Drosophila Beynindeki Protocerebral Anterior Medial Küme Dopaminergik Nöron Sayılarında Grup Farklılıklarını Tespit Etmek İçin Yarı Otomatik Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, büyük Drosophila protoserebral anterior medial kümesinde dopaminergik nöron sayılarını nicelendirmek için yarı otomatik bir yöntem sunar. Deneysel ve kontrol grupları arasındaki farkları tespit etmek ve karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmış bu yaklaşım, manuel sayma bağımlılığını azaltır ve grup düzeyinde analizler için pratik bir araç sağlar.

Özet

Drosophila melanogaster , Parkinson hastalığı (PD) dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde güçlü bir model organizma olarak hizmet vermektedir; bu hastalık öncelikle dopaminergik (DA) nöron dejenerasyonu ve ilişkili hareket eksikliklerinin analizi yoluyla gerçekleşir. Tarihsel olarak, sinek beynindeki DA nöron kaybının nicelendirilmesi, protoserebral posterior medial (PPM) kümeler ve protoserebral posterior lateral (PPL) kümeleri dahil olmak üzere daha küçük, kolayca sayılabilir kümelerle sınırlıdır. Buna karşılık, 100'den fazla nörondan oluşan önemli ölçüde daha büyük protoserebral ön medial (PAM) kümesi, manuel sayım için önemli bir zorluk teşkil eder ve nicel çalışmalarda yeterince temsil edilmemesine yol açar. Bugüne kadar, bildirilen araştırmalar hâlâ zaman alıcı ve değişkenliğe yatkın konfokal Z-yığınları aracılığıyla yapılan emek yoğun manuel sayımlara dayanmaktadır. Bu metodolojik açığı gidermek için, açık kaynak aracı Labkit'i kullanarak yarı otomatik bir görüntü analiz boru hattı geliştirdik. Bu protokol, aynı deneysel parti içinde PAM kümesindeki tirozin hidroksilaza (TH) pozitif nöronların etkin grup-ilişkili niceliklendirilmesini sağlar. Yöntem, standart immünofluoresans boyama ve konfokal görüntüleme ile başlar, ardından segmentasyon ve analiz için detaylı, adım adım bir rehber takip eder. Bu yaklaşım, PAM kümesi niceli boyutunu ele alır ve nörodejenerasyon modellerinde DA nöron zayıflığındaki gruplar arası farkları tespit etmek için pratik bir iş akışı sağlar. PAM kümesi üzerindeki PD çalışmalarının göreceli azlığı, biyolojik önem eksikliğinden ziyade tarihsel teknik bir engeli yansıtmaktadır. Bu engeli aşarak, yöntemimiz PAM nöron savunmasızlığının ve bunun motor olmayan semptomlarla potansiyel bağlantısının sistematik olarak araştırılmasına yol açmaktadır.

Giriş

Sirke sineği, Drosophila melanogaster, nörodejeneratif hastalıkların genetik ve moleküler temellerini araştırmak için popüler bir model organizmadır; özellikle Parkinson hastalığı (PD)¹. Korunmuş nöronal sinyal yolları, gelişmiş genetik araç seti ve kısa ömrü, yaşa bağlı nöronal savunmasızlıkları incelemek ve yüksek verimli genetik ve farmakolojik taramalar yapmak için olağanüstü uygun^{hale getirmektedir 2,3}. Bu araştırmaların merkezinde, seçici dejenerasyonu^{PD 4'ün} patolojik bir özelliği olan dopaminergik (DA) nöronlarının analizi yer almaktadır. Drosophila beyninde, DA nöronları ayrı, genetik olarak tanımlanabilir^{kümeler halinde organize edilmiştir 5,6}. TH immünboyama ile görselleştirilmiş ve mikroskopi ile nicelendirilen belirli kümeler içindeki DA nöronlarının ilerleyici kaybı, deneysel modellerde hastalık ilerlemesi ve nöroprotektif müdahalelerin değerlendirilmesi için birincil fonksiyonel bir okuma olarak hizmet^{eder 7,8}. Bu nedenle, DA nöron kaybının güvenilir nicel edilmesi, Drosophila genetiğinin gücünü anlamlı PD araştırma sonuçlarına dönüştürmek için gereklidir.

Geleneksel olarak, DA nöron kaybının nicel analizi, protoserebral posterior medial (PPM) kümeleri ve protoserebral posterior lateral (PPL) kümeleri dahil olmak üzere küçük kümelerin tirozin hidroksilaza (TH) immünboyamasına odaklanmıştır; her kümede göz ile kolayca sayılabilir 10'dan az hücre^{bulunur 7}. Konfokal Z-yığınları üzerinden manuel sayma, zahmetli olsa da, Drosophila ^9,10,11 kullanılarak yapılan birçok PD çalışmasında bu kümeler için yerleşik yöntem olmuştur. Buna karşılık, sinek beynindeki en büyük DA nöron grubu olan ve 100'den fazla hücreden oluşan protoserebral anterior medial (PAM) kümesinin manuel sayılması, uzun süredir devam eden metodolojik bir darboğaz oluşturur ve PD çalışmalarının^{çoğuna dahil edilmesini engeller 9,10,11}. PAM nöronlarının öğrenme, hafıza ve motivasyon devrelerindeki kritik rolüne rağmen, bu sınırlama, nörodejenerasyonun nicel analizlerinde göreceli olarak az temsil^{edilmesine yol açmıştır 12,13,14,15}. Özellikle, son araştırmalar bile bu verimsiz manuel sayım yaklaşımına dayanmaya devam ediyor ve bu da alanda standartlaştırılmış, otomatik bir çözüme olan kalıcı ve karşılanmamış bir ihtiyacı^vurguluyor.

Bu kritik açığı gidermek için, bir deney içinde PAM kümesindeki TH-pozitif (^TH+) nöronlarının etkin grup-ilişkili niceliklendirmesini sağlayan yarı otomatik bir görüntü analiz boru hattı geliştirdik. Bu protokol, Fiji/ImageJ platformundaki açık kaynaklı, makine öğrenimi tabanlı eklenti Labkit'i ve 3D görüntü işleme^yazılımı 16,17'yi kullanır. Temel iş akışı, kullanıcının piksel sınıflandırma modelini eğitmek için temsil eden bir alt küme görsel açıklaması yapmasını gerektirir; bu model, toplu süreç deneysel TH-boyama veri setlerine uygulanır ve ardından ^TH+ bölgesine göre çekirdek noktası oluşturma ve sınıflandırma yapılır. Bu yaklaşım, otomasyonu uzman denetimiyle dengeler: tamamen manuel sayımların yükünü ve değişkenliğini azaltırken, algoritmayı yönlendirmek ve sonuçları incelemek için araştırmacı girdilerini korur.

Bu makalenin amacı, araştırmacılara bir deney içinde grup-ilişkili karşılaştırmalar için etkili PAM kümesi DA nöronu göreceli niceliklendirme için adım adım bir protokol sağlamaktır. Beyin diseksiyonu, immünofluoresans boyama ve konfokal görüntülemeden yarı otomatik yöntemle detaylı görüntü analizine kadar tüm iş akışını gösteriyoruz. Bu önemli nicel adımı standartlaştırarak, bu protokol araştırma topluluğunun büyük PAM kümesini analizlerine tutarlı şekilde dahil etmelerini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yarı otomatik yöntem özellikle PAM kümesi için tasarlanmıştır ve diğer dopaminergik kümelere veya optik loblardaki TH-pozitif nöronlara uygulanmaz. Bu yöntem, PAM kümesi DA nöron savunmasızlığının toplu düzeyde çalışmalarını ve Drosophila modeli kullanılarak sinaptik plastiklik, nörodejenerasyon ve terapötik tarama üzerine daha ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.

