Protoperithecia gelişimi kullanarak neurospora crassa'da fotoperiyodik yanıtların nicelendirilmesi için plaka tabanlı görüntüleme testi

Özet

Protoperithecia Testi, Neurospora crassa'da fotoperiyodik yanıtları, tanımlanmış ışık-karanlık döngüler altında protoperithecia oluşumunu ölçerek niceliklerini nicelikle değerlendirir. Bu plaka tabanlı yöntem, deneysel koşullar arasında fotoperiyoda bağlı gelişimsel yanıtların karşılaştırılması için basit ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.

Özet

Neurospora crassa , biyolojik zamanlama ve ışıkla düzenlenen gelişimi incelemek için iyi kurulmuş bir model organizmadır. Protoperithecia Testi (PPA), protoperithecia oluşumunu gelişimsel bir çıktı olarak ölçerek fotoperiyodik yanıtları niceleyen plaka tabanlı görüntüleme yöntemidir. Bu protokolün amacı, tanımlanmış ışık-karanlık döngülerin mantar cinsel gelişimini nasıl etkilediğini değerlendirmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir iş akışı sağlamaktır. Bu testte, mantar kültürleri sentetik çaprazlama ortamında kontrollü fotoperiyot koşullarında yetiştirilir ve ardından görselleştirmeyi iyileştirmek için yüzey konidyumlarının standartlaştırılmış şekilde kaldırılması sağlanır. Protoperithesieler, manuel görüntü tabanlı sayımla nicelleştirilir ve fotoperiyot koşulları arasında istatistiksel karşılaştırmalar için plaka başına ortalama sayılar kullanılır. Önceki yaklaşımların aksine, PPA standartlaştırılmış kültür koşullarını, kontrollü fotoperiyot maruziyetini ve kuadrat tabanlı görüntülemeyi entegre ederek suşlar arasında tekrarlanabilir nicel karşılaştırmalar yapılmasını sağlar. Bu iş akışı, belirli deneysel koşullar altında fotoperiyoda bağımlı gelişim çıktısını ölçmek için tutarlı ve ölçeklenebilir bir çerçeve oluşturarak temel bir protokolün ötesine geçer. Yöntem, aşılamadan analize yaklaşık bir hafta sürer ve tanımlanmış çevresel koşullar altında birden fazla suşta uygulanabilir. PPA, mantarlarda kontrollü laboratuvar koşullarında fotoperidosa bağımlı gelişimin karşılaştırmalı analizi için basit ve erişilebilir bir platform sağlar.

Giriş

Protoperithecia testi (PPA), Neurospora crassa mantarındaki fotoperiyodik yanıtları nicelikle ölçülür. Birçok organizma, fotoperiyodizm olarak bilinen bir olguda biyolojik süreçleri koordine etmek için^{gündüz ve gece uzunluğunu ölçer} 1,2,3,4,5,6,7,8. Bu testte, kadın cinsel yapısı olan protoperithecium'un gelişimi, fotoperiyodik yanıt için ölçülebilir ve ışığa bağımlı bir vekil olarak hizmet eder. Fotoperiyodizma bitkilerde gece aracılığı^{deneyleriyle iyi tanımlanmış olsa da,} mantar gibi fotosentetik olmayan ökaryotlarda fotoperiyodik yanıtların nicelendirilmesi için daha az standart yaklaşım mevcuttur. N. crassa, iyi tanımlanmış genetiği ve ışığa duyarlı gelişim yolları sayesinde bu amaçla yönetilebilir bir model sistemi sağlar. Üreme zamanlamasının fotoperiyoda bağlı düzenlemesi^organizmalar 1,2,3,4,5,6,7,8 arasında gözlemlenmiştir ve ışık kaynaklı fizyolojik yanıtların önemini desteklemektedir; Ancak, mantarlarda yapılan mekanik çalışmalar, tekrarlanabilir testlerin eksikliği nedeniyle sınırlı kalır.

