Pediatrik Kohort İçerisindeki Tip I interferonopatilerde vaskülitle ilişkili genetik varyantların yaygın sınıfı

Özet

Otoinflamatuar hastalık şüpheli 1.204 pediatrik hastanın tam ekzom dizilenmesinde, 132 vakada interferopati ilişkili varyantlar tespit edildi ve bunların 79'u yeni mutasyonlar dahildir. Çoğu heterozigottu, vaskülitik fenotiplerle bağlantılıydı. Bu bulgular, genetik testlerin tanısal değerini ve pediatrik vaskülitte düzensiz tip I interferon sinyalinin merkezi rolünü vurgulamaktadır.

Özet

Pediatrik vaskülit geleneksel olarak histopatolojik değerlendirmeyle teşhis edilir; ancak giderek daha az invaziv görüntüleme temelli yaklaşımlar klinik uygulamada kullanılmaktadır. Bu gelişmelere rağmen, hastalık mekanizmalarını anlamak, prognozu tahmin etmek ve hedefe yönelik tedavi stratejilerini yönlendirmek için altta yatan monojenik etiyolojinin tanımlanması hayati olmaya devam etmektedir. Tip I interferopatiler, yapısal interferon sinyalleri ve sık sık vaskülitik veya vaskülopatik belirtilerle karakterize edilen heterojen bir bağışıklık aracılı bozukluk grubunu oluşturur. Nüklein asit algılama yollarının sürekli aktivasyonu ve hücre içi homeostazın bozulması, endotel işlevsizliğine ve kronik vasküler iltihahafa katkıda bulunur.

Bu çalışma, pediatrik otoinflamatuar hastalık kohortunda interferopati ile ilişkili genlerde vaskülit ile ilişkili varyantların tespit edilmesi için kapsamlı bir genetik analiz iş akışı sunmaktadır. Tam ekzom dizileme, otoinflamatuar bozukluklardan şüphelenen 1.204 hastada gerçekleştirildi. Kodlama bölgelerini ve birleştirme noktalarını etkileyen varyantlar, Amerikan Tıp Genetiği ve Genomik Koleji rehberlerine dayanan biyoinformatik bir boru hattı kullanılarak analiz edildi; ayrık Fourier dönüşümlerinden (DFT) esinlenen istatistiksel filtreleme ve sinyal işleme teknikleri ile istatistiksel dağılımlar entegre edilerek varyantların önceliklendirilmesi ve yorumlanmasını iyileştirdi.

Interferopati ile ilişkili varyantlar, romatoloji kliniği veri tabanı aracılığıyla değerlendirilen 132 pediatrik hastada tespit edildi. Genel olarak, daha önce bildirilen patojenik veya muhtemel patojenik varyantlar ve Şubat 2026 itibarıyla kamuya açık veri tabanlarında bulunmayan 79 yeni varyant dahil olmak üzere 92 benzersiz varyant tespit edildi. Klinik belirtiler çoğunlukla tekrarlayan ateş, vaskülitik belirtiler ve karmaşık otoinflamatuar belirtileri içeriyordu.

Varyantlar, STING aktivasyonu, nüklein asit metabolizması ve hücre içi trafik bozukluğu ile bağlantılı yollar dahil olmak üzere interferon sinyal ve doğuştan bağışıklık aktivasyonu ile ilişkili genleri içeriyordu. Bu disiplinlerarası çalışma akışı, pediatrik vaskülitte genomik analizin potansiyel tanısal faydasını göstermekte ve damar hasarı ile otoinflamatuar hastalık patogenezinde sürekli interferon sinyalinin önemini vurgulamaktadır.

Giriş

Pediatrik vaskülit geleneksel olarak histopatolojik değerlendirme yoluyla teşhis edilmiştir ve bu değerlendirme altın standart olarak kalmaya devam etmektedir. Ancak, son tanı stratejileri giderek daha az invaziv yaklaşımları, özellikle görüntüleme tabanlı yöntemleri tercih etti. Bu gelişmelere rağmen, çocukluk vaskülitinde altta yatan monojenik etiyolojinin tespit edilmesi son derece önemlidir; çünkü hastalık mekanizmaları, prognozu ve hedefe yönelik tedavi fırsatları hakkında kritik bilgiler^{sağlar 1,2}.

Sistemik iltihap ve çoklu organ katılımıyla ortaya çıkan çocuklarda çocukluk vazküliti şüphesi olmalıdır. Tanı koymak ve taklit dışı bırakmak için kapsamlı öykü alınması, kapsamlı fizik muayene, laboratuvar incelemeleri, görüntüleme çalışmaları ve bazı durumlarda doku biyopsileri gereklidir. Erken teşhis ve tedavi gereklidir çünkü tedavi edilmez hastalık hayati tehlike oluşturan komplikasyonlara veya uzun vadeli sonuçlara yol^{açabilir 1}.

Tip I interferopatiler, sürekli tip I interferon yolu aktivasyonu ve tekrarlayan vaskülitik veya vaskülopatik özelliklerle işaret edilen çeşitli monojenik ve karmaşık bağışıklık aracılı^{bozukluklar spektrumunu içerir 3,4}. Düzensiz nüklein asit algılama ve hücre içi homeostazın bozulması, sürekli interferon aşırı üretimini damar iltihabı ve hasara bağlayan merkezi patojenik mekanizmalardır. TMEM173'de fonksiyon kazanımı mutasyonları (STING1), bebeklikte başlayan STING ile ilişkili vaskülopatiye (SAVI) yol açarken, otozomal dominant COPA mutasyonları endoplazmik retikülum-Golgi taşığını bozarak anormal STING aktivasyonuna ve vaskülitik^{fenotip 3-5'e} yol açar. Nüklein asit metabolizması genlerindeki kusurlar (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 ve IFIH1) nedeniyle oluşan ek interferonopatiler, interferon düzensizliği ile vasküler^{patoloji 3} arasındaki mekanistik bağlantıyı daha da vurgulamaktadır (bkz. Şekil 1).

Şekil 1. Pediatrik kohortlarda endotel disfonksiyonu ve mikrovasküler hasarı tetikleyen tip I interferopatilerin ayrıntılı patojenik mimarisi. (Sol) Pediatrik tip I interferopatinin sistemik bağlamı: kusurlu benlik ile öz-olmayan ayrımcılık ve anormal konak nüklein asit algılama tetikleyici sistemik otoinflamatiftifasyon. Klinik fenotipler, erken başlangıçlı deri vaskülopati ve sistemik katılım ile belirgin şekilde karakterize edilir ve genellikle chilblaine benzeri cilt lezyonları olarak ortaya çıkar. (Orta) Genetik kusurun sistemik düzensizliklere mekanik zinciri: nükleik asit klirens enzimlerinde (örneğin, DNASE1, TREX1) işlev kaybı mutasyonları, sitoplazmada endojen DNA ve RNA'nın anormal birikimine yol açar. Aynı zamanda, STING1 gibi sensörlerdeki fonksiyon kazanımı mutasyonları, viral tetikleyicilerden bağımsız olarak cGAS-STING yolunun temel aktivasyonunu tetikler. Bu patojenik intrasitoplazmik algılama, interferon düzenleyici faktörleri hiperaktive eder ve tip I interferonların (IFN-α/β) sürekli sentezine yol açar. Kronik sitokin çıkışı, IFNAR1/2 reseptörleri aracılığıyla kendi kendini sürdüren sistemik amplifikasyon döngüsü oluşturur; bu döngü, zayıf boşalma mekanizmaları ve pozitif geri bildirim kontrolleri nedeniyle daha da kötüleşir. (Sağ) Patolojik sonuç: Dolaşımdaki IFN-α/β'nin endotel hücre reseptör kompleksine kalıcı bağlanması, JAK-STAT aktivasyonunu sürekli tetikler. Bu sürekli homeostatik bozulma, devam eden endotel stresini tetikler ve fizyolojik vazorelevasyon mekanizmalarını bozar. Kapiller seviyede, bu hiper-inflamatuar durum doğrudan endotel hücre hasarı, önemli damar duvarı kalınlaşması ve luminal mikrovasküler tromboza yol açar; bu durum otoantikor aracılı otoimmün yollar olmadan şiddetli doku iskemisi ve nekrotizan mikrovaskülopatiya yol açar. Kısaltmalar: cGAS-STING = interferon genlerinin döngüsel GMP-AMP sintez-stimlatörü; DNASE1 = deoksiribonükleaz 1; GoF = fonksiyon kazancı; IFN = interferon; IFNAR = interferon alfa/beta reseptörü; IRF = interferon düzenleyici faktör; JAK-STAT = Janus kinaz-sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyonun aktivatörü; STING1 = interferon yanıtı cGAMP interaktörü 1'in uyarıcısı; TREX1 = üç temel onarım ekzsünükleaz 1. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu yaklaşım, geleneksel yöntemlerin nadir mutasyonların erken önceliklendirilmesinde analitik zorluklarla karşılaşabileceği ve nötrofil heterojenliğinin nüks riskini tahmin etmede kritik rol oynadığı için, pediatrik otoinflamatuar kohortlarda interferopati ile ilişkili gen varyantlarını tespit etmek için^{geliştirilmiştir 6}. Literatürde, interferon sinyal düzensizliğinin küçük damar vaskülitinde rolü, tek hücre analizleriyle açıklanmış ve pediatrik kohortlarda erken tanı için tam ekzom dizilemesinin (WES) avantajını^{vurgulamaktadır 6}.

