Drosophila melanogaster'de Stres Kaynaklı Depresyona Benzer Durumların Çok Modlu Davranışsal Fenotiplenmesi

Özet

Bu protokol, Drosophila melanogaster'de stres kaynaklı davranış değişikliklerini değerlendirmek için bir çerçeve sağlar. Tamamlayıcı testlerin birleştirilmesi, bireysel sinekler için aktivite, keşif ve karar verme süreçlerinin nicelendirilmesini sağlar. Yaklaşım esnektir ve stres biyolojisi, metabolizması ve nörodavranışsal fonksiyonları inceleyen geniş bir çalışma yelpazesine uyarlanabilir.

Özet

Metabolik, nörodejeneratif ve stresle ilgili bozukluklar sıklıkla değişen hareket hareketleri, karar verme güçlüğü ve davranışsal esnekliğin azalmasıyla birlikte görülür. Ancak, Drosophila melanogaster'de bu fenotipleri niceliklendirmek için erişilebilir çok modlu davranışsal çerçeveler hâlâ sınırlıdır. Burada, zorunlu yüzme maruziyeti, Y-labirent dönüş davranışı ve el hareketliliği, fototaksi ve FlyVac sisteminde aktivite değerlendirmesi, açık alan keşfi ve Drosophila Aktivite Monitörü kullanılarak uzun vadeli lokomotor izlemeyi entegre eden bir protokol sunulmaktadır. Bu tamamlayıcı testler, motor çıktı, motivasyon, karar yapısı ve davranışsal değişkenlik gibi davranışın birden fazla boyutunu sinirsel ve metabolik durumların fonksiyonel okumaları olarak kaplar. Bu hattı, ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve farmakolojik, genetik ve çevresel manipülasyonlara uyarlanabilir olup, Drosophila'da stres, metabolik ve nörodejenerasyonla ilgili davranış fenotiplerini tespit etmek için çok yönlü bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

Hareket değişiklikleri, karar alma ve keşif faaliyetlerindeki değişiklikler, organizma düzeyinde sinirsel ve fizyolojik durumun göstergeleri olarak yaygın olarak kullanılır. Taksonlar arasında sinirsel disfonksiyon genellikle değişen hareket yapısı, azalmış keşif motivasyonu, duyusal yönlendirilmiş karar davranışının bozulması ve davranışsal öngörülebilirlikteki değişiklikler olarak kendini gösterir. Bu organizma düzeyindeki çıktılar sinirsel, metabolik ve fizyolojik durumu entegre ettiğinden, hastalıkla ilgili fenotiplerin tespit edilmesi için ölçeklenebilir okumalar sağlarlar. Ancak, Drosophila melanogaster'in moleküler genetik ve sinirbilimde yaygın kullanımına rağmen, aynı anda lokomotor performans, karar yapısı ve davranışsal değişkenliği yakalan standartlaştırılmış çok modlu davranışsal çerçeveler sınırlı kalmaktadır.

Model organizmalar, stresle ilgili ve nöropsikiyatrik fenotiplerin altında yatan mekanizmaları incelemek için gereklidir çünkü insanlarda kontrollü deneysel manipülasyon genellikle imkansızdır. Stresle ilişkili davranışsal sendromlar, böcekler dahil olmak üzere birçok taksonda görülür ve serotonin ve dopamin gibi korunmuş nöromodülatör sistemler ile metabolik sinyal yollarını içerir. Bu nedenle, meyve sineği, kısa üretim süresi, genetik şekilde yönetilebilirliği ve hastalıkla ilgili yolların korunması nedeniyle moleküler işlevsizliği organizma düzeyindeki davranışsal sonuçlarla ilişkilendirmede güçlü bir sistem^{olarak ortaya çıkmıştır 1,2}.

