Protoperithecia Testi, Neurospora crassa'da fotoperiyodik yanıtları, tanımlanmış ışık-karanlık döngüler altında protoperithecia oluşumunu ölçerek niceliklerini nicelikle değerlendirir. Bu plaka tabanlı yöntem, deneysel koşullar arasında fotoperiyoda bağlı gelişimsel yanıtların karşılaştırılması için basit ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Protoperithecia gelişimi kullanarak neurospora crassa'da fotoperiyodik yanıtların nicelendirilmesi için plaka tabanlı görüntüleme testi
Bu makalede
Özet
Özet
Neurospora crassa , biyolojik zamanlama ve ışıkla düzenlenen gelişimi incelemek için iyi kurulmuş bir model organizmadır. Protoperithecia Testi (PPA), protoperithecia oluşumunu gelişimsel bir çıktı olarak ölçerek fotoperiyodik yanıtları niceleyen plaka tabanlı görüntüleme yöntemidir. Bu protokolün amacı, tanımlanmış ışık-karanlık döngülerin mantar cinsel gelişimini nasıl etkilediğini değerlendirmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir iş akışı sağlamaktır. Bu testte, mantar kültürleri sentetik çaprazlama ortamında kontrollü fotoperiyot koşullarında yetiştirilir ve ardından görselleştirmeyi iyileştirmek için yüzey konidyumlarının standartlaştırılmış şekilde kaldırılması sağlanır. Protoperithesieler, manuel görüntü tabanlı sayımla nicelleştirilir ve fotoperiyot koşulları arasında istatistiksel karşılaştırmalar için plaka başına ortalama sayılar kullanılır. Önceki yaklaşımların aksine, PPA standartlaştırılmış kültür koşullarını, kontrollü fotoperiyot maruziyetini ve kuadrat tabanlı görüntülemeyi entegre ederek suşlar arasında tekrarlanabilir nicel karşılaştırmalar yapılmasını sağlar. Bu iş akışı, belirli deneysel koşullar altında fotoperiyoda bağımlı gelişim çıktısını ölçmek için tutarlı ve ölçeklenebilir bir çerçeve oluşturarak temel bir protokolün ötesine geçer. Yöntem, aşılamadan analize yaklaşık bir hafta sürer ve tanımlanmış çevresel koşullar altında birden fazla suşta uygulanabilir. PPA, mantarlarda kontrollü laboratuvar koşullarında fotoperidosa bağımlı gelişimin karşılaştırmalı analizi için basit ve erişilebilir bir platform sağlar.
Giriş
Protoperithecia testi (PPA), Neurospora crassa mantarındaki fotoperiyodik yanıtları nicelikle ölçülür. Birçok organizma, fotoperiyodizm olarak bilinen bir olguda biyolojik süreçleri koordine etmek içingündüz ve gece uzunluğunu ölçer 1,2,3,4,5,6,7,8. Bu testte, kadın cinsel yapısı olan protoperithecium'un gelişimi, fotoperiyodik yanıt için ölçülebilir ve ışığa ba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Kullanılan reaktifler, yazılım ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Medya ve materyallerin hazırlanması
(Tahmini süre: 1–1,5 saat aktif zaman; gece soğutma isteğe bağlı)
- Sentetik çaprazlık (SC) ortamı hazırla
- SC ortamı hazırla: %0,2 sukroz, 5 μg/L biotin, %1,5 agar ve Westergaard tuzları (pH 6,5 ile 1 N NaOH)15.
- Ortamı otoklav edin. Dökülebilir hale gelene kadar 50–55 °C'ye kadar soğumasına izin verin.
DIKKAT: Otoklavdan termosları çıkarırken ısıya dayanı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vahşi tip suşla aşılandıktan sonra, konidyumlar SC yüzeyini 36–48 saat içinde kapladı. 7 gün fotoperiyot maruz kaldıktan sonra, yoğun bir konidial tabaka oluştu ve %70 etanol ile doydurulmuş nemli bir kağıt havluyla çıkarıldı (Şekil 1). Bu adım, altta yatan protoperithecia'ları ortaya çıkardı ama yapılarını bozdu. Mikroskopi altında, protoperithecia, levha yüzeyine dağılmış koyu, dairesel yapılar olarak görülürdü. Bu yapılar küresel bir morfoloji sergiliyor ve çevresindeki hiflerden ayırt ed.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PPA'nın amacı, mantarlarda cinsel gelişimi bir organizmanın belirli bir fotoperiyodu algılayıp algılamadığını belirlemek için bir vekil olarak kullanmaktır. Farklı ışık döngüleri altında üretilen protoperithecia'ların ortalama sayısını nicelikle, fotoperiyodik yanıtlar koşullar arasında değerlendirilebilir ve karşılaştırılabilir. Öncekigözlemlerle uyumlu olarak 4,16, N. crassa ekinoks benzeri fotoperiyotlarda daha yüksek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, bu projeye destek, destek ve katkıları için Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung ve Morgan Bartleson'a teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca Rutgers Üniversitesi–Camden Biyoloji Bölümü ve Hesaplamalı ve Bütünleyici Biyoloji Merkezi (CCIB)'nin kurumsal destek, araştırma olanakları ve kaynakları sağladığı için takdir etmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | İnokülasyon döngüsünü sterilize etmek için |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Minimal Ortam için |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | Cam eşyaları ve ortamları sterilize etmek için |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Plakaların ve laboratuvarın kontaminasyonunu azaltmak için |
| Biotin | VWR | 97061-444 | Sentetik Çapraz Ortam için |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Sentetik Çapraz Ortam için |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Minimal Ortam için |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Konidyaları plaka yüzeyinden çıkarmak ve inokülasyon döngüsünü sterilize etmek için kullanılır |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Görüntü analizi/sayım için |
| Gloves | SW Safety Solutions | 76382-944 | Güvenlik için |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | İstatistiksel testler yapmak ve şekiller oluşturmak için |
| Growth Chamber | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Fotoperiyot döngüleri için programlanabilir |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Işık yoğunluğu ve sıcaklık kaydı için |
| Inoculation loop | VWR International | 10806-354 | Mantar malzemesini petri kabına aktarmk için |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Görüntüleme için |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Mantar suşu |
| Paper Towels | Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex | 6666114 | Ortam dökmek için |
| Permanent Marker | Sharpie | 30072 | Plakaları etiketlemek için |
| Petri Dishes | VWR International | 25384-164 | Sentetik Çapraz Ortam plakalama için |
| Pipettes | VWR International | 75816-090 | Ortam dökmek için |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Potassium nitrate (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Sentetik Çapraz Ortam için |
| Small Disposable Glass Test Tubes | VWR International | 470211-698 | İlk mantar suşu büyümesi için |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Sentetik Çapraz Ortam için |
| Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Minimal Ortam için |
| Sodium hydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Sentetik Çapraz Ortam için |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Sentetik Çapraz Ortam/Minimal Ortam için |
Kaynaklar
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
