Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

96 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

Bu makalede

Özet

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Özet

Mitokondriler patogenez ve hastalık ilerlemesinde merkezi olsa da, mitokondriyal sağlık dinamiklerine mekanik bir bakış açısı maliyetli ve ulaşılmazdır. Bu boşluğu gidermek için, bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanmaktadır; fare karaciğerlerinde mitokondriyal sitokrom redoks durumlarının gerçek zamanlı, invaziv olmayan ve nicel ölçümlerini sağlayan taşınabilir bir sistem kullanılmıştır. Bu protokolde, kurulum, veri toplama ve veri işleme dahil olmak üzere bu teknolojinin kullanımını gösteriyoruz. Bu çalışma, RRS'nin mitokondriyal redoks durumundaki gerçek zamanlı değişiklikleri – ve dolayısıyla mitokondriyal fonksiyonu – ölçme yeteneğini vurgulayan bir kavram kanıtı deneyi sunmaktadır. Kısa bir süreliğine, RRS cihazı bir lazer pompasına ve veri toplama bilgisayarına bağlandı ve sıçan karaciğerinden 1 cm uzaklığa yerleştirildi.  Edinim parametreleri fare karaciğer protokolüne uygun olarak seçildi; Redoks durumları, oksijenli ve iskemik koşullarda oksijen stres testi kullanılarak ölçüldü. Mitokondriyal redoks durumlarındaki değişiklikler oksijen stres testi boyunca takip edildi.

Giriş

Mitokondriler, hücresel fonksiyon ve homeostazda kritik bir rol oynar. Mitokondriler, hücresel metabolizmanın ana sürücüleridir ve oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimini düzenler. Ayrıca, apoptotik yolları düzenleyerek hücre kaderini belirleyen sinyal organelleri olarak da hizmet ederler; ayrıca ROS ve Ca+2 sinyalleri 1 ile birlikte kullanılırlar. Bu nedenle, mitokondriyal işlev bozukluğu çeşitli nörodejeneratif, kas ve kardiyovasküler hastalıklara yol açabilir 2,3. Mitokondrilerin hastalık ilerlemesinde kritik bir rolü olmasına rağmen, mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi invaziv, maliyetli ve sınırlı olabilir.

Mitokondriyal fonksiyonun temel göstergeleri, oksijen tüketim oranı, oksidatif fosforilasyon ve elektron taşıma zincirindeki (ETC) çeşitli komplekslerin aktivitesi respirometri yoluyla ölçülür. ETC, iç mitokondriyal zarda (IMM) gömülü dört kompleksten (I–IV) oluşur. Bu kompleksler, diğer ko-enzimlerin yardımıyla, NADH ve FADH2 gibi indirgenmiş substratlardan elektronları son elektron alıcısı olan O2'ye aktarır ve O 2 suya indirgenir. Seahorse ve Orobros O2k gibi çoğu çağdaş respirometri testi, doku işleme gerektirir, bu nedenle translasyon araştırması için uygulanmalarınısınırlar 4,5. Mitokondriyal membran potansiyelinin (MMP) ölçülmesi, JC-1 gibi katyonik lipofilik floroforları ve mikroskobik görüntülemeyi kullanarak mitokondriyal disfonksiyonun değerlendirilmesinde bir diğer yöntemdir ve burada bağlı (sağlıklı) ve bağlanmamış (hasarlı) mitokondriler farklı dalga boylarına sahipfloresans yapar 6. Ancak, bu testler düşükhassasiyete sahip olabilir 5. Boya kendisi yüksek konsantrasyonlarda yüksek sitotoksisiteyesahip olabilir 5. Son olarak, respirometri ölçümleri gibi, bu teknik de doku işleme gerektirir. Spektroskopiye dayalı teknikler, son zamanlarda mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için invaziv olmayan yöntemler olarak kullanılmıştır. Örneğin, fosfor içeren metabolitlerin konsantrasyonlarını ölçerek hücresel metabolizmayı değerlendiren Fosfor Manyetik Rezonans Spektroskopisi (P-MRS), farklılaşma geçiren mühendislik yapımı adipojenik dokunun karakterizasyonuiçin kullanılmıştır 7. Ancak bu teknik ayrıca özel ekipman ve eğitim gerektirir.

Grubumuz yakın zamanda, Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak organ yaşamalılığını belirtemek için mitokondriyal redoks durumunu ölçmek için gerçek zamanlı, invaziv olmayan ve son derece spesifik bir teknik gösterdi. RRS, mitokondriyal sitokromların redoks durumlarının nicelendirilmesi için fotonların elastik olmayan saçılmasını kullanır. Mitokondriyal sitokrom, hemoglobin ve miyoglobin gibi moleküllerin hem bölmelerindeki porfirin halkaları, 441 nm dalga boylu lazer8 ile uyarıldığında oksidasyon durumlarına bağlı olarak karakteristik bir Ramanspektrumu üretir. RRS sistemi 441 nm dalga boyu kullansa da, 420 nm ve 405 nm dalga boylarına sahip lazerler de kullanılabilir ve her biri tercihen farklı bir sitokrom kompleksini güçlendirir. İlgi çekici bilinmeyen bir örnekten elde edilen spektrum, tamamen oksitlenmiş veya indirgenmiş sağlam mitokondrilerden oluşan önceden kaydedilmiş kütüphanelerle çapraz referans olarak alınır ve bu da indirgenmiş toplam mitokondrilerin oranını veya yerinde ETC sitokromlarının ortalama redoks durumunu elde eder. Bu oran, Rezonans Raman İndirgenmiş Mitokondriyal Oranı (3RMR) olarak tanımlanır.

