Vitamin C Destekli Fenton Oksidasyonu, In Vitro Helicobacter pylori'nin oksidatif öldürmesini iyileştirir

Özet

Bu çalışma, vitamin C'nin in vitro koşullarda bir Fenton reaksiyonunun kinetik davranışını nasıl modüle ettiğini inceliyor. Kimyasal boya probu ve bakteriyel testler, kontrollü vitamin C dozlamasının reaksiyonun oksidatif davranışını değiştirdiğini ve basitleştirilmiş bir model sisteminde Helicobacter pylori karşı artan antibakteriyel aktiviteyle ilişkili olduğunu göstermektedir.

Özet

Helicobacter pylori enfeksiyonu hâlâ büyük bir küresel sağlık yükü olmaya devam ediyor ve antibiyotik direncinin artan yaygınlığı, alternatif antibakteriyel stratejilere olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu çalışma, C vitamini dozunun Fenton oksidasyonunu modüle edip edemeyeceği ve belirli asidik in vitro koşullarda H. pylori'ye karşı oksidatif antibakteriyel aktiviteyi artırıp artırmayacağını incelemiştir. Oksidatif aktivite, dolaylı kimyasal okuma olarak Acid Orange 7 renk decolorizasyonu ve demir peroksit reaksiyonlarında hidroksil radikal ilişkili ürün oluşumunun göreli göstergesi olarak tereftalik asit floresan testi kullanılarak değerlendirildi ve C vitamini ile takviye edildi. Antibakteriyel etkinliği, standartlaştırılmış H. pylori maruz kalarak değerlendirildi. pH 3'te ürea içeren tuzlu süzme ile hidrojen peroksit ve demir demire adım adım C takviyesi ile veya olmadan süspansiyonlar, ardından koloni oluşturan birim sayımıyla yapılır. C vitamini takviyesi, oksidatif gösterileri değiştirmiş ve geleneksel Fenton kimyasına kıyasla canlı bakterilerde daha fazla azalma ile ilişkilendirilmiştir. Deferoksamin ve tiourea kullanılarak yapılan kurtarma deneyleri, antibakteriyel aktiviteyi azaltmış ve antibakteriyel aktivitenin demir aracılı ve radikal ilişkili oksidatif süreçlerle ilişkili olduğu hipotezini desteklemiştir. Canlı/ölü floresan boyama ve taramalı elektron mikroskobi, koloni oluşturma birimi (CFU) sayımı sonuçlarıyla uyumlu niteliksel görsel gözlemler sağladı. Bu bulgular toplamda, kontrollü vitamin C dozunun Fenton bazlı oksidatif reaksiyonları modüle edebileceğini ve H. pylori'ye karşı antibakteriyel aktiviteyi basitleştirilmiş ve asidik bir in vitro modelinde artırabileceğini göstermektedir.

Giriş

H. pylori, spiral şekline sahip Gram-negatif bir bakteri olan ve Helicobacter cinsine ait olup, popülasyon sağlığı çalışmalarıyla coğrafi alanlar, cinsiyet ve yaş genelinde enfeksiyon oranının yüksek olduğu ve küresel olarak yaklaşık %50 oranında olduğu gösterilmiştir^. Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC), H. pylori'yi Grup 1 kanserojen olarak sınıflandırmış ve bunun mide kanseri ile mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfomasıyla güçlü bağlantısını vurgulamaktadır. Şu anda H. pylori enfeksiyonunun klinik yönetimi öncelikle farmakolojik rejimlere dayanmaktadır. En kapsamlı incelenen ajanlar arasında mide asidi salgılanmasını baskılayan proton pompası inhibitörleri (PPI) bulunur; antibiyotik etkinliğini artıran bizmut bileşikleri; ve amoksisilin, klaritromisin ve metronidazol gibi antibiyotikler. Ancak, monoterapinin tamamen yok etme için yetersiz olduğu gösterilmiştir; bu da yaygın olarak üçlü terapi olarak adlandırılan kombinasyon rejimlerinin yaygın kullanımına yol açmıştır. Bu yaklaşım genellikle yaklaşık iki hafta boyunca uygulanan bir PPI, klaritromisin ve amoksisilin veya metronidazolden oluşur³. Antibiyotik dirençli H. pylori türlerinin yaygınlığının artmasıyla birlikte, üçlü tedavinin etkinliği belirgin şekilde azalmış ve PPI, bizmut ve iki antibiyotikten oluşan dört katlı tedavinin^{benimsenmesine yol açmıştır3}. Buna rağmen, bu rejimler hâlâ temelde antibiyotiklere bağlıdır ve antibiyotik direnci klinik yönetimde büyük bir zorluk^{olmaya devam etmektedir 4,5}. Sonuç olarak, alternatif, antibiyotikten bağımsız antibakteriyel stratejilerin araştırılması giderek artan ilgi çekti.

