları şu koşullarda muhafaza ediyoruz: 23 °C, %70 bağıl nem ve 12:12 saatlik ışık-karanlık fotoperiyodu. Bu kültür, diyet ve kafes kurulum koşullarına yönelik standartlaştırılmış protokollerin uygulandığı bu koşullar altında iki yılı aşkın süredir başarıyla sürdürülmektedir. Ayrıca, şunlarla yürütülen güncel deneyleri desteklemek amacıyla yumurta ve yavru bakımı yöntemlerini de sunmaktayız: C. morosusKültür koşullarımız altında, aynı 24 saatlik süre içinde yumurtlanan ve izlenen 105 parti yumurta, tutarlı bir 12 günlük süre içinde açılmış ve yavruların %13,9'u başarıyla yetişkinliğe ulaşmıştır. Bu standartlaştırılmış yöntemler, tekrarlanabilirliği ve erişilebilirliği artırarak C. morosus'un gelişim, davranış ve fizyoloji analizleri dahil olmak üzere çok çeşitli çalışmalar için bir laboratuvar model sistemi olarak daha yaygın kullanımına olanak tanımaktadır.

Giriş

Memeli olmayan alternatif model sistemlere olan ilgi arttıkça, böcekler geniş bir biyolojik çeşitliliği keşfetme fırsatı sunmanın yanı sıra memeli modellere göre daha düşük maliyetli araştırma modelleri, daha basit bakım gereksinimleri ve daha az düzenleyici engel sağlamaktadır1. Gelişmekte olan böcek model sistemleri, örneğin Carausius morosus (Sinéty, 1901) gibi sopa böceklerindeki partenogenez dahil olmak üzere benzersiz biyolojik fenomenlerin araştırılmasını mümkün kılmaktadır2. Meyve sineği Drosophila melanogaster, 20. yüzyılın başlarından beri gelişimsel ve genetik süreçlere dair anlayışımızı şekillendirmiş olsa da3, C. morosus gibi diğer böcek model sistemleri yalnızca gelişimsel biyoloji için değil, aynı zamanda motor kontrol, lokomosyon ve nörohormonla düzenlenen sistemlerin araştırılması için de benzersiz bir fırsat sunmaktadır4.

Ayrıca, evrimsel gelişimsel biyoloji alanında, holometabola (dolaylı gelişim gösteren veya metamorfoz geçiren) böceklere kıyasla hemimetabola (doğrudan gelişim gösteren) böceklerin yeterince temsil edilmediği görülmektedir. D. melanogaster en iyi çalışılmış model böcek olarak hizmet eden. Doğrudan gelişen böcek türlerini çalışmak gibi C. morosus, cinsel olgunluğa erişmeden önce birkaç nimfa instar evresinden geçen5, evrimsel gelişimsel biyoloji araştırmalarındaki temel filogenetik boşlukları doldurmamıza olanak tanır. Bu durum, böcek evriminin erken dönemlerinde ayrılan ancak mevcut laboratuvar model sistemlerinde eşit düzeyde temsil edilmeyen hemimetabol ve holometabol böcekler arasında karşılaştırma yapılmasını sağlar. Daha geniş kapsamlı kullanımı... C. morosus bir laboratuvar organizması olarak kullanımı, tutarsız ve tekrarlanamayan bakım koşulları ile gelişim ve sağkalım için net kıstasların eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Burada, embriyogenez takibi, boylamsal gelişim ve reprodüktif çıktı deneyleri dahil olmak üzere çok sayıda uygulamayı destekleyen, laboratuvarlar genelinde uygulanabilecek tanımlanmış kültür koşulları ve beklenen sonuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

C. morosus esaret altında kolayca yetiştirilebilir, bu da onları hem laboratuvar araştırmaları hem de eğitim ortamları için oldukça uygun hale getirir. Partenogenetik olarak üreme yetenekleri6, karmaşık yetiştirme düzeneklerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak bakım gereksinimlerini azaltır ve popülasyon yönetimini kolaylaştırır. Başarılı bir yetiştirme süreci kontrollü çevresel koşullardan faydalanmaya dayalı olsa da, bakımı diğer birçok laboratuvar modeline kıyasla basit ve düşük maliyetlidir. C. morosus; sarmaşık (Hedera helix), böğürtlen (Rubus fruticosus) veya gül yaprakları (Rosa spp.) gibi yaygın bitki materyalleriyle kolayca beslenir. Bu sistemin diğer avantajları arasında ototomi, bacakları rejenerasyon yeteneği7, büyük vücut boyutu ve çeşitli konukçu bitkilerle beslenebilme kabiliyeti yer alır. Ancak, bu türün halka açık bir genom dizisinin bulunmaması, nispeten uzun gelişme süresi ve enjeksiyonları zorlaştırabilen sert bir embriyonik ekzokoryuma sahip olması gibi sınırlamaları da vardır8. Bu sınırlamalara rağmen C. morosus, hem araştırma hem de eğitim uygulamaları için pratik ve etkili bir model sunar.

C. morosus için standartlaştırılmış yetiştirme protokolleri, araştırma çalışmalarında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Literatürde C. morosus üzerine çok sayıda laboratuvar çalışması bildirilmiş olsa da6,9,10,11,12, bildiğimiz kadarıyla, C. morosus'un laboratuvar ortamında yetiştirilmesine yönelik derinlemesine protokoller bugüne kadar yayınlanmamıştır. Bu çalışmada; yumurtaların, yeni çıkan larvaların ve reprodüktif olarak olgun erişkinlerin yetiştirilmesini içeren, C. morosus laboratuvar kültürleri için kapsamlı ve standartlaştırılmış bir protokol seti başarıyla oluşturulmuştur. Bu yöntemlerle, bu böceğin daha geniş biyolojik araştırma topluluğu için daha erişilebilir olmasını hedefliyoruz.

