Çalışma Tasarımı
Bu araştırma, NET'lerle ilişkili enflamatuar özellikler ile T2DM ve komplikasyonları arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için iki örneklemli MR yaklaşımı kullanmıştır. MR çerçevesi üç temel varsayıma dayanmaktadır20: 1) genetik varyantın maruziyetle güçlü bir şekilde ilişkili olması, 2) genetik varyantın sonucu yalnızca maruziyet aracılığıyla etkilemesi (pleiotropinin dışlanması) ve 3) genetik varyantın herhangi bir karıştırıcı faktörle ilişkili olmaması. Bu çalışmanın sürecine ilişkin ayrıntılı bir genel bakış için lütfen Şekil 1'e bakınız. Makale, şeffaflık ve tekrarlanabilirlik standartlarının titizlikle uygulanmasını sağlamak amacıyla, MR çalışmalarının raporlanmasına yönelik MR-STROBE kılavuzuna uygun olarak hazırlanmıştır21.
Veri Kaynakları
Bu MR analizinde kullanılan Genom Boyu İlişkilendirme Çalışmaları (GWAS) verileri, GWAS genel veri tabanlarından temin edilmiştir. T2DM ile ilgili özet düzeydeki GWAS'lar açısından, 74.124 vaka ve 824.006 kontrolden oluşan Avrupa popülasyonuna ait en büyük meta-analiz ile Avrupa'da yürütülen, 9.978 vaka ve 12.348 kontrolün yer aldığı prospektif iç içe geçmiş vaka-kohort çalışması dahil edilmiştir22. Renal komplikasyonlu T2DM ve periferik dolaşım komplikasyonlu T2DM dahil olmak üzere diyabetik komplikasyonlar için bu çalışma, vakaların ilgili komplikasyona sahip T2DM hastaları, kontrollerin ise T2DM olmayan bireyler olduğu çalışmalardan GWAS özet istatistiklerini çekmiştir. Veri kaynakları hakkında detaylı bilgi Ek Tablo 1'de bulunabilir.
NET'lerle ilişkili inflamatuar özelliklere ait GWAS verileri GWAS kataloğundan elde edilmiştir (bkz. Ek Tablo 2). Biyolojik özgüllükteki heterojenliği gidermek için bu çalışma, dahil edilen maruziyetleri nötrofil biyolojisindeki fonksiyonel rollerine göre iki ayrı gruba ayırmıştır: (1) Temel NETozis İlişkili Faktörler: Bu kategori, NET'lerin yapısal oluşumunda veya kromatin dekondansasyonunun enzimatik sürecinde doğrudan yer alan belirteçleri içerir. Spesifik olarak bu çalışmaya NET'lerin kendileri, Miyeloperoksidaz (MPO), Nötrofil Elastaz (NE) ve MPO-DNA kompleksi dahil edilmiştir. MPO ve NE, histon degradasyonu ve kromatin dekondansasyonu için temel enzimlerken, MPO-DNA kompleksi NET'ler için spesifik bir sürrogat belirteçtir23. (2) NET'lerle İlişkili İnflamatuar Mediyatörler: Bu kategori, NETozis ile yakından bağlantılı olan ancak daha geniş inflamatuar yolaklarda da yer alan, upstream regülatörler veya downstream efektörler olarak görev yapan sitokinleri ve mediyatörleri kapsar. Bu grup, İnterlökin-6 (IL-6)24, Tümör Nekroz Faktörü-alfa (TNF-α)25, Nötrofil gelatinaz ilişkili lipokalin düzeylerini (NGAL)26 ve Hücresel İletişim Ağ Faktörü 1 (CCN1)27 içerir.
Bu çalışmada kullanılan veriler, açık erişimli veri tabanlarından veya önceki çalışmalarda yayınlanmış GWAS verilerinden elde edilmiştir; bu nedenle, bu araştırma için etik onay gerekmemiştir.
NET'lerle İlişkili Genetik Araçların Seçimi
NET oluşumunun, geleneksel GWAS çalışmalarında doğrudan ölçülmeyen dinamik bir biyolojik süreç olduğu göz önüne alındığında, bu çalışmada NET ile ilişkili inflamatuar özellikler için genetik araçları belirlemek amacıyla gen tabanlı bir yaklaşım kullanılmıştır. MPO gibi NET oluşumu ve düzenlemesinde kritik rol oynadığı bilinen 257 genlik kapsamlı bir set, histonları ve nötrofil granül proteinlerini kodlayan genlerle birlikte, yerleşik mekanistik çalışmalardan ve yayınlanmış literatürden28 derlenmiştir.