Doğrudan patolojik etkilerinin ötesinde, H. pylori enfeksiyonu aynı zamanda mide mikrobesinli homeostazında değişikliklerle de ilişkilendirilmiştir. Klinik ve epidemiyolojik çalışmalar, enfekte bireylerin mide suyu ve serumunda C vitamininin azaldığını^{bildirmiştir 6}; bu durum mukoza iltihaplanma, salgılanma bozuklukları veya artan oksidatif tüketimle ilişkili^{olabilir 7,8,9}. Paralel olarak, H. pylori enfeksiyonu demir eksikliğiyle mide asiditesinin azalması, diyetin demir emiliminin bozulması ve mevcut demir¹⁰ için bakteriyel rekabet gibi birçok mekanizma aracılığıyla ilişkilendirilmiştir. Bu gözlemler, H. pylori enfeksiyonuna eşlik eden karmaşık biyokimyasal ortamı vurgular ve asidik mide koşullarında redoks ve demir ile ilgili süreçlerin önemini vurgulamaktadır.

Reaktif oksijen türleri (ROS), bu türlerin oksidatif özellikleri nedeniyle antimikrobiyal araştırmalara büyük ilgi kazanmıştır. ROS, oksijenin kısmi indirgenmesi sırasında oluşan kimyasal olarak reaktif moleküller sınıfını ifade eder; örneğin süperoksit anyon (O₂•⁻), hidrojen peroksit (H₂O₂), tekli oksijen (¹O₂) ve hidroksil radikalleri (•OH) gibi. Biyolojik sistemlerde, ROS, normal fizyolojik metabolizmada yoğun şekilde yer alır ve çeşitli hücresel düzenleyici aktiviteler için gereklidir¹¹. Özellikle, çok sayıda çalışma aşırı ROS'un bakteriyel hücre zarlarını lipid peroksidasyonu yoluyla bozabileceğini, membran yapısı ve işlevinde değişikliklere yol açabileceğini ve nihayetinde bakteriyel inaktivasyona^{yol açabileceğini göstermiştir 12}. Buna göre, ROS tabanlı antimikrobiyal yaklaşımlar, H. pylori^{13,14,15,16'ya} karşı antibiyotik olmayan antibakteriyel etkilerin araştırılması için potansiyel bir yol olarak ilgi çekmiştir. Çeşitli ROS üretim yöntemleri arasında, Fenton reaksiyonu yüksek verimli radikal üretimiyle önemli ilgi gördü. Fenton reaksiyonu, demir iyonlarının (Fe²⁺) asidik koşullarda H₂O₂ ile reaksiyona girerek güçlü oksidatif potansiyele sahip ve hücre içi biyomolekülleri oksitleyebilen hidroksil radikalleri (•OH) ürettiği gelişmiş bir oksidasyon^{sürecidir 17}.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+^OH-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Özellikle, yaklaşık 2.8–4.5 pH olduğunda, H₂O₂ Fe²⁺ tarafından katalitik ayrışmaya uğrar ve •OH oluşurken, Fe²⁺ Fe³⁺'ye oksitlenir. Fe³⁺ daha sonra H₂O₂ ile reaksiyona girerek Fe²⁺'yi yeniden üretir ve sürekli ROS^{üretimi 18'i} sürdüren bir Fe²⁺/Fe³⁺ redoks döngüsü oluşturur. Ancak, Fe³⁺'nun Fe²⁺'ya indirgenmesi nispeten yavaştır; bu da hız sınırlayıcı adımı oluşturur ve dolayısıyla Fenton reaksiyonunun genel verimliliğini düşürür. Çalışmalar, Fenton reaksiyon sistemine uygun bir indirgeme maddesinin eklenmesinin Fe²⁺ indirgemesini Fe²⁺'ye hızlandırabileceğini ve böylece ROS üretimini artırabileceğini göstermektedir. C vitamini bağlama bağlı bir redoks rolü vardır. Demir içeren sistemlerde, Fe²⁺ indirgemesini Fe²⁺'ya teşvik edebilir ve böylece Fenton döngüsünü destekleyebilir; yüksek konsantrasyonlarda veya farklı reaksiyon koşullarında ise antioksidan veya radikal temizleyici olarak da işlev^görebilir.