Protokol

1. Çevresel yetiştirme koşulları

  1. Klima kontrollü bir oda veya inkübatörde laboratuvar kültürünü aşağıdaki çevresel ayarlarla sürdürülmelidir: 23 °C, %70 bağıl nem, 12:12 saat aydınlık-karanlık fotoperiyodu.
    NOT: Bu koşullar altında, C. morosus Yumurtaların, bırakıldıktan yaklaşık 74-80 gün sonra kapanması beklenir.

2. Örgü kafeslerin oluşturulması ve sürdürülmesi

NOT: Mesh böcek kafeslerinin üç tarafında kumaş fileli havalandırma bulunması, barındırma için önerilir C. morosus61 x 61 x 91,5 cm boyutlarındaki bir kafes, 50 adet yetişkini veya yeni bir koloni kurulurken 500 adet yavruyu barındırmak için uygundur.

  1. Uygun boyutta bir ağ kafes seçin. Hayvanları yerleştirmeden önce kabın temiz ve artıklardan arınmış olduğundan emin olun.
  2. Olgun yetişkinler kullanarak yeni bir koloni kurmak için 25–50 yetişkin dişiyi temiz, 61 cm x 61 cm x 91,5 cm'lik bir file kapalı alana yerleştirin.
    NOT: Örgü açıklıkları 0,2 aralığında olmalıdır–1.0 mm, küçük birinci evre yavruların kaçmasını önlemek için.
  3. Yeni bir koloni kurmak için yavruları kullanarak yaklaşık 500 kadar yavrayı temiz, 61 cm x 61 cm x 91,5 cm boyutundaki gözülü bir kafese aktarın.

3. Besleme ve bakım

  1. Kafes temizliği sırasında böceklerin kafeste kalmasına izin verin; temizlik yaparken onları yapraklardan nazikçe alın ve onları örgülü kafesin alt kısmına yerleştirin.
    NOT: Temizleme işleminin yaklaşık 10 dakika süreceğini bekleyin–Kümes başına 20 dakika.
  2. Haftada bir defa sarmaşık, böğürtlen veya gül gibi taze yapraklar sağlayın. Tüm bitki materyalinin tarım ilacı içermemesini sağlayın. Kafeslere eklenmeden önce yaprakları musluk suyuyla yıkayarak yüzey kalıntılarını ve kontaminantları uzaklaştırın.
  3. Sapları, musluk suyu ile doldurulmuş küçük kavanoz veya şişelere sığacak şekilde keserek yaprakların nemliliğini koruyun. Hazırlanan yaprakları kapatma içine yerleştirin ve yaprakların yükseltilmiş konumda olmasına ve böceklere erişilebilir olmasına dikkat edin. Yerleştirmeden sonra kapatmayı dikkatlice kapatın.
  4. Haftalık kafes temizlikleri sırasında, kafesin dibinden solmuş veya kurumuş yaprakları ve birikmiş tüm dışkıları uzaklaştırın.
    NOT: Yapraklarda kuruluk, gevreklik, solma veya renk değişimleri gibi kuruma belirtileri görüldüğünde bitki örtüsünü değiştirin. Koloninin sağlığı ve refahı için temiz bir ortamın korunması esastır.
  5. Her bir kabı günde bir kez hafifçe püskürtün–250 mL'lik bir sprey şişeden musluk suyundan 2 püskürtme yaparak uygun hidrasyonu sağlayın.
    NOT: Bu, özellikle çok önemli olan bir durumdur. yavru olduktan sonraki ilk gün. Hızlı yem tüketimi gerçekleşirse yoğunluğu azaltın.

4. Toplama ve sürdürme Carausius morosus yavru bireyler

NOT: Bu çalışmada, şunu kullanıyoruz “yavru (yumurtadan yeni çıkmış)” yumurtadan yeni çıkmış bireyleri (ilk evre) ifade etmek için “nimf” ifade eder için embriyonik sonrası derilerin ardından gelen ergin öncesi evreler

  1. Yeni çıkmış yavrularla birlikte 6 cm'lik Petri kutularını toplayın.
  2. Blunt plastik forseps kullanarak, 500'den fazla olmayan yavru balıkları dikkatlice temiz bir 61 cm x 61 cm x 91,5 cm'lik örgülü kafese aktarın.
    NOT: Yalnızca dış iskelet genişlemesini tamamlamış, tamamen ortaya çıkmış ve uzamış nymfları toplayın. Yumurtadan tamamen çıkmaları öncesinde nymfları rahatsız etmek, vücut uzamasını engelleyebilir ve erken ölümlere neden olabilir. Benzer nedenlerle, nymflar örgü kafese aktarıldıktan sonra doğrudan teması en aza indirmeye çalışın.
  3. Bölüm 3'te açıklandığı gibi taze yaprak malzemesi sağlayın.
  4. Yeni koloni kafeslerini şu bilgilerle etiketleyin: yumurta partisi toplama tarihi/tarih aralığı, çıkış tarihi veya çıkış tarih aralığı ve eklenen yavru sayısı.
    NOT: Bu, kafes yaşını takip eder ve üreme olgunluğunun başlangıcını öngörür.
  5. Yavru aktarımından hemen sonra ve bundan sonraki her gün, her bir bölmenin üzerine hafifçe püskürtme yapın, 1–250 mL'lik bir sprey şişeden musluk suyuyla 2 püskürtme yaparak uygun hidrasyonun sağlanması.
    NOT: Bu, özellikle yavrunun çıkışından sonraki ilk gün için çok önemlidir. Yavrular gelişimlerinin tamamı boyunca, yetişkinlik dönemine kadar aynı kafeste kalabilir. 1. bölümde tanımlanan laboratuvar koşullarında yaklaşık %13'ü yavru, 4–5 ayTablo 1).
  6. Haftalık kafes temizliği sırasında kontaminasyonu önlemek için ölü veya hasarlı yavruları çıkarın.