Aynı zamanda, Drosophila'da birçok davranışsal test genellikle izole olarak uygulanır; bu da genel hastalık etkileri, motor bozukluklar, motivasyonel değişiklikler ve karar düzeyindeki davranışsal değişiklikler arasındaki ayrımı zorlaştırır. Ayrıca, ortalama davranışsal ölçütler bile biyolojik olarak anlamlı fenotipleri gizleyebilir; çünkü nöromodülatör ve gelişimsel bozulmalar genellikle ortalama davranışsal çıktı yerine davranışsal değişkenliği değiştirir. Bu nedenle, sağlam organizma düzeyinde fenotipik imzalar oluşturmak için lokomotor, keşif, duyusal ve karar verme testlerini birleştiren çok modlu bir davranışsal yaklaşım^{gereklidir 3}.

Burada, zorunlu yüzme^{maruziyeti 4,5}, Y-labirent dönüş davranışı ve el hareketi ^6,7,8,9, FlyVac sistemi^10,11 kullanılarak fototaksi ve aktivite değerlendirmesi, açık alan keşif¹² ve Drosophila Aktivite^{Monitörü 5,13} ile uzun vadeli lokomotor izleme içeren çok modlu bir davranışsal boru hattı sunulmaktadır (Şekil 1). Bu çerçevedeki her test, stresle ilgili fenotiplerle ilgili belirgin bir davranışsal boyutu yakalar. Zorunlu yüzme testi, pasif başa çıkma davranışını ölçür; burada daha erken hareketsizlik değişikliği, kaçış tepkilerini sürdürme motivasyonunun azalmasını yansıtır. Açık alan ve DAM testleri, genel lokomotor aktivite ve sirkadiyen yapıyı nicelikle ölçer, motor çıkışı ve uyarılmanın temel ölçümlerini sağlar. Y-labirent testi, karar verme yapısını sol-sağ seçimleri dizilimi aracılığıyla yakalar; böylece hem dönüş yanlılığı (yanalma) hem de davranışsal değişkenlik tahmini olarak öngörülebilirlik ölçüsü olarak görülür. Son olarak, FlyVac testi, duyusal yönlendirilen karar alma ve yaklaşım-kaçınma davranışını tekrarlayan fototaktik seçimler yoluyla değerlendirir. Bu testler birlikte, aktivite, motivasyon ve karar düzeyindeki davranıştaki değişiklikleri ayırt eden tamamlayıcı okumalar sağlar.

Bu protokol, motor çıktı, motivasyon, karar yapısı ve davranışsal değişkenliğin tamamlayıcı yönlerini yakalarak, D. melanogaster^14'te stres, metabolik ve nörodejenerasyonla ilişkili davranış fenotiplerini tespit etmek için ölçeklenebilir bir çerçeve sağlar. Bu çalışmanın temel amacı, stres kaynaklı davranış değişiminin çoklu boyutlarını yakalamak için tamamlayıcı testleri entegre eden çok modlu davranışsal fenotipleme çerçevesi oluşturmaktır. Burada gerilme paradigması, çerçevenin hassasiyetini ve uygulanabilirliğini göstermek için standart bir pertürbasyon olarak kullanılır.

Protokol

Zorunlu yüzme testi, 3R'lerin (Değiştirme, Azaltma ve Geliştirme) prensiplerine uygun olarak gerçekleştirildi. Yerine geçme, Drosophila melanogaster omurgasız model olarak kullanılarak sağlandı; böylece etik nedenlerle giderek kısıtlanan omurgalı zorunlu yüzme paradigmalarından kaçınıldı. Azaltma, testin yüksek verimliliğiyle desteklendi; bu da nispeten küçük kohortlardan güçlü davranışsal çıkarım sağlarken hayvan kullanımını en aza indirdi. Geliştirme, yüzme maruziyetinin 2 dakika ile sınırlandırılmasıyla ele alındı; bu süre yorgunluğu veya boğulmayı önler ve testten hemen sonra normal hareket davranışının tam iyileşmesini sağlar. Bu hususlar birlikte, testin anlamlı davranışsal veriler sağlamasını sağlarken, potansiyel sıkıntıyı en aza indirir ve eğitim ortamlarında da dahil olmak üzere etik kabul edilebilirliği maksimize eder.