Bu arka plana dayanarak, mevcut çalışma, tanımlanmış asidik in vitro koşullarında oksidatif aktiviteyi modüle etmek için kimyasal olarak ayarlanabilir bir yaklaşım olarak vitamin C destekli Fenton reaksiyon^{sistemini incelemektedir 20,21}. C vitamini, Fe²⁺ rejenerasyonunu kolaylaştırmak ve böylece Fenton reaksiyonunun etkili oksidatif davranışını değiştirmek için indirgetici bir ajan olarak kullanıldı. Burada kullanılan deneysel sistem, basitleştirilmiş bir asidik tuzlu üre modeliydi ve mukus, tamponlama bileşenleri, konak hücreler, bağışıklık faktörleri ve çeşitli organik substratlar içeren fizyolojik mide mikro ortamını tam olarak yeniden üretmeyi amaçlamamıştır. Bu kontrollü model içinde, oksidatif aktivite kimyasal okumalar kullanılarak karakterize edilmiş ve bakteriyel fenotipik yanıtlarla paralel olarak değerlendirilmiş, bu da H. pylori karşı in vitro olarak ROS ile ilişkili antibakteriyel etkilerin incelenmesi için deneysel bir temel sağlamıştır.

Protokol

Etik bildirisi
Bu çalışma in vitro bakteriyel çalışmaydı ve insan katılımcıları, hayvan denekleri veya hasta kaynaklı materyalleri içermedi. Bu nedenle, kurumsal inceleme kurulu onayı ve hayvan etiği onayı gerekmiyordu.

Vitamin C destekli Fenton sisteminde AO7 ayrışmasının değerlendirilmesi
Fenton reaksiyonunun gözlemlenebilir oksidatif davranışı üzerindeki C vitamini etkisini değerlendirmek için, oksidatif aktivitenin dolaylı kimyasal okuması olarak Acid Orange 7 (AO7) ayrıştırması kullanıldı. Bu test, bireysel reaktif oksijen türlerini özel olarak niceliklendirmez. 5 mg/L ile 100 mL AO7 çözeltisi hazırladım ve çözeltiyi pH 3'e ayarladım. H₂O₂ ve FeSO₄ eklenmiş olarak sırasıyla 2,2 mM ve 0,055 mM nihai konsantrasyonlara eklenmiştir. Reaksiyon başlatıldığında tek bir bolus olarak ya da üç aşamalı dozlama yöntemiyle C vitamini eklendi. Doz-yanıt deneyi için, 0,0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 ve 8 olan Vc:^{Fe 2}⁺ molar oranları kullanıldı; bunlar FeSO₄ 0,055 mM'de kullanıldığında sırasıyla 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 ve 0,440 mM olan nihai C vitamin konsantrasyonlarına karşılık geldi. Üç aşamalı toplama koşulu için, aynı toplam C vitamini miktarı üç eşit aliquot'a bölündü ve reaksiyon başlatıldıktan 3, 5 ve 7 dakika sonra bir aliquot eklendi. Örneğin, Vc:Fe²⁺ oranı 0.48 olduğunda, aliquot başına 0.0088 mM C vitamini eklenerek toplam konsantrasyon 0.0264 mM olur.