Protoperithecia, N. crassa'da erken dişi cinsel yapılardır. Ascogonia'dan kaynaklanır; bu trikojinler, zıt çiftleşme^{tipi 9'a} ait hiphae veya conidialarla birleşen sarılmış trichogynler geliştirir. Füzyonun ardından, "erkek" partnerden gelen çekirdekler protoperitésiuma girer. Üretilen protoperithecia sayısı mevsimsel olarak düzenlenir ve güçlü şekilde ışıkla indüklenir¹⁰. Fotoperiyodik düzenleme, ekoloji, kronobiyoloji ve mantar fizyolojisinin merkezinde yer alır çünkü birçok saat kontrollü süreç ışığa bağlıdır. Işık, fotoreseptörler, kinazlar ve cinsel gelişimle bağlantılı ışık iletimi mekanizmaları dahil olmak üzere birçok genetik yolu etkiler¹¹. Protoperithecia, mikroskop altında kolayca görselleştirildikleri ve ışığa hassas yanıt verdikleri için fotoperiyodik çıktıyı ölçmek için çok uygundur.

Mantarlarda fotoperiyodizmanın önemine rağmen, kontrollü ışık döngüleri altında protoperithecia üretimini nicelikle ölçemek için çok az standart ve tekrarlanabilir test mevcuttur. Orta verimlilikli, plaka tabanlı bir test, mantarların ucuz ve kolay bakımı yapılan model organizmalar olması nedeniyle değerlidir; bu da ışıkla tetiklenen cinsel gelişim ve gen fonksiyonunun sistematik analizini mümkün kılar. Çoğu fotoperiyodimizm araştırması bitkilere odaklanmışken, mantar sistemleri için eşdeğer niceliksel çerçeveler sınırlıdır. Böcekler dahil olmak üzere diğer organizmalarda, diyapoz gibi ışığa bağımlı olaylar iyi^{tanımlanmıştır,} ancak mantarlarda benzer yaklaşımlar eksiktir. Bu boşluk, suşlar ve deneysel koşullar arasında fotoperiyodik yanıtların tekrarlanabilir karşılaştırmasını kısıtlar.

PPA, 2004 yılında yapılan bir çalışmaya dayanır; bu çalışma, sürekli karanlıktan sürekli ışığa kadar artan gün sürelerinde protoperithecia üretimini ölçmüştür; bu çalışma (bd) mutantı (ras-1^bd) üzerinde yer almıştır; bu çalışma, sirkadiyen^{çalışmalarda 4,12} olarak kullanılmıştır. Bu arka planda protoperiteki üretiminde fotoperiyoda bağımlı değişiklikler gözlemlenmiştir. Mevcut iş akışı, bu yaklaşımı tam genom dizileme ve eleme kaynaklarıyla ilişkili referans suş FGSC 2489 kullanarak^{uyarlar ve genişletirler 13,14}. Test, bir hafta boyunca tanımlanmış fotoperitsler altında üretilen protoperithecia'ların ortalama sayısını fotoperiyodik yanıt için bir vekil olarak nicelikleşir. Bu yaklaşım, kültür koşullarını, görüntülemeyi ve nicelleştirmeyi standartlaştırarak deneysel koşullar ve suşlar arasında tekrarlanabilir karşılaştırma mümkün kılar. Temel metodolojik ilerlemeler arasında standartlaştırılmış plaka tabanlı kültür koşulları, tanımlanmış fotoperiyod pozlama parametreleri, dörtre tabanlı görüntüleme ve tekrarlanabilir nicelik iş akışı yer alır.

Bu protokol, tanımlanmış ışık-karanlık döngülerine maruz kaldıktan sonra protoperithecia oluşumunu ölçerek N. crassa'da fotoperiyodik yanıtları niceliklerini ölçer. Her fotoperiyodik durum için, her biri bağımsız olarak aşılanmış sentetik çaprazlama (SC) plakasından oluşan dört biyolojik replikat kullanılır. Her plaka için dört görüntü toplanır ve istatistiksel analiz için biyolojik kopya başına tek bir değer elde edilmek üzere ortalamaya alınır. Plakalar, kalibre edilmiş fotoperiyotlar altında yedi gün kuluçka edilir (örneğin, 12 saat 12 saat veya 8 saat 16 saat ışık-karanlık döngüler).