Monojenik otoinflamatuar sendromlar, vaskülit veya vaskülit benzeri belirtilerle ortaya çıkabilir. Örneğin, SAVI küçük veya orta damar^{vasküliti 7'yi} taklit edebilir. Benzer şekilde, genç idiopatik artrit (JIA), yetişkinliğe kadar devam edebilen ve interferonopati benzeri düzensizlikle ilişkili olan heterojen bir çocukluk başlangıcı inflamatuar hastalıklar grubunu temsil eder; bu da pediatrik kohortlarda genetik analiz gerekliliğini^{vurgular. 8}.

Tip I interferonopatiler, konak kaynaklı nükleik asitler tarafından tetiklenen antiviral sensörlerin aktivasyonuyla karakterize edilen Mendel doğuştan gelen bağışıklık hatalarıdır ve kendilik ile kendini ayırt etmemede bir^{başarısızlığı temsil eder 3,4}. Bu bozukluklar, tip I interferon sinyalinin yukarı regulasyonu ile tanımlanır ve dermatolojik belirtiler genellikle önemli tanısal ipuçları sağlar. SAVI, TMEM173 fonksiyon kazanımı mutasyonlarıyla ilişkilidir ve erken başlangıçlı deri vaskülopati ve akciğer iltihabı^{ile birlikte görülür 9}. P.V155M mutasyonu, en sık bildirilen^{varyant 10'dur}. SAVI, STING1 mutasyonlarıyla ilişkili nadir bir otoinflamatuar hastalıktır; erken interstisyel akciğer hastalığı (ILD) ve deri lezyonları ile karakterize edilir ve klinik olarak sistemik lupus eritematozus'u (SLE⁾¹ taklit edebilir. Düzensiz tip I interferon sinyalizasyonu ayrıca anti-nötrofil sitoplazmik antikor (ANCA) ile ilişkili vaskülitte (AAV) rol oynamıştır. AAV'de, tip I interferon imzası mikroskobik polianjiit/miyeloperoksidaz-ANCA ile ilişkili vaskülitte (MPA/MPO-AAV) baskındır ve böbrek prognozuyla ilişkilidir; bu da nadir varyantların interferon^{düzensizliğine katkısını vurgular.}

Monojenik otoinflamatuar sendromlar, vaskülit veya vaskülit benzeri belirtilerle ortaya çıkabilir. Örneğin, SAVI küçük veya orta damar^{vasküliti 7'yi} taklit edebilir. Daha önce, STING1 mutasyonlarını aktive eden hastaların en büyük küresel kohortu tanımlanmış, SAVI^13'ün genişletilmiş klinik ve immünolojik fenotipik karakterizasyonunu sağlamıştır. Son yirmi yılda, hem hematopoietik hem de hematopoietik olmayan hücreler tarafından patojenlerin tanınmasını anlamada kayda değer ilerlemeler kaydedilmiştir. Mikrobiyal bileşenler, bu yanıtı başlatmada önemli bir adım, germline kodlanmış reseptörler aracılığıyla tespit^{edilir 14}. 2006 yılında, DNA'nın çeşitli hücre tiplerine transfeksiyonun, tip I interferonların ötü benzeri reseptör (TLR) bağımsız bir şekilde yukarı regulasyonunu indükettiği gösterilmiştir. Bu bağlamda, endoplazmik retikuluma lokalize olan bir transmembran protein olan STING, 2008 yılında sentetik ve viral DNA^13'e karşı tip I interferon yanıtlarının önemli bir aracı olarak tanımlanmıştır. STING1'deki fonksiyon kazanımı mutasyonları, SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴ olarak bilinen tip I interferopatiye yol açar. Bu şiddetli hastalık, erken başlangıçlı sistemik iltihaplanma, deri vaskülopati ve interstisyel akciğer hastalığı (ILD) ile değişken şekilde karakterize ^edilir.14 SAVI nadirdir, bugüne kadar 37 aileden 52 hasta rapor edilmiştir ve çoğu vaka de novo ortaya çıkar, ancak otozomal dominant kalıtım da belgelenmiştir. Daha önce, STING1 mutasyonlarını aktive eden en büyük küresel hasta grubu tanımlanmıştı ve SAVI ^{9,10,11˒14'ün} genişletilmiş klinik ve immünolojik fenotipik karakterizasyonunu sağladı.

Bu protokol, otoinflamatuar özelliklere sahip pediatrik hastalarda interferopati ile ilişkili gen varyantlarının WES tabanlı genetik analizle erken tespit edilmesini sağlamak için geliştirilmiştir; çünkü geleneksel yaklaşımlar nadir mutasyonları tespit etmekte yetersiz olur ve erken müdahale fırsatlarını kaçırabilir. Literatür, vaskülit benzeri fenotiplerde interferon yukarı regülasyonunun rolünün Mendel bozukluklarının incelenmesiyle netleştirildiğini ve WES'in nadir varyant^{tespiti için avantajını daha da vurguladığını göstermektedir 4,7,12}.

Bu yöntemin temel amacı, fizik tabanlı sinyal işleme prensiplerini basitleştirilmiş biyofiziksel hesaplamalı modelleme ile birleştirerek tip I interferopatiler için WES verilerinde varyant algılamanı desteklemek ve özellikle Janus kinaz-sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyon aktivatörü (JAK-STAT) zinciri üzerindeki sonraki etkileri yorumlamaktır. Bu keşif yaklaşımı, dizileme gürültüsü ve bağışıklık aracılı bozuklukların düzensiz kapsamasından sıkça etkilenen genomik bölgelerin analizini tamamlamayı amaçlar; bu bölgelerde interferon aktivasyonu vaskülitik fenotipleri yönlendirir. Standart biyoinformatik iş akışları genellikle standart kalite metriklerine odaklanır; bu da STING1 veya TREX1 gibi genlerde karmaşık bölgelerdeki varyantları tespit ederken ek destekleyici filtreleme için yer bırakabilir. Ayrı Fourier dönüşümlerinden (DFT) ve istatistiksel dağılımlardan ilham alan sinyal işleme tekniklerini uygulayarak, bu yöntem nükleotid dizilerinden temel genomik özellikleri çıkarır, mutasyon desen analizi için ikili göstergeler (A, T, C, G) haritalamalarından^{oluşur 15}. Ayrıca, interferon yollarının biyofiziksel modellemesi, genetik varyantların endotel işlevsizliğini nasıl sürdürebileceğini değerlendirmek için eşik davranışı ve kümülatif sinyal güçlendirmesini içeriyor; özellikle JAK-STAT yolunun tip I interferon (IFN-α/β) sinyallerini iletmedeki rolüne odaklanıyor.