Reaksiyon çözeltisini 10 dakika boyunca karanlıkta sürekli karıştırdım ve sıcaklığı 30 °C'nin altında tuttuk. Reaksiyondan önce ve sonra 2 mL örnek topladım. UV-Vis spektrofotometre ile 483 nm'de soğurma ölçümü ve Denklem 1'i kullanarak AO7 bozulma oranı hesaplandı:

Bozulma oranı (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × %100 (1)

Burada, A₀ reaksiyon öncesi numunenin emilimini temsil ederken, A₁ reaksiyon sonrası numunenin emilimini temsil eder.

•OH ile ilişkili floresan sinyalinin TA probu kullanılarak değerlendirilmesi
Antibakteriyel deneylerde kullanılan aynı asidik in vitro koşullarda hidroksil radikal ilişkili floresan sinyallerini değerlendirmek için, floresan probu olarak disodyum tereftalat (TA, 1 mM) kullanılarak hücresiz bir kimyasal sistem kuruldu. Bu test, •OH ile ilişkili ürün oluşumunun göreceli bir göstergesi olarak kullanıldı ve hidroksil radikal oluşumunun mutlak nicelenmesi olarak yorumlanmadı. Yedi grup dahil edildi: (1) boş (sadece reaksiyon tamponunda 1 mM TA), (2) yalnızca H₂O₂, (3) Fe²⁺ yalnız, (4) Vc tek başına (kademeli toplama), (5) geleneksel Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) bolus Vc eklemeli vitamin C destekli Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, bolus) ve (7) Vc destekli Fenton ve adım adım Vc ekleme ile (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, adım adı). Adım ekleme koşulunda, Vc reaksiyon başlatıldıktan sonra 3, 5 ve 7 dakika sonra eşit aliquotlarda uygulanırken, bolus koşulu tek bir ekleme ile aynı toplam Vc alır.

Aliquotlar 10 dakikalık bir reaksiyon süresince toplanmış, hemen NaOH ile alkalinize edilerek daha fazla radikal reaksiyonu söndürülmüş ve floresansı stabilize edilmiş ve ölçüm öncesi 4 °C sıcaklıkta saklanmıştır. TA-kaynaklı ürünün floresans yoğunluğu mikroplaka okuyucu (Ex/Em: 315/425 nm) kullanılarak ölçüldü. Radikal üretimi, boş çıkarmadan sonra floresans yoğunluğu olarak ifade edildi ve radikal oluşumunun göreceli bir göstergesi olarak kullanıldı. En az üç bağımsız deney yapıldı ve veriler 10 dakikada zaman kulturası profilleri ve uç nokta karşılaştırmaları olarak sunuldu.

Koloni sayımı ile antibakteriyel performansın değerlendirilmesi
H. pylori suşları, %25 gliserol içeren beyin kalp infüzyon (BHI) çorbasında −80 °C sıcaklıkta depolandı. Ana koloni sayma testi, kurtarma testi, matriks girişimi testi, canlı/ölü floresan boyama ve taramalı elektron mikroskopi analizi için kullanılan birincil suş H. pylori G27'ydi. Her deneyden önce, bakteriler Columbia kan agar plakalarına damlatıldı ve %5 O₂, %10 CO₂ ve %85 ^N₂22 içeren mikroaerofilik koşullarda 37 °C'de kuluçka altına alındı.

Birincil suşta koloni sayımı testi
Farklı tedavi koşullarında antibakteriyel aktiviteyi değerlendirmek için koloni oluşturan birim (CFU) sayımı kullanıldı. Aşağıdaki grupları içeriyordu: tedavi edilmemiş kontrol, sadece H₂O₂, yalnızca C vitamini, geleneksel Fenton reaksiyonu ve C vitamini destekli Fenton reaksiyonu. Eğer orijinal deneyde yalnızca bir Fe²⁺ grubu dahil edilmediyse, birincil testi sadece demir etkilerini Fenton reaksiyonu aracılı oksidatif etkilerden tamamen ayıran olarak yorumlamaktan kaçının. H . pylori kültürü yapıldı ve bakteriyi fizyolojik tuzlu suyla yeniden askıya alındı. 600 nm (OD₆₀₀) optik yoğunluğunu 0.5'e ayarladı ve süspansiyon, pH 3'e ayarlanmış 3 mM üre içeren fizyolojik tuzlu suyuna aktarıldı. Atanan tedavi grubuna göre H₂O₂, FeSO₄ ve C vitamini eklendi. Nihai konsantrasyonları 2,2 mM H₂O₂ ve 0,055 mM FeSO₄ olarak kullanıldı. C vitamini destekli Fenton tedavisinde, 3, 5 ve 7 dakikada üç eşit aliquot içinde C vitamini eklendi ve toplam konsantrasyon 0,0264 mM oldu.