3RMR'nin 3 farklı hesaplaması/türü vardır: mitokondriyal 3RMR (mito-3RMR), kompleks III 3RMR (cIII-3RMR) ve kompleks IV 3RMR (cIV-3RMR). Bu indekslerin her biri, belirli bir bileşenin toplam sayısına indirgenmiş bir bölme üzerinden hesaplanır. Örneğin, cIII'ün 3RMR'si, azaltılmış cIII'ün dokudaki toplam cIII sayısına oranı (cIII-R/(cIII-O+CIII-R) olurdu. Aynı kalıp cIV için de geçerlidir. Dolayısıyla 3RMR-cIII, azaltılmış cIII'ün toplam cIII miktarına oranını, 3RMR-cIV ise azaltılmış cIV'in toplam cIV miktarına oranını ifade eder. Regresyon analizi ile, mitokondriyal redoks durumları (mito-3RMR) sağlam mitokondrilerin spektral kütüphaneleri kullanılarak hesaplanır ya da bireysel kompleks redoks durumları (cIII-3RMR ve cIV-3RMR) cIII ve cIV spektral kütüphaneleri kullanılarak hesaplanır. Yakın tarihlibir yayın 9 , mito-3RMR'nin cIII ve cIV redoks durumlarının (veya cIII-3RMR ve cIV-3RMR) ağırlıklı ortalamasını temsil ettiğini göstermiştir. CI ve cII'nin 441 nm dalga boyu boyunca Raman-aktif veya rezonanslı olarak güçlendirilmediğini belirtmek önemlidir. Sonuç olarak, mito-3RMR hesaplanırken hesaplanmazlar.

Bu tür 3RMR'lerden yararlanarak, 3RMR'nin optimal aralığını tanımlıyoruz. "Sağlıklı" organlarda mitokondriler sağlam ve yeterli oksijen kaynağı vardır. Buna karşılık, hasar görmüş organlar oksijen yetersiz ulaşımı veya kullanımı olabilir, bu da ETC komplekslerinin elektron birikmesine neden olabilir. Elektron birikimi "indirgeme stresine" neden olur; mitokondriler oksitlenmiş halden indirgenmiş hale kaydırır ve 3RMR değerlerini artırır. Kemirgen ve domuz modellerinde kalp ve karaciğer gibi çeşitliçalışmalar, 3RMR için en uygun "sağlıklı" aralığı aydınlatmaya başladı; bu aralığın 10 ile 30 arasında olması önerilmektedir. Örneğin, Perry ve ark., memeli kalplerini hipoksiye maruz bıraktı; burada %30 RMR'nin hipoksik dokuyu tespit etmek için hassasiyet ve özellik açısından optimal dengeyisağladığı gösterildi 8. Bu eğilim, kardiyak doku11,12 ve karaciğergreftleri 10 ile yapılan ek çalışmalarda da doğrulandı. Ayrıca, Nyugen ve ark.9, metabolizması durmuş dokularda 3RMR değerlerinin çok düşük (oksidlenmiş) değerlere düştüğünü, 3 saat normotermik makine perfüzyonu sonrası nakil edilmeyen sıcak-iskemik karaciğerlerde 3RMR seviyelerinin (7.667 ±± 4.926) olduğunu, taze ve nakil edilebilir sıcak-iskemik karaciğerlerde ise 3RMR değerlerinin 10'un üzerindeydi (~12–15) olduğunugöstermiştir9.

3RMR'nin doku yaşamlılığını nasıl ölçebileceğine dair bu gösterimlerin ötesinde, RRS'nin hassasiyeti, özgüllüğü ve kullanım kolaylığı, hücresel metabolizma ve mitokondriyal fonksiyonun etkilendiği birçok diğer araştırma türüne de oldukça uygulanabilir hale getirir. Önceki çalışmalarda, RRS, optik sinir başında retinal ganglion hücrelerinin miyelinsiz aksonlarının metabolik aktivitesini değerlendirerek farelerde makula dejenerasyonu ve glokomu tespit etmek içinkullanılmıştır 13. Ayrıca, doğuştan kalp hastalığı modelinde sıçan modelinde aort koarktasyonunu (CoA) tespit etmek için kullanılmıştır; bu tanı genellikle yenidoğan kalp taramalarında gözdenkaçırılır 12. Bu teknoloji, organ nakli alanında ilgili çeşitli deneysel koşullarda organ fonksiyonu ve canlılığını anlamak için kullanılmıştır; bunlar arasında ex vivo makine perfüzyonu üzerinde organ canlılığınıdeğerlendiren çalışmalar da vardır 10,11, statik soğuk depolama sonrası reoksijenasyonudeğerlendirir veya sıcak iskemik karaciğerlerin reperfüzyon hasarını hafifletmekdahildir.

Bu makale, RRS'yi mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için gerçek zamanlı, hassas bir araç olarak kurmayı amaçlamaktadır. Bir fare modelinden alınan tüm karaciğerler, mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için stres testi kapsamında çeşitli işemi ve oksijen reperfüzyona maruz bırakıldı. Bu oksijen stres testinde, taze karaciğerler 5 dakika başlangıç perfüzyon akışı, 5 dakika iskemi ve 5 dakika reperfüzyon ile tabi tutulur. Stres testi boyunca 3RMR ile laktat, K+, kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçümleri alındı. 3RMR ile oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analizlerine kıyasla daha hızlı bir yanıt gözlemlenmiştir. Bu deneylerde, RRS'nin kullanımı sadece mekanik çalışmalar için değil, aynı zamanda tanı yöntemi ve terapötik test platformu olarak da vurgulanmaktadır. Bu nedenle, paylaşılan protokol mitokondri ile çalışan çeşitli araştırmacılar için faydalı olabilir. Genel olarak, RRS, invaziv olmayan, gerçek zamanlı ve son derece spesifik yapısıyla hücresel metabolizma üzerinde önemli bir etki yaratabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler için tüm hayvanlar Ulusal Araştırma Konseyi yönergelerine uygun olarak bakımı yapıldı ve Massachusetts General Hospital'daki (Boston, MA, ABD) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. RRS'nin kurulması ve kullanımı

