Farelerde Tekrarlanan Tüm Vücut Pletismografisi için Tünel Kullanımı ve Çevresel Zenginleştirme

Özet

Bu protokol, farelerde boylamasına çalışmalar sırasında stresle ilişkili solunum değişkenliğini azaltmak amacıyla tekrarlanan tüm vücut pletismografisi için tünel yönetimi ve çevresel zenginleştirme prosedürlerini açıklar.

Özet

Tekrarlanan tüm vücut pletismografisi (WBP), farelerde solunum fonksiyonunun boylamasına değerlendirmesinde yaygın olarak kullanılır. Ancak, kontrol kaynaklı stres, tedavi etkilerini karıştıran ve deneysel tekrarlanabilirliği azaltan fizyolojik değişkenlik getirebilir. Geleneksel kuyruk tutma yöntemleri, tekrarlanan seanslarda sürekli stres yanıtları ve kötü alışkanlık yaratabilir, bu da deneysel sonuçları etkileyebilir. Bu protokol, tekrarlanan WBP oturumları için tünel yönetimi ve çevresel zenginleştirmeyi entegre eden geliştirilmiş işleme ve konut yöntemlerini açıklar. Altı vahşi tip 129S1/SvImJ faresi (3 erkek, 3 dişi) 10 haftalık bir çalışma boyunca tünel kullanımı ve sürekli çevresel zenginleştirme aldı. Hayvanlar tekrar tekrar WBP seansları geçirdi ve alışma dönemleri başlangıç, erken çalışma, orta çalışma ve geç çalışma zaman noktalarında analiz edildi. Başlangıç oda yerleştirme sırasında solunum sıklığı (fbaşlangıç, 0–2 dakika) ve stabil başlangıç (fbaşlangıç, 8–10 dakika) boylamasına alışma desenlerini değerlendirmek için nicel olarak ölçüldü. Uygulanan koşullar altında çalışma zaman çizelgesi boyunca aşamalı değişiklikler gözlemlenmiştir. Ortalama başlangıç solunum sıklığı, başlangıçta 345 ± 111 SD nefes/dak'dan geç çalışma oturumlarında 267 ± 43 SD nefes/da'ya düştü; bu da varyasyon katsayısının azalmasıyla (%32'den %16'ya) birlikte gerçekleşti. Başlangıç solunum ölçümleri de 255 ± 67'den 193 ± 43 nefes/daka (p = 0.033) düştü; bu, sonraki seanslarda ölçüm stabilitesinin artmasıyla uyumludur. Davranışsal gözlemler, minimal defekasyon, idrar veya huzursuzlukla sakin uyum sağladı. Bu protokol, farelerde tekrar eden solunum değerlendirmeleri yapan laboratuvarlar için pratik bir yaklaşım sunar. Tünel kullanımı ve çevresel zenginleşme, uzunlamasına WBP çalışmalarında ilerleyici uyum ve azalan solunum değişkenliği ile ilişkilendirilmiştir.

Giriş

Tüm vücut pletismografisi (WBP), bilinçli, sınırsız kemirgenlerde solunum fonksiyonunun invaziv olmayan şekilde değerlendirilmesini sağlar ve solunum fizyolojisi, solunum toksikolojisi ve hastalık modellemesi ^1,2 alanlarında uzunlamasına çalışmalar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir^. Tekniğin başlıca avantajları, invaziv olmayan yapısı ve tekrarlanan ölçümlere uygunluğu, hastalık ilerlemesi, terapötik müdahaleler veya maruz kalma süreleri boyunca solunum değişikliklerini takip etmek için özellikle değerli kılar. Glaab ve Braun², invaziv olmayan baş-dışarı vücut pletismografisinin, bilinçli farelerde tekrar akciğer fonksiyonu ölçümleri için güvenilir bir yöntem olduğunu, ortaya çıkan solunum yolu enfeksiyonları da dahil olmak üzere hava yolu hastalıklarında translasyonel araştırmalar için temel araçlar sağladığını vurguladı. Ancak, WBP ölçümlerinin kalitesi ve tekrarlanabilirliği, davranışsal sakinlikle uyumlu düşük solunum frekansı durumlarına ulaşılmasına kritik önem verir; bu durum ele geçirme kaynaklı stresle zayıflayabilir. Stresle başa çıkmak, fizyolojik ölçümleri karıştırabilir ve veri kalitesini tehlikeye atabilir, iyi bilinen ancak çoğu zaman yeterince takdir edilmeyen deneysel değişkenlik kaynağıdır. Standart laboratuvar uygulaması genellikle kuyruk taşımasını içerir; fareler kuyruğun tutarak taşınma ve^{manipülasyon için yapılır 3,4}.