Araç Değişken Seçimi
NET'lerle ilişkili inflamatuar özellikler için güçlü genetik araçlar belirlemek amacıyla, bu çalışmada GWAS özet istatistikleri kullanılarak ardışık bir filtreleme iş akışı uygulanmıştır. Spesifik operasyonel adımlar şu şekildedir:
İlk Tarama: Maruziyet özellikleri ile anlamlı düzeyde ilişkili olan genetik varyantlar, P < 5 × 10⁻6 anlamlılık eşiği temel alınarak çıkarılmıştır29.
Minör alel frekansı (MAF) Filtrelemesi: İstatistiksel gücü sağlamak için MAF ≤ 0.01 olan Tek Nükleotid Polimorfizmleri (SNP'ler) hariç tutulmuştur30.
Bağlantı Dengesizliği (LD) Kümeleme: Bağlantı dengesizliği (LD) karıştırıcı etkilerini azaltmak için, 10,000 kb pencere boyutunda r2 < 0.001 olarak ayarlanan parametrelerle kümeleme fonksiyonu kullanılarak bağımsız SNP'ler seçilmiştir31.
Enstrüman Gücü Değerlendirmesi: Kalan her bir IV'nin gücü, F = R2 × (N-2) / (1-R2) şeklinde hesaplanan F-statistiği kullanılarak nicelleştirilmiştir. Zayıf enstrüman yanlılığını en aza indirmek için yalnızca F-statistiği > 10 olan SNP'ler tutulmuştur32.
Proxy SNP Tanımlama ve Veri Harmonizasyonu
Sonuç veri setindeki eksik SNP'leri gidermek için, bu çalışmada bir vekil (proxy) araması ve veri harmonizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir:
Proxy İkamesi: Maruziyet GWAS'tan elde edilen hedef SNP, sonuç GWAS'ta mevcut olmadığında, bu çalışmada 1,000 Genomes Project Avrupa referans paneline dayalı LDproxy() fonksiyonu kullanılmıştır. Aday bir proxy SNP, yalnızca orijinal SNP ile yüksek LD (r2> 0.8) göstermesi durumunda seçilmiştir. Uygun bir proxy bulunamadığı durumlarda, ilgili SNP analiz dışı bırakılmıştır.
Harmonizasyon: Maruziyet ve sonuç veri setleri, TwoSampleMR paketindeki (R versiyon 4.0.5) harmonise_data() fonksiyonu kullanılarak hizalanmıştır. Bu çalışmada, tüm SNP'leri otomatik olarak ileri zincire (forward strand) hizalamak ve belirsiz zincir yönelimine sahip palindromik SNP'leri çıkarmak için action = 2 parametresi belirlenmiştir.
Doğrulama: Harmonizasyon sonrası bu çalışmada, etki alel frekanslarının maruziyet ve sonuç verileri arasında tutarlı olduğunu onaylamak için harmonize edilmiş veri seti manuel olarak incelenmiştir.
MR Analizi ve Duyarlılık Testleri
Nedensel çıkarım, TwoSampleMR paketi (R versiyon 4.0.5) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Birincil ve İkincil Analizler: Bu çalışmada birincil yaklaşım olarak Ters Varyans Ağırlıklı (IVW) yöntem uygulanmıştır33. Sağlamlığı doğrulamak için MR-Egger34, ağırlıklı medyan ve ağırlıklı mod yöntemleri kullanılarak tamamlayıcı analizler gerçekleştirilmiştir35.
Hassasiyet Değerlendirmeleri: IV'ler arasındaki heterojenlik, mr_heterogeneity() fonksiyonu aracılığıyla Cochran’ın Q testi36 kullanılarak değerlendirilmiştir. Yatay pleiotropi, MR-Egger34 kesişim testi (mr_pleiotropy_test()) ile değerlendirilmiştir.
Aykırı Değerlerin Tespiti: Bu çalışmada, potansiyel aykırı değerleri tespit etmek için MR-PRESSO paketi kullanılmıştır37. mr_presso() fonksiyonu 1.000 simülasyon ile çalıştırılmıştır. Tespit edilen aykırı SNP'ler (P < 0.05) çıkarılmış ve sonuçların kararlılığını doğrulamak için nedensel tahminler yeniden hesaplanmıştır. Ek olarak, nedensel ilişkinin tek bir SNP tarafından yönlendirilmediğinden emin olmak için "biri dışarıda bırakma" (leave-one-out) analizi gerçekleştirilmiştir38.
İstatistiksel Düzeltme
Çoklu testleri hesaba katmak için, MR analizlerinden elde edilen P-değerleri Yanlış Keşif Oranı (FDR) yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir. Bu işlem, R'daki P.adjust() fonksiyonu method = "fdr" parametresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Düzeltilmiş P-değeri (PFDR) < 0.05 olan ilişkiler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.