5. Toplama ve sürdürme C. morosus yumurtalar

  1. Yetişkin dişileri içeren bir kavanozu açın.
  2. Eldivenli elinizle kafesin dibindeki, hem yumurta hem de dışkı maddesi içeren alt tabakaları ön açıklığa doğru hafifçe süpürün.
  3. Eldivenli el ile malzemeyi dikkatlice bir 15 cm'lik Petri kabına taşıyın ve yumurta toplama işlemini gerçekleştirin.

6. Böceklerin öldürülmesi ve yaşam alanının atıklarının bertaraf edilmesi

NOT: Her zaman C. morosus deneysel amaçlar için artık gerekli değilse, ölmüşse veya yumurtalara ihtiyaç duyulmuyorsa:

  1. Ötenazi/Böceklerin imhası: Kültür veya deneyler için artık gerekli olmayan canlı veya ölü böcekleri oto klavlanabilir bir atık torbasına aktarın ve -20'de saklayın °en az 72 saat boyunca C dondurucusunda
  2. Yumurta tahribi: Aşırı nüfuslanmayı önlemek için herhangi bir yumurtayı çıkarın deneylerde kullanılmayanları kafeslerden veya Petri kutularından alarak otoklavlanabilir bir atık poşetine koyun ve -20'de saklayın °en az 72 saat boyunca C
  3. Atık işleme: Kafeslerden veya yumurta ve böcek toplama için kullanılan malzemelerden çıkan bulaşmış atıkları otoklavlanabilir bir atık torbasına koyun ve -20 °C'de saklayın °en az 72 saat boyunca C
  4. Donmuş malzemelerin ardından otoklavlanabilir atık poşetini uygun şekilde bertaraf edilmesi için biyolojik tehlike kutusuna aktarın.
    NOT: Şu anda olarak C. morosus Hindistan'ın dışında invaziv bir tür olduğundan, çevreye yanlışlıkla salınmayı önlemek için yukarıda açıklandığı gibi tüm malzemelerin uygun şekilde bertaraf edilmesi hayati öneme sahiptir.

7. Yumurta toplama

  1. Blunt plastik forseps kullanarak her bir yumurtayı dikkatlice alınız ve temiz bir 6 cm'lik Petri kabına yerleştiriniz.
    NOT: Olgun yumurtalar sert bir ekzokoryon tarafından korunur ve koyu kahverengi olup bitki tohumlarını andırır. Ayırma işlemi sırasında dışkıdan yumurtaları ayırt etmeye yardımcı olmak için beyaz bir arka plan kullanılabilir.
  2. Kabı, takip amacıyla toplama tarihi ve saatiyle etiketleyin. Havalandırmaya izin vermek için inkübasyon sırasında kapağı açık bırakın.
    NOT: 200 adete kadar yumurta saklamak için 6 cm'lik Petri kabı yeterlidir.
  3. Beklenen kuluçka penceresinden yaklaşık 1 hafta önce (74–Yumurta bırakılmasından 80 gün sonra; Kovacikova & Extavour, yayımlanmamış veriler), Petri kabı kapağını yerine takın.
  4. Beklenen kuluçka tarihinden önce yumurta kaplarını günlük olarak izlemeye başlayarak çıkan yavruları gözlemleyin.

8. Yaşam süresi

  1. Kuluçkadan sonra, bireyleri laboratuvar koşullarında ortalama 139. günde üreme olgunluğuna ulaşıncaya kadar beş ila altı defa ekdvize uğrarlar; bu süreç boyunca takip edin (Tablo 1).
  2. Bu protokolü uygulamak için, bu kültür koşulları altında gelişimsel zamanlamayı şu şekilde tanımlayın: embriyogenez süresi (yumurta bırakma ile çıkış arasında) 74–80 gün; yumurtadan çıkıştan cinsel olgunluğa ulaşmaya (yumurtlamaya başlamaya) kadar geçen süre yaklaşık 135 gündür ve bu, yumurta bırakılmasından cinsel olgunluğa kadar yaklaşık 200 güne karşılık gelir. Yumurta bırakılmasından ölüme kadar olan toplam yaşam süresi yaklaşık 9,5 aydır.

Sonuçlar

Eylül 2024 ile Kasım 2025 tarihleri arasında, C. morosus türünün yumurtalardan üreme yeteneğine sahip erişkinlere kadar başarılı laboratuvar yetiştirilmesini belgeleyen veriler topladık. Bu 14 aylık süre boyunca, şu parametrelerden biri veya daha fazlası için beş kafes kurduk, sürdürdük ve izledik: erişkin mortalitesi, yumurtlanan yumurta sayısı, yumurtaların çıkım zamanı ve yeni çıkan yavruların yetişkinliğe kadar olan sağkalımı. Yöntemimiz, patojen kaynaklı hastalık veya üreme kaybı gibi suboptimal sonuçlara yol açabilecek belirgin işaretler olmaksızın uzun süreli koloni bakımını desteklemektedir. İki yılı aşan sürekli kültür süresince, patojen kaynaklı belirgin kitlesel ölümler gözlemlenmedi; yumurta ve yavru üretimi nesiller boyunca stabil kaldı.

Şu şekilde gösterilen veriler Şekil 1 ve Şekil 2 kurulumdan yavruların yetişkinliğe erişimine kadar izlenen beş kafesteki gözlemleri, her bir kafes için yumurtlanan yumurtalar ve yetişkin mortalitesi dahil olmak üzere sunun. Her kafesteki kurucu bireyler cinsel olgunluğa erişip yumurtlamaya başladıktan sonra, ovipozisyon başlangıcındaki başlangıç popülasyonunu belirlemek amacıyla her kafeste bulunan yetişkin sayısını kaydettik. Zaman içinde her kafesteki yetişkin sayısı şurada gösterilmiştir: Şekil 1 ve Tablo 1Sağkalımdaki sürekli düşüşü, yaşa bağlı mortalite olarak yorumluyoruz.