Standart laboratuvar uygulamaları genellikle kuyruk taşımasını içerir; fareler kuyruğun tutarak taşınma ve manipülasyon için tutulur. Gouveia ve^{Hurst 3} , kuyruk tutumunun farelerde kaygı tetiklediğini, saplı hayvanların tünel saplı kontrollere kıyasla yükseltilmiş ve labirentte kaygı benzeri davranışların arttığını göstermiştir. Bu anksiyete tepkisi, değişen fizyolojik parametrelerle ilişkilidir. Rasid ve ^ark.4 , rutin laboratuvar prosedürlerinin solunum etkilerini niceliklendirmek için WBP kullanarak, kısıtlama ve ele geçirmenin cinsiyete bağlı olarak küçük hacmi önemli ölçüde değiştirdiğini ve etkilerin işlem sonrası 24 saate kadar devam ettiğini bulmuştur. Bu tutumdan kaynaklanan etkilerin büyüklüğü ve süresi, kuyruk kontrolünden kısa süre sonra alınan solunum ölçümlerinin, stabil temel fonksiyon yerine akut stres fizyolojisini yansıtabileceğini vurgular.

Kısıtlama ve stresle başa çıkma üzerine daha geniş literatür, anlık davranışsal tepkilerin ötesine geçen etkileri ortaya koymaktadır. Buynitsky ve^{Mostofsky 5} , kısıtlama stresinin fizyolojik, immünolojik, endokrin ve gelişimsel süreçler üzerindeki kapsamlı etkilerini inceledi ve stresle ilgili karışıklıkların genellikle araştırma makalelerinde yeterince belgelenmediğini vurguladı. Özellikle solunum testleri için, tekrar ölçüm gerekliliği sorunu daha da kötüleştirir. Her müdahale olayı stres tepkisini sıfırlayabilir, kademeli alışkanlığı sınırlayabilir ve uzunlamasına zaman noktalarında tutarsız temel ölçümler üretebilir. DeLorme ve Moss¹ , bilinen interstrain fizyolojik farklılıkları olan farelerde kısıtlı ve kısıtsız pletismografi yaklaşımlarını karşılaştırarak, kısıtlanmayan tek odalı sistemlerin hava yolu reaktivitesinin daha iyi analizini sağlamasına rağmen, tekrarlanabilir temel ölçümler elde etme zorluğunun devam ettiğini bulmuştur.

Farelerin gönüllü olarak bir tünele girerek taşınma için kullanıldığı tünel yönetimi, ele geçirme kaynaklı kaygıyı önemli ölçüde azaltan kanıta dayalı bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Yöntemin etkinliği birden fazla suşta ve deneysel bağlamda gösterilmiştir. Gouveia ve Hurst³ , tünel saplı farelerin kuyruk saplı farelere kıyasla yükseltilmiş ve labirent testlerinde daha az kaygı benzeri davranışlar gösterdiğini, tüneller yabancı olsa bile fayda gözlemlediğini gösterdi. Önemli olarak, bu faydalar işlem sonrası hemen dönemin ötesine kadar uzanır. Sensini ve ^ark.6 , cinsiyetler arasında ele alma tekniği ve kullanım sıklığının etkilerini incelemiş, sık kuyruk tutmanın kazma gibi iyilik durumu ile ilişkili davranışları azalttığını ve erkeklerde umutsuzluk benzeri davranışların arttığını bulmuştur; tünel kullanımı ise her iki cinsiyet tarafından tercih edilmiş, daha olumlu yaklaşım davranışları ve daha az savunma tepkisi ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, Davies ve ^ark.7 , kuyruk dışı kullanımın faydalarının karmaşık işlemler sırasında devam ettiğini göstermiştir. Laboratuvar deneyimleri boyunca, hatta kısıtlama prosedürleri sırasında kuyruk kullanımına maruz kalan fareler, yalnızca kuparma veya tünel yöntemleriyle ele alınan farelere kıyasla çevresel uyarılara daha fazla yanıt verme ve daha az tutunma kolaylığı göstermiştir.

Yöntem seçiminin ötesinde, deneysel prosedürlere sistematik alışkanlık stres kaynaklı değişkenliği daha da azaltabilir. Sorli ve ^ark.8 , fareleri kısıtlama temelli bir sistem olan head-out pletismografi için eğitmiş ve beş gün üst üste yapılan eğitimin toleransı artırdığını, farelerin ikinci gün itibaren davranışsal stabilitesinin arttığını ve tüm seanslarda nefes parametrelerinin 5 dakika içinde stabilleştiğini bulmuştur. Benzer şekilde, Ueno ve ^ark.9 , davranışsal testlerden önce erkek C57BL/6 farelerinin tekrarlayan nazik müdahalesinin, yükseltilmiş ve labirent testlerinde kaygı benzeri davranışları azalttığını ve mekansal bilişi iyileştirdiğini göstermiştir; bu da yöneticilerle tekrar tekrar temasın ölçülebilir alışkanlık etkileri yaratabileceğini göstermiştir. Bu bulgular, kaçınıcı olmayan tutma yöntemlerini sistematik alıştırma protokolleriyle birleştirmenin, tekrarlanan ölçümler sırasında fizyolojik değişkenliği azaltmada kümülatif faydalar sağlayabileceğini göstermektedir.