Protokol

1. Numune hazırlama ve konfokal görüntüleme

1. Sinek yetiştiriciliği ve koleksiyonu
   1. İstenen genotiplerin çapraz ebeveyn sinekleri deneysel yavrular üretmek için kullanılır. Eklozyon sırasında, taze gıda şişesi için 20–30 sinek toplayın. Kullanıcının deneysel tasarımına göre sinekleri istenen deneysel yaşına ulaşana kadar bakıma götürün.
2. Diseksiyon hazırlığı
   1. 30 mm Petri kabının kapağını yarı yüksekliğe kadar Sylgard silikon elastomeri ile doldurarak bir diseksiyon kabı hazırlayın. Kabı 1x Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) ile doldurun. Aliquot 450 μL fiksatif maddesi, 1x PBS ve %4 paraformaldehit (PFA) içeren 0,6 mL mikrosantrifüj tüpünde koyun, ardından tüpü buz üzerine yerleştirin.
   2. 10–20 sineği 5–10 saniyelik CO₂ darbesiyle anestezi edin, ardından hareketsizliği korumak için hemen buzun üzerine yerleştirilmiş 60 mm Petri kapına aktarın.
      DIKKAT: PFA toksiktir ve şüpheli bir kanserojen olarak görülür. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğüyle bir duman başlığı ile tutun. Atıkları kurumsal tehlikeli madde yönergelerine göre bertaraf et.
3. Sinek beyni diseksiyonu ve fiksasyonu
   1. Penses kullanarak bir sineği kanat kökünden tutup ventral tarafı yukarıya doğru PBS dolu diseksiyon kabına daldırın. Sineği Sylgard pedine sabitlemek için ince bir diseksiyon iğnesi ile göğsün deliğini delin.
   2. Vücudu yatay olarak yönlendirin (örneğin, baş sola, karın sağa). Proboscis tabanını bir forsepsle tutarken, diğerini kullanarak tüm hortumu çıkararak bileşik gözler arasında bir açıklık oluşturun.
   3. Açıkta duran göz kenarlarını iki forsepsle tutun ve çok yavaş simetrik olarak ayırın, böylece beyni açığa çıkarır ve ventral sinir kordonuna olan bağlantısını korur.
   4. Beyin çevresindeki trakeal keseleri ve yağ bedenini çıkarın. Ventral sinir kordonunu keserek beyni serbest bırakın ve ön tarafı yukarı bakacak şekilde çanak üzerine yerleşmesini sağlayın.
      NOT: Yerleşmiş beyin ventral yarıyı dorsal yarıdan daha yukarıda gösteriyorsa (Şekil 1B,C), forseps kullanarak yükselmiş kısmı nazikçe aşağı bastırın.
   5. Diseksiye uğrayan beynin iç duvara yapışmasını önlemek için P10 pipet ucunu %0,1 Triton X-100 ile önceden ıslatın. Bu ıslatılmış ucu kullanarak, diseksiyon edilen beyinleri fiksatif içeren tüpe aktarın, ardından bir sonraki diseksiyona geçin. Tüm beyinler transfer edildikten sonra, tüpü 5 kez ters çevirin ve 30 dakika boyunca yatay olarak buzun üzerine koyun. Tüpü oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca çaltımarak inkübe edin.
   6. Beyinlerin dipte 1 dakika yerleşmesine izin verin. Beyni, 1x PBS ve %0,1 Triton X-100 (PBST) içeren yıkama solüsyonuyla 3 x 10 dakika boyunca çalkalayın. Beyinleri, %0,1 sodyum azid içeren PBS'de 4 °C'de depolayın veya immünboyamaya geçin.
4. İmmünboyama
   1. Beyinleri, 1x PBS, %0,1 Triton X-100, %5 Normal Keçi Serumu, %0,1 Sodyum Azid ve tavşan anti-TH antikoru (1:500 seyreltme) içeren 300 μL primer antikor boyama çözeltisiyle 2 gün boyunca 4 °C'de boyanarak boyanın. Beyninizi 3 x 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.
   2. Beyinleri, 4 °C'de 2 gün boyunca 1x PBS, %0,1 Triton X-100, %5 Normal Keçi Serumu, %0,1 Sodyum Azid ve anti-tavşan Alexa Fluor 635 içeren ikincil antikor çözeltisiyle boyanın. Beyninizi bir kez PBST ile yıkayın.
   3. Beyinleri 4',6-diaminino-2-fenilindol (DAPI) ile takviye edilmiş PBST'de 2 saat RT'de inkübe edin, ardından beyinleri 2 saat boyunca PBST ile yıkayın. Beyinleri gece boyunca 4 °C'de sakla ya da montaja geç.
5. Montaj
   1. İnce kalit iğneyle donatılmış 1 mL enşırıngeye 0,5 mL montaj maddesi yükleyin. Cam slayta iki paralel şeffaf yapışkan bant şeridi takarak 3 mm boşluk bırakarak bir montaj odası oluşturun (Şekil 1A,D).
      DIKKAT: Keskin iğneler delme riski oluşturur. Her zaman dikkatli davranın, gerekirse tek elli kepçe ile tekrar yapın ve kullanılmış iğneleri hemen onaylı bir keskin kapta atın.
   2. Beyinleri, kesik bir P200 uç kullanarak temiz bir Petri kabına aktarın. Beyinleri çevreleyen fazla sıvıyı çıkarın ve beyne 10 μL mountant verin. Beyinleri mountantla nazikçe karıştırın.
   3. Kaydıraktaki boşluk boyunca üç damla montaj malzemesi dağıtın ve boşluk boyunca eşit şekilde yayın. Beyinleri boşluğun merkezi hattı boyunca P10 pipetiyle aktarın ve konumlandırın (Şekil 1A).
   4. Beyinleri, boşluğun merkez hattı boyunca eşit şekilde konumlandırın, ön taraf yukarıya bakıyor. Boşluğu yavaşça bir coverslip ile kapatın. Örtü slipinin kenarlarına başparmaklarla 3 saniye bastırarak sağlam temas sağlanır.
   5. Slaytı yatay olarak bir slayt klasörüne yerleştirin ve gece boyunca RT'de karanlıkta kürleyin, ardından uzun süreli depolama için 4 °C'de kürleyin.
6. Konfokal görüntüleme
   1. Konfokal mikroskop sistemini aç ve lazer stabilizasyonu için 15 dakika bekleyin. 10x objektif lens ile beyinleri parlak alanda konumlandırın, ardından 100x yağ daldırma objektif lense geçin ve canlı görüntü altında PAM kümesine gidin.
   2. Aşama XY'yi görüntüleme merkezinde bir PAM kümesi bulmak için ayarlayın. Sınırları ve yönelimi doğrulamak için Z'ye kadar önizleme. Dijital yakınlaştırma ve yönelimi, PAM kümesi görüntü çerçevesine çapraz boyunca uyana kadar ayarlayın.
   3. Yığının üst ve alt konumunu ayarlayın. Z-step boyutunu 0.34 μm ve görüntü çözünürlüğünü 512 x 512 olarak ayarlayın. Pin deliğini otomatik moda ayarlayın. Ekran arama tablosunu (LUT) doygunluk göstergesine ayarlayın.
   4. TH kanalının lazer gücünü ve dedektör kazancını, PAM nöronları içindeki en az miktarda dağınık, ayrık nokta doygunlaşana kadar ayarlayın. Doygunluk olmadan parlak, net bir nükleer sinyal elde etmek için DAPI kanalının ayarlarını ayarlayın.
      NOT: Optimal yakınlaştırma faktörü değişkendir. Deneysel partiler arasında ve aynı partideki bireysel beyinler arasında doku küçülmesinde farklılıklar olabilir.
   5. Görüntüleri ham formatta edinin ve kaydedin (örneğin, D:\Konfocal\images) giriş klasöründe 12-bit veya 16-bit ile. Canlı görünüme geri dönün, zoom'u sıfırlayın ve boşluk boyunca gezinerek daha düşük büyütmeye geçmeden bir sonraki beyni bulun.
      NOT: Bu aşamada birincil veri dosyalarını kaydetmeyin, dışa aktarmayın veya işlenmiş .tif formatına dönüştürülmeyin. Orijinal ham meta verilerin korunması, sonraki görüntü işlemesi için gereklidir.