Büyüme odasına bir veri kaydedici yerleştirilerek ışık yoğunluğu, sıcaklık ve nem sürekli olarak kaydedilir ve böylece stabil çevresel koşullar doğrulanır. Işık yoğunluğu 1.000 luks'un üzerinde tutulur, çünkü düşük seviyeler protoperithecia üretimini azaltır. Odada sıcaklık artışını ve kafa karıştırıcı termal etkileri önlemek için aşırı aydınlatmadan kaçınılır. İnkubasyon sonrası, makrokonidler %70 etanol ile doymuş nemli bir kağıt havluyla nazikçe çıkarılır. Her plakanın çevresinde eşit aralıklı dört dört, parlak alan aydınlatması altında stereo mikroskop kullanılarak 40× büyütme ile görüntülenir. Protoperithesiler, görüntü işleme paketi kullanılarak manuel olarak sayılır ve fotoperiodlar arasında istatistiksel karşılaştırmalar için plaka başına ortalama sayılar kullanılır.

Protokol

Kullanılan reaktifler, yazılım ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Medya ve materyallerin hazırlanması

(Tahmini süre: 1–1,5 saat aktif zaman; gece soğutma isteğe bağlı)

1. Sentetik çaprazlık (SC) ortamı hazırla
   1. SC ortamı hazırla: %0,2 sukroz, 5 μg/L biotin, %1,5 agar ve Westergaard tuzları (pH 6,5 ile 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Ortamı otoklav edin. Dökülebilir hale gelene kadar 50–55 °C'ye kadar soğumasına izin verin.
      DIKKAT: Otoklavdan termosları çıkarırken ısıya dayanıklı eldivenler kullanın.
2. Dökme plakaları
   1. 10 mL erimiş ortamı 60 mm Petri kaplarına pipet ile tek kullanımlık pipet ile koyun.
   2. Plakaların oda sıcaklığında 30–45 dakika katılaşmasına izin verin.
   3. Tabakları ters 4 °C'de 4 haftaya kadar sakla.
      NOT: Plaka hidrasyonunu koruyun. Plakaları 4 °C'de 4 haftadan fazla saklamayın.
3. Mantar türleri hazırlayın
   1. Her suş, laboratuvar kılavuzu^{talimatlarına 15} uygun olarak hazırlanmış tam veya minimal ortam içeren küçük cam test tüplerinde yetiştirin.
   2. Tüpleri 30 °C'de sürekli karanlıkta (DD) kuluçka yapın, ta ki tüp yüzeyi boyunca görünür miselyal örtü oluşana kadar (genellikle 2–3 gün boyunca).
      DIKKAT: Mantar kültürlerini standart mikrobiyolojik uygulamalarla ele alın ve kontaminasyonu en aza indirmek için biyogüvenlik kabinde çalışın.

2. Plakaların aşılanması

(Tahmini süre: Plaka seti başına 15–30 dakika)

1. Transfer mantar konidiyleri
   1. Her SC plakasını steril teknik ve aşılama döngüsüyle aşılayın.
   2. Düz büyümeyi sağlamak için konidyumları plakanın ortasına yerleştirin (Şekil 1A). Konidiyumlar, koloni yüzeyini kaplayan toz gibi, açık renkli sporlar olarak ortaya çıkar.
   3. Plakalar arasında aşılamayı standartlaştırmak için yaklaşık 1–2 μL konsantre konidiyal süspansiyon (veya eşdeğer bir halka) uygulanır.
2. Kuluçka için plakalar hazırla
   1. Gaz değişimine izin verirken kirliliği önlemek için plakaları sıkıca kapatın.
   2. Her plakayı suş adı, tarihi ve fotoperiyot durumu ile etiketleyin.