1. Drosophila'da depresyon benzeri bir durumun indüksiyonu (titreşim stresi protokolü)

1. Erkek D. melanogaster'i eklonisyondan sonra 24 saat içinde hafif CO₂ anestezisi altında toplayın. Tüm detaylar Materyaller Tablosu'nda belirtilmiştir.
2. Sinekleri 10 kişilik gruplar halinde pamuk tıkaçlarla mühürlenmiş polipropilen veya akrilik şişelere (95 mm uzunluğu × 25 mm iç çapı) yerleştirin.
3. Bir titreşim platformu kullanarak sinekleri mekanik titreşime (300 Hz) maruz bırakın.
4. 45 dakikalık titreşim ve ardından 15 dakikalık iyileşme döngülerini standart yiyecek içeren şişelerde uygulayın.
5. Titreşim döngülerini günde toplam 6 saat sürdür.
6. Stres protokolünü 3 gün üst üste tekrarlayın.
7. Kontrol sineklerini titreşim maruz kalmadan aynı konut koşullarında koruyun.
   NOT: Mevcut protokolde, cinsiyete özgü fizyolojik ve davranışsal farklılıklarla, üreme durumu ve hormonal etkiler dahil olmak üzere değişkenliği azaltmak için yalnızca erkek sinekler kullanılmıştır. Bu standartlaştırma, stres kaynaklı davranışsal etkilerin kontrollü bir ortamda tespit edilmesini kolaylaştırır. Ancak, protokol dişi sinekler için tamamen geçerlidir ve cinsiyete özgü yanıtlar gelecekteki araştırmalar için önemli bir alandır. Stresle ilgili ve depresyona benzer fenotiplere duyarlılığın, Drosophila dahil taksonlar arasında cinsiyet ve yaşa göre değişebileceği göz önüne alındığında, bu çerçeveyi farklı demografik gruplara genişletmek ek biyolojik içgörü sağlayabilir. Bu paradigma, sineklerde motivasyon ve aktivite değişikliklerini tetikleyen yerleşik kontrol edilemez titreşim stresi modellerinden uyarlanmıştır.

2. Drosophila melanogaster'de zorunlu yüzme testi

DIKKAT: Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir tahriş edici maddedir. SDS çözümlerini hazırlayıp kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman (örneğin eldiven ve göz koruma) takın. Cilt ve göz temasından kaçının. SDS içeren atıkları kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf et.

1. Yetişkin sinekleri eklonsiyondan 24 saat içinde toplayın ve onları sürekli ışık ve kontrollü çevresel koşullar altında koruyun.
2. Çok kuyu odalı slaytları hazırlayın ve her kuyuyu oda sıcaklığında ~2 mL %0,08 SDS çözeltisi ile doldurun.
3. Kayıttan hemen önce her kuyuya tek bir sinek aktarın. Anestezi gerektirmez.
4. İlk hareketsizlikten gecikmeyi ölçmek için 2 dakika boyunca bir üst kamerayla davranışı kaydedin.
5. Gecikmeyi ilk hareketsizlikten ölçe.
6. Kayıttan sonra sinekleri çıkarın ve normal hareket ettiğinizden emin olmak için emici kağıda koyun.
   NOT: Hareketsizlik, yüzey pozisyonunu koruyarak aktif kaçış hareketlerinin durması olarak tanımlanır. Toplam hareketsizlik süresi ve hareketsizlik dönemi sayısı gibi ek parametreleri kaydetmek için daha uzun kayıt süreleri (örneğin 3 dakika) gereklidir. Bu test, pasif başa çıkma davranışını yansıtır; Hareketsizliğe giden gecikmenin azalması, kaçış tepkilerini sürdürme motivasyonunun azalması olarak yorumlanır. Sinekler arasında gecikme ile hareketsizliğe / toplam hareketsizlik değişkenliği. Bu test, geçici stres veya yorgunluk yaratabilir. Uzunlamasına tasarımlarda kullanıldığında, diğer testlerden önce yapılabilir ve sonraki testlerden önce yeterli geri kazanım (örneğin ≥24 saat) sağlanır.