  1. Cihaz açıklaması:
    NOT: Taşınabilir RRS sistemi (Pendar Technologies; ürün sadece araştırma amaçlıdır) bu dalga boyunda mitokondriyal sitokromların Raman spektrumunun rezonans artırılması nedeniyle 441 nm lazer kullanır. Lazer 4 mW ile 8 mW arasında çalışır.
    1. Lazer uyarılma kaynağını özel yapım bir proba fiber optik kablo aracılığıyla bağlayın. Prob, dokuya 2 mm çapında bir lazer noktası parlar ve yayılan spektrumu toplar. Spektrum daha sonra bir bant geçişli filtreden geçer ve bir yük-bağlı cihaz (CCD) dizisi tarafından toplanır. Spektrum, 180 saniyelik bir zaman diliminde her saniye toplanır ve analiz için ham ve gürültü azaltılmış bir spektrum oluşturmak üzere ortalaması alınır.
    2. Yazılım, bu elde edilen spektrumu önceden ölçülmüş spektral kütüphanelerle regresyon analiziyle karşılaştırır.
  2. Kütüphanelerin ön kayıt prosedürü
    NOT: Bu makalede sunulan deneyler için, mitokondri, kompleks III ve kompleks IV, hemoglobin ve miyoglobin kütüphanelerinin indirgenmiş ve oksitlenmiş formları oluşturulmuş ve kullanılmıştır. Tüm kütüphanelerin RRS sinyalleri oda sıcaklığında (21 °C) siyah bir kutuda alındı. Bu kütüphane dosyaları, analiz yazılımıyla ayrı ayrı sağlanır. Ancak, ilgilenilen dokuya ve diğer Raman-aktif moleküllerin varlığına bağlı olarak, aşağıdaki protokolü uygun şekilde uyarlayarak başka kütüphaneler de oluşturulabilir. Hemoglobin, miyoglobin ve oksitlenmiş/indirgenmiş kompleks III/IV kütüphanelerinin ham RRS spektrumları şu adreste sunulmaktadır: Ek Şekil 1.
    1. Hemoglobin kütüphaneleri (Ek Şekil 1C):
      1. Hayvan kanını boşaltma yoluyla taze kemirgen kanı toplayın. Toplanan kanı %100 oksijenle oksijenlendirin veya %100 azot kullanarak cam bir küvette sodyum ditionat ekleyerek oksijensizleştirin.
      2. Her durumun RRS'sini cam küvet duvarından 10 dakika boyunca ölçün; RRS probu cam küvetten 9 mm uzakta konumlandırılmıştır.
      3. Oksijensizleşmiş durumu doğrulamak için 1356 cm-1'deki spektral zirveleri ve oksijenli durumu doğrulamak için 1376 cm-1'deki zirveleri kullanın.
    2. İndenmiş/oksitlenmiş mitokondriyal kütüphaneler (Şekil 1)
      1. Mitokondrileri, homojenleştirilmiş ve arındırılmış kemirgen kalplerinden cam bir küvette izole edin. Raman probunu cam küvetten 9 mm uzaklığa yerleştirin ve bu mitokondrilerin spektrumlarını cam duvardan ölçün.
      2. Mitokondrilere %100 oksijen akışı sağlayarak tamamen oksitlenmiş koşullar oluşturun. 1357 cm-1'de indirgenmiş RR zirvesi yokluğu nedeniyle oksitlenmiş durumu doğrulayın.
      3. Mitokondrileri %100 azotla az miktarda hidrojen sülfüre maruz bırakarak tamamen indirgenmiş koşullar oluşturun. 1371 cm-1'de oksitlenmiş RR işaretleyici zirvesinin olmaması nedeniyle azaltılmış koşulları doğrulayın.
    3. Oksitlenmiş/indirgenmiş kompleks III/IV (Ek Şekil 1A,B):
      1. Başka yerlerde tanımlandığı gibi Kompleks III ve IV'üizole edin 9,15,16,17. Kısaca, başlangıç malzemesi olarak izole mitokondrilerden oluşan stok bir örnek (200 nanomol sitokrom a'ya karşılık gelir) kullanın.
      2. Mitokondrileri buz gibi soğuk tampon C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8.45) içinde 10 nmol sitokrom A/mL olarak seyreltin. Sonra, %10 w/v n-β-D-dodesil maltozid (DM) damla-damla ekleyin ve buz üzerinde nazikçe karıştırın.
      3. Ekstraktı 40.000 × g sıcaklığında 40 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendirin. Üst katmayı, daha önce 5 sütun hacmi tampon C (%0,02 w/v DM içeren) dengelenmiş değişim reçineyi ile doldurulmuş 2,5 cm × 20 cm cam bir kolona uygulanın.
      4. İki sütun hacmi tampon C ile yıkandıktan sonra, aynı tamponda 0–400 mM doğrusal bir NaCl gradyanı uygulayarak mitokondriyal kompleksleri elülasyon yapın ve elyutu 4 mL fraksiyonlarda toplayın.
      5. Kompleks IV'ü içeren yeşil fraksiyonlar, gradyanın ortasına yakın (~180 mL NaCl) ölüasyonlu, Kompleks III'ü içeren kırmızımsı fraksiyonlardan önce. Her kompleksi içeren biriktirilmiş fraksiyonları 20–30 nmol sitokrom a/mL'ye yoğunlaştırın.
      6. Bireysel kompleksler izole edildikten sonra, her birini oksitleyici ve indirgeme koşullarına maruz bırakın. Tris tamponunda 11 mM Kompleks III örneğini sitokrom c1 indirgençliği için 2 mL askorbat (1 M) ve sitokromları bL ve b H'yi tamamen indirgemek için 2 mL askorbat (1 M) ile 2 mL HS (hidrosülfit) ile indirgençleştirin.
      7. Kompleks IV çok aşamalı bir katalitik oksidasyon sürecinden geçtiği için, Tris tamponunda 18,67 mM Kompleks IV örneğini birden fazla adımda indirgesin. Kompleks IV'ü tamamen azaltmak için iki adet 2 mL H2O2 (10 mMM) ve ardından 2 mL HS ekleyin.
      8. Her eklemeden sonra kütüphane spektrumlarını toplayarak döngünün her adımını yakalayın. Kompleks IV'in sabit durumlarını temsil etmek için nihai referans kütüphanesine tamamen oksitlenmiş ve indirgenmiş spektrumlar ekleyin.
      9. Tüm örnekleri 1 mL'lik cam şişede hazırlayın ve sonda lensin 9 mm mesafesinde sabit bir konumda tutun ve ışık kirliliğini önlemek için siyah bir kutuya yerleştirin. Her kompleks ve oksidasyon durumu için 600 saniye boyunca RRS spektrumları toplayın.
      10. Daha önce açıklandığı gibi izole cIII ve cIV'in saflığınıdoğrulayın 17 ve izole cIII ve cIV spektral kütüphanelerinin tam mitokondriyal spektrumları açıklamada yeterliliğinidoğrulayın 9.
    4. Miyoglobin kütüphaneleri (Ek Şekil 1D):
      1. Benzer oksijen ve azot (çözünmüş sodyum ditionit ile) akışları kullanılarak, miyokard miyoglobin özünün oksimiyoglobin doygunluğunu %0 ile %100 arasında değiştirin. Raman spektrumlarını, 1355 cm-1 ve 1376 cm-1 işaretleyici zirvelerle doğrulayın.