Çevresel zenginleşme, stres yanıtlılığını ve temel fizyolojiyi etkileyebilen ek bir faktördür; ancak etkileri karmaşık ve bağlama bağlıdır. Zenginleşme genellikle olumlu refahı desteklerken, aşırı veya öngörülemez zenginleşme bazı deneysel bağlamlarda fizyolojik değişkenliği ve stresle ilişkili davranışları paradoksal olarak artırabilir ^10,11. Dengeli bir yaklaşım, örneğin iç içe materyal gibi sabit temel unsurları koruyarak, zenginleştirici öğelerin periyodik dönüşümü yoluyla yönetilebilir yenilik sağlarken, kafa karıştırıcı varyasyon getirmeden refahı optimize^{edebilir 12}. Zenginleştirme, kullanım yöntemi ve alışma protokolleri arasındaki etkileşim, tekrarlanan solunum ölçümleri bağlamında yeterince incelenmemiş durumda ve bu da üç faktörü aynı anda ele alan entegre protokollere ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır.

Fizyolojik ölçümler üzerindeki kontrol etkilerinin artan farkına rağmen, tekrarlanan WBP seanslarında kontrol stresini en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış standart protokoller sınırlı kalmaktadır. Mevcut WBP protokolleri genellikle stres kaynaklı takipinenin azalmasına izin vermek için seans başına 10–30 dakika aralarındaki uzun adaptasyon dönemlerine dayanır, ancak temel tutma yöntemini nadiren ele alır veya seanslar arasında aşamalı alışkanlık olup olmadığını sistematik olarak değerlendirir. Ayrıca, çoğu çalışma hayvanların davranışsal sakinlikle uyumlu fizyolojik durumlara ulaşıp ulaşmadığını değerlendirmez; örneğin solunum frekanslarının literatürde sessizlik veya uykuya bağlı durumlarla ilişkilendirildiği aralıklara yaklaşması veya bunun yerine akut stresten kronik düşük seviyeli uyarılmaya geçiş olur. Burada, tünel yönetimi, dengeli çevresel zenginleştirme ve tekrarlanan WBP seanslarını 10 haftalık bir uzunlamasına çalışma boyunca entegre eden bir protokol sunuyoruz. Alışkanlıkla uyumlu solunum frekansındaki ilerleyici değişikliklerle ilişkili bir yaklaşımı tanımlıyoruz; seanslar boyunca başlangıç solunum sıklıklarının azalması ve literatürde sessiz veya uyku ile ilişkili durumlarla ilişkilendirilen aralıklara yaklaşan temel ölçümler dahildir. Önemli olarak, bu protokol sadece hayvan refahı iyileştirmesi olarak değil, aynı zamanda uzunlamasına solunum ölçümleri sırasında değişkenliği azaltmaya ve tutarlılığı artırmaya yardımcı olabilecek deneysel bir tasarım değerlendirmesi olarak sunulmaktadır.

Protokol

Miami Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC Protokolü #23-103) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak tüm prosedürleri gerçekleştirmek. Fareleri, AAALAC onaylı bir vivaryum tesisinde barındırmak, çevresel koşullar kurumsal standartlara uygun şekilde korunmakta.

1. Hayvan Seçimi ve Yaşam Koşulları

1. Çalışmaya hayvanları seçip hazırlayın
   1. Yerleşik bir üreme kolonisinden hayvan seçin veya ticari bir satıcıdan edinin. Bu çalışma için altı vahşi tip 129S1/SvImJ faresi (3 erkek, 3 dişi) kullanıldı.
   2. Hayvanları AAALAC onaylı bir tesiste SPF (özel patojensiz) koşullarında bulundurmak, kurumsal standartlara uygun rutin sağlık izleme yapılmaktadır.
   3. Çalışmaya başlangıçta hayvanların yaklaşık 6 aylık (genç yetişkinler) olduğunu doğrulayın.
      NOT: Bu çalışmadaki fareler, rutin bakım kapsamında tünel yönetimine daha önce maruz kalmışlardır. Naif fareler için, WBP oturumlarına başlamadan önce bir koşullandırma dönemi uygulayın (bkz. Adım 3.2).
2. Fareler çalışma amaçları için uygun yaşa ulaştığında deneysel işlemlere başlayın. Bu çalışmada, fareler WBP seanslarının başında yaklaşık 6 aylık (genç yetişkinler) olarak değerlendirildi. Tekrarlanabilirlik için, belirli bir yaş aralığında (örneğin ±1 ay) fareler kullanın ve kullanılan spesifik yaşları raporlayın; çünkü yaş, başlangıç solunum parametrelerini ve alışkanlık kinetiklerini etkileyebilir.