2. Görüntü işleme ve nicelik

1. Görüntü dosyası dönüşümü ve TH kanal paylaşımı
   1. Giriş klasöründeki ham görüntüleri, ilgili dosya dönüştürücü (Materyal Tablosu) kullanılarak 3D görüntü analiz yazılımıyla uyumlu bir formata dönüştürün. Dönüştürülmüş dosyaları dönüştürülmüş klasöre yerleştirin (örneğin, D:\Konfocal\dönüştürülmüş)
   2. Fiji'yi aç ve Dosya | sayfasına geç Yeni | Senaryo. Script düzenleyicide Dosya | Makro dosyası ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Ek Dosya 1) yüklemek için açık. Düzenleyici penceresinin en altına yakın Çalıştır tuşuna tıklayın (düğme gizliyse, göstermek için küçük üçgen simgeye tıklayın).
   3. Yapılandırma diyalogunda, Browse (Gez) tuşuna tıklayın ve dönüştürülmüş klasörü seçin. Adlandırma Sözleşmesi altında, 3. seçeneği seçin. Dışa aktarmak için kanal altında, TH'ye karşılık gelen kanal indeksini seçin. TH kanalını toplu bölmek için Ok'a tıklayın; dışa aktarılan TH yığınları otomatik olarak ChannelSplitOut ile biten bir klasörde kaydedilir.
2. Labkit sınıflayıcısının eğitimi
   1. Eğitim veri setinin hazırlanması
      1. TH yığın klasöründen örneklerin sinyal yoğunluklarını ve arka plan varyasyonlarını yakalayan 20 temsilci yığını seçin. Seçilen dosyaları seçim klasörüne kopyalayın (örneğin, D:\Konfocal\selection).
      2. Fiji makrosunu ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Ek Dosya 2) çalıştırın. Istendiğinde, eğitim görsellerinin bulunduğu klasörü seçin. Makro, her yığını aynı sayıda Z-dilimine kırpar ve yığınları eğitim için zaman geçişli bir TIFF dosyasına birleştirir.
   2. Piksel sınıflandırıcının etkileşimli eğitimi
      1. Labkit'i Fiji Eklentileri Üzerinden Başlat | Labkit | Güncel görüntüyü Labkit (materyal tablosu) ile açın. Araç çubuğunda, Z-dilimleri (sağ taraftaki kaydırıcı) ve örnekler arasında (alt tarafta sürgü) gezinmek için 3D Kutu butonuna tıklayarak Dilim Görünümü moduna geçin.
      2. Parlaklık ve Kontrast panelini açmak için S tuşuna basın ve ^TH+ nöronların optimal görselleştirilmesi için Max kaydırıcısını ayarlayın. Uygun bir fırça boyutu ayarlayın (örneğin, 5 piksel). Araç panelini genişletmek için Ayarlar'a tıklayın. Varsayılan Görüntü Modlarını (Sigortalı, Kaynak, En Yakın) koruyun.
      3. Çiz tuşuna tıklayın. Etiketleme panelinde Arka Planı öne çıkarın ve birkaç hücresel olmayan bölge çizin; Ön planı vurgulayıp birkaç ^TH+ nöronunun içini çiz.
      4. Ctrl + Shift + Scroll ile alanı yakınlaştırıp uzaklaştırın. Dikey kaydırıcıyı kullanarak diğer Z-dilimlerine ve alt kaydırıcıyı kullanarak diğer eğitim örneklerine gidin. Güçlü sınıflandırıcı eğitimi için çizimi birkaç kez tekrarlayın.
      5. Piksel sınıflandırmasına tıklayın. Eğitim Başlat üçgenine tıklayarak eğitim ve tembel tahmini başlatabilirsiniz; bu üçgen daha sonra gerçek zamanlı segmentasyon geri bildirimi sağlarken örnekler, dilim veya pozisyonlar arasında (sağ tıkla ve sürükle) hareket edebilirsiniz.
      6. Tahminin yanlış olduğu yerlerde düzeltici açıklamalar eklemek için Çiz'e tıklayın; Kaynaklar panelinde tahmin ve etiket görünürlüğünün isteğe bağlı olarak değiştirilip yeniden eğitilmesiyle değiştirilebilir. Sınıflandırıcı ^TH+ nöronları arka plandan güvenilir şekilde ayırt edene kadar yineleme yapın, ardından sınıflandırıcıyı Segmentasyon | Labkit'i kapatmadan önce Sınıflandırıcıyı kaydet .
3. Batch Labkit segmentasyonu
   1. Fiji'deki TH stack klasöründen rastgele bir görüntü açın. Labkit'i başlatın ve Remove All tuşuna tıklayın, ardından önceden eğitilmiş sınıflandırıcıyı Segmentation | Görsel segmentlere ayrılmak için Sınıflandırıcıyı açın . Kaliteyi görsel olarak inceleyerek sınıflandırıcı genellenebilirliğini doğrulayın, sonra pencereyi kapatın.
   2. 2.3.1'i birkaç başka rastgele görüntüde tekrarlayın. Her denetimden sonra pencereyi kapatın, son kontrol hariç.
   3. Bir Labkit çıkış klasörü oluşturun (örneğin, D:\Confocal\LabkitOut). Diğerleri > Toplu Segment Görüntüleri üzerinden toplu işlemeye başlayın. Input Directory'yi TH stack klasörüne, Output Directory'yi Labkit output klasörüne ayarlayın, sonra toplu işlemeye başlamak için OK'ye tıklayın.
   4. Aynı TH antikoru ve benzer konfokal ayarlarla yapılan gelecekteki deneyler için 2.2'yi atlayın ve önceki sınıflandırıcıyı tekrar kullanın.
      NOT: Test amaçlı önceden eğitilmiş bir sınıflandırıcı da sağlıyoruz (Ek Dosya 3).
4. DAPI spot oluşturma ve TH⁺ Nöron nicelendirmesi
   1. XT_Jove_Labkit_TH.m (Ek Dosya 4) bir betik klasörüne (örneğin, D:\scripts) yerleştirilin. 3D yazılımı açın ve Dosya | Tercihler bölümünden sonra Özel Araçlar'ı seçin. XTension Klasör panelinde, Ekle... script klasörü seçip OK'ye tıklayın.
   2. Her dönüştürülmüş dosya için, script otomatik olarak aşağıdaki ardışık işlemleri gerçekleştirir.
      NOT: Bu açıklayıcı bölüm kullanıcı için işlemleri içermez ancak sonraki adımlara geçmek için gereklidir.
      1. DAPI kanalı, optimize edilmiş DAPI nokta tanımlamasını kolaylaştırmak için Arka Plan Çıkarma ve Gauss Filtresi ile işlenir.
      2. Labkit segmentasyon maskesi, ses çıkarma ve delik doldurma ile geliştirilir ve veri setine maske kanalı olarak bağlanır. Maske kanalından rafine bir TH yüzey nesnesi oluşturulur. TH yüzey nesnesi, maske kanalının üzerine yazmak için geliştirilmiş bir maske oluşturur.
      3. TH yüzeyinden bir mesafe dönüşüm kanalı oluşturulur; yüzey içindeki voxeller 0 olarak ayarlanır ve yüzey dışındaki voxeller en yakın TH yüzeyine olan Öklid mesafesini temsil eden yüzer nokta değerleriyle atanır.
      4. Mesafe dönüşüm kanalındaki her DAPI noktasının yoğunluk profilini ^TH+ nöron tanımı için bir metrik olarak kullanın. ^TH+ bölgeleri içinde veya yakınında bulunan DAPI noktalarının mesafe değerleri düşüktür. Bu kriter, kusurlu olmayan bir Labkit önbiçin ön plan bölgesinin hemen dışında ama hemen bitişiğinde bulunan gerçek DA nöron çekirdekleri gibi yanlış negatifleri kurtarmaya yardımcı olur.
   3. DAPI nokta oluşturma için Kalitenin manuel optimizasyonu