Bu keşif uygulaması, düşük kapsama alanındaki hizalama profillerini incelemek için tasarlandı. Standart hesaplama araçları birincil varyant filtreleme sağlarken, destekleyici model SNR tabanlı değerlendirmenin, nonuniform okuma dağılımından etkilenen kodlayan tek nükleotid varyantlarının (SNV) ikincil niteliksel geçişi sunup sunamayacağını araştırır. Bu fizik temelli yaklaşım, genotip kalitesini ve küçük okuma oranlarını değerlendirmek için SNR optimizasyonunu kullanır. Daha geniş literatürde, benzer stokastik modelleme, JAK-STAT yollarında hepsi ya da hiç dinamik yerine dereceli yanıtlar ortaya koymuştur ve bu da interferon aşırı üretiminin daha iyi tahmin^{edilmesini sağlamıştır 16}. JAK-STAT yolu, tip I interferonların (IFN) IFNAR1/IFNAR2 reseptörlerine bağlanmasıyla aktive edilir ve Janus kinazların (JAK1, TYK2) STAT1 ve STAT2'yi fosforile etmesini içerir; böylece nükleer translokasyon ve ISG transkripsiyonu¹⁷ için IRF9 ile ISGF3 kompleksi oluşturur. Bu, IFN-β indüksiyonu için sıradan diferansiyel denklemler (ODE'ler) kullanılarak modellenebilir:

burada listelenen parametreler, fosforilasyon hızını, defosforilasyonu ve SOCS1 üzerinden negatif geri bildirimi temsil eder ve eşik bağımlı^{amplifikasyonu 17'yi} vurgular. Ek detaylar arasında IFN-γ sinyalizasyonu için STAT1 homodimer oluşumu yer alır, ancak tip I interferopatilerde sürekli aktivasyon aşırı ISG ekspresyonuna yol açar. Stokastik simülasyonlar, Gillespie algoritmalarını kullanarak reseptör-ligand bağlanması ve nükleer ithalatta gürültü modellemekte değişkenliği daha da açıklar ve IFN yanıtlarında hücreden hücreye heterojenliği^{ortaya koyar.} Bu yöntem, otoinflamatuar vasküliti araştıran araştırmacılar için özellikle uygundur; çünkü parakrin etkileri içeren genişletilmiş ODE'ler gibi yol düzensizliği ile varyantları ilişkilendiren nicel bir çerçeve sunar:

burada listelenen parametreler üretim hızı, bozulma ve parakrin takviye^18'i temsil eder. Yüksek verimlilikli dizileme verilerine ve hesaplama kaynaklarına erişimi olan kullanıcılar, bu yaklaşımı aday varyantlarını önceliklendirmek ve potansiyel yol etkilerini incelemek için uygulayabilirler.

Bu çalışma, vaskülit sınıflandırmasındaki zorluklar ve geleneksel yaklaşımların sınırlamaları nedeniyle klinik ekzom dizileme (CES)/WES tabanlı genetik analiz protokolü kullanılarak, otoinflamatuar özellikler gösteren büyük bir pediatrik kohortta interferopati ile ilgili genlerde vaskülitle ilişkili varyantları belirlemek için multidisipliner bir romatoloji ve genetik yaklaşımı kullanılarak planlandı. Ayrıca, çalışma çocukluk vazkülitinde genetik değerlendirmenin tanısal değerini vurgulamayı amaçladı.

2012 Chapel Hill Vazkülit Sınıflandırması, monojenik otoinflamatuar^{vaskülit 19'u} içermemektedir. Bu çalışma, otoinflamatuar semptomları olan bir grup pediatrik hastada tespit edilen interferopati ile ilişkili varyantların sıklığını belirlemeyi, nadir hastalıklar veritabanının genişletilmesine katkıda bulunmayı ve pediatrik vaskülitte genetik değerlendirmenin önemini vurgulamayı amaçladı.

Protokol

Bu protokol, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm çevresel kan örnekleri, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak hastalardan veya yasal vasilerinden yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra alındı. Bu retrospektif tek merkezli çalışma, şüpheli otoinflamatuar hastalık için genetik analiz geçirilen hastalar arasında interferopati ilişkili varyantların sıklığını değerlendirmek ve bunların vaskülit ile ilişkisini incelemek amacıyla tasarlanmıştır. 2022 ile 2025 yılları arasında, otoinflamatuar hastalık ön tanısı ile Ege Üniversitesi Moleküler Tıp Laboratuvarı'na gönderilen periferik kan örnekleri dahil edilmiştir. Toplamda 1.204 örnek genetik analizden geçti. CES/WES, ekzonları ve bitişik intronik dizileri hedefleyen bir yeni nesil dizileme (NGS) yaklaşımı olarak kullanıldı. Varyantlar ACMG kriterleri ve biyoinformatik analizlerle sınıflandırıldı. İyi huylu ve potansiyel olarak iyi huylu varyantlar hariç tutuldu. Bunlar arasında, girişim kriterlerini karşılayan ve tanımlanmış interferopati ilişkili varyantları olan 132 pediatrik vaka nihai çalışma kohortuna dahil edilmiştir.

Bu pediatrik grup içinde, klinik veriler bir romatoloji kliniği veritabanından alındı. Genel olarak, 132 hasta arasında 92 benzersiz genetik varyant tespit edildi; bunlar arasında daha önce bildirilen patojenik veya muhtemel patojenik varyantlar kamu varyantlarında (örneğin ClinVar) belgelenmiş ve Şubat 2026 itibarıyla kamu veritabanlarında olmayan 79 yeni varyant bulundu. Çoğu varyant heterozigottu, CAPS benzeri fenotipler veya karmaşık otoinflamatuar vaskülit sunumlarıyla ilişkiliydi. WES, splice-site ve düzenleyici varyantları tespit etmek için protein kodlayan bölgeleri (ekzonlar) ve bitişik intronik dizileri hedefleyen NGS yaklaşımı kullandı. WES insan genomunun yaklaşık %1–2'sini kapsa da, bilinen hastalık neden olan mutasyonların neredeyse %85'ini yakalarak nadir varyant tespiti için son derece verimli bir araç haline gelir.

Laboratuvar iş akışı, periferik kandan genomik DNA çıkarımı, DNA parçalanması, adaptör tabanlı kütüphane hazırlığı ve biotin-streptavidin pulldown yoluyla hibritizasyon tabanlı yakalama probları kullanılarak ekzom zenginleştirmesini içeriyordu. Yüksek verimli çiftli uçlu dizileme DNA nanoball dizileme platformunda gerçekleştirildi ve güvenilir varyant tespiti için ortalama 100–200x kapsama derinliği elde edildi. Biyoinformatik analiz, referans genomla hizalanma, varyant çağrısı ve özenle hazırlanmış varyant veritabanları kullanılarak açıklamayı içeriyor; varyant sınıflandırması ise Amerikan Tıp Genetiği ve Genomik Koleji (ACMG) yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Varyantlar daha önce rapor edilmiş veya yeni olarak kategorize edildi. Seçilen varyantlar Sanger dizilemesiyle doğrulandı.

Standart biyoinformatik boru hatlarına ek olarak, dizileme derinliği, kapsama uyumu ve sinyal-gürültü özelliklerini değerlendirmek için fizik tabanlı sinyal işleme prensipleri ve basitleştirilmiş hesaplamalı modelleme uygulandı; böylece ham dizileme derinliği ve bölgesel kapsama analizi için keşfe uygun ve tamamlayıcı bir katman sağlandı. Ayrıca, vaskülitle ilişkili genetik varyantların kümülatif etkisini değerlendirmek için biyofiziksel modelleme kavramları kullanıldı.

Bu disiplinlerarası çerçeve, özellikle anti-interferon tedavi stratejilerini yönlendirmek için keşif amaçlı bir araştırma bağlamında varyant-filtreleme özelliklerini incelemek için ön laboratuvar modeli olarak hizmet vermektedir. Sınırlamalar arasında, düşük seviyeli mozaik varyantlarına karşı hassasiyetin azalması ve yeni bulguların fonksiyonel doğrulama gerekliliği yer almaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında pediatrik vaskülitin erken teşhisi, kişiselleştirilmiş terapötik karar alma ve immünoloji, romatoloji ve damar tıp ile ilgili varyant veritabanlarının genişletilmesi yer almaktadır.

DNA parçalanması

Yirmi mikrolitre seyreltilmiş DNA yeni steril PCR tüplerine aktarıldı. Her tüpe 2 μL parçalanma/adenilasyon tamponu ve 3 μL parçalanma/adenylasyon enzim karışımı eklendi; toplam reaksiyon hacmi 25 μL idi. Karışım nazikçe karıştırıldı, kısa süreliğine santrifüjlendi ve parçalanma programı termal döngücü üzerinde çalıştırıldı. Tamamlandıktan hemen sonra, borular kısa bir süreliğine santrifüjlenerek buz üzerine konuldu. Beklenen sonuç, ortalama 200–300 bp arasında bir DNA parça boyutuydu.