2. Çevresel Zenginleştirme Protokolü

1. Sürekli iç içe malzeme sağla
   1. Her kafes değişiminde her kafese yaklaşık 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) bir sıkıştırılmış pamuk kare yerleştirin.
   2. Kafes değişimleri sırasında mevcut yuva yapısının çoğunu sağlam olarak yeni kafese her iki elinizle aktarın.
   3. Biriken yuva malzemesi yaklaşık 10 g'yi (orijinal kütlenin yaklaşık iki katı) aşarsa, en eski ve en sıkışmış kısımları alt kısımdan çıkararak dış kubbe yapısını koruyun.
   4. Temiz kafese bir taze pamuk kare (5 cm × 5 cm) ekleyin, böylece yuva yapımının ve bakımının devam etmesini destekleyebilirsiniz.
   5. Yuva malzemesi yalnızca gözle görülür şekilde ıslaksa (yüzeyin >%25'ini idrar kirlemesi) veya yuva yok edilip 48 saat içinde yeniden inşa edilmemişse (Şekil 1A ve 1C) değiştirilin.
      NOT: Kafes değişiklikleriyle ilişkili stresi en aza indirmek ve çalışma boyunca tutarlı koklu ile dokunsal ipuçlarını korumak için yuva yapısını koruyun. Yuva kalitesi, hayvan refahı ve sağlık durumunun bir^{göstergesi olarak hizmet eder 13}.
2. Aşağıdaki standart prosedürle haftalık olarak yuva yapımını değerlendirin
   1. Her kafes değişiminde, sağlam yuvayı iki elinizle dikkatlice temiz bir yüzeye taşıyın ve yapıyı rahatsız etmeyin.
   2. Kamerayı yüzeye 30–40 cm dik konumlandırarak yuvayı doğrudan yukarıdan fotoğraflayarak genel yapıyı ve krater oluşumunu görselleştirin.
   3. Yuvanın yanından yuva yüksekliğinde fotoğraflayarak duvar bütünlüğünü ve kubbe özelliklerini belgeleyin.
   4. Yuvayı, standart 5 noktalı Deacon^{ölçeği 13} ile puanlayın; burada 1 = büyük ölçüde dokunulmamış yuva materyali ve 5 = şeffaf kraterli kubbe şeklinde yuva. Skor 5 yuva örnekleri için Şekil 1A–1C'ye bakınız.
   5. Yuvayı dikkatlice temiz kafese geri koyun.
      NOT: Haftalık yuva fotoğrafları, çalışma boyunca yuva kalitesine dair nesnel dokümantasyon sağlar. Yuva yapımındaki bozulma, hastalık, stres veya veteriner bakımı gerektiren diğer refah endişelerini gösterebilir.
3. Haftalık olarak değiştirilmiş dönüşümlü zenginleştirme sağlar
   1. Bir zenginleştirme ürünü seçin ve kafese yerleştirin. Parçalanmış kağıt (sade beyaz kağıt, avuç boyutunda porsiyon), kağıt havlular (2–3 yaprak, kokusuz, beyaz, katlanmış veya buruşturulmuş) veya kağıt bazlı barınaklar (karton tüpler veya küçük kutular) kullanın.
   2. Zenginleştirme öğelerini önceden belirlenmiş bir programa göre haftalık olarak döndürün (örneğin, 1. Hafta: parçalanmış kağıt; 2. Hafta: kağıt havlular; 3. Hafta: karton tüp; 4. hafta: tekrar) yönetilebilir yeniliği korumak için.
      NOT: Haftalık rotasyon fareleri bunaltmadan yenilik sağlar. Fizyolojik değişkenliği artırabilecek plastik kulübeler, toplar veya sert yapılar gibi plastik zenginleştirici ürünlerden^kaçının. Her kafes değişiminde tüm zenginleştirici öğeleri değiştirin.