NOT: Yukarıda detaylandırılan çoğu spektral bileşen, örneğin hemoglobin veya oksitlenmiş/indirgenmiş mitokondriler, hem içeren moleküllerdir ve aynı dalga boyu tarafından uyarılırlar. Bu RRS sistemi, her molekül için benzersiz spektral sinyal temelinde bir regresyon kütüphanesi oluşturarak sinyal örtüşmesini önler. Elde edilen dağılmış spektrumlar, seçilen kütüphanelere karşı bir regresyon algoritması üzerinden çalıştırılır. Regresyon algoritması, her kütüphane spektrumu için, kaydedilen spektrumdaki göreceli katkısının en iyi uyum tahminini ve dolayısıyla dokudaki göreli konsantrasyonunu temsil eden bir faktör verir. Algoritma, dalga sayıları aralığında en iyi uyumu kullandığı için, çeşitli kütüphane bileşenlerinin spektral zirvelerinin konumu veya yoğunluğundaki küçük farklılıklar, regresyonun yakın ilişkili kromoforları bile ayırt etmesine olanak tanır. Regresyon algoritması ve spektral kütüphaneler sayesinde, RRS sistemi toplam, dağılmış sinyali benzersiz spektral zirvelerine göre çeşitli bileşenlere ayırabilir ve heme içeren moleküllerden sinyal örtüşmesini önler. Hemoglobin ile mitokondri arasındaki ilişkiyi göstermek için, karaciğer perfüzyonundan alınan spektrumların, ölçülen sinyalete, en iyi uyum çizgisine ve bireysel spektral tepelerdeki farklılıklardan kaynaklanan açıklanamayan kalıntıya bölünmüş Ek Şekil 2 dahil edilmiştir. Panel A'da, indirgenmiş ve oksitlenmiş hemoglobin ile indirgenmiş ve oksitlenmiş mitokondri regresyon kütüphaneleri seçilir. Kütüphaneler ve regresyon analizi boyunca seçilen en iyi uyum çizgisi ölçülen sinyalle düzgünce örtüşüyor ve açıklanamayan kalıntılar çok azdır. Panel B'de yalnızca oksitlenmiş ve indirgenmiş mitokondri kütüphaneleri seçilir. Büyük, açıklanamayan bir kalıntı yapısı olduğundan, mitokondriyal spektral zirve, regresyon analizine dahil edilmemiş olan hemoglobin zirvesinden birkaç dalga numarası kaydırılır. Ayrıca, Nguyen ve ark.9'un ek figürlerinde, yazarlar mitokondri ile bireysel kompleksler (cIII ve cIV) arasındaki ilişkiyi ve bireyselkompleksler 16 arasındaki ilişkiyi açıklar; burada kompleks III daha keskin, düşük frekanslı zirveler gösterirken, kompleks IV daha geniş, yukarı kaymış bantlar gösterir. Ayrıca, yazarlar indirgenmiş Kompleks III ve Kompleks IV kütüphanelerinin, indirgenmiş tüm mitokondrilerin ölçülen spektrumunu tam olarak açıkladığını ve bunun sonucunda minimum açıklanamayan kalıntı elde ettiğini göstermektedir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Tam oksitlenmiş ve indirgenmiş mitokondrilerin spektral kütüphaneleri. RRS kütüphane spektrumları, izole mitokondrilere sırasıyla (A) %100 oksijen veya %100 azot (B) sağlanarak oksitlenmiş ve indirgenmiş durumlara ulaştıktan sonra elde edilmiştir. Bu durumlar, RR (C) oksijenli ve indirgenmiş (D) işaret zirvelerinin varlığıyla doğrulandı. Bu tepelerdeki kayma, oksijen varlığında moleküler titreşim modlarındaki değişikliklere karşılık gelir. Her zirvenin yoğunluğu, bu 441 nm uyarılma dalga boyu kullanılarak azaltılmış durumun artırılması daha yüksek olduğu için 1 rastgele yoğunluk birimine (AU) normalize edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. RRS kullanarak veri toplama