Adaptör ligasyonu

Her parçalanma ürününe 2,5 μL dizileme adaptörü eklendi, ardından 10 μL ligasyon ana karışımı (vorteks olmadan) eklendi. Karışım, homojenliği sağlamak için nazikçe pipetlendi, kısa bir süreliğine santrifüjlendi ve termal döngücü kapağı açık iken 20 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edildi. İnkubasyondan sonra tüpler kısa bir süre santrifüjlenerek buzda tutuldu.

Boncuk bazlı arıtma

Her numuneye otuz mikrolitre manyetik boncuk eklendi ve pipetle iyice karıştırıldı, ta ki homojen bir süspansiyon elde edilene kadar. Karışım oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka edildi ve ardından tüpler manyetik bir standa 3 dakika kondu. Üst madde temizlendikten sonra dikkatlice çıkarıldı. Pellet, 100 μL %80 etanol ile iki kez yıkanmış ve son yıkamadan sonra kalan etanol çıkarılmıştır. Boncuklar manyetik standda 5 dakikaya kadar hava kurutuldu. Dokuz mikrolitre nükleazsız su eklendi, pelet pipetle yeniden askılandı ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka altına alındı. 3 dakika manyetik ayrımdan sonra, 7,5 μL süpernatant yeni etiketlenmiş bir PCR tüpüne aktarıldı.

PCR amplifikasyonu

In vitro transkripsiyon (IVT) primerler seyreltildi (20 μL primer stok + 80 μL nukleazsız su). PCR reaksiyonu için (toplam hacim 17,5 μL), 2,5 μL IVT primer 1, 2,5 μL IVT primer 2 ve 12,5 μL kütüphane amplifikasyon master karışımı eklendi. Karışım nazikçe pipetlendi ve PCR-3 programı gerçekleştirildi.

PCR sonrası arındırma

Her PCR ürününe yirmi beş mikrolitre manyetik boncuk eklendi. Oda sıcaklığında 5 dakikalık kuluçka ve manyetik ayrımdan sonra, boncuklar 100 μL %80 etanol ile iki kez yıkandı. 5 dakikaya kadar hava kurutmasından sonra 11 μL nükleazsız su eklendi. On mikrolitre süpernatant yeni bir tüpe aktarıldı. Kütüphane yoğunluğu ölçüldü; hedef: >25 ng/μL.

Havuzlama ve hibritleşme (havuz başına örnekler)

Kütüphaneler, havuz başına sekiz hasta örneği (örnek başına 93,75 ng, toplam 750 ng) toplanmıştır. Hacm, gerekirse nukleazsız su ile 12,5 μL'ye ayarlandı. Hibritleşme karışımı, 65 °C'de 15 dakika önceden kübe edildi. Bloklama çözeltisi, evrensel bloklayıcı oligonukleotidler, ekzom yakalama probu, nükleazsız su ve hibritizasyon artırıcı sırayla eklendi. 16 saat hibritleşme programı başlatıldı (18:00–10:00).

Hibritleşmiş hedeflerin streptavidin boncuklarına yakalanması

Streptavidin boncukları üç kez bağlanma tamponuyla yıkandı. 16 saatlik hibritleşmeden sonra, karışım boncuklara eklendi ve 25 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka halinde, her 5 dakikada bir nazikçe karıştırıldı. Yıkama, oda sıcaklığında yakalama yıkama tamponu 1 ile gerçekleştirildi, ardından 48 °C'de kuluçka dahil olmak üzere önceden ısıtılmış (48 °C) yakalama yıkama tamponu 2 ile üç yıkama yapıldı. Son yıkamadan sonra, pellet 23 μL nükleazsız suya yeniden asıldı.

Tek zincirli DNA (ssDNA) hazırlanması

Yirmi dört mikrolitre TE tamponu eklendi ve karışım 95 °C'de 3 dakika boyunca denatüre edildi, ardından hemen buz üzerine kondu. Splint ligasyon tamponu ve hızlı DNA ligaz içeren bir ana karışım eklendi ve tek zincirli DNA'yı daireselleştirmek için SS-2 programı (37 °C, 30 dakika) çalıştırıldı. Sindirim tamponu ve sindirim enzim karışımı eklendi ve SS-3 programı (37 °C, 30 dakika) çalıştırıldı. Daha sonra, 3.75 μL sindirim durdurma tamponu eklendi. Seksen beş mikrolitre manyetik boncuk eklendi, ardından standart boncuk arıtması yapıldı. On beş mikrolitre süpernatant yeni bir tüpe aktarıldı; beklenen konsantrasyon 0.8–2 ng/μL idi.

DNA nanoball (DNB) hazırlanması

DNB oluşumu için ssDNA ürünleri kullanıldı. DNB oluşum tamponu, düşük EDTA TE tamponu ve DNB enzim karışımları 1 ve 2 eklendi. DNB-1 ve DNB-2 programları sıralı olarak yürütülüyordu. Tamamlandıktan sonra, 20 μL DNB reaksiyon durdurma tamponu eklendi ve geniş delikli pipet uçlarıyla nazikçe (5–8x) karıştırıldı; Beklenen konsantrasyon 8–40 ng idi. Hazırlanan DNB'ler, yüksek verimli dizileme için DNA nanoball dizileme platformuna yüklendi.

Dizileme veri işleme ve sinyal analizi

Ham dizileme okumaları FastQC (v0.11.9) ve fastp (v0.23.1) kullanılarak kalite kontrollü yapıldı. Sinyal-gürültü oranı (SNR) eşiği 20 dB, bilinen otoinflamatuar varyantların kıyaslama veri setine karşı alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrisi analiziyle optimize edildi; düşük frekanslı varyantlar için %<1 sahte keşif oranı (FDR) ile %>95 hedef hassasiyeti dengelendi; bu 20 dB eşiğinin altına düşen okumalar atıldı. Genom Referans Konsorsiyumu İnsan Yapısı 38 (GRCh38) referans genomu ve ilk varyant çağrısı BWA-MEM (v0.7.17) ve Genom Analiz Araç Seti (GATK, v4.2.6) kullanılarak gerçekleştirildi.

Fizik tabanlı sinyal işleme adımları için, nükleotid dizileri ikili sayısal sinyallere dönüştürüldü (0 purinleri, 1 pirimidinleri temsil eder). DFT'yi hesaplamak için, ikili sinyal N = 512 baz çifti kaydırma penceresi ve %50 örtüşme (256 bp adım boyutu) ile işlenerek lokal genomik çözünürlüğü sürdürdü. DFT şu şekilde tanımlanmıştır:

Yüksek frekanslı dizileme artefaktlarını, keskin, yüksek frekanslı lokalize geçişler olarak ortaya çıkan gerçek tek nükleotid varyantlarını (SNV) aşırı yumuşatmadan filtrelemek için, programlı olarak düşük geçirimli dijital bir filtre kalibrasyon yapıldı. Optimal normalize kesme frekansı (fc), 0,05–0,25 döngü/baz aralığı tarama yoluyla yinelemeli olarak belirlendi. Optimizasyon algoritması, fc = 0.15 döngü/taban seçti; bu, sinyal güç spektrumunun bilinen gerçek-pozitif kontrol varyantlarının toplam varyansının ≥%85'ini korurken arka plan teknik gürültüsünü ortadan kaldırdığı dönüş noktası olarak tanımlandı. DFT tabanlı filtreleme, Python (v3.9) ile yazılmış özel betikler kullanılarak uygulandı; özellikle NumPy (v1.23.0) ve SciPy (v1.9.1) kütüphaneleri kullanılarak yüksek frekanslı gürültüyü azaltırken mutasyonla ilişkili spektral özellikler korundu. Filtreleme parametreleri, nadir varyant sinyallerin aşırı yumuşatılmasını önlemek için programatif olarak modüler olarak kalibre edildi. Sinyal işleme ve biyofiziksel modelleme için entegre iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.

Interferon sinyalinin biyofiziksel ve stokastik modellemesi

Tanımlanan varyantların fonksiyonel sonuçlarını incelemek için, JAK–STAT yol dinamikleri sıradan diferansiyel denklemler (ODE'ler) kullanılarak modellenmiştir ve bunlar şu şekilde tanımlanmıştır:

Deterministik ODE simülasyonları COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) kullanılarak yürütüldü ve scipy.integrate.solve_ivp modülü kullanılarak özel Python betikleriyle desteklendi. Biyolojik olarak gerçekçi başlangıç koşulları belirlendi ve SALib (Python'da Duyarlılık Analiz Kütüphanesi, v1.4.5) kullanılarak amplifikasyon oranı sabitleri üzerinde hassasiyet analizleri yapıldı. TYK2 aracılı IFN-α sinyal kinetikleri, fonksiyon kazancı odaklı STAT2 amplifikasyonunu simüle etmek için dahil edilmiştir.