      1. 3D yazılımda dönüştürülmüş klasörden rastgele bir örnek açın. Düzenle | Görüntü Özellikleri ve Koordinat panelindeki Voxel Boyutu Z'nin 0.340 μm olup olmadığını doğrulayın. Eğer olmazsa, manuel olarak 0.340 μm'ye değiştirin.
      2. DAPI kanalına arka plan çıkarma uygulamasını uygulayın; Görüntü İşleme | Eşik Belirleme | Arka plan çıkarma. Diyalogda sadece DAPI kanalını işaretleyin, Filtre Genişliği'ni 3'e ayarlayın ve Tamam'a tıklayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve ardından 1 filtre genişliğiyle üçüncü tekrarı yapın.
      3. Gauss düzgünleştirmesini uygulayın, Görüntü İşleme | Yumuşatma | Gauss Filtresi. Sadece DAPI kanalını işaretleyin, Filtre Genişliği'ni 0.2'ye ayarlayın ve OK tuşuna tıklayın.
      4. Surpass Sahnesinde, Yeni Noktalar Ekle seçeneğine tıklayarak Spot oluşturma sihirbazını başlatın. DAPI kanalını seçin ve 1,2 μm Tahmini XY Çapı girin. Sihirbazı takip ederek, "Kalite üzerinde" filtresi ekleyin ve eşiği ince ayarlayarak her çekirdek için doğru bir tek nokta elde edin.
      5. 2.4.3.1–2.4.3.4 adımlarını birkaç rastgele seçilmiş örneklemde tekrarlayın ve örnekler arasında güvenilir şekilde çalışan eşik değerler(leri) kesinleştirin.
   4. Metin düzenleyicide XT_Jove_Labkit_TH.m (Ek Dosya 4) betikini açın ve aşağıdaki kullanıcı tanımlı parametreleri değiştirin.
      1. ims_Folder dönüştürülmüş klasörün yoluna ayarlayın; LabkitOut_Folder Labkit çıkış klasörünün yoluna ayar. Dönüştürülmüş klasördeki tüm dosyalar için Ch_DAPI DAPI kanal indeksine ayarla (örneğin, DAPI birinci kanal ise 1, DAPI ikinci kanal ise 2).
      2. Set reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Eğer Görüntü Özellikleri'nde voxel boyutları doğruysa (bkz. adım 2.4.3.1), cevapları boş parantez halinde bırakın []. Aksi takdirde, dönüştürülmüş klasördeki tüm dosyalara uygulanacak uygun değerleri manuel olarak girin (örneğin, sırasıyla 0.130, 0.130, 0.340).
   5. Spot oluşturma parametrelerini kesinleştirin.
      1. SpotsParameterAss hücre dizisinde her satırın bir versiyonu belirttiği birden fazla parametre versiyonunu özelleştirin. Bu, her satırın sol kısmında DAPI nokta algılanması için Tahmini XY çapının (μm) tanımlanmasını ve her satırın sağ kısmındaki kriter filtre(ler)den oluşan Filtre Dizisi tanımlanmasını içerir; bu filtre(ler) 2.4.3.4.4.4 aşamasından Kalite eşiğini ve/veya 2.4.2.2 aşamasından rafine maske kanalında Yoğunluk eşiğini veya 2.4.2.3 adımından uzaklığa dönüştürülmüş kanalı içerir.
      2. "Yoğunluk Merkezi Ch=aSizeC+1" 0.5'in üstüne ayarlayın, böylece yalnızca geometrik merkezi 2.4.2.2'den itibaren rafine TH maske kanalı içinde olan noktalar tutulur (voxel değeri > 0.5). Bu, ^TH+ DAPI nokta filtreleme için en doğrudan ve katı kriteridir.
      3. "Yoğunluk Ortalaması Ch=aSizeC+2" [eşik] altına ayarlayın; böylece 2.4.2.3. adımdan itibaren mesafe dönüşüm kanalındaki ortalama yoğunluğu belirlenen eşik seviyesinin altına düşen noktalar korunur. Alt eşikler, TH yüzeyinin içinde veya ona çok yakın konumlanmış noktaları seçer; Daha yüksek eşikler ise giderek daha uzaklaşan noktaları içerir. Bu, ^TH+ ataması için kabul edilebilir yakınlığın ampirik kalibrasyonuna olanak tanır.
      4. Önceden yapılandırılmış örnek:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Kalite" 94.5' üzerinde,"Yoğunluk Merkezi Ch=aSizeC+1" 0.5' üzerinde];
         1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0.0001'in altında];
         1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,001' altında];
         1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalaması Ch=aSizeC+2" 0.01' altında];
         ... Script içinde daha fazla filtre kombinasyonu sağlanmıştır.
         };
      5. Aynı TH antikor ve konfokal ayarlarla yapılan gelecekteki deneyler için önceki parametre kombinasyonlarını tekrar kullanın. Spot sayıların gerçek sayılardan önemli ölçüde sapmasına yol açan kötü kombinasyonları silin, böylece gereksiz hesaplama yükünü azaltın.
   6. Parti spot oluşturma
      1. Yukarıdaki tüm değişiklikleri scripte kaydedin XT_Jove_Labkit_TH.m. Yeni bir 3D yazılım penceresi açın. Menüye tıklayın Görüntü İşleme | PAM_TH_processing scripti toplu olarak çalıştırmak gerekiyor.
      2. Başlangıçta, her filtre kombinasyonu için betik, parametrelerini yansıtacak şekilde adlandırılan bir Spots nesnesi oluşturduğunu ve dönüştürülmüş klasörden gelen dosyaların yeni bir çıktı klasöründe kopya olarak işlenip "işlendi" eki olarak kaydedildiğini gözlemleyin. O zaman bilgisayarı gözetimsiz bırak.
      3. Tamamlandıktan sonra bir tablo oluşturulur. Dosya adlarını içeren ilk sütunu, sonraki sütunlarda ise her filtre kombinasyonuna karşılık gelen DAPI nokta sayılarını ve sütun başlıklarının Tahmini XY çapı ve kullanılan Filtre Dizisi gösterildiğini gözlemleyin.
   7. Sonradan işlem doğrulaması
      1. 2.4.6 adımı tamamlandıktan sonra, "işlenmiş" klasörden birkaç rastgele dosyayı manuel olarak açın ve orijinal TH kanalıyla üst üste binmiş farklı Spots nesnelerini inceleyin. Görsel incelemeye dayanarak, gerçek ^TH+ nöron sayılarının en sadık temsilini veren bir veya iki optimal filtre seçin. Hesaptan ilgili sütunları aşağı yönlü istatistiksel analiz ve şekil hazırlamak için dışa aktarın.
      2. Tercih edilen filtre kombinasyonlarındaki nokta sayısı hatalarını düzeltmek için, Surpass sahnesinde ilgili Spots nesne(lerini) seçin ve Düzenle sekmesine tıklayın. Hatalı noktaları manuel olarak kaldırabilir veya gerektiğinde eksik noktaları ekleyerek Shift tuşuna basıp ekrana tıklayarak ekleyin. Güncellemeleri Store as/Export as/Save as ile kaydederek aynı dosya adıyla "işlenmiş" klasördeki ilgili dosyanın üzerine yazabilirsiniz.
         NOT: Spots nesnelerini silmek, eklememek, yeniden adlandırmak veya sürüklemek/yeniden konumlandırmak gerekçesi—sadece tercih edilen noktaları düzenleyin. Alfabede herhangi bir değişiklik gerekmez; Sadece betiği tekrar çalıştırın ve manuel iyileştirmeleri yansıtan güncellenmiş bir tablo anında oluşturulur. Tutarlılık için ya hiçbirini düzenlenmiş bırakın ya da deneydeki tüm örnekler için tercih edilen Spots nesne(ler)ini düzenleyin.