  1. Cihaz kurulumu:
    1. Spektrometre ünitesini (kompakt bir kutu içinde bulunan) doğru akım (DC) güç kaynağına ve verilen kablolarla güç adaptörüne bağlayın. Spektrometre ünitesi, hizalama girintileri olan yuvarlak bir fişe sahiptir.
    2. Yuvarlak fişin girintilerini, güç adaptörüne bağlanan kablonun girintileriyle hizalayın. Portları bağlamadan önce temizlik gerekmez (Şekil 2).
    3. Analizi çalıştıran bilgisayarı, spektrometre ve güç kaynağını sağlayan aynı güç adaptörüne verilen kablolarla bağlayın.
    4. Lazer probu prob tutucusuna yerleştirin. Deneyin başında bu probun konumunu ayarlayın.
    5. Spektrometre kontrol yazılımını (Cellular Energetics Software) açın.
  2. Yazılım kurulumu:
    NOT: Sistemle birlikte farklı doku türleri için ayar dosyaları ve regresyon kütüphaneleri sağlanır. Bu dosyalar, RRS sisteminin regresyona hangi kütüphaneleri dahil etmesi, regresyon penceresinde kaç spektrumun dahil olduğu ve lazer gücü gibi diğer parametreler hakkında bilgi içerir. Varsayılan ayarlar değiştirilebilir ve gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere yeni bir ayar dosyası kaydedilebilir. Aşağıda detaylandırılan yazılımın ekran görüntüleri Ek Şekil 3'te sunulmaktadır.
    1. Spektrometre kontrol yazılımı açıldığında, yüzde 3RMR, Oksijen Doygunluğu (StO2) ve miyoglobin doygunluğunu gösteren bir grafik görünecektir. Bu ekran, ölçümler boyunca seçilirse gerçek zamanlı olarak gösterilecek metriklerdir. Sayfanın sol alt köşesindeki Ayarlar sekmesine tıklayın.
    2. Bilgi sekmesinden, Oturum Adı altına oturum bilgilerini ve gerekli detayları Oturum Açıklaması sekmesine girin.
    3. İki veri toplama modu vardır. Belirli kalite metrikleri (örneğin, hedef sigma veya regresyon penceresi/spektrum sayısı) sağlanana kadar spektrum biriktirmek için Spot Check modunu kullanın, ardından kaydı durdurun. Dur düğmesine basılana kadar spektrumları kaydetmek için Sürekli Mod kullanın. Her iki modda da, tüm veriler, hem 3RMR sonuçları hem de bireysel spektrumlar otomatik olarak saklanır. Bu deney Sürekli Mod kullanır.
    4. Tüm oturum bilgileri girildikten sonra, Sistem sekmesine tıklayın.
    5. Settings File bölümünden, projeye uygun protokolü seçin (hücresiz fare karaciğer perfüzyonları için Rat Liver Acellular protokolünü seçin). Bu, ölçüm türünü, ortalama ölçüm süresini (regresyon penceresi) ve hedef sigmayı otomatik olarak ayarlar.
      1. Yeni bir ayar dosyası oluşturmak için, yukarıda listelenen bileşenlerden herhangi birini ayarlayın ve ardından Kaydet butonuna tıklayın. Bu, bu parametreleri ayrı bir ayar dosyası olarak kaydetmelidir ve ardından sisteme aktarılabilir.
      2. Yeni bir ayar dosyası içe aktarmak için, Varsayılan (Mod) yanındaki açılır menüye tıklayın ve Yeni Ayarlar Dosyasını İçe Aktar'ı seçin. İçe aktarılacak yeni Ayarlar Dosyasına tıklayın.
    6. Regresyon Kütüphaneleri altında, veri toplama ve analiz için kullanılacak kütüphanelerin kombinasyonunu seçip onaylayın. Bu deney için indirgenmiş ve oksitlenmiş mitokondriler [Sadece Mito] kütüphaneleri seçildi. Diğer kullanıcılar, Gelişmiş Kütüphane altında bulunan hemoglobin, miyoglobin veya diğer kompleksleri de içeren kütüphaneleri tercih edebilir.
    7. Tercih edilen Pencere Genişliği Modu'nu seçin ve onaylayın.
      1. Adaptif genişlik modu: Adaptif genişlik modunu kullanarak ortalama spektruma bireysel spektrumlar ekleyin, maksimum sigma hedefine ulaşana kadar. Eğer sigma hedefi ulaşılmazsa, kayıt ayarlanmış regresyon penceresinin üst sınırına (yani kaydedilmesi gereken maksimum spektrum sayısına) ulaştığında durur. Minimum sigma hedefine ulaşıldıktan sonra ölçüm sonuçları ekranda gösterilecektir.
      2. Sabit genişlik modu: Sabit genişlik modunu kullanarak hedef spektrum sayısı dahil edilene kadar (ortalama uzunluk altına ayarlanır) bireysel spektrumlar eklenir.
    8. Sistem ayarları tamamlandıktan sonra Plot sekmesine tıklayın.
    9. Ana Seri altında, ölçümler sırasında ekranda gösterilecek ve çizilecek bileşenleri seçin.
    10. Seçilen tüm ölçüm bileşenlerinin ilgi duyulan protokolle uyumlu olduğunu doğrulayın.
  3. Veri edinimi:
    NOT: Raman ölçümleri karanlık bir alanda yapılmalıdır. Veri toplamaya başlamadan önce, çalışma alanının mümkün olduğunca ışıktan korunduğundan emin olun. Oda tamamen ışıktan korunamazsa, RRS sistemi ortasında dikdörtgen bir açıklığı olan siyah bir kapakla gelir (gösterilmiştir: Şekil 2), bu sistemin içine lazer probun yerleştirilebileceği bir nokta vardır. Kutu, RRS ölçümlerinin alındığı organ örneğini/bölümünü kaplayabilir. RRS lazeri ile çalışırken, doğrudan veya uzun süreli göz maruz bırakmaktan kaçının. Lazeri doğrudan göze veya yansıtıcı yüzeylere tutmayın. Lazeri yalnızca doğrudan ilgilenilen dokuya yerleştirildiğinde aktive edin. RRS lazeri, 4 mW'ta kullanıldığında Sınıf 3R lazer, 10 mW'ta kullanıldığında ise Sınıf 3B lazeridir. Lazer doku teması için güvenlidir.
    1. Uygun, önceden kaydedilmiş ayarları, kayıt parametrelerini ve kütüphane dosyalarını seçin.
    2. Lazer probu doğrudan ilgi duyulan doku/organın üzerine yerleştirin. Probu mümkün olduğunca dik ve dokudan 1 cm uzakta konumlandırın. Orgun yüzeyinden doğru şekilde 1 cm yüksekliği ölçmek için bir cetvel kullanın. Sinyal net değilse, probu 1 cm'den daha yakın konumlandırın. Ancak, probun dokuya asla dokunmadığından emin olun.
      NOT: Prob elde tutulabilir, ancak ayarlanabilir ve stabil kalan bir prob tutucu/stand kullanılması önerilir. Probu mümkün olduğunca dik ve dokudan 1 cm uzakta konumlandırın. Bir cetvel kullanılarak orgun yüzeyinden 1 cm mesafeyi doğru ölçülebilirdi. Sinyal net değilse, sonda 1 cm'den daha yakın konumlandırılabilir. Ancak, prob asla dokuya dokunmamalıdır.
    3. Lazer noktasının sol lateral lobda, portal venlere mümkün olduğunca yakın olduğunu doğrulayın.
    4. Seçilen tüm kütüphanelerin, regresyon ayarlarının, hedef sigma'nın, regresyon penceresinin ve edinim modlarının doğru ve istendiği gibi olduğunu doğrulayın.
      1. Odanın mümkün olduğunca karanlık olduğundan emin olun. Probun camda özellikle kan gibi herhangi bir kirlenme olmadığını doğrulayın. Kontaminasyon durumunda, Quartz penceresini temizlemek için tüy içermemiş, aşındırıcı olmayan ve %70 izopropil alkol içeren bir mendil kullanın, ardından kuru bir mendil ile iyice kurutunuzu ve ardından devam edin.
      2. Yoğun kirlenme durumunda, probu yukarıda açıklandığı gibi mümkün olduğunca iyice silin. Sonra, lazeri siyah bantla kaplanmış koyu bir muhafaza yerleştirerek cihazı kalibre edin ve Take Dark tuşuna basın. Kalibrasyon yaklaşık 5–10 dakika sürer. Kirlenme olursa olsun, cihazı ayda bir kalibre edin, otomatik hatırlatma mesajları gönderir.
        NOT: Her kalite kontrol metriğinin açıklamaları, bu tür kalite kontrol metriklerinin örnekleri ve optimal ve alt optimal kayıtlardan elde edilen ham spektral sinyal (Ek Dosya 1, Şekil 3, Ek Şekil 3). Bu kalite kontrol kriterleri fare modelinden tüm karaciğerler için optimize edilmiştir. Farklı bir organ/hayvan modeli kullanan yeni geliştirilen herhangi bir protokol, bu metrikleri buna göre iyileştirmeli ve ayarlamalıdır.
    5. Ana sayfada, veri toplamaya başlamak için Başlat butonuna tıklayın. Seçilen ayarlara bağlı olarak, yazılım hedef hata değeri (sigma) veya 180 saniyeye ulaşana kadar kayıtları alır. Veri toplama işlemi artık tamamlandı.
      1. Bu grafiklerden RRS sinyalinin kalitesini çıkararak prob konumunun veya ölçüm koşullarının ayarlanmasını mümkün kılın (Şekil 3). Elde edilen RRS sinyali bu kalite kontrol kriterlerini karşılamazsa, probu mümkün olduğunca dik olacak şekilde ve yüzeyden prob penceresine yaklaşık 9 mm mesafede ayarlayın.
    6. Veri toplama/deneysel protokol tamamlandıktan sonra, tüm karaciğer/doku biyolojik tehlike kutusuna atılır. Organ/doku ile temas eden herhangi bir sistemi veya yüzeyi %70 etanol ile temizleyin.
      1. Perfüzyon sistemi ile çalışıyorsanız, DI suyu enzimatik temizleyici (7.8 mL 1 L deiyonize [DI] suya seyreltilmiş şekilde) karıştırın, ardından temiz DI suyu kullanın.
        NOT: Her kayıt, yeni bir oturum dosyası altında ayrı bir analiz dosyası olarak kaydedilir. 3RMR ve mitokondriyal sinyal gücü (r3RMR) için sonuçlar ana pencerede çizilmiştir. Ham spektrum da görüntülenebilir. Kalıntı sinyal gücü ve toplam sinyal gücü gibi diğer kalite kontrol metrikleri Spectrum sekmesi altında gösterilecektir.
  4. Veri analizi:
    1. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, deneysel dosyayı açmak ve sonuçları görmek için ekranın altındaki İnceleme klasörünü tıklayın.
    2. Alternatif olarak, sonuçları içeren bir metin dosyası açın. İlgilendiğiniz oturum dosyasını seçin. Tüm elde edilen ölçümleri içeren bir analiz dosyası açılacaktır. Her parametre ve sigma değeri kendi sütunu olur. Örneğin, her saniye elde edilen 3RMR değerleri "3RMR" sütununun altında, sigma değeri ise "sigma_3RMR" altında listelenir.
    3. Her sütunun son satırı, o oturum dosyasının her parametresi için nihai değerleri içerir. Bu değeri çizim için kullanın.
    4. Her oturum dosyası/kayıt için adımları tekrarlayın. Grafik, istendiği gibi değerleri elde etti.