3. Fotoperiyod tedavi kurulumu

(Tahmini süre: 10 dakika kurulum + 7 günlük kuluçka)

1. Büyüme odasını kalibre edin
   1. Odanın sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın.
   2. Plakanın kurumasını önlemek için nem seviyesini %50'ye ayarlayın (kabul edilebilir aralık: %40–%60).
   3. Fotoperiyot döngülerini programlayın: EQ (ekinoks): 12 saat ışık / 12 saat karanlık ve SDP (kısa gün): 8 saat ışık / 16 saat karanlık
   4. Plaka seviyesinde ışık yoğunluğunu kalibre edilmiş ışık ölçer kullanarak >1.000 luks'a ayarlayın. Oda sıcaklığını 25 °C'nin üzerine çıkaran yoğunluklardan kaçının.
      NOT: Odadaki ışıkların iç kısmı aşırı ısıtmadığından emin olun.
      DIKKAT: Nem korunmak için Parafilm veya plastik poşetler kullanmayın, çünkü gaz değişimini kısıtlar ve mantar büyümesini engellerler. Nem kontrolü mümkün değilse, odanın içine bir su deposu yerleştirin.
2. Plakaları hazneye yerleştirin
   1. Plakaları raflara eşit şekilde yerleştirerek ışık tabakasının eşit olmasını sağlayın.
   2. Odanın içine bir veri kaydedici yerleştirerek sıcaklık ve nemi sürekli izleyin ve stabil çevresel koşulları doğrulayın.
3. Testi başlatın
   1. Programlanmış fotoperiyot altında 7 gün boyunca rahatsız edilmeden inkubka yapın.

4. Görüntüleme için plakaların izlenmesi ve hazırlanması

(Tahmini süre: tabak başına 15–20 dakika)

1. Plakaları odadan çıkarın
   1. 7 gün kuluçkadan sonra tabakları çıkarın.
   2. Plakalarda konidial büyüme ve protoperithecia oluşumu açısından kontrol edilsin.
2. Görünürlük için temiz plakalar
   1. Yırtık kağıt havlularla plaka kapağından ve agar yüzeyinden yüzey konidiylerini çıkarın (Şekil 1B).
   2. Bir kağıt havluyu %70 etanol içeren 1–2 mL ile nemlendirin. Konidyumları çıkarmak için plaka yüzeyini 3–5 kez nazikçe spreslenin. Plakaların görüntülemeden önce 1–3 dakika boyunca hava kurumasına izin verin (Şekil 1C).
      DIKKAT: Etanol yanıcıdır; Isı kaynaklarından uzak durun.
      NOT: Aşırı baskı uygulamaktan kaçının. Havluyu agar yüzeyi boyunca sürüklemeyin, çünkü bu ortama zarar verebilir veya protoperitesiyi bozabilir.

5. Protoperithecia görüntüleme

(Tahmini süre: tabak başına 5 dakika)

1. Görüntülemeye hazırlanın
   1. Düzenli aydınlatma ve büyütme (genellikle 40×) olan bir mikroskop kurun.
   2. Plaka yüzeyinin kuru ve kalıntıdan arınmış olduğundan emin olun.
2. Fotoğraf çek
   1. Plaka çevresinde dört eşit aralıklı dört dörtlüğü tutarlı büyütme ile görebilirsiniz.
   2. Her görüntüyü gerilim, fotoperiyot durumu, plaka numarası ve kadran konumuyla etiketleyin.
   3. Görüntüleri analiz için tutarlı bir formatta (örneğin TIFF) kaydedin.