3. Drosophila Aktivite İzleyicisi (DAM) kullanılarak uzun vadeli hareket aktivitesi izleme

1. Meyve sineklerini kısa süreliğine (5 saniye) CO₂ kullanarak anestezi yapın.
2. Bireysel sinekleri, yiyecek ve pamuk tıkacı içeren cam DAM tüplerine^{yerleştirin 17}.
3. Drosophila Aktivite İzleme sistemine tüpler takın.
4. Kontrollü sıcaklık ve ışık-karanlık koşullarında sürekli olarak (48 saat) lokomotor aktivite kaydedilmesi.
5. Depo ışın kırma sayımları satın alma yazılımı kullanılarak yapılır.
6. Etkinlik verilerini belirli zaman aralıklarına (örneğin 1–10 dakika) binleştirin.
7. Alışma sonrası ölen veya hiç faaliyet göstermeyen sinekleri hariç tutun.
   NOT: 48 saatlik bir süre boyunca sürekli hareket motoru izleme, sirkadiyen aktivite kalıplarını yakalamak için yeterlidir. DAM: Bireyler arasında toplam mesafe, hız ve duruş yapısındaki değişkenlik.

4. Açık alan lokomotor testi

1. Kısa süreliğine (5 saniye) meyve sineklerini CO₂ kullanarak anestezi edin.
2. Bireysel sinekleri dikdörtgen 25 x 75 mm arenalara (her arenada bir sinek) aktarın.
3. Sineklerin arena ortamına (20 dakika) alışmasına izin verin, ardından kayıt yapmadan önce sabit, düşük yoğunluklu dağınık beyaz ışık altında.
4. Sürekli aydınlatma altında otomatik video takip sistemi kullanarak davranış kaydı yapın.
5. İzleme yazılımı kullanarak yörüngeleri analiz ederek şunları çıkarın:
   Taşınan toplam mesafe
   Ortalama lokomotor hızı
   Hızlanma ve dönüş metrikleri
   NOT: Bu test, stresle ilişkili davranış değişikliklerinin yorumlanması için bir temel sağlar. Uyum süresi, kontrol kaynaklı stresi en aza indirir ve sineklerin arenaya alışmasını sağlar; böylece kaydedilen lokomotor aktivitenin temel davranışı yansıtmasını sağlar. Sürekli aydınlatma, sirkadiyen dalgalanmalarla ilişkili değişkenliği azaltmak ve denemeler arasında tutarlı davranış koşulları sağlamak için kullanıldı. Yörüngeler, erişilebilirlik ve kullanıcı tercihine bağlı olarak EthoVision XT (Noldus Information Technology) gibi otomatik takip yazılımları veya Ctrax, idTracker ve TrackMate (ImageJ/Fiji) gibi açık kaynak alternatiflerle çıkarılabilir. Açık alan testi: bireyler arasında toplam mesafe, hız ve duruş yapısındaki değişkenlik. Sırayı azaltmak için, uyum ve aydınlatma koşullarını seanslar arasında standartlaştırın. Aynı bireyler üzerinde birden fazla test yapıldığında, arena maruziyet sürelerini tutarlı tutun.

5. Y-labirent dönüş davranışı ve davranışsal değişkenlik testi

1. Meyve sineklerini CO₂ kullanarak kısa süreliğine anestezi yapın.
2. Bireysel sinekleri Y-labirent^{odaları 8,9'a} yerleştirin. Labirentler, lazer gravür makinesi kullanılarak 1,6 mm kalınlığında siyah akrilik olarak kesildi. Sinekleri, her biri üç simetrik koldan (12 mm uzunlukta ve 3,3 mm genişliğinde) oluşan 95 ayrı labirentten oluşan bir dizide yerleştirdik.
3. Sineklerin uzun kayıt süreleri (20 dakika) boyunca özgürce keşfetmesine izin verin.
4. Keşif hareketi sırasında dönüş kararlarını (sol veya sağ) kaydedin (1 saat).
5. Bireysel dönüş yanlılığını sağa dönüşlerin oranı olarak hesaplayın. Hız, ivme, hareketsiz hareket, zaman bazlı aktivite değişimleri^{gibi ilgili ölçütleri hesaplayın 12,15}.
6. Dönüş yanlılığının medyan mutlak sapması (MAD) kullanılarak sinek arası davranışsal değişkenliği nicelikle ölçülür.
   NOT: Bu test, genel aktivite seviyelerinden bağımsız olarak hareketli el hareketini ve davranışsal öngörülebilirliği ölçer. Çevirme dizileri karar yapısını yakalar; Dönüş önyargısı yanlışlığı yansıtırken, bireyler arasındaki değişkenlik davranışsal öngörülebilirliği yansıtır. bias = sağa dönüş oranı (uçuş başına); değişkenlik = sinekler arasında önyargının dağılımı (MADn). Tekrarlayan testler için, bireyler veya kohortlar arasında analiz sırasını dengeleyerek dizi etkilerini kontrol etmeyi düşünün.