Sonuçlar

Yazılımdan toplanan ham veriler halka açık bir depoya depolanmış ve aşağıdaki DOI adresinden erişilebilir durumda: 10.5281/zenodo.19814348. Bu yarı otomatik nicelik hattının kullanımını göstermek için, insan α-sinuklein'in pan-nöron ifadesini (nSyb-QF2>QUAS-SNCA) kullanarak iyi kurulmuş bir Drosophila PD modeline uyguladık. Kontrol sinekleri yalnızca nSyb-QF2 sürücüsünü barındırıyordu. Her iki genotip de 3 hafta boyunca 29 °C'de yaşlandırıldı, ardından beyinler diseksiyon edildi, TH için immünboya alındı ve PAM kümesi için görüntülendi. Şekil 3E'de gösterildiği gibi, yarı otomatik boru hattı, α-sinuklein ifade eden sineklerde kontrollere kıyasla PAM TH⁺ nöron sayısında anlamlı bir azalma tespit etti (Student's t-testi, p < 0.0001), bu da yöntemin aynı deneysel partide genotipe bağlı farklılıkları yakalayabildiğini gösterdi. Aşağıdaki bölümler, montaj yapılandırmasını (Şekil 1), Labkit eğitim arayüzünü (Şekil 2) ve bu niceltiyi mümkün kılan görüntü işleme adımlarını (Şekil 3) açıklar.

Şekil 1, diseksiyona uğramış Drosophila beyinlerinin montaj konfigürasyonunu ve bunun PAM küme görüntülemesi üzerindeki etkisini göstermektedir. Diseksiyondan sonra, beyinler zaman zaman kopmuş ventral sinir kordonuna bitişik dokunun eğilmesi veya yukarı eğilmesi görülür. Beynin ventral kısmındaki bu kaldırma, stereoskop altındaki perspektifi değiştirir; bu da dorsal konturdaki stereotipik oluk projeksiyonunun değişmesine ve ventral işaretlerin göreli perspektifinde fark oluşmasına yol açar. (Şekil 1B,C). Bu deformasyon genellikle beynin vücuttan ayrıldığı anda meydana gelir. Bu tür deformasyon, montaj sırasında PAM kümesinin yönelimini etkiler ve dolayısıyla gerekli Z-yığını derinliğini etkiler (Şekil 1C,D). Optimal montaj koşullarında, tek katmanlı Scotch bant aralayıcı merkezi beyin bölgesinde yeterli bir sıkıştırma oluşturur ve dorsal konumda bulunan PAM kümesinin örtü kuşağının hemen yanında yatay bir yön almasına neden olur. Bu yapılandırma, 0,34 μm aralıklarla 15–25 dilimden oluşan Z-yığınları verir (Şekil 1D). Diğer durumda, PAM kümesi eğik bir konum tutar ve bu da daha derin Z-yığınlarının olmasını gerektirir (Şekil 1D). Benzer şekilde, çift katmanlı bant aralığı kullanımı yeterli sıkıştırma sağlamaz; bu da PAM kümesinin doğal, eğik konformasyonunda kalır ve Z-yığını derinliğini artırır (Şekil 1D). Şekil 1E, TH boyalı Z-yığınlarının hem optimal konumlanmış hem de eğimli koşullarda temsil eden yansal projeksiyon görünümlerini gösterir.

Şekil 2, Labkit kullanıcı arayüzünü ve temsilci bir eğitim iş akışını sunmaktadır. Tek bir örnekte sadece birkaç seyrek karalama açıklaması ile (Şekil 2A), başlangıç piksel sınıflandırıcı zaten oldukça makul bir segmentasyon üretir (Şekil 2B). Ancak, bu kadar minimal annotasyonun tüm veri seti boyunca sağlam ve genelleştirilebilir performans için yeterli olmadığını vurgulamak önemlidir. ^TH+ nöronlarını tam veri seti boyunca güvenilir şekilde segmentlere ayıran bir sınıflandırıcı oluşturmak için çok daha yinelemeli etiketleme—birden fazla Z-dilim, örnekler ve boyama varyasyonlarını kapsayan—gereklidir. Özellikle, çoklu eğitim görüntüleri Z ekseni boyunca üst üste yığılmak yerine zaman (çerçeve) boyutu boyunca birleştirilir. Bu tasarım, her bireysel beyin hacminin mekansal bütünlüğünü korur ve 3D filtre çekirdeklerinin yalnızca biyolojik örnekler içinde—içinde değil—çalışmasını sağlar. Örnekler dikey olarak tek bir kalın Z-yığına yığılırsa, bitişik örnekler arasındaki sınırlardaki Z-dilimler mekânsal olarak birbirine bitişik hale gelir ve farklı beyinlerden gelen voxeller komşu yapılar olarak ele alınır ve gereksiz manuel düzeltmeler riskini artırır (Şekil 2C). Zaman ekseni boyunca birleştirme, bu tür çapraz örnek kirlenmelerini önler ve yine de tek bir Labkit oturumunda verimli, çok numuneli eğitimi mümkün kılar.

Şekil 3, işlem sonrası üretim hattı ve nihai nicelik sürecini göstermektedir. Ham Labkit segmentasyon maskeleri (Şekil 3A) çok sayıda küçük sahte pozitif benek ve iç delik içerir. Morfolojik denoizasyon ve delik doldurma işlemleri uygulandıktan sonra (Şekil 3B), düzleştirilmiş bir TH yüzeyi oluşturulur ve rafine bir ikili maske oluşturmak için kullanılır (Şekil 3C). Bu iyileştirmenin elde ettiği iyileştirme, ilk ve son maskeleri karşılaştıran bir üst katman olarak görselleştirilir (Şekil 3D, üst). Özellikle, bazı TH açısından zengin nöurit bölgeleri ara sıra son maskede korunur; ancak bu alanlar neredeyse her zaman DAPI boyalı çekirdeklerden yoksundur ve bu nedenle nihai nöron sayımlarına önemsiz katkı sağlar. İleri kullanıcılar, bu tür kalıntı artefaktların ortadan kaldırılmasını ince ayarlamak için sunulan toplu işleme betikindeki morfolojik parametreleri daha da ayarlayabilirler. Şekil 3D (altta), maksimum yoğunluk projeksiyonundan TH kanalı (yeşil) üzerine bindirilmiş son DAPI noktalarını (magenta) göstermektedir. Şekil 3D ayrıca, pipeline'ımızda zaman zaman gözlemlenen nadir bir yanlış pozitif türü de ortaya koymaktadır: TH açısından zengin bir nöurit bölgesinde bulunan DAPI lekeli bir çekirdek, nöurit sinyali çekirdekle güçlü şekilde örtüştüğünde yanlış bir TH⁺ noktası olarak sınıflandırılabilir. Ancak, Şekil 3C'de gösterildiği gibi, nöritlerin civarındaki DAPI-pozitif çekirdekler genellikle seyrektir. Ayrıca, bu nörit bölgelerinin yakınında bulunan birkaç DAPI sinyali genellikle doğru şekilde gerçek negatif olarak sınıflandırılır (yani TH⁺ olarak sayılmaz), çünkü boru hattı tarafından yanlış tanımlanmaz. Şekil 3E, yöntemin pratik faydasını göstermektedir: 3 haftalık nSyb-QF2>SNCA sinekleri, birden fazla filtre boyunca nSyb-QF2 kontrollerine kıyasla PAM ^TH+ nöron sayısında anlamlı bir azalma gösterir (Öğrencinin t-testi, p < 0.0001). Mutlak nokta sayımları farklı filtre kombinasyonlarında değişiklik gösterse de yöntem mükemmel tek nokta doğruluğunu sağlamasa da, deneysel ve kontrol grupları arasındaki göreceli fark sağlam kalır. Test edilen birden fazla filtre için, grup karşılaştırmasının istatistiksel sonucu büyük ölçüde aynı deneysel parti içindeki filtreler arasında korunur. Buna göre, çıktı, PAM nöronların hatasız mutlak sayısı yerine toplu toplu karşılaştırmalı bir okuma olarak yorumlanmalıdır.