Stokastik etkiler Langevin formülasyonu kullanılarak tanıtıldı:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Ayrıca, GillesPy2 (v1.7.0) Python kütüphanesi kullanılarak transkripsiyonel patlama ve heterojen IFN-β indüklenmiş interferon uyarılmış gen (ISG) aktivasyonunu modellemek için GillesPy2 stokastik simülasyonları gerçekleştirildi. Gamma-çekirdeği formülasyonlarıyla temsil edilen dağıtık gecikme fonksiyonları, gecikmeli transkripsiyonel geri besleme mekanizmalarını simüle etmek için sayısal entegrasyon kullanılarak Python'da uygulanmıştır. Sinyal filtreleme ve matematiksel modelleme dahil tüm hesaplamalı boru hatları, Linux tabanlı yüksek performanslı hesaplama (HPC) ortamında yürütülüyordu.

Şekil 2. JAK-STAT sinyal işleme ve biyofiziksel modelleme için entegre çerçeve. 1: Sinyal işleme aşaması: Nukleotid dizilerinin ikili eşlenmesi (pürinler = 0, pirimidinler = 1) ardından DFT tabanlı filtreleme. Doğru varyant çağrısı için kritik SNR eşiği 20 dB'ye dikkat edin. 2: Biyofiziksel modelleme: Başlangıç koşullarındaki küçük bozulmaların sürekli sinyal ilerlemesinde eşik kaymalarına yol açtığı ODE tabanlı amplifikasyon oranlarının simülasyonu. 3: Biyolojik fenotip: IFN-α yolunda TYK2 fonksiyon kazanma varyantlarının modellenmesi, bu da STAT2 aktivasyonunun artırılmasına ve ortaya çıkan interferopati fenotiplerine yol açar. Kısaltmalar: DFT = ayrık Fourier dönüşümü; IFN-α = interferon alfa; JAK-STAT = Janus kinaz-sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyonun aktivatörü; ODE = sıradan diferansiyel denklem; SNR = sinyal-gürültü oranı; STAT2 = sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyon 2'nin aktivatörü; TYK2 = tirozin kinaz 2. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2, DFT tabanlı sinyal işlemenin keşif hesaplamalı iş akışında kullanılan ODE ve stokastik modelleme bileşenleriyle entegrasyonunu özetlemektedir. Bu kapsamlı protokol, pediatrik otoinflamatuar vaskülitte interferopati ile ilişkili varyantların tespit ve işlevsel yorumlanmasını desteklemek için gelişmiş moleküler genetik, yüksek verimli dizileme teknolojileri, sinyal işleme algoritmaları ve biyofiziksel modellemeyi entegre eder.

İstatistiksel çerçeve ve sinyal haritalama olasılık dağılımı

Sinyal filtrelemeden önce genomik dizilerin dijital haritalanmasını resmileştirmek için, nükleotid biyokimyasına dayalı ikili dönüşüm çerçevesi oluşturuldu. Uzunluğu N olan herhangi bir yapısal genomik pencere için, pürinler {A, G} dijital değere 0 ile eşlenir ve pirimidinler {C, T} 1'e eşlenir. Tarafsız, tekdüze arka plan genomik dağılımı olan null hipotezi (H0) altında, bu ikili dönüşüm Bernoulli deneme çerçevesini takip eder. Eşlenen sinyal X'in olasılık kütle fonksiyonu (PMF) aşağıdaki şekilde tanımlanır

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x için x ∈ {0,1}

burada p = 0.5, seçilmemiş bir arka plan izinde bir pirimidin kalıntısı ile karşılaşma olasılığını temsil eder. Bu dönüşüm, DFT aracılığıyla güç spektral yoğunluğu (PSD) hesaplaması için ardışık tabanlar arasında ölçeklenirken, kümülatif arka plan gürültüsü dağılımı rastgele bir yürüyüş gibi davranır ve Merkezi Sınır Teoremi ile Gauss beyaz gürültü dağılımına yaklaşır. Sonuç olarak, bu null dağılımın normalleştirilmiş güç spektrumu 2 özgürlük derecesi olan ki-kare (χ²) dağılımını takip eder. Sıkı bir istatistiksel anlamlılık eşiğini (α = 0.05) korumak için, gerçek bir patojenik varyant sinyal artışını tanımlamak için kritik güç yoğunluğu eşiği aşağıdaki olasılık yoğunluğu entegrasyonu kullanılarak analitik olarak hesaplandı:

Eşik = - In(a) x^{a 2}

burada^{σ 2} , yerel arka plan genomik gürültü tabanının operasyonel varyansını temsil eder. Bu eşiği aşan herhangi bir spektral zirve (p < 0.05, SNR > 20 dB'ye eşdeğer) önceliklendirildi; böylece varyant çağrıların veri odaklı ve stokastik dizileme gürültüsünden daha az etkilenmesini sağladı.

Operasyonel verimlilik ve maliyet analizi (Şekil 3)

Translasyonel ve klinik uygulama açısından, bu entegre protokolün operasyonel verimliliği, klinik dönüş süresi (TAT) ve ekonomik sürdürülebilirliği, ardışık Sanger dizileme veya sınırlı hedefli gen panelleri gibi geleneksel tanı yolları ile karşılaştırıldı. Pediatrik vaskülit veya şüpheli tip I interferopatiler için geleneksel tanısal odisseyalar, yinelemeli tek gen testleri nedeniyle genellikle 8–12 hafta sürerken, yüksek verimli WES, optimize edilmiş 16 saat hibridizasyon ve yüksek performanslı hesaplama (HPC) kümesinde paralel DFT sinyal filtrelemesini içeren sade iş akışı—ilk örnek alımından nihai moleküler rapora kadar toplam klinik TAT süresini 10–14 gün olarak kapsar. Ayrıca, verimli örnek çoğaltma (hibridizasyon bloğu başına sekiz hasta örneğinin birleştirilmesi) nedeniyle, çekirdek reaktif ve dizileme maliyeti hasta başına yaklaşık $250–$300 olarak bildirilirken, geleneksel kapsamlı paneller genellikle $1.200–$1.800'ü geçmektedir. Hem tanı zaman çizelgesinin hem de maliyet çerçevelerinin sıkıştırılması, önerilen fizik esinli biyoinformatik iş akışının rutin klinik genetik laboratuvarları için uygulanabilir ve ölçeklenebilir olabileceğini öne sürmektedir.

Sonuçlar

Tanımlanmış interferopati ile ilişkili varyantlara sahip 132 hastadan oluşan bu kohortta, geniş bir genetik varyant yelpazesi tespit edildi (Tablo 1). Hastaların 53'ü (%40,2) kadın, 79'u (%59,8) erkekti. Ortalama yaş 10,2 idi (aralık: 0–18 yıl). Son kohorta karşılık gelen hasta düzeyindeki veriler, Ek Tablo S1'de sağlanmıştır.

Tablo 1: Pediatrik otoinflamatuar kohort içinde tanımlanan tip I interferopati ile ilişkili genetik varyantların dağılımı ve sınıflandırılması (n = 132). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

En sık etkilenen genler ADAR (25 hasta, %18,94) ve DNASE1 (24 hasta, %18,18) idi. DNASE1 varyantları tamamen sınıf 3'tü (%100 gen içinde; toplam kohortun %18,18'i). Benzer şekilde, ADAR varyantlarının çoğu sınıf 3 (24 hasta, %96,00; %18,18 kohort), sadece bir sınıf 2 varyantı vardı (gen içinde %4,00; kohortun %0,76'sı) (Tablo 2).

Tablo 2: Nadir hastalık NGS panelinde tanımlanan varyantlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

STING1 (20 hasta, %15,15) ve RNASEH2B (14 hasta, %10,61) varyantları da yaygındı. Tüm STING1 varyantları %100 (3. sınıftı) idi. RNASEH2B için 10 hastada (%71,43) sınıf 3 varyant vardı (%7,58 kohort), 4 hasta (%28,57) ise sınıf 2 varyantlara sahipti (%3,03 kohort).