6. Fototaktik seçenekler: FlyVac cihazında aktivite izleme

1. Bireysel sinekleri_CO2 anestezi kullanmadan FlyVac ^6,11 numaralı odalara yükleyin.
2. Denemelere başlamadan önce alışma (10 dakika) izin verin.
3. Her sinek için tekrar eden ikili ışık-karanlık seçenekler sunun.
4. Otomatik tespit kullanarak 40 deneme boyunca seçimleri kaydedin.
5. Bir sinek başına ışık seçimi olasılığını ve ışık seçimleri arasındaki ortalama süreyi faaliyet ölçüsü olarak hesaplayın.
6. MAD kullanarak bireyler arasında davranışsal değişkenliği nicelikle ölçemek.
   NOT: FlyVac sistemi, ortalama karar yanlılığı ve bireyler arası değişkenliğin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu protokolde tanımlanan davranışsal testler modülerdir ve deneysel tasarıma bağlı olarak farklı sıralarda yapılabilir. Ancak, olası kalıcı etkileri en aza indirmek için, diğer testlerden önce zorunlu yüzme testinin yapılması önerilir. Sırayı azaltmak için, uyum ve aydınlatma koşullarını seanslar arasında standartlaştırın.

7. Veri analizi

NOT: Davranışsal analizler, aksi belirtilmedikçe çıkarım birimi olarak bireysel sinekler kullanılarak yapılmıştır.