Yetişkin sağkalımının izlendiği aynı beş kafeste yumurta üretimini de paralel olarak takip ettik (Şekil 1 ve Şekil 2). Kafes başına günlük yumurta sayıları, yumurtlama döneminin ilk 30–50 gününde en yüksek seviyedeydi ve sonrasında kademeli olarak azaldı. Toplam yumurta üretimi kafesler arasında farklılık gösterse de (Tablo 2), bu genel patern beş replika kafesin tamamında tutarlıydı. Toplam 105 yumurta grubu için 50 günlük bir süre boyunca yumurta çıkım dinamiklerini izledik; burada her bir yumurta grubu, 24 saatlik bir süre içinde aynı kafese bırakılan yumurtalar topluluğunu ifade etmektedir. Şekil 3'te gösterilen grup boyutu analizleri için 75 grup; küçük, orta ve büyük kategorilerine ayrıldı. Bir gruptaki ilk yumurta çıktıktan sonra, grup boyutundan bağımsız olarak (Şekil 3B), ilk yavrunun çıkışından sonraki 12 gün içinde %90 çıkım tamamlanma oranına ulaşıldığını tespit ettik (Şekil 3D). Bir gruptaki ilk yavrunun çıkışını takip eden belirli bir zaman noktasında, gruptaki yumurtaların çıkım yapmış olan oranını tanımlamak için “çıkım tamamlanması” terimini kullanarak, yumurta gruplarının %90 çıkım tamamlanma gününe göre dağılımının, çoğu grubun ilk yavru çıkışından sonraki 10 ile 14. çıkım günleri arasında (Şekil 3C) bu eşiğe ulaştığını belirtmekteyiz.

figure-results-1
Şekil 1. Yetişkin ölüm dinamiği. Zaman içinde beş tekrarlı C. morosus deney kafeslerindeki sağkalım yörüngeleri. İzlenen her kafesteki bireyler için yüzde sağkalım zamana karşı grafiğe dökülmüştür. Özet metriklere Tablo 1'den bakınız. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2Yumurta üretim dinamikleri. takip edilen aynı beş kafesten toplanan yumurta sayısı Şekil 11'den 5'e kadar olan kafesler sırasıyla 47, 58, 106, 129 ve 132 gün boyunca günlük olarak izlenmiştir. Grafik, yumurtlama sürecinin ilk 126 gününe ait verileri göstermektedir. Özet metriklere şuradan bakınız: Tablo 2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3Yumurta çıkım dinamikleri. (A) Batch başına toplam yumurta sayısı ile %90 kuluçka tamamlanma oranına ulaşmak için gereken gün sayısı arasındaki ilişki. (B) 7-20. kuluçka günleri boyunca, yumurta partilerinin %90 kuluçka tamamlanma oranına ulaştığı güne göre dağılımı. (C) Küçük, orta ve büyük yumurta gruplarında grup bazlı çıkım oranının dağılımı. Her grup boyutu kategorisi için n = 25 grup. (D) Parti boyutu analizinde kullanılan 75 yumurta partisi için 70 günlük toplama süresi boyunca izlenen çıkım yörüngeleri. Toplam 105 yumurta partisi izlenmiştir; burada gösterilen analizler için 75 parti, tersil kesim noktaları kullanılarak toplam yumurta sayısına göre gruplandırılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4Kafes başına yetişkin sayıları, yetişkin mortalitesi ve yumurta üretimi arasındaki ilişkiler. (A) Anlamlı bir ilişki yoktur (R2 ortalama yetişkin günlük ölüm oranı ile bir kafesteki kurucu yetişkin sayısı arasında (p = 0,025) [bir ilişki vardır].B) Anlamlı bir ilişki yoktur (R2 = 0,017) toplam yumurta üretimi ile bir kafesteki kurucu yetişkin sayısı arasında. (C) Orta düzeyde negatif bir korelasyon (R2 = 0,411) ortalama günlük yumurta üretimi ile ortalama yetişkin günlük mortalite arasındadır. Ortalama yetişkin günlük mortalite = (% toplam mortalite) / (toplam izleme gün sayısı). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kafes Noeski kafes noİlk gün çıkımı
kurucu kafese yavrular eklendi		Son gün çıkışı
yavrular kurucu kafese eklendi		# Kuluçka
kafese eklenen yavrular		Kuluçka süresi aralığı
eklemeler yapıldı		Kafes Başlangıcı ile Yetişkin Sayımı Arasındaki Ortalama SüreYetişkinlerin Sayımının İlk GünüYetişkinlerin Yumurta Yumurtlamaya Başladığı İlk GünKuluçkadan Çıkış ile Erginlik Arasında Geçen SüreKuluçka Çıkışı ile Yumurta Yumurtlama Arasında Geçen SüreBaşlangıç Erişkin SayısıYavru Hayatta Kalma Oranı ve Yetişkinliğe Geçiş
çeker ocak		Yetişkin Sayımının Son GünüYetişkinlerin Son Sayısıİzlenen Yetişkin Sayısının Süresi  [gün]İzlenen Süre Boyunca Ortalama Yetişkin Mortalitesi [%]Günlük Ortalama Yetişkin Mortalitesi [%]
1712/7/
2024		12/21/
2024		Saptanmadı14.00166.005/29/
2025		5/29/
2025		173.00173.0061.00Saptanmadı10/9/
2025		9.00133.0085.25%0.64%
282/10/
2025		3/9/
2025		ND27.00130.007/17
/2025		7/17/
2025		157.00157.0042.00ND11/5/
2025		12.00111.0071.43%0.64%
394/5/
2025		4/12/
2025		Saptanamadı7.00110.007/17/
2025		7/27/
2025		103.00113.0045.00Saptanmadı11/5/
2025		36.00111.0020.00%0.18%
4105/8/
2025		5/22/
2025		35014.00121.009/4/
2025		9/13/2
025		119.00128.0036.0010.29%11/5/
2025		24.0062.0033.33%0.54%
5115/23/
2025		6/6/
2025		53614.00117.009/4/
2025		9/24/
2025		104.00124.0086.0016.04%11/5/
2025		66.0062.0023.26%0.38%
Ortalamalar15.20128.80131.20139.0054.0013.17%29.4095.8046.65%0.48%