10 dakikalık işlemden sonra, her örnek hemen fosfatla tamponlanmış tuzlu sıvıda (PBS, pH 7.4) 100 kat seyreltilerek asidik süspansiyonu nötralize etti ve kalıntı oksidanların ile demirin kaplama aşamasına aktarılmasını azalttı. Sulandırılmış bakteriyel süspansiyonu Columbia kan agar plakalarına kaplama yaptı ve %5 O₂, %10 CO₂ ve %85 N₂ mikroaerofilik koşullarda 3 gün boyunca 37 °C'de inkübe edildi. CFU'ları saydı ve antibakteriyel aktivite olarak hesaplandı, tedavi edilmemiş kontrole göre Denklem 2 kullanılarak hesaplandı:

log₁₀ CFU indirgenmesi = log₁₀(CFU_kontrolü) − log10(_{CFU işlenmiş}) (2)

Kurtarma testi
C vitamini destekli Fenton sisteminin antibakteriyel aktivitesinin demir bulunabilirliği ve radikal ilişkili süreçlerle ilişkili olup olmadığını incelemek için, deferoksamin (DFO) demir kelatörü ve thiourea hidroksil radikal temizleyici olarak kullanılarak kurtarma deneyleri yapıldı. DFO veya thiourea, FeSO₄ ve H₂O₂ eklenmeden 5 dakika önce bakteriyel süspansiyona eklendi. DFO ve thiourea, sırasıyla 100 μM ve 5 mM nihai konsantrasyonlarda kullanıldı.

Altı deneysel grup dahil edildi: tedavi edilmemiş kontrol, C vitamini destekli Fenton, vitamin C destekli Fenton ve DFO, C vitamini destekli Fenton ve tiorea ile, sadece DFO ve sadece tiorea ile birlikte. PH, salin/urea arka planı, H₂O₂ konsantrasyonu, FeSO₄ konsantrasyonu, C vitamini dozlama programı, tedavi süresi, kaplama öncesi seyreltme/nötralizasyon ve kuluçka koşulları dahil olmak üzere diğer tüm deneysel parametreler, birincil koloni sayımı testinde kullanılanlarla aynıydı. Antibakteriyel aktivite, CFU sayımıyla nicel edilmiş ve tedavi edilmeyen kontrole göre log₁₀ CFU azalması olarak ifade edilmiştir.

Çok sürün doğrulaması
Birincil suşta gözlemlenen antibakteriyel etkiyi sınırlı çapraz suş desteği sağlamak amacıyla, koloni sayma testi iki ek H. pylori referans suşuna da uygulandı: ATCC 43504 ve ATCC 26695. Her suş için üç deneysel grup dahil edildi: tedavi edilmemiş kontrol, geleneksel Fenton reaksiyonu ve adım adım C vitamini eklenen vitamin C destekli Fenton reaksiyonu. Deneysel koşullar ve prosedürler, birincil koloni sayımı testinde kullanılanlarla aynıydı. Antibakteriyel aktivite, her suş için tedavi edilmemiş kontrole göre log₁₀ CFU azalması olarak ifade edildi. Her deney n = 3 bağımsız biyolojik kopya ile gerçekleştirildi ve veriler ortalama ± standart sapma ile bireysel veri noktaları olarak sunuldu.