Şekil 1. Uzunlamasına tüm vücut pletismografisi (WBP) çalışmalarında protokol uygulaması ve refah göstergeleri. (A) Dişi kafesten temsil eden yüksek kaliteli yuva (Deacon puanı 5), iyi şekillenmiş kubbe yapısı ve tanımlanmış bir krater. (B) Ev kafesinde yuva malzemesiyle entegre edilmiş şeffaf polikarbonat işleme tüneli (yaklaşık 10 cm uzunluğu × 5 cm iç çapı). Tüneller, çalışma boyunca zenginleştirme ve taşıma cihazı olarak kafeslerde kalıcı olarak kaldı. (C) Hem erkek hem de dişi kafeslerde 5 yuva yapımının sürekli skorunu gösteren temsil geç çalışma yuva kalitesi (10. hafta). (D) 10 haftalık çalışma süresi boyunca yuva kalitesi puanları. Her veri noktası, standart 5 puanlık Deacon^{ölçeği 13} kullanılarak bir kafesin haftalık yuva puanını temsil eder; burada 1 = dokunulmamış yuva malzemesi ve 5 = kraterli tam kubbe şeklinde yuva. Her iki kafes de tüm çalışma aşamalarında 5 yuva kalitesini tutarlı şekilde korudu. Gölgeli yeşil bölge, optimal refah koşullarıyla ilişkili puanları gösterir (puanlar 4–5). Çalışma aşamaları, Başlangıç (0. hafta), erken çalışma (2–3. haftalar), orta çalışma (5–7. haftalar) ve geç çalışma (8–10. haftalar) ile uyumlu renkli arka plan bölgeleriyle belirtilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tünel Yönetimi Uygulaması

1. Taşıma tünellerini hazırla
   1. Pürüzsüz, yuvarlak kenarlara sahip şeffaf polikarbonat tüneller (100 mm veya 130 mm uzunluğunda × iç çapı 50 mm) kullanın (Şekil 1B).
   2. Her ev kafesine kalıcı olarak bir tünel yerleştirin; bu da kafes zenginleştirme kapsamında.
   3. İşlem etkinlikleri arasındaki tünelleri kaldırmayın.
      NOT: Tüneli ev kafesinde tutmak, kafesin tanıdık kokularını almasını ve prosedürleri ele geçirmek yerine ev ortamıyla ilişkilendirilmesini sağlar. Fareler genellikle tünelleri sığınak veya yuva yeri olarak kullanır.
   4. Her kafes değişiminde, tünel içini önceki kafesten az miktarda kullanılmış yatak malzemesiyle temiz kafese yerleştirin.
   5. Tünelleri otoklav olarak kullanın veya kullanımlar arasında dezenfekte gerekirse kafes temizliği için kullanılan aynı dezenfektan maddeyle yıkayabilirsiniz. İyice durulayın ve tünelleri kafese geri götürmeden önce hava kurumasına izin verin.
      NOT: Koku sürekliliğini korumak, yabancı kokularla ilgili stresi en aza indirmeye yardımcı olur. Tüneller otoklavlanabilir ve yeniden kullanılabilir.
2. Farelerden tünel yönetimine koşulu
   1. Naif yetişkin fareler için, WBP seansları başlatmadan önce en az 1–2 haftalık bir kondisyon^{dönemi uygulayın; 14,15}.
   2. Temiz polikarbonat tünelleri (bkz. Adım 3.1) ev kafesine kalıcı olarak yerleştirin ve pasif alışma için 3–7 gün bekleyin.
   3. Pasif maruz kaldıktan sonra günlük nazik müdahale seansları yapın. Fareleri tünele gönüllü olarak girmeye teşvik edin, ardından tüneli yatay olarak 30–60 saniye boyunca kaldırın ve fareyi kafese geri döndürün.
   4. Aşağıdaki kriterler kullanılarak başarılı alışkanlığı değerlendirin: 10–30 saniye içinde gönüllü tünele giriş, kaçış girişimleri veya seslendirme olmadan tünel içinde sakin davranış ve rutin kafes gözlemleri sırasında dinlenme veya keşif için kendiliğinden tünel kullanımı^14,15.
   5. Tüm alışkanlık kriterleri karşılandıktan sonra WBP seanslarına başlayın.
      NOT: Bu çalışmadaki fareler, WBP seanslarına başlamadan önce rutin bakım kapsamında tünel yönetimine maruz kalmışlardır.
3. Kaçınıcı olmayan işlemeyi gerçekleştir
   1. Tüm işlem işlemlerinde tozsuz nitril eldiven giyin.
   2. Tünel yönetimini birincil yöntem olarak kullanın. Fare tünelin içindeyse, tüneli yatay olarak kaldırarak bir elinizle tabanı destekleyin.
   3. Fare tünelin dışındaysa, tünel açıklığını farenin 5–10 cm mesafesine yerleştirin ve gönüllü girişe 10–30 saniye izin verin, kovalamadan veya zorlamadan yapın.
   4. Fare 30 saniye içinde girmezse, temas etmeden farenin arkasında yerleştirilmiş bir fincanlı elle tünele doğru hareket etmeyi teşvik edin.
   5. Fare iki denemeden sonra girmezse (maksimum toplam 60 saniye), kupa yöntemini kullanın. Yassı bir eli farenin yanına koyun, 10–20 saniye gönüllü yaklaşmaya izin verin, ardından fareyi her iki elinizle nazikçe alın ve kuyruk tutmaktan kaçının.
   6. Seslendirmenin olmaması, kaçış girişimleri veya stresle ilişkili dışkılama gibi sakin davranışlara yol açan müdahale yöntemini kullanın.
4. Fareleri pletismografi odasına transfer edin
   1. Fareyi tünelden eller kapalı hale aktarın ve sonra odaya yerleştirin.
   2. Tüneli yatay tutun ve arka ucu (kuyruk tarafı) yaklaşık 10–20° yukarı doğru eğin.
   3. Farenin tünelden geri çekilmesine izin verin, önce arka bacaklar, ellerin üzerine koyun.
   4. Her iki elinizi odaya indirin ve farenin 5–10 saniye içinde gönüllü olarak odanın zeminine adım atmasına izin verin.
      NOT: Bu tünelden elden-odaya aktarma yöntemi, odanın yerleştirilmesi sırasında daha iyi kontrol sağlar.
   5. Alternatif olarak, fareyi tünelden doğrudan odaya aktarın, tüneli odanın açıklığına doğru eğip yönlendirin.
      NOT: Doğrudan tünelden odaya transfer, yerleştirme sırasında daha az kontrol sağlar ve bu çalışmada daha az kullanılmıştır.
   6. Tüneli dikey olarak çevirmeyin veya sallayın.
   7. Fare yerleştirildikten hemen sonra odanın kapağını kapatın ve tüneli ev kafesine geri döndürün.
      KRITIK ADIM: Çalışma sırasında fareleri kuyruğundan tutmayın. Bir fare 30 saniye içinde tünele girmezse veya bir fincanlı ele yaklaşmazsa, yumuşak yatak ile hareketi nazikçe teşvik edin, kovalamadan veya etkileşime zorla müdahale etmeden. Farenin bireysel tercihe göre tünel veya el yaklaşımı seçmesine izin verin. İlk seanslarda sabır, olumsuz müdahalelerle olumlu ilişkiler kurmaya^{yardımcı olur 3,7}.