Tablo 1: Deneysel kafeslerdeki yetişkin sağkalım ve mortalite dinamikleri. Beş tekrarlı deneysel kafes için yetişkin sağkalım sonuçları. Her bir kafes için; kafesin kurulduğu tarih aralığı, her kafesi kurmak için kullanılan yavruların sayısı (5 kafesten 2'si için), yavruların yetişkinliğe kadar sağkalımı (5 kafesten 2'si için), kafes kurulumu, yetişkin sayımlarının başlatılması ve yumurtlamanın başlaması arasındaki süre, yetişkin izleme süresi, başlangıç ve bitiş yetişkin popülasyon büyüklükleri, izleme süresince gerçekleşen yetişkin mortalitesi ve ortalama günlük mortalite rapor edilmiştir. Yavruların yetişkinliğe kadar sağkalımı, yalnızca başlangıç yavru sayıları bilinen kafesler için hesaplanmıştır.

Kafes NoYumurta Toplama Başlangıç TarihiYumurta Toplama Bitiş TarihiYumurta Toplama Süresi [gün]Kafes Başına Toplam Yumurta SayısıGünlük Ortalama Yumurta SayısıBaşlangıçtaki Erişkin Birey SayısıBaşlangıçtaki Erişkin Başına Toplam Yumurta SayısıErişkin Başına Günlük Ortalama Yumurta Sayısı
15/29/202510/8/
2025		132.006721.0050.9261.00110.180.83
27/4/202511/10/2025129.007333.0056.8442.00174.601.35
37/27/202511/10/2025106.009198.0086.7745.00204.401.93
49/13/202511/10/202558.002583.0044.5336.0071.751.24
59/24/202511/10/202547.006104.00129.8786.0070.981.51
Ortalamalar94.406387.8073.7954.00126.381.37

Tablo 2: Deneysel kafeslerdeki yumurta üretimi. Olgun yetişkinleri içeren beş tekrarlı deneysel kafesin yumurta verme verimi. Her bir kafes için yumurta toplama başlangıç ve bitiş tarihleri, toplam yumurta toplama süresi, kafes başına kümülatif yumurta üretimi ve günlük ortalama yumurta sayısı rapor edilmiştir.

Tartışma

Burada detaylandırılan bakım yöntemleri, C. morosus laboratuvar popülasyonlarının sürdürülmesi için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır. C. morosus uzun süredir laboratuvarlarda veya evcil hayvan olarak beslenmiş olsa da, laboratuvar araştırma bakım protokolleri çalışmalar arasında farklılık göstermiştir6,9,10,11,12. Tutarlı çevresel koşulların ve besleme uygulamalarının sağlanması, C. morosus'un gelişimsel, fizyolojik ve evrimsel araştırmalar için güvenilir bir laboratuvar model organizması olmasını sağlamak açısından önemlidir.

Diğer model böceklerle karşılaştırmalı olarak C. morosus gelişme süreci

Meyve sineği Drosophila melanogaster gibi holometabol böceklere kıyasla C. morosus, daha yavaş gelişim hızları ve daha uzun bir juvenil evre sergiler. D. melanogaster 25 °C'de embriyogenezi ~24 h içinde tamamlayıp 10–12 gün içinde üreme olgunluğuna erişirken13, bizim yetiştirme koşullarımız altında C. morosus embriyogenez için 74–80 güne ve yumurtadan çıktıktan sonra üreme olgunluğuna erişmek için yaklaşık 135–139 güne ihtiyaç duyar; bu da 23 °C'de yumurtlamadan üreme olgunluğuna kadar yaklaşık 200 güne tekabül eder (veriler gösterilmemiştir). Bu uzamış zaman çizelgesi, hemimetabol ve holometabol böcekler arasındaki temel fizyolojik ve evrimsel farklılıkları yansıtır14,15 ve Phasmatodea genelinde defalarca görülür16,17,18. Cırcır böceği Gryllus bimaculatus gibi diğer hemimetabol böcekler embriyogenezi daha kısa bir sürede tamamlayıp cinsel olgunluğa erişirken (29 °C'de sırasıyla on gün ve altı hafta19), C. morosus'un daha yavaş gelişimi, tekrarlanabilir araştırmalar ile embriyogenez ve juvenil gelişimin ayrıntılı, boylamsal çalışmaları için eşsiz bir fırsat sunar.

Yaprak kaynağı ve besleme uygulamaları

Bu protokolde, C. morosus kolonisinin temel besin kaynağı olarak, yıl boyunca kampüs içindeki sabit bir konumdan toplanan sarmaşık (Hedera helix) kullanımını bildiriyoruz. Sarmaşık tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir; ancak böğürtlen (Rubus spp.), ligustrum (Ligustrum spp.), ateş dikeni (Pyracantha spp.), gül (Rosa spp.), alıç (Crataegus monogyna), meşe (Quercus spp.) ve fındık (Corylus spp.) dahil olmak üzere çeşitli alternatif bitkisel besin kaynaklarının C. morosus kolonilerini sürdürmek için uygun olduğu rapor edilmiştir20. Dış kaynaklardan toplanan yapraklar kullanılırken dikkat edilmesi gereken önemli bir husus, besin içeriğinin standart diyetlere (örneğin, Drosophila melanogaster) dayanan laboratuvar sistemlerine göre daha az kontrollü olması ve bunun potansiyel olarak besinsel değişkenliklere yol açabilmesidir. Bunu sınırlamaya yardımcı olmak için, tüm mevsimler boyunca aynı konumdan aynı bitki türünü kullandık ve rutin kafes bakımı sırasında haftada bir kez tüm kafeslere yaprak sağladık. Besleme için kullanılan sarmaşık dalları tipik olarak yeni filizlenmiş ve olgunlaşmış yaprakların bir karışımına sahipti; dalları belirli bir yaprak gelişim aşamasına göre seçmedik. Tüm yapraklar kafeslere eklenmeden önce yıkandı. Tüm yaprakların çıkarılıp aynı gün yenilenmesini içeren haftalık değişim programı, tutarlılık sağlamak ve koloninin ölçeğini yönetmek için uygulanmıştır. Kesilmiş sarmaşık yaprakları, hafta boyunca nemliliğini korumak amacıyla kafes içindeki su dolu kaplarda tutuldu. Çoğu durumda yapraklar tüm hafta boyunca iyi durumda kaldı; ancak nadiren kuruma veya tükenme meydana gelebiliyordu, bu durumda yapraklar 1 haftadan daha erken değiştiriliyordu.