Matris girişim testi
Organik matris bileşenlerinin vitamin C destekli Fenton sisteminin antibakteriyel etkinliğini zayıfladımıp azaltamayacağını değerlendirmek için, sığır serum albümini (BSA) kullanılarak bir protein girişim modeli oluşturuldu. BSA, 0, 1 ve 3 g· nihai konsantrasyonlarında dahil edildi L⁻¹. Her BSA konsantrasyonunda üç deneysel grup dahil edildi: (1) tedavi edilmemiş kontrol, (2) geleneksel Fenton (Fe²⁺ + H₂O₂) ve (3) adım adım C vitamini eklenen C vitamini destekli Fenton. Test, birincil koloni sayımı testinde tanımlanan aynı protokol altında birincil suş kullanılarak gerçekleştirildi; aynı pH koşulları, tuzlu/üre arka planı, reaktif konsantrasyonları, tedavi süresi (10 dakika) ve kaplama prosedürleri kullanıldı. Antibakteriyel aktivite, her BSA konsantrasyonunda tedavi edilmemiş kontrole göre log₁₀ CFU indirgenmesi olarak ifade edildi. Her deney en az üç kez bağımsız olarak gerçekleştirildi. Birincil karşılaştırma, geliştirilmiş Fenton durumunun, protein içeren koşullarda geleneksel Fenton durumundan üstün olup olmadığına veya en azından zayıf olup olmadığına odaklanmıştır.

Bakteriyel canlı/ölü floresan boyama
Tedaviden sonra, bakteriyel süspansiyon yukarıda tarif edildiği gibi PBS ile 100 kat seyreltilerek kalıntı asidik ve oksidatif transferi azaltmıştır. Süspansiyonu 1.800 × g ile oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjlendirdim ve üst yüzeyi attım. Bakteriyel pellet 200 μL fizyolojik tuzlu suyla yeniden süspansiyona alındı. SYTO9 ve propidium iyodid (PI) sırasıyla 6 μM ve 30 μM nihai konsantrasyonlara eklendi. Süspansiyonu oda sıcaklığında 20 dakika karanlıkta inkubasyon yaptım. 5–10 μL boyalı bakteri süspansiyonunu temiz bir cam kaydırığa yerleştirip örtü ile kapattı. Tüm tedavi grupları için aynı pozlama ayarlarında yeşil ve kırmızı floresans kanallarıyla floresan mikroskobu kullanılarak floresan görüntüleri alındı. Her grup için en az üç rastgele seçilmiş alan yakalandı. Görüntüleri, bakteriyellerin canlılığının nicel ölçümü olarak değil, canlı/ölü boyama desenlerinin niteliksel görsel kanıtı olarak kullandı.

Taramalı elektron mikroskopisiyle bakteriyel morfoloji analizi
İşlemden sonra, bakteri örnekleri toplandı ve 0,1 M fosfat tamponunda (pH 7,4) 4 °C'de 12 saat boyunca hazırlanmış %2,5 glutaraldehit içinde sabitlendi. Fiksasyondan sonra, örnekler fosfat tamponu ile yıkanarak kalıntı fiksator çıkarıldı. Örnekler ardışık olarak %50, %70, %90 ve %100 dereceli etanol çözeltilerinde kurutuldu. Susuz kaldıktan sonra kritik nokta kurutma gerçekleştirildi. Kurutulmuş örnekler SEM kıvılcımlarına monte edilip yaklaşık 10 nm ince bir altın tabaka ile sputter kaplandı. Bakteriyel morfoloji, 5 kV hızlandırıcı voltajda taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak incelenmiştir. Her tedavi grubu için düşük ve yüksek büyütmede temsil edici görüntüler alındı. SEM görüntüleri, tanımlanmış bir hasar mekanizmasının nicel kanıtı olarak değil, nitel morfolojik gözlemler olarak kullanıldı.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler GraphPad Prism sürüm 10.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm nicel deneyler n = 3 bağımsız biyolojik kopya ile yapıldı ve veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. TA floresans testleri için, birden fazla tedavi grubu arasında istatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Birden fazla tedavi koşullarını içeren birincil suşta koloni sayımı testleri için, istatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Kurtarma testleri için, gruplar arası karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı, ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı; referans olarak vitamin C destekli Fenton grubu seti yapıldı. Sınırlı çapraz suş doğrulama deneyleri için, her suş içindeki geleneksel Fenton ve vitamin C destekli Fenton grupları arasında çiftsiz iki kuyruklu t-testi kullanılarak log₁₀ CFU indirimleri karşılaştırıldı. Matris-girişim testleri için, iki yönlü ANOVA tedavi ve BSA konsantrasyonu olarak etkileşim terimi dahil olmak üzere faktörler olarak gerçekleştirildi. Her BSA konsantrasyonunda tedaviler arasında çift karşılaştırmalar Šídák'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlandı. Anlamlılık seviyeleri *p < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001 ve ****p < 0.0001 olarak belirtilmiştir.