RNASEH2A mutasyon, 13 hastada (%9,85) tespit edildi ve bunların hepsi sınıf 3 varyantını taşıyordu (%100). TREX1 mutasyonları 10 hastada (%7,58) bulundu; bunların içinde 8 sınıf 3 varyantı (%80,00; kohortun %6,06'sı) ve 2 sınıf 2 varyant (%20,00; %1,52 kohort) bulundu.

SAMHD1 varyantları 9 hastada (%6,82) tespit edildi; 7 hasta sınıf 3 varyant taşıyordu (%77,78; kohortun %5,30'u), 1 hasta sınıf 1 varyant taşıyordu (%11,11; %0,76) ve 1 hasta sınıf 2 varyant taşıyordu (%11,11; %0,76).

RNASEH2C mutasyon, tamamı sınıf 3 hastada (%6,06) bulunan 8 hastada bulundu. DNASE1L3 mutasyon, 6 hastada (%4,55) tespit edildi; bunlar arasında 5 sınıf 3 varyantı (%83,33; %3,79 kohort) ve 1 sınıf 2 varyant (%16,67; %0,76) bulundu. PSMB8 ve COPA mutasyonları 5 hastada (%3,79) tespit edildi ve tüm varyantlar sınıf 3 (%100) idi. DNASE2 ve STAT4 mutasyonları her biri 3 hastada (%2,27) bulunuyordu ve tüm varyantlar sınıf 3 olarak sınıflandırıldı.

Genel olarak, sınıf 3 varyantları, kohorttaki neredeyse tüm genlerde baskın varyant sınıfını oluşturuyordu. Hedef genler üzerindeki ayrıntılı nükleotid ikameleri ve ilgili amino asit değişiklikleri dahil olmak üzere spesifik varyant siteleri Tablo 3'te kataloglanmıştır.

Sinyal işleme performansının keşif analizi

DFT tabanlı sinyal işleme boru hattının sağlamlığını ve hassasiyetini incelemek için, standart GATK tabanlı varyant çağrı iş akışına karşı karşılaştırmalı bir kıyaslama yapıldı ve özellikle düşük kapsama alanına sahip genomik bölgelere (derinlik < 30 kat) odaklandı. Ön kıyaslamada, entegre DFT filtreleme düzeni, seçilmiş düşük kapsama alanlarında önceliklendirmenin iyileştirilmesine yönelik potansiyel bir eğilim gösterdi ve bu özel laboratuvar kontrol koşullarında %96,8'e kadar keşfedici bir iyileşme tahmini olduğunu gösterdi. Önemli olarak, bu parametreler ve sayısal verimlilik metrikleri, evrensel olarak doğrulanmış bir klinik ürün hattı değil, belirli kurumsal kohort bağlamında kalibre edilmiş ön hazırlık, keşif bulgularını temsil eder. Boru hattı ayrıca yüksek gürültülü bölgelerde daha önce atılmış gerçek pozitif varyantları geri kazandı. Ayrıca, FDR %6,4'ten %1,2'ye düşürüldü ve düşük geçirici filtrenin yüksek frekanslı dizileme artefaktlarını ortadan kaldırmadaki potansiyel dayanıklılığını vurguladı. Kohortta tanımlanan yeni varyantlar arasında, STING1 ve TREX1'de düzensiz kapsama bölgelerinde bulunan 14 varyant (yeni bulguların %17,7'sini temsil eden), başlangıçta standart algoritmik eşiklere göre düşük kaliteli artefaktlar olarak sınıflandırılmış, ancak sinyal-gürültü geliştirme protokolü izlenerek Sanger dizileme ile başarıyla geri getirilip doğrulanmıştır. Bu analitik gözlem, fiziksel sinyal özelliklerinin değerlendirilmesinin keşif araştırma iş akışlarında faydalı bir araç olabileceğini öne sürmektedir.

Standart iş akışlarıyla karşılaştırmalı kıyaslama

Bu entegre çerçevenin karşılaştırmalı performansını değerlendirmek için, iki standart varyant çağrı boru hattına karşı yan yana kıyaslama analizi yapıldı: GATK En İyi Uygulamalar iş akışı (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) ve DeepVariant (v1.5). Performans metrikleri, düşük kapsama (derinlik 30 Tablo 4'te özetlenmiştir.

Hesaplamalı modellerin nicel parametreleştirmesi ve doğrulaması

Biyofiziksel ve stokastik çerçeveleri nicel terimlerle temellendirmek için, ODE'ler ve Gillespie simülasyonları, deneysel kontrol koşullarına göre kalibre edilmiş ampirik kinetik değerlerle parametreleştirildi. Sürekli ODE simülasyonları, simüle edilmiş tip I interferon maruziyetini takip eden 720 dakikalık zaman boyunca fosforile STAT2'nin ([STAT2p]) mutlak konsantrasyonunu takip eder. Vahşi tip (WT) hesaplama modelinde, sinyal zinciri hızlı homeostatik zayıflama gösterdi; bu da t = 45 dakika aktivasyon zirvesi ile tanımlandı; ardından programlanmış negatif geri besleme (k3 = 0,45 min-1) ile simüle edilmiş SOCS1 ifadesi ile hızlı temizlenme görüldü. Buna karşılık, STING1 ve TYK2 yollarındaki fonksiyon kazanımı (GoF) varyasyonlarının modellenmesi, şiddetli eşik kaymaları ortaya koymuş, bu da kalıcı ve zayıflatıcı olmayan bir hiper-inflamatuar duruma yol açmıştır. Sinyal yarı ömrü (t1/2) ve sabit durum katlama değişiklikleri Tablo 5'te özetlenmiştir.

Veri Erişilebilirlik Beyanı

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level son kohorta karşılık gelen klinik veriler Ek Tablo S1'de sağlanmıştır. DFT filtreleme ve biyofiziksel yol simülasyonlarını (ODE'ler ve stokastik modelleme) çoğaltmak için gerekli olan ayrık dijital sinyal işleme eşikleri, matematiksel formülasyonlar, yazılım ortamı kurulumları ve hesaplama parametreleri kamuya açık hale getirilmiştir. Okuyucular için kalıcı ve engelsiz erişim sağlamak amacıyla, bu çoğaltma çerçevesi GitHub'a depolanmış ve DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497 aracılığıyla Zenodo'da kalıcı olarak arşivlenmiştir. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Bu iş akışında kullanılan standart açık kaynak yazılım kütüphaneleri ve sayısal hesaplama platformları, örneğin NumPy, SciPy ve COPASI gibi, halka açık erişilebilirdir.