Şekil 1. Drosophila beyin diseksiyonu ve montaj konfigürasyonu. (A) Beyin montaj montajının şematik diyagramı. Sarı çubuklar Scotch tape aralayıcılarını temsil eder. Büyütülmüş bir beyin şeması, PAM kümesinin yaklaşık konumunu (mor) gösterir. (B) A'daki kesik düzleme ile uyumlu yan kesitsel şemalar; diseksiyon sonrası iki yaygın beyin morfolojisini gösterir: optimal konumlanmış (üst) ve eğik (aşağı). (C) İki disseksiye edilmiş sinek beyni stereoskop altında bakılır: optimal konumda (sol) ve eğimli (sağ). Sarı oklar, dorsal kontur boyunca stereotipik yırtığı gösterir. Mavi kesik çizgiler, ventral yarımın sol ve sağ taraflarında karşılık gelen iki simge noktayı birbirine bağlar. Mavi oklar, bu ventral işaretlerin göreli perspektifindeki değişimi vurgular. Ölçek çubuğu = 500 μm. (D) Beyin morfolojisi ve bant aralayıcı kalınlığının (tek ve çift katmanlı) PAM kümesinin dikey konumlanmasını ve dolayısıyla gerekli Z-yığını derinliğini nasıl etkilediğini gösteren şematik illüstrasyon. (E) Optimum konumlanmış (üst) ve deforme edilmiş (alt) montaj koşullarından TH boyalı konfokal Z-yığınlarının temsil yan görünümleri (Y projeksiyonu). Ölçek çubuğu = 5 μm. Kısaltma: PAM = protoserebral anterior medial. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Laboratuvar seti eğitimi ve etkileşimli segmentasyon. (A) Labkit grafik kullanıcı arayüzü. Annotasyonlar (karalamalar) iki sınıfta gösterilir: ön plan (kırmızı) ve arka plan (mavi). (B) A'da gösterilen karalamalar üzerinde eğitimden hemen sonra oluşturulan segmentasyon sonucu. Kırmızı ön plan rengini gösterir; Mavi, arka plan rengini gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Bitişik Z-dilimler arasında çapraz iletişim Farklı sinek beyinlerinden gelen floresan protein işaretli mitokondrilerin tek dilimli görüntüleri Z ekseni boyunca birleştirildi. 1. ve 3. dilimler aynı görüntünün aynı kopyalarıdır, 2. ve 4. dilimler ise farklı beyinlerden gelir. Sarı oklar, tahmin 2. dilimden 1. dilime sızıyor. Yeşil oklar, 4. dilimden 3. dilime tahmin sızması. Ölçek çubuğu = 3 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Labkit segmentasyon maskelerinin ve ^TH+ nöron niceliklerinin sonradan işlemesi. (A) Ham Labkit ikili maskesi (gök göbeği, üst) ve orijinal TH kanalı (alt) ile üst örtü. Bol miktarda küçük benekler ve nöron hücre vücutlarında eksik dolgu görülür. (B) Morfolojik denoizasyon ve delik doldurmadan sonra maske (magenta, üst); TH kanalı (altta) ile örtülen bir örtü. (C) B için düzleştirilmiş TH yüzeyinden rafine ikili maske (kırmızı, üst) ve yeniden maskeleme; TH kanalı (altta) ile örtülen bir örtü. (D) Üst: Ham (mavini) ve rafine (kırmızı) maskelerin üst üste örtülmesi, sonradan yapılan işlemlerle düzeltilmiş bölgeleri vurgulamak. Alt: Maksimum yoğunluk projeksiyonu, son DAPI noktalarını (magenta) TH kanalının üzerine (yeşil) üstüste bindiriyor. Sağ üst köşedeki iki noktanın kontralateral PAM kümesinden kaynaklandığını unutmayın. Filtre 4 illüstrasyon için kullanıldı. (E) Parkinson hastalığı modelinde birden fazla filtre kombinasyonu kullanılarak nicel doğrulama. Üç haftalık nSyb-QF2>SNCA (PD modeli) sinekleri, çoklu filtrelerde (yukarıda) nSyb-QF2 kontrollerine kıyasla PAM ^TH+ nöron sayısında anlamlı bir azalma gösterir (üstte). Ham veriler bir tabloda (altta) sağlanır. filtre 1: 1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,0001'in altında]; filtre 2: 1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde, "Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0.001' altında]; filtre 3: 1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,01'in altında]; filtre 4: 1.2, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,05' altında]; filtre 5: 0.6, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,001' altında]; filtre 6: 0.6, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,01' altında]; filtre 7: 0.9, ['"Kalite" 94.5'in üzerinde,"Yoğunluk Ortalama Ch=aSizeC+2" 0,01' altında]; n = 57 beyin (kontrol), n = 65 beyin (PD); Öğrencinin t-testi, p < 0.0001 (****). Sinekler 29 °C'de yetiştirildi. Ölçek çubukları = 5 μm (M–D). Veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Fiji makrosu, dönüştürülmüş görüntü dosyalarından TH kanalını ayırmak ve çıkış yığınlarını kaydetmek için.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. Z-yığınlarını ortak bir Z-dilim derinliğine kırpmak ve bunları Labkit sınıflandırıcı eğitimi için zaman geçişli TIFF dosyasına birleştirmek için Fiji makrosu.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3. PAM TH segmentasyon iş akışını test etmek için kullanılan önceden eğitilmiş Labkit sınıflayıcısı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4. Labkit maskelerinin toplu işlemesi, DAPI noktaları oluşturması, filtre kombinasyonları uygulanması ve ^TH+ nöron sayılarının dışa aktarılması için MATLAB scripti.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Drosophila PAM kümesindeki DA nöronlarının nicelendirilmesi tarihsel olarak büyük bir zorluk olmuştur. Burada, makine öğrenimi tabanlı piksel sınıflandırmasını görüntü analiz yazılımıyla entegre eden yarı otomatik bir iş akışı sunuyoruz ve bu uzun süredir devam eden sorunu ele alıyoruz. Bu yöntem, aynı deney içindeki gruplar arasında PAM kümesindeki ^TH+ nöronlarındaki varyasyonların toplu düzeyde tespit edilmesini sağlar ve Parkinson hastalığı modellerinde karşılaştırmalı çalışmaları^{destekler 18}.

Bir deney için optimal filtre seçilirken, kullanıcılar ya ham görüntülerin görsel incelemesine en uygun filtreyi seçebilir ya da literatürdeki bildirilen vahşi tip PAM nöron sayılarının ortalama aralığına ve/veya ortalamasına başvurabilirler^12,13. Ancak dikkatli olmak gerekir: sadece iki çalışma PAM kümesi sayıları rapor etmiş, hiçbiri PD ile ilgili değildir ve bildirilen değerler önemli tutarsızlık göstermektedir. Ayrıca, standart sapma yaşla artabilir ve bu da çapraz karşılaştırmaları daha da karmaşıklaştırabilir. Bu nedenle, literatür temelli referanslar sadece kaba bir rehber olarak kullanılmalıdır, mutlak bir standart olarak değil. Bu boru hattının hatasız mutlak sayım sağlamadığını kabul ediyoruz (Şekil 3D). Ancak, karşılaştırmalar aynı deneysel parti içindeki gruplarla sınırlı olduğu sürece (yani farklı partiler arasında tek bir grafikte veri toplanmadığı sürece), yöntem bir parti içindeki genotipler veya tedavi koşulları arasındaki göreceli farkları tespit etmek için kullanılabilir.

