$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Analiz iş akışına genel bakış
Bu çalışmanın transkriptomik ve makine öğrenimi tabanlı analizinin genel tasarımı, temel adımları kapsayan Şekil 1'de gösterilmiştir: Renin-Anjiotensin Sistemi ile ilişkili genlerin (RASRG) toplanması; hipertansiyon veri setlerinden RAS ile ilişkili farklı ekspresyon genlerin (RASRDEG) taraması; fonksiyonel zenginleştirme analizi (GO/KEGG/GSEA); bağışıklık sızma analizi (CIBERSORT); protein-protein etkileşimi (PPI) ve düzenleyici ağların inşası; makine öğrenimi tabanlı anahtar gen seçimi (lojistik regresyon, rastgele orman [RF]); ve hipertansiyon tanı modelinin değerlendirilmesi. Bu çalışmada kullanılan yazılım, veritabanları ve çevrimiçi araçların tam listesi Materyaller Tablosu'nda sunulmaktadır.
Veri indirme
Hipertansiyon veri setleriGSE75360 8 ve GSE74144 (Homo sapiens), GEOveritabanı 10'dan R paketi GEOquery9 üzerinden elde edilmiştir. GSE75360 periferik kan mononükleer hücrelerinden (platform: GPL10558) türetildi, 10 hipertansiyon ve 11 kontrol örneği içeriyordu; Beyaz kan hücrelerinden (platform: GPL13497) türetilen GSE74144 14 hipertansiyon ve 8 kontrol örneği içeriyordu (Tablo 1). Protein kodlayan RASRG'ler (1.264) başlangıçta GeneCards11 (anahtar kelime: "Renin-Anjiotensin Sistemi") ve PubMed (anahtar kelime: "Renin-Anjiotensin Sistemi") ile tanımlanmıştır12,13. Bu RASRG'lerin GSE75360/GSE74144 genleriyle kesişimi 1.159 nihai RASRG14 elde etti. İki veri seti ayrı ayrı işlenmiş çünkü farklı mikroarray platformlarında üretilmiştir. Prob notasyonu, ilgili GPL platform notasyon dosyalarına göre yapıldı ve sonraki analizler için normalize edilmiş gen ifade matrisleri kullanıldı. Kutu grafikleri, normalizasyon öncesi ve sonrası ifade dağılımlarını karşılaştırmak için kullanıldı.
Hipertansiyonla ilişkili renin-anjiyotensin ile ilgili farklı şekilde ekspresyon edilen genler
GSE75360 veri setindeki örnekler hipertansiyon grubu ve kontrol grubu olarak kategorize edildi. Limma yazılımı, iki grup arasında farklı gen ekspresyonu analiziyapmak için kullanıldı 14; farklı ekspresyon genler (DEG) |logFC| eşiği ile tanımlandı. > 0,45 ve p-değeri < 0,05. Bu diferansiyel analizin sonuçları, R paketi ggplot2 kullanılarak oluşturulan volkan grafikleri aracılığıyla görselleştirildi.
RASRDEG'leri elde etmek için, yukarıdaki eşik değerini karşılayan DEG'ler (|logFC| > 0.45, p-değeri < 0.05) RAS ile ilgili genlerle (RASRG) çapraz referans yapıldı ve kesişim sonucu bir Venn diyagramı aracılığıyla sunuldu. Daha sonra, tanımlanan RASRDEG'lerin ifade desenleri R paket pheatmap kullanılarak bir ısı haritası olarak görselleştirildi ve RASRDEG'lerin kromozomal lokalizasyonu, R paketi RCircos15 kullanılarak oluşturulan kromozom haritalarıyla gösterildi.
Farklı şekilde ifade edilen gen doğrulaması ve ROC eğrisi analizi
GSE7536016'da hipertansiyon/kontrol arasındaki RASRDEG ifade farklarını analiz etmek için bir gruplar arası grafik oluşturuldu; R paketi pROC ROC eğrilerini çizmek ve RASRDEG tanısal etkinliği için AUC (0.5–0.7: düşük doğruluk; 0.7–0.9: orta; >0.9: yüksek) hesaplamak için kullanıldı.