Koloni büyüklüğü, hayatta kalma oranları ve yetişkin üremesi

Uygun koloni kurulumu ve popülasyon yoğunluğunun dikkatli yönetimi, stokların sağlıklı tutulmasında kilit rol oynamıştır. 61 cm x 61 cm x 91.5 cm boyutlarındaki her bölme için maksimum yaklaşık 500 yavru veya 5 yetişkinin tutulması; stabil koşulları, koloni bakımını ve tekrarlanabilir gelişimsel gözlemleri desteklemiştir.

Ortalama günlük mortalitenin bir kafesteki kurucu yetişkin sayısı ile karşılaştırılması (Şekil 4A ve Tablo 1), bu iki parametre arasında öngörülebilir bir ilişki olmadığını ortaya çıkarmıştır. Benzer şekilde, toplam kurucu yetişkin sayısı ile toplam yumurta üretimi arasında güçlü bir öngörücü ilişki bulunmamıştır (Şekil 4B, Tablo 1 ve Tablo 2). Bunun yerine, ortalama günlük yetişkin mortalitesi daha düşük olan kafesler, daha yüksek ortalama günlük yumurta verimine sahip olma eğilimi göstermiştir (Şekil 4C). Ancak, kafesler arasındaki farklılıklar, yumurta üretiminin yetişkinler arasında değişkenlik gösterdiğini önermektedir (Tablo 1 ve Tablo 2); bu durum, yetişkin sağkalımının ötesindeki faktörlerin fekondite modellerine katkıda bulunduğunu ve bireysel dişilerin her gün yumurtladıkları yumurta sayısı bakımından da farklılık gösterebileceği anlamına gelebilir.

İzlenen tüm kafeslerdeki yumurta üretimi, deney süresince genel olarak azalmıştır (Şekil 2). Çoğu kafeste günlük yumurta yumurtlama oranları, üreme döneminin başında (ilk 50 gün) en yüksek seviyeye ulaşmuş, ardından üretim kademeli olarak azalmıştır (Şekil 2). Bu örüntü, bireylerin genellikle kuluçkadan çıktıktan yaklaşık 135 gün sonra cinsel olgunluğa erişip yumurtlamaya başladığı ve ölümlerin yaklaşık 90 gün sonra başladığı (~225 gün kuluçka sonrası; veriler gösterilmemiştir) gözlemimizle tutarlıdır.

Kuluçkanın zamanlaması ve dinamikleri

İzlenen yumurta partileri genelinde, çıkımların çoğu çıkışın başlangıcını takip eden tutarlı bir 12 günlük süre içinde gerçekleşmiştir (Şekil 3D). Benzer şekilde, parti boyutu ile %90 çıkım tamamlanma zamanı arasında bir korelasyon saptanmamıştır (Şekil 3A) ve çoğu parti, ilk yavrunun çıkmasından sonraki 10 ile 14. günler arasında %90 çıkım tamamlanma oranına ulaşmıştır (Şekil 3B). Bu öngörülebilir çıkım süresi, yavruların benzer yaşlarda kohortlar halinde gruplandırılmasına olanak tanıdığı için C. morosus koloni yönetimi açısından kullanışlı bir özelliktir; bu durum gelişimsel evrelemesini iyileştirir ve deneysel değişkenliği azaltır. Toplu çıkımın ne zaman gerçekleşeceğini bilmek, aynı zamanda kafes değişiminin ve kaynak tahsisinin daha iyi planlanmasına olanak tanır; buna kafeslerin, bitki örtüsünün ve takip materyallerinin zamanında hazırlanması dahildir ki bu durum özellikle büyük ölçekli veya uzun süreli çalışmalar için önemlidir. Hem seksüel hem de partenojenetik Phasmatodea türleri çalışılmış olsa da, tek başına üreme modunun embriyogenez zamanlamasındaki farklılıkları yönlendirdiğine dair herhangi bir kanıt bulunmamaktadır. Bunun yerine, gelişimdeki varyasyonların türe özgü olduğu ve çevresel koşullardan etkilendiği bildirilmiştir2.