figure-protocol-2
Şekil 2: RRS cihaz kurulumu. RRS sistem kurulumunun bir şeması. Prob, lazer uyarılma kaynağı ve spektrometreyi içeren RRS sistemine optik fiber kablo ile bağlanır. Bu kurulum, veri toplama ve analiz için spektrometre kontrol uygulamasını içeren herhangi bir dizüstü bilgisayara bağlanır. Hem bilgisayar hem de spektrometre ünitesi bir güç prizine bağlıdır. RRS ölçümleri karanlıkta yapılmalıdır. Oda tamamen ışıktan korunamazsa, RRS sistemi ortasında dikdörtgen bir açıklık bulunan siyah bir kapakla gelir; lazer probu burada konumlandırılabilir. Kutu, RRS ölçümlerinin alındığı organ örneğini/bölümünü kaplar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Düşük kalite ve optimal kalite izlerinin örnek izleri ve kalite kontrol metrikleri. Kalıntı sinyal (gürültü) turuncu bir braketle, mitokondriyal sinyal ise yeşil bir braketle işaretlenir. (A) Optimal olmayan bir Raman sinyalinden örnek iz. Kalıntı sinyal, mitokondriyal sinyalden ayırt edilemeyecek kadar büyüktür. Spektral zirveler ölçülen sinyal boyunca ayırt edilemez. (B) Optimal Raman sinyalinden örnek iz. Mitokondriyal sinyal gözle görülür şekilde daha büyüktür ve kalıntı sinyalinden farklıdır. Elde edilen ölçümden elde edilen spektral zirveler ayırt edilebilir. (C) Her sinyalden elde edilen kalite kontrol metrikleri. Genel olarak, suboptimal okumada elde edilen toplam sinyal, optimal okumadan daha azdır. Optimal kayıtta daha fazla mitokondriyal sinyal, suboptimal kayda kıyasla ölçülür; mitokondriyal sinyal toplam sinyalin %17 ve %14'ünü oluşturur. Sinyal, optimal okumada %4,3 hatayla ölçüldü, iken suboptimal okumada %18,5 hataya karşılık. Benzer şekilde, açıklanamayan kalıntı sinyal suboptimal kayıtta toplam sinyalin %11'ini oluştururken, optimal kayıtta %3,6'sını oluşturur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. RRS kullanarak mitokondriyal sağlığın değerlendirilmesi