6. Niceliklendirme ve veri analizi

(Tahmini süre: Sayma için 10–20 dakika; analiz için 15–25 dakika)

1. Kont protoperithecia
   1. Her görüntüyü bir görüntü işleme paketinde açın.
   2. Protoperithecia'yı manuel olarak saymak için Cell Counter eklentisini kullanın. Baloncukları, kenar artefaktlarını ve belirsiz yapıları hariç tutun. Kümelenmiş protoperithecia'ları birey, ayırt edilebilir birimler olarak sayın.
   3. Her çeyrek için kayıt sayımları alın ve her plaka başına ortalama hesaplayın.
2. Verileri analiz et
   1. Nicel verileri istatistiksel analiz yazılımına aktarın.
   2. Şekil 2'de gösterilen karşılaştırmalar için Welch'in t-testini kullanarak istatistiksel analiz yapın.
   3. Fotoperiyot tedavilerini, suşlarını veya tekrarlarını karşılaştıran grafikler oluşturun.

Sonuçlar

Vahşi tip suşla aşılandıktan sonra, konidyumlar SC yüzeyini 36–48 saat içinde kapladı. 7 gün fotoperiyot maruz kaldıktan sonra, yoğun bir konidial tabaka oluştu ve %70 etanol ile doydurulmuş nemli bir kağıt havluyla çıkarıldı (Şekil 1). Bu adım, altta yatan protoperithecia'ları ortaya çıkardı ama yapılarını bozdu. Mikroskopi altında, protoperithecia, levha yüzeyine dağılmış koyu, dairesel yapılar olarak görülürdü. Bu yapılar küresel bir morfoloji sergiliyor ve çevresindeki hiflerden ayırt ed...

Tartışma

PPA'nın amacı, mantarlarda cinsel gelişimi bir organizmanın belirli bir fotoperiyodu algılayıp algılamadığını belirlemek için bir vekil olarak kullanmaktır. Farklı ışık döngüleri altında üretilen protoperithecia'ların ortalama sayısını nicelikle, fotoperiyodik yanıtlar koşullar arasında değerlendirilebilir ve karşılaştırılabilir. Önceki^{gözlemlerle uyumlu olarak 4,16}, N. crassa ekinoks benzeri fotoperiyotlarda daha yüksek...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	BD	90000-786	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Alcohol burner flame	Wards	470346-104	İnokülasyon döngüsünü sterilize etmek için
Ammonium iron sulfate hexahydrate	Supelco	FX0245-1	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Ammonium nitrate (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Minimal Ortam için
Autoclave	VWR International	76683-456	Cam eşyaları ve ortamları sterilize etmek için
Biological Safety Cabinet	ThermoFischer Scientific	1323TS	Plakaların ve laboratuvarın kontaminasyonunu azaltmak için
Biotin	VWR	97061-444	Sentetik Çapraz Ortam için
Boric acid (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Calcium chloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Sentetik Çapraz Ortam için
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Minimal Ortam için
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Konidyaları plaka yüzeyinden çıkarmak ve inokülasyon döngüsünü sterilize etmek için kullanılır
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Görüntü analizi/sayım için
Gloves	SW Safety Solutions	76382-944	Güvenlik için
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	İstatistiksel testler yapmak ve şekiller oluşturmak için
Growth Chamber	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Fotoperiyot döngüleri için programlanabilir
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Işık yoğunluğu ve sıcaklık kaydı için
Inoculation loop	VWR International	10806-354	Mantar malzemesini petri kabına aktarmk için
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Görüntüleme için
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Mantar suşu
Paper Towels	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	Ortam dökmek için
Permanent Marker	Sharpie	30072	Plakaları etiketlemek için
Petri Dishes	VWR International	25384-164	Sentetik Çapraz Ortam plakalama için
Pipettes	VWR International	75816-090	Ortam dökmek için
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Potassium nitrate (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Sentetik Çapraz Ortam için
Small Disposable Glass Test Tubes	VWR International	470211-698	İlk mantar suşu büyümesi için
Sodium chloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Sentetik Çapraz Ortam için
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Minimal Ortam için
Sodium hydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Sentetik Çapraz Ortam için
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için