Yumurta işlemleri ve substrat değerlendirmeleri

Yumurta taşıma yöntemimiz, yumurtaların doğrudan kafes tabanından toplanmasını ve havalandırmalı Petri kaplarında inkübe edilmesini içerir. Bu yaklaşım, yumurtaların hindistan cevizi lifi veya pamuk fitili gibi substratlarda toplandığı cırcır böceği sistemlerinin aksine, yumurtaların kolayca gözlemlenmesini sağlar21. C. morosus yumurtalarının sert ekzokoryonu, taşıma sırasında ve kurumaya karşı koruma sağlayarak, bizim kültür koşullarımız altında ek bir substrat olmaksızın Petri kaplarında güvenli inkübasyona olanak tanır. Topluca ele alındığında, bu standartlaştırılmış prosedürler; tekrarlanabilir gelişimsel, davranışsal, genetik veya fizyolojik araştırmalar için sağlıklı C. morosus popülasyonlarının sürdürülmesine yönelik yapılandırılmış bir yaklaşım sunar. Tutarlı çevresel kontroller (23 °C, 70% RH, 12:12 LD), düzenli kafes bakımı ve öngörülebilir gelişim zaman çizelgeleri, C. morosus'u erişilebilir ve düşük maliyetli bir model sistem haline getirir. Önemli bir nokta olarak, kalabalıklık, kanibalizm veya patojen yükünün kolonileri hızla istikrarsızlaştırabildiği bazı cırcır böceği sistemlerinin aksine22, C. morosus'ların bakımı kolaydır; bu da onları geniş ölçekli deneyler ve birden fazla nesli kapsayan çalışmalar için oldukça uygun kılar. C. morosus hemimetabol bir model tür olarak daha yaygın şekilde benimsendikçe, standartlaştırılmış yöntemlerin kullanımı, böcek biyolojisinin birçok alanındaki çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği ve karşılaştırılabilirliği artırmalıdır.

Kuluçkadan yetişkinliğe hayatta kalma oranı

Çalışmamızdaki yumurtadan çıkıştan yetişkinliğe kadar olan sağkalım oranı (~%13), kontrollü laboratuvar koşulları altında C. morosus nimf sağkalımına ilişkin bir başka kantitatif çalışmada bildirilen oranlardan önemli ölçüde daha düşüktür; söz konusu çalışmada bireylerin %68'i kalori kısıtlaması altında, %87'ye kadarı ise ab libitum besleme altında yetişkinliğe ulaşmıştır23. Kolonimizde gözlemlediğimiz daha düşük sağkalımın (~%13) önceki rapora kıyasla, hayvanların yetiştirilme biçimindeki farklılıklardan kaynaklandığını ve bunun da bizim kültürümüzün ve önceki çalışmanın farklı hedeflerini yansıttığını tahmin ediyoruz. Protokolümüz, bireysel grupların sağkalımını maksimize etmekten ziyade, büyük ve sürekli üreyen kolonileri sürdürmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, yumurtadan yetişkinliğe kadar izole hayvanların bireysel kafeslerde yetiştirildiği önceki çalışmanın aksine, hayvanları nispeten yüksek yoğunluklarda tuttuk23. Burada tanımladığımız yüksek yoğunluklu kültür yönteminin, özellikle bireylerin kalabalığa veya rekabete karşı daha hassas olabileceği erken nimf evrelerinde, izole yetiştirmeye kıyasla mortaliteyi artırabileceğini tahmin ediyoruz. Bireylere bitki yapraklarından kesilmiş kontrollü boyutlardaki disklerin verildiği bireysel yetiştirme yaklaşımıyla karşılaştırıldığında23, daha büyük kafeslerimizdeki bitki kalitesi varyasyonları da bir rol oynamış olabilir. Bununla birlikte, nispeten daha düşük sağkalım oranına rağmen, kolonimiz tutarlı bir şekilde çok sayıda yumurta üretmiş ve zaman içinde stabil kalmıştır (Şekil 1, Şekil 3, Tablo 1 ve Tablo 2). Bu durum, burada tanımladığımız yaklaşımın uzun vadeli bir laboratuvar kültürünü sürdürmek için etkili olduğunu göstermektedir.

Sağkalımı etkileyen faktörler ve protokol kısıtlamaları

Bu protokoldeki birkaç faktörün sağkalım üzerinde etkili olması muhtemeldir ve dikkatle kontrol edilmelidir. Popülasyon yoğunluğu, özellikle erken instar evrelerinde aşırı kalabalıklaşma sağkalımı azaltabileceğinden önemli bir parametredir. Sağkalımı etkileyen bir diğer parametre ise, özellikle erken instar evrelerinde yeterli hidratasyondur. Protokolde açıklanan tüm prosedürler ve zamanlamalar, bu çalışmada kullanılan spesifik çevresel koşullara dayanmaktadır. Bununla birlikte, nem, sıcaklık, hava akışı veya bitki türündeki değişiklikler; su püskürtme sıklığını, yaprakların ne sıklıkla değiştirilmesi gerektiğini, yumurtaların açılma süresini ve genel sağkalımı etkileyebilir. Örneğin, daha kuru kültür koşullarında, hidratasyonu korumak için daha sık su püskürtme ve bitki değişimi gerekebilir. Farklı bitki türleri ayrıca beslenmeyi ve gelişimi etkileyebilir. Bu faktörler, yetiştirme koşullarına ve deneysel hedeflere bağlı olarak ayarlanmalıdır. Yüksek juvenil sağkalımı, bireysel takip veya davranışsal analizler gerektiren uygulamalar için daha düşük başlangıç yoğunlukları tercih edilebilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