Deneyimimize göre, AF488 ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar yüksek arka plan nedeniyle kaçınılmalıdır ve AF546 ise Z ekseni boyunca daha yüksek sinyal zayıflaması nedeniyle kaçınılmalıdır. Ayrıca, kapsamlı DAPI kuluçka ve yıkama işleminin, yüksek sinyal-gürültü oranı ve net nükleer sinyaller elde etmek için kritik olduğunu, bu da otomatik segmentasyonun performansını doğrudan etkilediğini bulduk. DAPI, bu uygulama için Hoechst'e tercih edilir, çünkü heterokromatinin tercihli boyaması daha parlak ve keskin tanımlanmış nükleer noktalar oluşturur ve daha doğru tespiti kolaylaştırır.

Yaygın arıza modları için sorun giderme tartışması

Boyayla ilgili arızalar. Diseksiyon becerisi, veri kalitesinin önemli belirleyicisidir. PAM kümesi yüzeysel olarak konumlanır ve iki trakeal kese ile yağ vücut dorsalını bu bölgeye çıkarırken kolayca zarar görür. Pensler, PAM bölgesinin delinmesini veya sıkışmasını önlemek için dikkatli tutulmalıdır. Ventral deformasyon genellikle ventral sinir kordonunun kesildiği anda meydana gelir ve cam kaydırağa yerleştirildiğinde beynin eğilmesine veya kıvrılmasına neden olur; bu deformasyon, PFA kuluçkasından sonra kalıcı olarak sabitlenebilir. Kullanıcılar, kesim sırasında en uygun tekniği bulmak için forseps açılarıyla denemeler yapmalıdır. Diseksiyon sonrası eğimlik gözlemlenirse, yükseltilmiş bölgeye hafif baskı deformasyonu tersine çevirebilir (sıkıştırılmış alan ilgi çekici bölge değilse kabul edilebilir).

Segmentasyon hataları. Zayıf segmentasyon genellikle yeterince çeşitli eğitim verilerinin olmamasından kaynaklanır. Labkit sınıflandırıcısı, partideki tüm boyama kalitesi aralığını kapsayan, en iyi, ortalama ve en kötü olanları kapsayan temsil edici bir görüntü seti üzerinde eğitilmelidir. Yinelemeli düzeltme sırasında, güvendiğiniz yanlış pozitif ve yanlış negatifleri not etmeye öncelik verin. Belirsiz veya belirsiz bölgeleri düzeltmekten kaçının, çünkü bu sınıflandırıcıyı yanıltabilir ve performansı düşürebilir.

Nokta algılama hataları. Parametre optimizasyonu, temsil örneklerin küçük bir alt kümesi üzerinde sistematik bir araştırma gerektirir. Farklı tahmini nokta çapları ve Kalite filtre eşiği veya bu protokolde kullanılan "Kalite yukarıda" filtrenin ötesinde filtre türlerini test edin. Spot oluşturma sihirbazı çeşitli filtreleme seçenekleri sunar (örneğin, yoğunluk). Kullanıcılar, filtre eşiklerini ve türlerini kendi veri setlerine uyarlamaları ve toplu işlemeden önce ampirik ayar yapmaları teşvik edilir.

PAM küme nöronları için manuel sayma neden olağanüstü zor olmaya devam ediyor? PAM kümesi, geleneksel manuel sayım yöntemlerini yetersiz kılan benzersiz anatomik ve boyama özellikleri sunar. Birincisi, Drosophila dopaminergik nöronların sitozolündeki TH immünfloresansı ağırlıklı olarak büyük, lekelenmemiş bir nükleer boşluğu çevreleyen ince bir sitoplazmik halkayı işaretler. Sonuç olarak, DAPI boyalı çekirdek ile ^TH+ sitoplazmik bölmesi minimum mekânsal örtüşme gösterir. Bu temel kolokalizasyon eksikliği, doğrudan "TH maskesinde DAPI noktası" sınıflandırma stratejisini engeller. İkinci olarak, PAM kümesi, üç boyutlu, üzüm benzeri bir mimaride düzenlenmiş 100'den fazla yoğun şekilde paketlenmiş nörondan oluşur. Konfokal Z-yığınlarında ilerlerken, nöronlar yavaş yavaş ortaya çıkar ve kaybolur—bazıları düzleme girer, bazıları dışarı çıkar—yüksek bilişsel yük ve önemli gözlemciler arası değişkenlik oluşturur. PAM DA nöronları nicelleştiren en son çalışma, ImageJ'nin hücre sayacı eklentisi kullanılarak manuel saymaya dayanıyordu. PPM1/2 veya PPL1 gibi küçük kümeler için tamamen uygun olsa da, bu yaklaşım PAM kümesinde uygulandığında, özellikle onlarca veya yüzlerce örnek gerektiren çalışmalarda aşırı emek yoğun hale gelir.

Labkit'in rastgele orman mimarisi neden TH nöron segmentasyonu için özellikle uygun? Labkit, TH boyalı PAM küme görüntülerinin özel zorluklarına son derece iyi uyum sağlayan, rastgele orman tabanlı piksel sınıflandırıcı uygular. Algoritma, her piksel için kapsamlı bir özellik vektörü hesaplar; bunlar arasında Gauss bulanıklığı, Gauss farkı, Gauss gradyan büyüklüğü, Gauss gradyanı büyüklüğü ve Hessen özdeğerleri de vardır — her biri birden fazla sigma ölçeğinde (1, 2, 4, 8) değerlendirilir. Bu çok ölçekli özellik çıkarımı, nükleer iç mekanı hücre dışı arka plandan ayıran tekstel ve kenar özelliklerini etkili bir şekilde yakalar. Önemli olarak, rastgele ormanlar derin öğrenme yaklaşımlarına göre çok daha az eğitim verisi gerektirdiğinden, kullanıcılar sınıflandırıcıyı 20–40 temsil görüntü kadar az sayıda karalama notlarıyla yinelemeli olarak geliştirebilirler. Her iterasyon, topluluğa yeni karar ağaçları ekliyor ve bu ağaçlar topluca her pikseli sınıflandırmak için oy kullanıyor. Bu süreç, boyama ve görüntüleme koşullarında partiden partiye değişkenliği doğal olarak barındırır— bu, Drosophila genetik çaprazlamaları ve yaşlanma çalışmalarındaki biyolojik değişkenlik göz önüne alındığında kritik bir avantajdır. Bu yaklaşımla, α-sinuklein eksprese eden Parkinson modellerinde ^TH+ nöron kaybı tespit edilebilir ve genetik güçlendiriciler ile baskılayıcıların PAM küme nöron sayıları üzerindeki etkileri deneysel bir parti içinde karşılaştırılabilir.

Önemli olarak, eğitim amacıyla kırpılmış yığınlar Z ekseni boyunca değil, zaman boyutu boyunca birleştirilir. Bu tasarım seçimi, optimal sınıflandırıcı eğitimi için kritiktir. Labkit'in 3D piksel sınıflandırması, ardışık Z-dilimleri boyunca voxel bilgisini dikkate alır; bu, PAM nöron morfolojisini tanımlayan ince, sitoplazmik TH halkasını doğru şekilde çözmek için gereklidir. Bireysel örnekler dikey olarak tek, ultra kalın bir Z-yığına yığılırsa, bitişik örnekler arasındaki sınırlardaki Z-dilimleri yığında mekansal olarak birbirine bitişik hale gelir. Sonuç olarak, farklı biyolojik örneklere ait voxeller, aynı üç boyutlu hacim içinde komşu yapılar olarak ele alınır. Etkileşimli eğitim sırasında, böyle bir sınıra yakın çizilen bir karalama, yanlışlıkla iki farklı örnekten özellikleri aynı anda yakalayabilir ve sınıflandırıcıyı karıştırabilir (Şekil 2B, oklar). Ayrıca, bir örnekten çıkan yanlış pozitif sinyaller bitişik örneğin hacmine yansıtılabilir ve bu da sonraki eğitim yinelemelerinde yanlışlıklı düzeltici karalamalara yol açabilir ve biyolojik olarak anlamsız kuralları kodlayan karar ağaçları oluşturur. Zaman ekseni boyunca örneklerin birleştirilmesi, her bireysel hacimin mekansal bütünlüğünü korur; böylece 3D filtre çekirdekleri yalnızca biyolojik örnekler içinde—içinde—üzerinde değil—çalışabilir, aynı zamanda tek bir Labkit oturumunda verimli, çoklu numune eğitimini mümkün kılar.