4. WBP Oturum Protokolü

1. Pletismografi sistemini hazırlayın
   1. Veri toplamadan önce günde bir kez tüm vücut pletismografını kalibre edin.
   2. Odalar boş ve mühürlendikten sonra, FinePointe solunum analiz yazılımı (hedef: 18–22 cm H₂O) üzerinden otomatik kalibrasyon dizisini başlatın. Kutu akışı etkili aralığı her site başına ±40 mL/s'yi aştığında başarılı kalibrasyonu doğrulayın.
   3. Bir oda başına bias akışını 1.0 L/dakika olarak ayarlayın.
   4. Dijital sensörler kullanarak odanın sıcaklığını (22°C–24°C) ve nem sürekli izleyin.
   5. Odaları sessiz bir yere yerleştirin; tutarlı aydınlatma ve minimum titreşim var.
      NOT: Tüm oturumlarda sürekli oda koşullarını koruyun. Sıcaklık dalgalanmaları solunum düzenlerini değiştirir ve boyuna karşılaştırmaları^{karıştırır 1}.
2. WBP seanslarını tutarlı bir sirkadiyen faza boyunca gerçekleştirin
   1. Tüm ölçümleri ışık döngüsünün aynı zaman aralığında yapın.
   2. Seansları 08:00–10:00 arasında (ışıklar 06:00'da açılır) gerçekleştirin ve ışıklar açıldıktan sonraki ilk 2 saatte sirkadiyen ritimler geçiş yaparken kaçının.
3. Fareleri deney odasına taşıma
   1. Oturum başlamadan yaklaşık 15 dakika önce bir arabayla eve kafesleri deney odasına taşıyın.
   2. Farelerin deneysel oda ortamına alışmalarını sağlarken alıştıkları ev kafesinde kalmasını sağlayın.
   3. Ev kafeslerini pletismografi odalarının yakınına yerleştirin.
   4. Her fareyi ev kafesinden kaplı ellere ve oradan odaya aktarmak için tünel kullanımı kullanın (bkz. Adımlar 3.3–3.4).
   5. Fareleri sakin bir şekilde yönetin ve transfer sırasında ani hareketleri en aza indirin.
      NOT: Bireysel fare transferi sadece birkaç saniye sürer.
4. Fareyi hazneye yerleştirin
   1. Fareyi kaplı ellerden nazikçe odaya aktarın (bkz. Adım 3.4).
   2. Fare yerleştirildikten 5 saniye içinde odanın kapağını mühürleyin.
5. Alışmaya ve kayda başlayın
   1. Solunum sinyallerini solunum analiz yazılımı ile kaydetmeye başlayın.
   2. Rahatsızlık veya müdahale olmadan uyum için 10 dakika bekleyin.
6. Uyum sırasında davranışsal stabiliteyi izleyin
   1. Alışma dönemi boyunca fareyi sürekli gözlemleyin.
   2. Seans günlüğüne aşırı hareket, sürekli hareketsizlik ve stres belirtileri (örneğin sert duruş) veya sakin davranış dönemleri olmadan tekrar eden kaçış girişimlerini kaydet.
   3. Bu tür oturumların hâlâ geçerli ilkveri sağlayabileceğini kabul edin; Ancak, Ftemel ölçümleri güvenilir olmayabilir.
   4. Alışma penceresinde gözlemlenebilir sakinlik dönemleri olmayan seansları, çalışmaya özgü kriterlere göre başlangıç analizlerinden dışlanma olasılığına işaretleyin.
   5. Bu çalışmadaki tüm oturumları tutun, çünkü hiçbiri alışma davranışına dayalı dışlama kriterlerini karşılamadı.
      KRİTİK ADIM: 10 dakikalık alışma süresi, alışkanlığı değerlendirmek için çok önemlidir. Bazı protokoller 20–30 dakikalık uyum dönemleri kullansa da, bu çalışmada iyi alışkanlık yapmış fareler 8–10 dakika içinde stabil solunum düzenlerine ulaştı; bu da uzun süreli alışmayı gereksiz ve artan hareket nedeniyle potansiyel olarak ters etki yarattı.