Şekil 3. Tip I interferopati ile ilişkili varyantların tanımlanması ve biyofiziksel modellenmesi için operasyonel storyboard ve veri odaklı boru hattı mimarisi. Şematik, klinik kohort analizini biyolojik sinyal işleme ile birleştiren kronolojik, dört kademeli deneysel ve hesaplamalı bir iş akışını özetler. (A) Kohort tabakalaşması ve NGS boru hattı: WES sürecinden geçen pediatrik otoinflamatuar kohort (n = 132) için iş akışı. İç dava kısmı, temsil eden ham FastQ kalite kontrolü Phred skor parçalarını gösterir, GATK/DeepVariant varyant çağrısına ve nihai VCF matris üretimine geçiş yapar. (B) DFT tabanlı sinyal işleme: genomik metnin gürültü azaltma için sayısal genomik sinyallere algoritmik çevirisi. Gömülü veri odaklı grafik, >20 dB SNR eşiği ile genomik arka plan gürültüsüne karşı patojenik varyant frekanslarını (sinyal spikeslerini) tanımlayan bir güç spektrumu dağılımını çizer. (C) In silico kürasyon kapısı: ACMG 5 kademeli patogenlik yönergelerini, HGMD ve Infevers çapraz kontrollerini entegre eden çok katmanlı önceliklendirme hunisi, 79 yeni ve 13 bildirilen varyantı önceliklendirmek için önceliklendirilmiştir. (D) Fonksiyonel biyofiziksel modelleme doğrulama: biyolojik doğrulama katmanı. Deterministik ODE çerçevesi ve stokastik Gillespie simülasyon eğrileri, grafiksel bileşenler olarak entegre edilmiş, 720 dakikalık zaman kurgusunun iyileşmesini ve vahşi tip ile simüle edilmiş mutant hücresel kinetiklerin sürekli sinyal göndermesini çizmektedir. Kısaltmalar: ACMG = Amerikan Tıp Genetiği ve Genomik Koleji; DFT = ayrık Fourier dönüşümü; GATK = Genom Analiz Araç Seti; HGMD = İnsan Gen Mutasyon Veritabanı; NGS = yeni nesil dizileme; ODE = sıradan diferansiyel denklem; SNR = sinyal-gürültü oranı; VCF = varyant çağrı formatı; WES = tüm ekzom dizileme. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Pediatrik kohort içinde tanımlanmış tip I interferopati ilişkili genetik varyantların kapsamlı açıklaması ve lokus veritabanı kontrolü (n = 132). ACMG kriterleri (2015 ACMG/AMP kılavuzlarından): ACMG/AMP kanıt kodları kanıt gücüne göre gruplandırılmıştır. Çok güçlü kanıtlar arasında, fonksiyon kaybı yerleşik bir hastalık mekanizması olan genlerde öngörülen fonksiyon kaybı varyantlarını ifade eden PVS1 varyantları vardı. Güçlü kanıtlar arasında PS1–PS4 yer aldı; bunlar daha önce belirlenmiş amino asit değişikliklerini, doğrulanmış de novo görülmesini, destekleyici fonksiyonel kanıtları ve etkilenen bireylerde artan varyant sıklığını kapsıyordu. Orta dereceli kanıtlar arasında kritik bir bölgede veya mutasyonel sıcak noktada konum, popülasyon veritabanlarında yokluk veya çok düşük sıklık, resesif bozukluklarda trans oluşumu, protein uzunluğu değişiklikleri, bilinen patojenik varyasyonlu kalıntılarda yeni yanlış anlamlı değişiklikler ve varsayılan de novo varsayımları yer alıyordu. Destekleyici kanıtlar arasında PP1–PP5; aralarında segregasyon, gen spesifik yanlış mantıklı kısıtlama, in silico kanıtlar, fenotip özgüllüğü ve bağımsız kanıt bulunmadığında itibarlı önceki patojenlik raporları yer alıyordu. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Yüksek gürültülü genomik bölgelerde varyant çağrı boru hatlarının yan yana performans karşılaştırması. Düşük kapsama alanlarında (<30x) kıyaslama değerlendirmesi, fizik tabanlı DFT alçak geçirim filtresinin sıralanma gürültüsünü ortadan kaldırma ve gerçek pozitif sinyalleri standart algoritmik konfigürasyonlara kıyasla koruma performansını değerlendirmek için yapıldı. Kısaltmalar: DFT = ayrık Fourier dönüşümü. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Aşağı akım JAK-STAT sinyalizasyonunun nicel kinetik parametreleri ve sabit durum varyasyonları. 720 dakikalık bir zaman boyunca ODE ve stokastik Gillespie simülasyon sınırlarının özeti, patojenik STING1 ve TYK2 varyasyonlarını taşıyan modellerde hücresel homeostatik zayıflamanın başarısızlığını vurguluyor. Kısaltmalar: JAK-STAT = Janus kinaz-sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyon aktivatörü; ODE = sıradan diferansiyel denklem; STING1 = interferon yanıtı cGAMP interaktörü 1'in uyarıcısı; TYK2 = tirozin kinaz 2. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1. Interferopati ile ilişkili varyantlara sahip pediatrik kohort için hasta düzeyinde veri seti. Tablo, makalede analiz edilen son 132 hastalık kohorta karşılık gelen hasta düzeyindeki verileri sunar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolteki kritik adımlar arasında DNA parçalanması, adaptör ligasyonu, PCR amplifikasyonu ve tek zincirli DNA (ssDNA) daireselleştirmesi yer alır. Bu aşamalarda, kirlenme riskini en aza indirmek için titiz uygulama gereklidir. Boncuk bazlı arıtma sırasında hassas etanol yıkamaları ve uygun manyetik stand kuluçka süreleri zorunludur; çünkü sapmalar ürün veriminin azalmasına veya varyant algısının kaçırılmasına yol açabilir. Havuzlu kütüphane hazırlığı sırasında, hasta başına doğru 93,75 ng hesaplama ve dikkatli hacim ayarlaması gereklidir.

Protokol optimizasyonu ve sorun giderme için, düşük florometrik niceleme ölçümleri, özellikle 0.8–2 ng/μL eşiğinin altında olan ssDNA konsantrasyonları, varyant çağrı hassasiyetini artırmak için dizileme derinliğini artırmayı veya boncuk kuruma sürelerinin kısaltılmasını gerektirebilir. Şüpheli mozaik varyantları durumunda, uzun okuma dizileme teknolojilerinin entegrasyonu tespit doğruluğunu artırabilir. Ayrıca, enzimatik sindirim sonrası örneklerin buz üzerine hızlı transferi, ürün kararlılığını korumak için^{kritiktir 12,13}. DNB hazırlığı sırasında, yavaş ve nazik pipetleme ile dikkatli stop buffer eklenerek nanoball bütünlüğünü korur. Bu özellikle, SAVI ^6,11 gibi erken başlangıçlı interferonopatilerde genotip-fenotip korelasyonlarını oluşturmak için önemlidir.

Bu WES tabanlı genetik analiz, otoinflamatuar özellikleri ve vasküliti olan pediatrik hastalarda interferopati ilişkili varyantların değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar. DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 ve COPA gibi anahtar genlerdeki varyantları belirleyerek, çalışma, interferon kaynaklı vaskülitik fenotiplerin altında yatan genetik heterojenliği ortaya koymaktadır. Bu kohorttaki nüklein asit metabolizmasındaki ve özellikle DNASE1 ve ADAR algılama genlerindeki varyantların sıklığı, pediatrik vaskülit ve otoinflamatuar hastalıkların patogenezinde düzensiz tip I interferon sinyalinin merkezi rolüyle tutarlıdır. Bu bulgular, bu genlerin interferonopati ve vaskülitik belirtilerle ilişkilendirildiğini belirten önceki raporlarla ^{tutarlıdır 4,5,7}.

SAVI'de gözlemlenen deri ve interstisyel akciğer tutulması gibi monojenik otoinflamatuar sendromların vaskülit benzeri sunumlarını aydınlatarak, bu yaklaşım erken teşhisi kolaylaştırabilir ve anti-interferon hedefli^{tedavilere rehberlik etmeye yardımcı olabilir 4,5,7}. Monojenik interferopatiler, ANCA ile ilişkili vaskülit ve diğer çocukluk vaskülitlerini klinik olarak taklit edebilir; bu da atipik veya tedaviye dirençli vakalarda genetik testin önemini^{vurgular. 9,10,11}. Erken genetik tanı ayrıca, STING1 ve diğer interferon kaynaklı mutasyonları olan hastalarda klinik fayda gösteren JAK inhibitörleri gibi hedefli tedavilerin zamanında başlatılmasını da mümkün^{kılabilir 7,13,14}.

Bu çalışma ayrıca, karmaşık otoinflamatuar vaskülitle başvuran pediatrik hastaların önemli bir kısmının interferopati ile ilişkili genlerde nadir veya yeni varyantlar barındırdığını da doğrulamaktadır. Bu büyük kohortta 79 yeni varyantın tanımlanması, bilinen genetik spektrumu genişletir ve çocukluk vazkülitinde genotip-fenotip korelasyonlarının iyileşmesine katkıda bulunabilir.

Bu keşif iş akışında operasyonel bir husus, eşik sınırlarının değerlendirilmesini içerir; çünkü keşif SNR parametrelerindeki sapmalar filtreleme çıktısını değiştirebilir. Örneğin, nükleotid dağılımlarının DFT tabanlı filtrelenmesi, gürültü denoise okumalarına yardımcı olur ancak aşırı yumuşatma mutasyon sinyallerini önlemek için kalibrasyon gerektirir; Sorun giderme, özellik çıkarımı optimize etmek için ikili eşleme parametrelerinin yinelemeli ayarlanmasını içerir (purinler için 0, pirimidinler için 1^). Biyofiziksel modellemede, ODE'ler için başlangıç koşullarının tanımlanması önemlidir, çünkü amplifikasyon oranlarındaki küçük bozulmalar eşik davranışları değiştirebilir ve sürekli interferon sinyalini küçümseme getirebilir. Geliştirilmiş JAK-STAT detayları, TYK2'nin IFN-α sinyalizasyonundaki rolünün modellenmesini içerir; burada fonksiyon kazanımı varyantları STAT2 aktivasyonunu artırır ve interferonopati^{fenotipleri 20'ye} yol açar.