1. Zorunlu yüzme testi: Video kayıtlarını manuel olarak veya davranışsal puanlama yazılımı kullanarak analiz edin.
   NOT: Hareketsizlik, sinek su üzerinde kalırken aktif kaçış hareketlerinin olmaması olarak tanımlanmıştır. Her sinek başına aşağıdaki parametreler çıkarıldı: ilk hareketsizliğe gecikme. Grup karşılaştırmaları, davranışsal ölçütlerin normal olmayan dağılımı nedeniyle parametrik olmayan istatistiksel testler kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
2. Uzun vadeli lokomotor aktivite (DAM): Drosophila Aktivite Monitörü tarafından rekor ışın kırılması sayımları elde edildi. Dışa aktarın ve 10 dakikalık aralıklarla binleyin.
   NOT: Her sinek için toplam aktivite sayıları ve sirkadiyen aktivite desenleri hesaplandı. Bu desenler R, Python veya Excel ile hesaplanabilir—hangisi mevcutsa. Ölüm veya teknik artefaktlar nedeniyle hareketsiz kalan sinekler analiz öncesinde hariç tutuldu. Test 48 saat sürdü.
3. Açık alan lokomotor testi: Video takip verilerini otomatik takip yazılımı kullanarak işlemek. Video dosyalarını EthoVision XT'ye aktarın. Otomatik algılama ile kontrast tabanlı eşik belirleme ile takip yapın.
   NOT: Yörüngeler, varsayılan filtreleme algoritması kullanılarak düzeltildi. Uçuş başına lokomotor parametreleri (mesafe, hız, ivme) aşağı akış analizi için CSV dosyaları olarak dışa aktarıldı. Uçuş başına lokomotor parametreleri şunları içeriyordu: toplam taşınan mesafe (mm), ivmelenmeler (mm/^{s 2}). Özet istatistikler, grup karşılaştırmasından önce bireysel düzeyde hesaplandı. Bu testin süresi her grup için 1 saat idi.
4. Y-labirent dönüş davranışı: Kayıtlı yörüngelerden dönüş kararlarını çıkarıp sol veya sağ olarak sınıflandırın ve her birey için ikili diziler (sol/sağ) olarak dışa aktarın.
   NOT: Her sinek için, dönüş yanlılığı, tüm kaydedilen kararlar arasında sağa dönüşlerin oranı olarak hesaplandı. Sinekler arası davranışsal değişkenlik, dönüşüm yanlılığının ölçekli medyan mutlak sapması (MAD_n = 1.4826 × MAD) kullanılarak nicelendirildi. Bu testin süresi her grup için 1 saat idi.
5. FlyVac fototaktik seçenekleri: İkili ışık-karanlık seçimlerini otomatik olarak kaydedin. Her sinek için, hafif kolun seçildiği denemelerin oranı olarak ışık seçimi olasılığı (LCP) hesaplanın. Fototaktik yanlılığı ikili deneme sonuçlarının ortalaması olarak ifade edin (ışık = +1, karanlık = −1).
   NOT: Sinek arası değişkenlik, bireysel fototaksi endekslerinin MAD_n ile nicelendirilmiştir.
6. İstatistiksel analiz: 10.000 etiket randomizasyonu ile permütasyon tabanlı testler kullanarak davranışsal ölçütlerdeki grup farklarını değerlendirin.
   NOT: Değişkenliği karşılaştırmak için, gruplar arasındaki MAD_n mutlak farkları üzerinde permütasyon testleri yapıldı. MAD_n tahmini için güven aralıkları bootstrap yeniden örnekleme kullanılarak elde edilmiştir. İki kuyruklu, eşleşmesiz bir t-testi, sineklerin hareket ettiği mesafe (mm) ile maksimum ivmelenme (mm/^{s 2}) karşılaştırmak için kullanıldı. Veri görselleştirmesi için keman grafikleri (ağırlık, yoğunluk ve eğriliği göstermek için), kutu grafikleri ve sütun grafikleri kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık α = 0.05 olarak değerlendirildi.

Sonuçlar

Titreşim stresi protokolünün uygulanması, D. melanogaster'de aktivite, başa çıkma davranışı ve karar alma süreçlerini yakalamak için tasarlanmış birden fazla testte ölçülebilir davranışsal değişiklikler üretmiştir (Şekil 1).

Depresyon benzeri indüksiyon

Tekrarlanan mekanik titreşime maruz kalan sinekler (Şekil 1A), stressiz kontrollere kıyasla daha düşük keşif aktivitesi ve değişmi...

Tartışma

Mevcut protokol, D. melanogaster'da depresyona benzer davranış durumlarını induksiyon ve niceliklendirme için çok modlu bir yaklaşım sunmaktadır. Titreşim tabanlı stres paradigması ve tamamlayıcı davranışsal testler kullanılarak, bu çalışma, depresyon benzeri indüksiyonun başa çıkma davranışı, hareketsel aktivite, keşif dinamikleri, karar alma ve davranışsal değişkenlik ölçütleri üzerinden tespit^{edilebileceğini göstermektedir 16}. Bu çalışmada kullanılan s...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	Tüm platformlarla birlikte
Cotton closures for narrow vials	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Katalog numarası: 51-101
Drosophila Activity Monitor (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: mevcut değil	32 tüp
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	Katalog adı: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Versiyon 11.0.1
Logitech C920 HD Pro Webcam, HD 1080p lensKatalog adı: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland	RRID: mevcut değil	FST için kullanılan üst kayıt kamerası
Narrow Fly Vial, Polypropylene	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Katalog numarası: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Sodium dodecyl sulfate (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Germany	Katalog adı: Sodium dodecyl sulfate (ACS reagent, ≥99% purity); RRID: mevcut değil
ZEISS Stemi 508 Stereomicroscope	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germany	15634448