NOT: Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) teknolojisi, nakil organların yaşamlılığını gösteren mitokondriyal canlılık ölçütü (3RMR) geliştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışma, oksijenlenmedeki ve dolayısıyla hücresel solunumdaki değişikliklerin, laktat ve K+ gibi geleneksel hasar biyobelirteçleriyle karşılaştırıldığında 3RMR trendlerinde nasıl yansıtıldığını göstermeyi amaçlamaktadır. Burada bir oksijen stres testi kullanılır; 5 dakika sürekli perfüzyonun ardından, oksijenli perfüzyon akışı 5 dakika duraklatılır, ardından 5 dakika devam eder. Stres testi boyunca RRS ölçümleri ile giriş ve çıkış perfüzyon örnekleri alınır.

  1. Karaciğer alımı:
    1. Hayvanları %3–%5 isofluran kullanarak indüksiyon odasında sedat etmektir. Fazla buharı aktif kömürle filtreleyin.
    2. Erkek Lewis farelerine tam hepatektomi yapın (150 g). Portal damarın dallarını bağlayın. IVC üzerinden 50 U sodyum heparin enjekte edin. Ameliyat sırasında portal ven 16 G kateterle kanülasyon yapılır ve karaciğeri 50 ml salin ile yurur.
    3. Temin edilen karaciğerleri, 30 mL Wisconsin Üniversitesi (UW) çözeltisi içeren bir Petri kabına buzun üzerine yerleştirin.
  2. Subnormotermik makine perfüzyonu (SNMP) kurulumu ve rezonans Raman ölçümleri:
    1. RRS cihazını daha önce tarif edildiği gibi kurun. Spektrometre kontrol yazılımında Acellular Rat Liver Protokolünü ayarlayın; bu protokol otomatik olarak genişlik modunu uyarlanabilir genişliğe, ortalama uzunluğu 180'e ve hedef sigma'yı 1.5'e ayar. Ayrıca ölçüm parametreleri olarak 3RMR ve Floresans'ı , regresyon kütüphanesi olarak ise sadece Mito'yu seçer. Alma modunu sürekli moda ayarlayın.
    2. SNMP sistemini başka bir yerde tarif edildiği gibikur 18.
      1. Kısaca, perfüzyon kurulumunun bir perfüzyon odası, bir peristaltik pompa, bir membran oksijenatörü ve bir baloncuk tuzağından oluştuğundan emin olun.
      2. Oksijenin atmosferik karışımla (%95 O2 ve %5 CO2) iletedilmesi; PO2'yi 400–500 mmHg arasında tutun. Bir basınç sensörüyle intrahepatik basıncı izleyin ve 3–5 mmHg arasında tutun. Örnekleri örnekleme portları aracılığıyla toplayın.
    3. Yazılım ve perfüzyon sistemi kurulduktan sonra, PV'yi delen kanülü perfüzyon makinesinin giriş tüpüne bağlayın. Organı, perfüzyonu ve perfüzyon kurulumunu oda sıcaklığında (21 °C) su banyosu olmadan tutun.
    4. Perfüzyo, peristaltik pompa kullanarak PV'deki kanül aracılığıyla organa iletin.
      1. Perfüzyonu hazırlamak için 500 mL fenol kırmızısı içermeyen Williams Medium ile 5 g Bovine Serum Albumin (BSA), 12 mg suda çözünen deksametazon, 5 mL penisillin-streptomisin, 5 mL L-glutamin, 2,5 μL insülin ve 1000 U heparin karıştırın.
      2. Tüm bileşenleri bir karıştırma plakasında yaklaşık 20 dakika veya tüm bileşenler çözünene kadar karıştırın. Perfüzyon akışlarını artırarak 3–5 mmHg basınç elde edin.
    5. Sonra, RRS lazer kaynağını prob tutucusuna yerleştirin ve karaciğerin en büyük lobun 1 cm yukarısında, PV'ye mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Perfüzyon akışını 5 dakika (T5) durdurun ve 10 dakikada (T10) devam edin. Stres testini 15 dakikada (T 15) yapın.
    6. Tüm stres testi boyunca RRS ölçümleri alın; T0'dan başlayarak her 5 dakikada bir giriş ve çıkış ölçümleri alın (Şekil 4). T0,T 5, T10, T15 (n = 3) için 3RMR değerlerini, ayrıca çıkış K+ seviyeleri ve laktat seviyelerini çizin (Şekil 5).
    7. Oksijenin giriş/çıkış kısmi basıncını (pO2) plazmadaki oksijenin çözünürlüğü katsayısı (0.00314) ile çarparak T0, T 5, T10, T15'te oksijen tüketim oranını (OCR) hesaplayın. OCR'yi T0, T5, T10, T15 için çizin (Şekil 5).
      NOT: Bir karaciğerden perfüze (T5), iskemik (T10) ve tekrar perfüze (T15) durumlarda örnek Rezonans Raman spektral izleri gösterilmiştir (Şekil 6)