Korelasyon analizi
Spearman'ın korelasyon analizi GSE75360'de RASRDEG ifadesi üzerinde gerçekleştirildi; sonuçlar ısı haritası (R paketi ggplot2) ile görselleştirildi (|r| < 0.3: zayıf/yok; 0.3–0.5: zayıf; 0.5–0.8: orta; >0.8: güçlü).
GO ve KEGG'nin zenginleştirme analizi
GO (Gen Ontolojisi, 2024 sürümü, http://geneontology.org/), biyolojik süreçler (BP), hücresel bileşenler (CC) ve moleküler fonksiyonlar (MF)17 olmak üzere, büyük ölçekli fonksiyonel zenginleştirme için yaygın kullanılan bir kaynaktır. KEGG (Kyoto Gens and Genomes, Sürüm 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) genomlar, biyopatlar, hastalıklar ve ilaçlar hakkında verilerisaklar.
RASRDEG'ler, R paket kümesiProfiler 19 kullanılarak GO notasyonu ve KEGG yol zenginleştirme analizine tabi tutuldu. Zenginleştirme testi yöntemi: hipergeometrik test; çoklu test düzeltme yöntemi: Benjamini-Hochberg (BH) yöntemi. Tarama kriteri: ayarlanmış p-değeri < 0.05.
Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)
Kohort düzeyinde GSEA için, GSE75360'nin diferansiyel ifade analizinde test edilen tüm genler logFC ile azalan sırayla sıralanmış ve clusterProfiler19 için giriş gen listesi olarak kullanılmıştır. GSEA'dan önce DEG ön filtreleme uygulanmadı. MSigDB20'den c2 gen seti koleksiyonu. Parametreler: tohum = 2022, set başına 10–500 gen; tarama kriterleri: düzeltilmiş p < 0.05 (Benjamini-Hochberg, BH yöntemi), FDR < 0.2521.
Hipertansiyon tanı modelinin inşası
Hipertansiyonla ilişkili anahtar genleri belirlemek için iki tür makine öğrenimi algoritması kullandık: lojistik regresyon ve rastgele ormanlar (RF). Lojistik regresyon (ikili bağımlı değişken: hipertansiyon/kontrol) RASRDEG'leri p < 0.05 ile tarandı. Rastgele Orman (RF, R paketi randomForest): parametreler set.seed(520), ntree = 1000; MeanDecreaseGini (değişken önem göstergesi) çıkarıldı ve en iyi 15 RASRDEG seçildi. RASRDEG'ler standart olarak p değeri < 0.05 ile tarandı.
RF (Rastgele Orman) algoritması, Paketleme kategorisi altında (çoklu karar ağacını entegre eden) toplu öğrenme yöntemi, R paketi randomForest22 üzerinden uygulandı (parametreler: set.seed(520), ntree = 1000). Özellik genlerinin MeanDecreaseGini (düğüm bölünmesi sırasında ortalama saflık azalmasıyla değişken önemini yansıtan) çıkarıldı ve en iyi 15 RASRDEG seçildi. Son olarak, lojistik regresyon ve RF ile taranan genlerin Venn diyagramı yüksek tansiyonla ilişkili anahtar genleri belirlemek için çizildi.
Hipertansiyon tanı modelinin doğrulanması
Anahtar genlere dayalı lojistik regresyon modeli oluşturuldu; Doğrusal tahmin değeri (η) şu şekilde hesaplandı:
R paketi pROC16 , ROC eğrilerini çizmek ve modelin hipertansiyon riskini tahmin etmedeki etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. R paketi rms23 üzerinden bir nomogram, her anahtar genin lojistik regresyon modeline katkısını görselleştirmek için oluşturuldu (anahtar genler ile hipertansiyon riski arasındaki ilişkiyi yansıtarak). Tahmin edilen ve gerçek hipertansiyon olasılıkları arasındaki tutarlılığı değerlendirmek için kalibrasyon eğrileri oluşturuldu; Karar eğrisi analizi (DCA, R paketiggDCA 24), modelin klinik faydasını (net fayda) değerlendirmek için GSE75360 ve GSE74144 yapıldı.