7. Alışma sırasında fare davranışlarını gözlemleyin
   1. 10 dakikalık uyum süresi boyunca fareleri görsel olarak izleme yoluyla sürekli gözlemleyin.
   2. Dışkılama, idrar yapma, sürekli kaçma girişimleri veya uzun süren hareketsizlik gibi açık stres göstergelerine dikkat edin.
   3. Her seanstan sonra odadaki dışkı pelletleri ve idrarın varlığını ve tahmini miktarını kaydedin.
      NOT: Bu gözlemler, stres seviyeleri ve alışkanlık ilerlemesinin niteliksel değerlendirmesini sağlar ancak bu çalışmada standart etografi kullanılarak resmi olarak puanlanmamıştır.
8. Uyum aşaması solunum metriklerini analiz etmek
   1. Bu yazılımdaki varsayılan nefes algılama algoritması ve varsayılan eşik ayarları kullanılarak basınç sinyallerinden otomatik olarak solunum frekansını hesaplamak için solunum analiz yazılımını kullanın.
   2. Sabit hava akışı koşullarında (bkz. Adım 4.1) standart alım parametreleri kullanılarak solunum sinyalleri alın.
   3. İki dönem için ortalama solunum frekansı hesaplayın: fbaşlangıç (0–2 dakika), başlangıç tepkisini ve hemen tedavi sonrası fizyolojiyi temsil eder; fbaşlangıç (8–10 dakika), stabilize edilmiş başlangıç solunum frekansını temsil eder.
   4. Görünür hareket artefaktlarının olduğu dönemler, hayvan hareketleri veya odadaki bozulmalarla ilişkili solunum olmayan basınç sapmaları veya düzensiz dalga formları olarak tanımlanır.
      NOT: Otomatik algoritmanın doğru nefes algılamasını doğrulamak için kayıtların bir alt kümesini (yaklaşık %10) görsel olarak inceleyin. Manuel doğrulama, otomatik algılama ile gözlemlenen solunum desenleri arasındaki uyumu doğruladı.
9. Mümkünse deneysel protokole devam edin
   1. Çalışma tasarımına göre 10 dakikalık alışma döneminden sonra deneysel müdahalelere devam edin (örneğin, aerosol ilaç dağıtımı, hipoksik zorluk, egzersiz testi).
      NOT: Bu çalışmada alışkanlık değerlendirme oturumlarında deneysel müdahaleler yapılmadı. Bildirilen solunum metrikleri (fbaşlangıç ve fbaşlangıç) ek prosedürler olmadan sadece adaptasyon seanslarında alındı.
10. Fareyi ev kafesine geri getirin
    1. Tünel kullanımı veya kupa eller kullanarak fareyi hazneden ev kafesine geri taşıyabilirsiniz.
    2. Seans sonrası 5 dakika boyunca fareyi gözlemleyerek normal davranışları doğrulayın; spontan hareket, bakım, kafes arkadaşlarıyla etkileşim ve yiyecek ile su incelemesi dahil.
    3. Anormal davranışlar 15 dakikadan fazla devam ederse, uzun süreli hareketsizlik (>5 dakika), zor nefes alma, kambur duruş veya kafes arkadaşlarıyla etkileşim kuramama gibi anormal davranışlar devam ederse gözlemi uzatın ve veteriner personeline danışın.
       NOT: Bu çalışmada seans sonrası herhangi bir anormal davranış gözlemlenmedi.
11. Oturum frekansını tutarlı tutun
    1. Uzunlamasına çalışma dönemi boyunca (bu protokolde 10 hafta) düzenli olarak WBP seansları yapın.
    2. Alışkanlık ilerlemesini takip etmek için haftalık aralıklarla seanslar yapın.
    3. Seansları günün tutarlı saatlerinde planlayın (bkz. Adım 4.2), böylece sirkadiyen ve prosedürel tutarlılığı koruyun.