figure-protocol-4
Şekil 4: Deneysel akışı gösteren diyagram. Dişi Lewis farelerine tam hepatektomi yapıldı. Temin edilen karaciğer, subnormotermik makine perfüzyona konmuş ve ilk 5 dakika boyunca oksijenli perfüzyon ile sağlanmıştır. Perfüzyon portal ven üzerinden karaciğere akar ve peristaltik pompa (perfüzyon akışı mavi oklarla gösterilmiştir) yoluyla dolaşır. Oksijenli perfüzyon sonraki 5 dakika boyunca T5'te duraklatıldı ve T10'da 5 dakika daha başlatıldı. Stres testi boyunca alınan 3RMR ölçümleri (lazer olarak gösterilir). Perfüzyon örnekleri T0, T5, T10 ve T15'te alındı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Taze karaciğerler, oksijen stres testi kullanılarak iskemi ve reperfüzyon dönemlerine maruz bırakıldı. Daha sonra, stres testi boyunca 3RMR'deki gerçek zamanlı değişiklikler, T0, T 5, T10, T15 perfüzyon analizinden elde edilen oksijen tüketim oranı, çıkış laktat ve potasyumla karşılaştırıldı. Sağlıklı koşullarda, 3RMR değerlerinin %10 ile %30 arasında olması beklenmektedir (Şekil 5A). Beklendiği gibi, T0...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, mitokondriyal sağlığın ölçülmesinde taşınabilir Rezonans Raman Spektroskopisi sistemi kullanılarak, kompakt bir probda bir lazerden oluşan ve fiber optik kablo ile lazer pompasına bağlanan bir yöntemi ortaya koymaktadır. Bu yöntem, oksidasyon durumlarına bağlı olarak benzersiz spektral sinyaller üreten mitokondrileri uyarmak için 441 nm lazer kullandı. Böylece, RRS, mitokondrinin her durumunu spektral imzaları üzerinden nicelikle ölçebilir ve yayılan spektrumları önceden ölçü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtir. S.N.T ve P.R.'nin bu çalışmayla ilgili geçici patent başvuruları bulunmaktadır. P.R., Pendar Technologies'in çalışanı ve hissedarıdır. S.N.T's, MGH ve Partners HealthCare tarafından çıkar çatışması politikalarına uygun olarak yönetilmektedir. J.N.K'nin rekabet eden çıkarları, BCH'nin çıkar çatışması politikalarıyla yönetilir. Bu çalışmada aşağıdaki patentli teknolojiler kullanılmıştır: US2020/0281474A1 Raman spektroskopisi ile hücresel enerjilerin in vivo izlemesi (uygulama). Oftalmoloji, doku canlılığı ve yanık yaralanması değerlendirmesi için Rezonans Raman Spektroskopisi kullanılarak ek patent başvuruları sunulmuştur; R.J. de mucittir.

Teşekkürler

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01DK134590) S.N.T.'ye cömert fon ile desteklendi. Ayrıca ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden S.N.T.'ye fon sağladığı için minnettarlığımızı bildiriyoruz (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Ulusal Bilim Vakfı (EEC 1941543), Polsky Aile Vakfı ve Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115) gibi kuruluşlarda yer aldı. Ayrıca, Amerikan Karaciğer Hastalıkları Araştırma Derneği Vakfı'ndan R.J.'ye #LIFER23-263034 numaralı hibe tarafından sağlanan fonları takdir ediyoruz.Yazarlar, Harvard Tıp Fakültesi'nin Patoloji Merkezi'nden histoloji çalışmaları için uzman desteği için derin teşekkür ediyor. NIH Ulusal Kalp ve Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden Dr. Robert Balaban ve Dr. Armel Femnou'ya, mitokondriyal enerjiler konusundaki uzmanlıkları ve bireysel mitokondriyal komplekslerin RRS kütüphanesinin geliştirilmesindeki önemli destekleri için teşekkürlerimizi sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Portal ven kanülasyonu için kullanılır
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Anastezi sırasında fazla buhar filtrelemek için kullanılır
BSA Sigma-Aldrich A7906Perfüzyon bileşimi
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Perfüzyon bileşimi
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Perfüzyon bileşimi
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Karaciğer boyunca perfüzat akışını sağlamak için kullanılır
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Karaciğer boyunca perfüzat akışını sağlamak için kullanılır
Membrane Oxygenator Radnoti130144Perfüzyonu oksijenlendirmek için kullanılır. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Perfüzyon bileşimi
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Kan gazı analizi için
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Bu ürünle ilgili sorular için Pendar Technologies ile iletişime geçin

Kaynaklar

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T pSay 234Say 234Bo De erSayMitokondriorgan canl lmitokondriyal sa l kKaraci er Naklimitokondriyal redoks durumlar

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.