Tek genli GSEA
GSEA, belirli bir genle ilişkili genlerin biyolojik süreçlerde/yollarında/hastalıklarda rolünü inceleyerek onun ifadesini analiz eder ve genin işlevsel rolünü anlamaya yardımcı olur. GSE75360'daki her odak gen için, örnekler medianda yüksek ve düşük ekspresyonlu gruplara ayrıldı. Daha sonra test edilen tüm genlerde farklı ekspresyon analizi yapıldı ve genom genelinde logFC değerleri, clusterProfiler19 ile GSEA'dan önce en yüksekten en düşüklere doğru sıralandı. GSEA'dan önce DEG ön filtreleme uygulanmadı. Parametreler: tohum = 2020, set başına 10–500 gen (MSigDB21'den c2 gen seti koleksiyonu). Tarama kriterleri: p < 0.05 (adj. p BH yöntemiyle düzeltildi).
İmmün sızma analizi (CIBERSORT)
CIBERSORTalgoritması 25 (doğrusal destek vektör regresyonuna dayanarak), transkriptom matrisini dekonvolyut ederek karışık örneklerde bağışıklık hücre bileşimini tahmin etti (bağışıklık hücre zenginleştirme puanı > 0 veriler seçildi). GSE75360'nin son bağışıklık hücresi infiltrasyon matrisi, oran çubuk grafikle görselleştirildi. Spearman korelasyonu, bağışıklık hücre-immün hücre ve ana gen-immün hücre ilişkilerini analiz etmek için kullanıldı; sonuçlar sırasıyla korelasyon ısı haritası (R paket pheatmap) ve korelasyon balonu grafiki (R paketi ggplot2) olarak sunuldu.
Protein-protein etkileşimi (PPI) ağı
PPI ağları, biyolojik süreçleri etkileşimler yoluyla düzenleyen birbirine bağlı protein sistemleridir. STRINGveritabanı 26 kullanılarak, anahtar genler için bir PPI ağı oluşturuldu (minimum etkileşim puanı: 0.150, düşük güven). Renin-anjiyotensin ile ilişkili hub genleri, etkileşimli genlerin taranmasıyla seçildi. Genomik ve proteomik veri setleri kullanılarak fonksiyonel olarak benzer genleri tanımlayan GeneMANIAveritabanı 27, anahtar RAS genlerinin fonksiyonel olarak benzer genlerini tahmin etmek ve protein etkileşim ağı oluşturmak için kullanıldı.
Düzenleyici ağın inşası
mRNA-TF ağı: Transkripsiyon faktörleri (TF'ler), hedef genlerle transkripsiyon sonrası etkileşim yoluyla gen ifadesini düzenler. Merkez genlerini ve düzenleyici ilişkilerini hedefleyen TF'ler ChIPBaseveritabanı 28'den alındı ve mRNA-TF ağı Cytoscape29 kullanılarak görselleştirildi.
mRNA-miRNA ağı: miRNA'lar birden fazla hedef genin modülasyonuna sahiptir (tek hedefler birden fazla miRNA tarafından birlikte düzenlenebilir). StarBase v3.030 , RASRDEG'lerle ilişkili miRNA'ları tanımlamak için kullanıldı ve mRNA-miRNA ağı Cytoscape aracılığıyla görselleştirildi.
mRNA-ilaç ağı: Toksikogenomikveritabanları 31 , hub genlerinin doğrudan/dolaylı ilaç hedeflerini tahmin etmek için kullanıldı. mRNA-ilaç ağı (gen-ilaç etkileşimlerini gösteren) Cytoscape ile görselleştirilerek ağ yapısını tamamladı.
Ang II kaynaklı HUVEC modeli
İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC), %5CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C olarak tutuldu. Hücreler, tedarikçinin talimatlarına göre fetal sığır serumu ve antibiyotiklerle takviye edilmiş tam endotel hücre kültür ortamında tutuldu. In vitro hipertansiyonla ilişkili endotel yaralanma modeli oluşturmak için, HUVEC'ler 48 saat boyunca anjiyotensin II (Ang II; 100 nM) ile tedavi edildi. Kontrol grubu olarak araçla tedavi edilen hücreler kullanıldı.