Bu proje, Howard Hughes Medical Institute araştırmacısı olan CGE'ye verilen Ulusal Bilim Vakfı (National Science Foundation) IOS 22207477 sayılı ödülü ile desteklenmiştir. Carausius morosus türünün Tamil Nadu, Hindistan kökenli olduğuna ve bu türe ait laboratuvar kültürlerinin en az 1908'den beri Hindistan dışında sürdürüldüğüne dair bilgileri onaylıyoruz. Kültürümüzü kurmak için kullanılan ilk yetişkin grubunu sağladıkları için Stanislav Gorb ve Thies Büscher'e (Kiel Üniversitesi'ne) ve ilk koloniyi kuran eski laboratuvar üyesi Dr. Upendra Bhattarai (güncel kurumu: Brown University) dahil olmak üzere Extavour laboratuvarının tüm üyelerine destekleri için içtenlikle teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otoklavlanabilir polipropilen torbalar, 30.5 cm × 61 cmVWR95042-554Böcek, yumurta ve kafes atıklarının bertarafı için
Biyotehlike atık kutusuN/AN/ADondurma sonrası bertaraf için
Küt uçlu plastik pensAmazonB07YZ5FB27Yumurta ve yeni çıkan larvaların toplanması ve taşınması için
İklim kontrollü oda veya inkübatörN/AN/A23 °C, %70 RH ve 12:12 sa ışık-karanlık fotoperiyodunu korumak için
Tek kullanımlık eldivenlerN/AN/AYumurta toplama ve atık yönetimi için
Tek kullanımlık Petri kapları, 150 × 15 mmVWR25384-326Yumurta toplama için
Tek kullanımlık Petri kapları, 60 × 15 mmVWR25384-092Yumurta inkübasyonu için
Taze yapraklar (sarmaşık, böğürtlen veya gül yaprakları)N/AN/APestisitsiz besin kaynağı
Dondurucu, -20 °CN/AN/AÖtanazi/bertaraf ve bertaraf öncesinde yumurtaları veya atıkları dondurmak için
Fileli böcek kafesleriAmazonB09GS2CH1GBöcekleri barındırmak için kullanılır
Sprey şişesi, 250 mLAmazonB000H88PCUFileli kafesleri nemlendirmek için
Yüksek cam kap, 18–23 cm yükseklikN/AN/ASu ve bitki saplarını tutmak için kullanılır
Musluk suyuN/AN/ANemlendirme ve yaprakların hidrasyonunu korumak için
Beyaz ayıklama yüzeyi veya tepsisiN/AN/AAyıklama sırasında yumurtaları dışkılardan ayırt etmek için

Kaynaklar

  1. Adamski Z, et al. Beetles as model organisms in physiological, biomedical and environmental studies: a review. Front Physiol. 2019;10:319.
  2. Schwander T, et al. On the repeated evolution of parthenogenesis in stick insects. Evolution. 2026;80(3):513-24.
  3. Arias AM. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 2008;420:1-25.
  4. Dürr V, König Y, Kittmann R. The antennal motor system of the stick insect Carausius morosus: anatomy and antennal movement pattern during walking. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 2001;187(2):131-44.
  5. Roth HL. XIX. Observations on the growth and habits of the stick insect, Carausius morosus, Br.; intended as a contribution towards a knowledge of variation in an organism which reproduces itself by the parthenogenetic method. Trans R Entomol Soc Lond. 1917;64(3-4):345-86.
  6. Pijnacker LP. The maturation divisions of the parthenogenetic stick insect Carausius morosus Br. (Orthoptera, Phasmidae). Chromosoma. 1966;19(1):99-112.
  7. Browaeys-Poly E. Extracellular matrix of the regeneration chamber and plasma membranes of the epidermis during leg regeneration in an insect Carausius morosus. Tissue Cell. 1991;23(1):41-55.
  8. Di Cristina G, et al. Pioneering genome editing in parthenogenetic stick insects: CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Medauroidea extradentata. Sci Rep. 2025;15(1):2584.
  9. Cavallin M. [“Substitutive polyembryony” and the problem of germinal line origin in the phasma Carausius morosus Br]. C R Acad Hebd Seances Acad Sci D. 1971;272(3):462-5.
  10. Giorgi F, Cecchettini A, Masetti M. Changes in the patterns of proteins stored and synthesized by developing embryos of the stick insect Carausius morosus Br. Comp Biochem Physiol B. 1990;95(1):107-13.
  11. Pijnacker LP, Godeke J. Development of ovarian follicle cells of the stick insect, Carausius morosus Br. (Phasmatodea), in relation to their function. Int J Insect Morphol Embryol. 1984;13(1):21-8.
  12. Pijnacker LP. Effect of centrifugation of the eggs on the sex of Carausius morosus Br. Nature. 1966;210(5041):1184-5.
  13. Hales KG, Korey CA, Larracuente AM, Roberts DM. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 2015;201(3):815-42.
  14. Truman JW, Riddiford LM. The evolution of insect metamorphosis: a developmental and endocrine view. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019;374(1783):20190070.
  15. Truman JW, Riddiford LM. The origins of insect metamorphosis. Nature. 1999;401(6752):447-52.
  16. Bedford GO. Description and development of the eggs of two stick insects (Phasmatodea: Phasmatidae) from New Britain. Aust J Entomol. 1977;15(4):389-93.
  17. Kim MJ, et al. Development of a phenology model for egg hatching of walking-stick insect, Ramulus mikado (Phasmatodea: Phasmatidae) in Korea. Forests. 2023;14(9):1710.
  18. Lee J, et al. Temperature-dependent development and oviposition models of Ramulus irregulariterdentatus (Phasmida: Phasmatidae). J Asia Pac Entomol. 2018;21(3):903-13.
  19. Donoughe S, Extavour CG. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Dev Biol. 2016;411(1):140-56.
  20. Conle O, Hennemann F, Riquelme PV, Kneubühler B. Phasmatodea [Internet]. 2000. Available from: https://www.phasmatodea.com/
  21. Ventura MK, Stull VJ, Paskewitz SM. Maintaining laboratory cultures of Gryllus bimaculatus, a versatile orthopteran model for insect agriculture and invertebrate physiology. J Vis Exp. 2022; (184):e63277.
  22. de Miranda JR, et al. Virus diversity and loads in crickets reared for feed: implications for husbandry. Front Vet Sci. 2021;8:642085.
  23. Roark AM, Bjorndal KA. Bridging developmental boundaries: lifelong dietary patterns modulate life histories in a parthenogenetic insect. PLoS One. 2014;9(11):e111654.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sopa Böceği YetiştirmeLaboratuvar BakımıBöcek Kültürü ProtokolüYumurta BakımıYavru BakımıLaboratuvar Model BöceğiBöcek GelişimiBöcek DavranışıBöcek Fizyolojisi
Laboratuvar Ortamlarında Carausius morosus (Phasmatodea, Insecta) Yetiştirilmesi İçin Standartlaştırılmış Bir Protokol
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.