Yöntemdeki değişiklikler, gürültülü hücresel ortamlar için stokastik elementlerin entegre edilmesini içerebilir; örneğin ODE'lere Langevin gürültü terimleri eklemek gibi:

dX = f(X)dt + g(X)dW

burada dW, listelenen terim Wiener süreç gürültüsünü temsil eder ve JAK-STAT^{değişkenliği 21'i} simüle ederken gerçekçiliği artırır. Gillespie algoritmaları kullanılarak interferon yollarının stokastik simülasyonları, IFN-β ifadesinde heterojenliği yakalar; negatif geri besleme döngüleri nedeniyle hücreden hücreye farklılıklar transkripsiyon faktörü seviyelerinde ISG aktivasyon ^22,23'ün bimodal dağılımlarına yol açar. Sorun giderme yolu modelleri, deneysel IFN-β verilerine karşı doğrulamayı içerir; Eğer amplifikasyon farklılaşırsa, fosfataz aktivasyon oranları gibi negatif kontroller yeniden kalibre edilebilir veya transkripsiyon için dağıtılmış gecikmeler eklenebilir:

gecikmeli süreçler için gamma çekirdeği ile.

Tam genom dizileme (WGS) ile karşılaştırıldığında, bu WES odaklı yaklaşım maliyet etkin olabilir ancak ekzonik olmayan bölgeler için daha az kapsamlı^{olabilir 24,25}. Bu ön çerçevenin kapsamı, matematiksel varyasyonların tahmini interferon sinyal davranışıyla nasıl korelasyon yaptığını değerlendirmek için destekleyici bir biyokimyasal simülasyon modeli sunmakla sınırlıdır; bu model, kümülatif etkilerin kritik değerleri aştığı ve damar hasarına yol açan kritik değerleri aştığı eşik modellerde görülmektedir. Yöntemin sınırlamaları arasında, düşük seviyeli mozaik varyantlarının göz ardı edilmesi ve yeni bulguların fonksiyonel doğrulama gerekliliği yer^{alır 6}.

Bu teknik, anti-interferon tedavilerini yönlendirmek ve nadir hastalık tanıları için veri tabanlarını zenginleştirerek immünoloji ve damar tıbbında potansiyel uygulamalara sahiptir¹⁹. Stokastik uzantılar, interferonopatilerde heterojen yanıtların tahmin edilmesini daha da mümkün kılarak kişiselleştirilmiş tıbbı destekleyebilir.

Bu çalışmada, pediatrik vaskülitte genetik değerlendirme, histopatoloji ve görüntüleme yöntemleri gibi geleneksel tanı araçları ile birlikte vurgulanmaktadır. Genel olarak, bu çalışma pediatrik vaskülitte genetik değerlendirmenin önemini vurgularken, şüpheli otoinflamatuar hastalıklar için genetik analiz geçirilen hastalar arasında interferopati ilişkili varyantların sıklığını vurgulamaktadır. Bu varyantların interferon sinyal yolları üzerindeki etkisini değerlendirerek ve pediatrik vaskülitte erken teşhisin önemini vurgulayarak bu çalışma, vaskülitik ve otoinflamatuar bozukluklarla ilgili nadir hastalık veri tabanlarının zenginleşmesine katkıda bulunmakta ve varyant patogenliği ile popülasyona özgü polimorfizmleri inceleyen gelecekteki çalışmalar için içgörüler sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adjustable Pipettes (P2, P10, P20, P200, P1000)	Herhangi bir tedarikçi		Doğru sıvı kullanımı için
Tezgah Üstü Santrifüj	Herhangi bir tedarikçi		PCR tüplerinin kısa süreli santrifüjlendirilmesi için
Equinox Kütüphane Amp Miks	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (veya eşdeğeri)	PCR amplifikasyonu ana karışımı
Etanol (Moleküler Biyoloji Sınıfı)	Herhangi bir tedarikçi		80% etanol yıkama çözeltisi hazırlamak için kullanılır
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Kit içinde bulunur veya ayrı	Kütüphane amplifikasyon primerleri
Düşük bağlanma PCR Tüpleri (0,2 mL)	Herhangi bir tedarikçi		Steril PCR tüpleri
Manyetik Stand / Manyetik Raf	Herhangi bir tedarikçi		Manyetik boncuk ayrımı için
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	DNBSEQ teknolojisini kullanan tezgah üstü sonraki nesil sıralayıcı (DNA Nanoball Sıralama); birden çok okuma uzunluğunu destekler (örneğin, SE50'den PE300'e); çalışma başına 1440 Gb'ye kadar yüksek verimli çıktı; WES, WGS ve hedefli sıralama uygulamaları için idealdir.
MGIEasy Daireselleştirme Kiti	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Çift Barkodlu, 16 RXN) veya 1000005260 (V2.0)	Tek zincirli dairesel DNA (ssCirDNA) üretmek için daireselleştirme kiti; çift barkod versiyonu indeks atlamayı azaltır; MGI sıralama iş akışında DNB oluşumu için kit sonrası gerekli adımdır.
MGIEasy DNA Temizleme Boncukları	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	DNA saflaştırma için manyetik boncuklar
MGIEasy DNB Hazırlama Kiti/ DNB Yapma Kiti	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Çift Barkodlu Daireselleştirme ile entegre) veya ilgili DNB Yapma (örneğin, 940-000036-00 Tek Adımlı DNB)	DNA Nanoball (DNB) hazırlama modülü; akış hücresi yüklemesi için daireselleştirme ve nanoball üretimi içerir; DNBSEQ sıralayıcıları için kit işlemede son adım (genellikle Daireselleştirme Kiti ile birleştirilir).
MGIEasy Ekzom Yakalama Aksesuar Kiti	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (veya eşdeğeri)	Engelleyici Çözelti, MGI Evrensel Engelleyiciler, Arttırıcı, Bağlama Tamponu, Yıkama Tamponu 1 & 2 ve Streptavidin boncuklarını içerir
MGIEasy Ekzom Yakalama V4 Probları (veya Twist CES Probları, MGI/DNBSEQ ile uyumlu)	MGI Tech Co., Ltd. (MGIEasy için) veya Twist Bioscience (Twist için)	1000007745 (V4 Prob Seti, 16 RXN) veya 1000007740 (Problar); Twist: Özel / panele özgü (sipariş temelli, standart numara yok)	Hibridizasyon bazlı tüm ekzom yakalama probları; ~59 Mb kodlama bölgelerini hedefler (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); DNBSEQ platformlarındaki WES iş akışlarında yüksek verimli zenginleştirme için tasarlanmıştır; MGIEasy Aksesuar Kiti ile hibridizasyon (65°C ön ön inkübasyon, 16 saat boyunca 65°C'de), engelleyici ilavesi, streptavidin boncuk yakalama (bağlama tamponu, 48°C'de Yıkama Tamponu 1/2), elüsyon ve hibridizasyon sonrası PCR amplifikasyonu (Equinox karışımı ile uyumlu) için kullanılır.
MGIEasy Hızlı Hibridizasyon ve Yıkama Kiti	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Hibridizasyon ve yıkama reaktifleri
MGIEasy FS DNA Kütüphane Hazırlama Kiti	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (16 RXN seti) veya 1000005256 (96 RXN çekirdek kiti)	Hızlı parçalanmaya dayalı DNA kütüphane hazırlama kiti; 5–400 ng gDNA girişi ile enzimatik parçalanma; DNBSEQ platformları ile uyumlu, verimli WGS/WES kütüphanesi oluşturma.
Nükleaz içermeyen Su	Herhangi bir tedarikçi		Moleküler biyoloji sınıfı
Qubit dsDNA HS Analiz Kiti	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Kütüphane kantifikasyonu için
Qubit ssDNA Analiz Kiti (isteğe bağlı)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Hibridizasyon sonrası ssDNA kantifikasyonu için
Streptavidin Manyetik Boncuklar	MGI Tech	Aksesuar Kitinde bulunur	Hibrid yakalamada için
TE Tamponu (pH 8.0)	Herhangi bir tedarikçi		Denatüre adımı için
Termal Çevrimci	Çeşitli (Bio-Rad, Thermo, vb.)		Parçalanma, ligasyon, PCR ve DNB programları için kullanılır
Vortex Mikser	Herhangi bir tedarikçi		Numune karıştırma için
Geniş Gövdeli Pipet Uçları	Herhangi bir tedarikçi		DNB hazırlaması için gereklidir