Gen müdahale deneylerinde, CST3 veya FURIN'i hedefleyen küçük interferensiya RNA'ları (si-CST3 ve si-FURIN), karşılık gelen negatif kontrol siRNA'ları (si-NC), CST3 veya FURIN aşırı ekspresyon plazmidleri (oe-CST3 ve oe-FURIN) ve ilgili boş-vektör kontrol (oe-NC), üretici protokolüne göre ticari bir transfeksiyon reaktifiyle HUVEC'lere aktarıldı. Transfeksiyondan sonra hücreler Ang II'ye maruz kaldı ve ardından ifade doğrulama ve fonksiyonel testler için hasat edildi. Knockdown ve aşırı ifade etkililikleri qRT-PCR ve western blotting ile doğrulandı.
qRT-PCR
Toplam RNA, standart bir RNA ekstraksiyon reaktifiyle HUVEC'lerden izole edildi ve tamamlayıcı DNA ters transkripsiyon kiti kullanılarak üretildi. QRT-PCR için SYBR Yeşil kimya kullanıldı. LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G, TBXAS1, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ve eNOS ekspresyon seviyeleri GAPDH'ye normalize edildi ve 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı.
Western blotting
Western blot analizi için, proteinler RIPA liz tamponu ile çıkarıldı ve BCA testi kullanılarak nicelendirildi. Eşit miktarda protein miktarı SDS-PAGE ile çözülür ve PVDF membranlarına aktarılır. Bloklamadan sonra, zarlar CST3, FURIN, TBXAS1 veya GAPDH'ye karşı primer antikorlarla ve ardından uygun ikincil antikorlarla kuluçka edildi. Bantlar kemimilüminesans ile tespit edildi ve densitometri GAPDH'ye normalize edildi. Kültür süpernatantlarında salgılanan CST3, üreticinin protokolüne uygun olarak bir ELISA kiti ile nicelendirildi.
Hücre yaşama
Hücre yaşamalılığı, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testi kullanılarak değerlendirildi. Kısa süreliğine, transfeksiyonlu ve Ang II ile işlenmiş HUVEC'ler 96 kuyu plakalarına tohumlanmış, CCK-8 reaktifinin eklenmesinden sonra 0, 24, 48 ve 72 saat içinde 450 nm'de absorbans ölçülmüştür. Hücre göçü Transwell odaları kullanılarak değerlendirildi. Belirtilen müdahalelerden sonra hücreler üst odalara tohumlanmış, alt membran yüzeyindeki göç eden hücreler sabitlenmiş, boyanmış ve rastgele seçilmiş alanlarda mikroskop altında sayılmıştır.
İltihabi test
İnflamatuar aktivasyon, oksidatif stres ve endotel fonksiyonlarını değerlendirmek, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ve eNOS.mRNA seviyeleri qRT-PCR ile tespit edildi. Kültür süpernatantındaki nitrik oksit (NO) seviyeleri, ticari bir NO test seti kullanılarak ölçüldü ve üreticinin talimatlarına göre DCF floresansı kullanılarak hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyeleri tespit edildi.
İstatistiksel analiz
Transkriptomik işlem ve modelleme R'de gerçekleştirildi. Sürekli değişkenler normallik açısından Shapiro-Wilk testiyle değerlendirildi. İki grup karşılaştırmaları için, normal dağılımlı değişkenler için bağımsız örneklem t-testleri kullanılırken, normal olmayan değişkenler için Wilcoxon sıra-toplamı testleri kullanıldı. Üç veya daha fazla grup için, varyans varsayımlarının normalliği ve homojenliği varsayımları sağlandığında uygun post hoc testlerle tek yönlü varyans analizi kullanıldı; aksi takdirde, Kruskal-Wallis testi uygulandı. CCK-8 zaman kulturası verileri, varyans analizi kullanılarak analiz edildi. Spearman korelasyon katsayıları ilişki analizleri için hesaplandı. Aksi belirtilmedikçe, deneysel sonuçlar ortalama SD ± olarak gösterilir ve iki kuyruklu p < 0.05 anlamlı olarak kabul edilir.