Sonuçlar

Bu tünel kullanımı ve çevresel zenginleştirme protokolünün, 10 haftalık uzunlamasına WBP çalışması boyunca altı yabani tip 129S1/SvImJ faresine (3 erkek, 3 dişi) uygulanması, ilerleyici alışkanlık ve gelişmiş fizyolojik stabiliteye dair kanıtlar sağladı. Solunum frekansı ölçümleri, düzenli boylamasına aralıklarla yapılan tekrarlayan WBP seanslarında alındı ve veriler dört çalışma aşamasından analiz edildi: Başlangıç (0. hafta), erken çalışma (2–3. haftalar), orta çalışma (5–7. haftalar) ...

Tartışma

Bu protokol, tünel yönetimi, çevresel zenginleştirme ve tekrarlayan maruziyetleri boylamasına WBP bağlamında birleştiren entegre bir yaklaşımı tanımlar. Bu koşullarda, solunum frekansı ölçümleri, tekrar eden seanslar boyunca ilerleyici bir stabilizasyon gösterdi; bu, azalan uyarılma ve ilerleyici alışkanlıkla uyumludur. Başarılı protokol performansı için birkaç uygulama faktörü önemli görünmektedir. İlk olarak, deneysel prosedürler başlamadan önce tünel yönetimiyle ilgili olarak tanıtılm...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aspen Talaşı Yatak	Laboratuvar Malzemesi	Aspen 323	Aspen talaşı yatak. Kullanmadan önce otoklavlanmış; kafes tabanına yaklaşık 1 cm derinliğe yerleştirilmiştir.
Otoklavlanan Su	Tesiste Sağlanan	Uygulanamaz	Standart su şişeleri ile ad libitum olarak sağlanan otoklavlanmış belediye suyu.
Karton Tüp	Tesiste Üretilmiş	Uygulanamaz	Düz karton tuvalet kağıdı rulosu. Dönen zenginleştirme ve barınak öğesi olarak kullanılır.
Crink-I-Nest (İşlenmiş)	The Andersons / Laboratuvar Malzemesi	CNKR	Parçalanmış kağıt zenginleştirme malzemesi. Gama-ışınlanmış. Alternatif haftalık olarak dönen zenginleştirme olarak sağlanır.
FinePointe Yazılımı	Data Sciences International	Katalog numarası yok	Versiyon 3.0 solunum veri toplama ve analiz yazılımı. WBP veri toplama ve parametre hesaplaması için kullanılır.
Bireysel Havalandırmalı Kafes (IVC) Rafı	Allentown	EP5000E	140 kafes kapasiteli egzoz paketi IVC rafı. Çift taraflı yüksek yoğunluklu sistem, otomatik havalandırma bağlantıları ile.
İşlenmiş Kemirgen Yem	Envigo	T.2918.15	Standart işlenmiş kemirgen diyeti. Tel çubuklu huniden ad libitum olarak sağlanır.
Fare Transfer Tüpü	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	100 mm uzunluğunda ve 50 mm iç çapında şeffaf polikarbonat tüp. Otoklavlanabilir ve yeniden kullanılabilir. Düşük stresli hayvan transfer prosedürleri için kullanılır.
Nestlets (İşlenmiş)	Laboratuvar Malzemesi	IRR	Sıkıştırılmış pamuklu yuva karelerinde (~5 cm × 5 cm, her biri ~2.5 g). Gama-ışınlanmış. Sabit zenginleştirme olarak sağlanır; her kafes için bir tane.
Tozsuz Nitril Eldiven	Kimberly-Clark	KC500	Mor nitril tozsuz muayene eldiveni. Tüm hayvan teması prosedürleri sırasında giyilir.
Örülmemiş Gazlı Bez Sünger	Pivetal	21295040	Steril olmayan, örülmemiş gazlı bez sünger, 4 katlı, 4 in × 4 in (10.16 cm × 10.16 cm). Zenginleştirme malzemesi olarak kullanılır.
Kağıt Havlu	Tork (Essity)	MB 540A	Beyaz katlı el havlusu. Dönen zenginleştirme malzemesi olarak kullanılır.
Akıllı Telefon Kamerası	Apple	Katalog numarası yok	iPhone akıllı telefon kamerası. Haftalık yuva puanlama dokümantasyonu için kullanılır.
Tam Vücut Pletizmografı Sistemi	Data Sciences International	10222C (2-site); 770621 (4-site)	Fareler için FinePointe FP Serisi kısıtlanmamış tam vücut pletizmografi sistemi. 2-site ve 4-site konfigürasyonlarında mevcuttur.