Metodolojik değerlendirmeler ve sınırlamalar

Birkaç önemli uyarı tartışmayı hak ediyor. Birincisi, bu protokol özel olarak PAM kümesi için optimize edilmiştir ve diğer DA kümelerine (örneğin, PPM1/2/3, PPL1) veya optik loblardaki ^TH+ nöronlara genelleştirilmez. PAM bölgesi, nispeten seyrek DAPI yoğunluğundan faydalanır; çekirdekler üç boyutlu uzayda iyi ayrılmış, bu da sağlam ve net DAPI nokta algılamaya olanak tanır. Buna karşılık, bu iş akışı PPL1 veya PPM1/2 gibi diğer DA kümelerine kolayca aktarılamaz. Bu bölgelerde, nöritlerin DAPI boyalı çekirdekleriyle yan yana konumlanma veya üst üste binme olasılığı daha yüksektir. Bu küçük kümelerdeki DA nöron sayısının çok düşük olması (genellikle küme başına 10 hücreden az) göz önüne alındığında, birkaç yanlış sınıflandırma bile orantılı olarak büyük hatalara yol açabilir ve bu tür uygulamalar için yöntemi daha az güvenilir hale getirir. İkinci olarak, TH immünboyama ayrıca nöripitleri ve nöropil içindeki aksonal projeksiyonları da işaretler. Eğitim sırasında düzeltici açıklamalara rağmen, bu fiber kanallar zaman zaman güçlü TH sinyalleri üretir ve sınıflandırıcı tarafından ön plan olarak yanlış sınıflandırılabilir. Ancak, PAM kümesindeki bu bölgeler neredeyse her zaman DAPI boyalı çekirdeklerden yoksundur; bu nedenle, PAM kümesinin nöurit açısından zengin bölgesindeki yanlış pozitif vokseller, nihai nöron sayımlarına minimum katkı sağlar. Üçüncüsü, Labkit'in piksel sınıflandırması, sonlu bir çevre içindeki yerel doku özellikleri üzerinde çalışır (varsayılan filtre çekirdekleri yaklaşık 16 × 16 piksel pencereye yanıt verir). Bu tasarım, hesaplama verimliliğini sağlar ve gerçek zamanlı etkileşimli segmentasyonu mümkün kılar, ancak sınıflandırıcının küresel anatomik bağlamdan yararlanamayacağı anlamına gelir. Sonuç olarak, eğitim setinden önemli ölçüde sapan nadir eserler veya lekelenme düzensizlikleri vaka bazında küralanmaya ihtiyaç duyabilir. Son olarak, burada tanımlanan toplu işleme boru hattı—Labkit segmentasyonunu DAPI nokta algısı ve mesafe dönüşümü ile entegre ederek—birden fazla çıkış kanalı ve filtre kombinasyonu üretir. Kullanıcılar, bu protokolde sunulan varsayılan eşikleri eleştirel olmadan benimsemek yerine, kendi özel deneysel koşulları için optimal filtre parametrelerini sistematik olarak doğrulamalıdır.

Gelecek uygulamalar

Burada gösterilen PD modelinin ötesinde, bu yarı otomatik boru hattı, öğrenme ve hafıza, motivasyon, uyku düzenlemesi ve yaşa bağlı nörodejenerasyon çalışmaları dahil olmak üzere, PAM kümesi DA nöron nicelendirilmesini içeren herhangi bir Drosophila modeline doğrudan uygulanabilir. Özellikle, bu yöntemin toplu işleme kapasitesi şu amaçlar için uygun olabilir: (1) Orta ve yüksek verimli ilaç taramaları: Birden fazla nöroprotektif bileşiğin dozlar arasında test edilmesi, manuel sayma çabasında orantılı bir artış olmadan daha uygulanabilir hale gelir. (2) Genetik değiştirici taramalar: α-sinuklein toksisitesini artıran veya baskılayıcıları belirlemek için yüzlerce genetik çaprazlamada (örneğin, RNAi çizgileri, aşırı ifade çizgileri) PAM nöron sayılarının nicelendirilmesi. (3) Boylamasına yaşlanma çalışmaları: PAM nöron kaybının birden fazla zaman noktasında ve manuel sayma yükünü azaltarak takip edilmesi. Ayrıca, Labkit tabanlı segmentasyon iş akışı sadece TH boyama ile sınırlı değildir; uygun yeniden eğitimle, PAM kümesiyle iki temel özelliği paylaşan Drosophila beynindeki diğer nöronal popülasyonları nicelikle ölçemek için uyarlanabilir: DAPI boyalı çekirdeklerin nispeten düşük yoğunluğu ve nörit boyamadan kaynaklanan minimum parazit. Labkit ve burada kullanılan 3D yazılımın ötesinde, bu ürün hattının genel mantığı—makine öğrenimi tabanlı piksel sınıflandırması, ardından nokta algılama ve mesafe dönüşümü—diğer desteklenen 3D görüntü analiz platformlarında da uygulanabilir, böylece daha geniş araştırma topluluğu için erişilebilirliği ve esnekliği artırılır.

Özetle, PAM kümesi TH⁺ nöron sayılarındaki grup farklarını tespit etmek için yarı otomatik bir iş akışı sunuyoruz. Labkit tabanlı piksel sınıflandırmasını nokta algılama ve mesafe dönüşümü ile birleştirerek, bu yöntem aynı partideki deneysel ve kontrol grupları arasında TH⁺ nöron sayılarının karşılaştırılmasını sağlar ve örneklem büyüklüğü arttıkça manuel sayma yükünü azaltır. Onlarca ile yüzlerce örnekten ölçeklendirme, hesaplama süresini orantılı olarak artırır, ancak ek manuel çaba esas olarak dosya organizasyonu ve kalite nokta kontrolüyle sınırlıdır. PAM kümesi bugüne kadar PD araştırmalarında çok az ilgi görmemiş olsa da, bu büyük ölçüde biyolojik önemsizlikten ziyade teknik sınırlamalardan kaynaklanmaktadır. Pratik bir nicelendirme aracı sunarak, protokolümüz gelecekte PAM nöronların PD modellerinde nasıl ve nasıl bozulduğunu araştırmayı kolaylaştıracak ve koklama eksikliği ile motivasyon düşüşü gibi motor dışı semptomlara potansiyel katkılarını araştıracaktır. Bu protokolün, Drosophila model sisteminde dopaminergik nörodejenerasyon, sinaptik plastisite ve nöroprotektif ilaç taramasının toplu düzeyde karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştıracağını öngörüyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D görüntü işleme yazılımı - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Bu çalışmada kullanılan 3D görüntü analiz yazılımı
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Mühendislik Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Dumont cımbız Styple 3C Dumoxel, 0.04/0.08 mm	Elektron Mikroskopi Bilimleri	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 konfokal	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Küçük Pimler, Paslanmaz Çelik, 0,15 mm Çapta	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Normal Keçi Serumu, Liyofilize Katı	Sigma-Aldrich	566380
Sayısal hesaplama yazılımı - Python	Python	3.8+
Sayısal hesaplama yazılımı - Matlab	Matematik çalışması	R2016a+	Bu çalışmada kullanılan sayısal hesaplama yazılımları
Oktilfenol Etoksilat (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
PBS'de %4 paraformaldehit çözeltisi	Santa Cruz Biyoteknolojisi	SC-281692
Polistiren Hücre Kültürü Kabı	Nest Scientific	706001
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
Tavşan anti-tirozin hidroksilaza (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	S2002
Stereoskop	Olympus	SZ51
Sterican Einmalkanü len 27 G grau 0.40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Şırınga, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Şeffaf yapışkan bant	3M Scotch 600, temiz	600