Sonuçlar

Vitamin C destekli Fenton sisteminde AO7 ayrışmasının değerlendirilmesi
AO7 bozunması, vitamin C'nin Fenton reaksiyonunun asidik koşullarda gözlemlenebilir oksidatif davranışını nasıl etkilediğini incelemek için kimyasal bir prob olarak kullanıldı. C vitamini yokluğunda, geleneksel Fenton sistemi 10 dakikalık reaksiyon süresinde kısmi AO7 bozulmasına yol açtı. C vitamini tanıtıldığında, boya bozulma derecesi arttı ve etkisi vitamin C ile Fe2⁺ arasındaki azı dişleri or...

Tartışma

Mevcut çalışma, C vitamini dozunun, Fenton bazlı bir sistemin oksidatif davranışını ve antibakteriyel gösterimlerini tanımlanmış asidik in vitro koşullarında modüle edip edemeyeceğini incelemiştir. Kimyasal ve mikrobiyolojik testler boyunca, adım adım C vitamini takviyesi gözlemlenebilir reaksiyon davranışını değiştirmiş ve test edilen koşullarda geleneksel Fenton reaksiyonuna göre H. pylori'ye karşı daha yüksek antibakteriyel aktiviteyle ilişkilendirilmiştir. Önemli ol...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	AO7 bozunma analizi için model boya olarak kullanılır.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Matris-girişim analizi için kullanılır.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Bakteryal kültür ve kriyosaklamada kullanılır.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Bakteryal kültür ve CFU sayımı için kullanılır.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Dereceli etanol dehidrasyonundan sonra SEM örnek hazırlığı için kullanılır.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Kurtarma analizinde demir şelatörü olarak kullanılır.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	•OH ile ilişkili sinyal algılaması için TA floresan probu olarak kullanılır.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	SEM örnek kurutması için derecelendirilmiş etanol serisini hazırlamak için kullanılır.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Canlı/ölü floresan görüntüleme için kullanılır.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	SEM öncesi bakteri örneklerinin fiksasyonu için kullanılır.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	BHI broth içinde bakteriyel kriyosaklama için kullanılır.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	İstatistiksel analiz ve grafikleme için kullanılır.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Sınırlı çapraz suş doğrulama için ek referans suşu.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Sınırlı çapraz suş doğrulama için ek referans suşu.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Koloni sayımı, kurtarma analizi, matris-girişim analizi, canlı/ölü boyama ve SEM için kullanılan ana suş.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	Fenton reaksiyon analizleri için peroksit substratı olarak kullanılır.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Fenton reaksiyonunda demir iyon kaynağı olarak kullanılır.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	TA türevi floresansı ölçmek için kullanılır (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	Plaklamadan ve numune yıkamadan önce işlem sonrası seyreltme/nötralizasyon için kullanılır.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	Bakteryal süspansiyon ve asidik tuzlu-üre modelinin hazırlanması için kullanılır.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Bakteryal morfoloji analizi için kullanılır.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	TA analizi alişanlarını alkalize etmek ve floresansı stabilize etmek için kullanılır.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	SEM görüntülemeden önce ince altın kaplamayı uygulamak için kullanılır.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Floresan temelli canlı/ölü bakteri boyaması için kullanılır.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Kurtarma analizinde radikal süpürücü olarak kullanılır.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Asidik tuzlu-üre modelini hazırlamak için kullanılır.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	AO7 absorbansını 483 nm'de ölçmek için kullanılır.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Vitamin C destekli Fenton sisteminde indirgeyici olarak kullanılır.