Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

Özet

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Özet

Mitokondriler patogenez ve hastalık ilerlemesinde merkezi olsa da, mitokondriyal sağlık dinamiklerine mekanik bir bakış açısı maliyetli ve ulaşılmazdır. Bu boşluğu gidermek için, bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanmaktadır; fare karaciğerlerinde mitokondriyal sitokrom redoks durumlarının gerçek zamanlı, invaziv olmayan ve nicel ölçümlerini sağlayan taşınabilir bir sistem kullanılmıştır. Bu protokolde, kurulum, veri toplama ve veri işleme dahil olmak üzere bu teknolojinin kullanımını gösteriyoruz. Bu çalışma, RRS'nin mitokondriyal redoks durumundaki gerçek zamanlı değişiklikleri – ve dolayısıyla mitokondriyal fonksiyonu – ölçme yeteneğini vurgulayan bir kavram kanıtı deneyi sunmaktadır. Kısa bir süreliğine, RRS cihazı bir lazer pompasına ve veri toplama bilgisayarına bağlandı ve sıçan karaciğerinden 1 cm uzaklığa yerleştirildi.  Edinim parametreleri fare karaciğer protokolüne uygun olarak seçildi; Redoks durumları, oksijenli ve iskemik koşullarda oksijen stres testi kullanılarak ölçüldü. Mitokondriyal redoks durumlarındaki değişiklikler oksijen stres testi boyunca takip edildi.

Giriş

Mitokondriler, hücresel fonksiyon ve homeostazda kritik bir rol oynar. Mitokondriler, hücresel metabolizmanın ana sürücüleridir ve oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimini düzenler. Ayrıca, apoptotik yolları düzenleyerek hücre kaderini belirleyen sinyal organelleri olarak da hizmet ederler; ayrıca ROS ve Ca^{+2 sinyalleri 1} ile birlikte kullanılırlar. Bu nedenle, mitokondriyal işlev bozukluğu çeşitli nörodejeneratif, kas ve kardiyovasküler hastalıklara yol açabilir ^2,3. Mitokondrilerin hastalık ilerlemesinde kritik bir rolü olmasına rağmen, mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi invaziv, maliyetli ve sınırlı olabilir.

Mitokondriyal fonksiyonun temel göstergeleri, oksijen tüketim oranı, oksidatif fosforilasyon ve elektron taşıma zincirindeki (ETC) çeşitli komplekslerin aktivitesi respirometri yoluyla ölçülür. ETC, iç mitokondriyal zarda (IMM) gömülü dört kompleksten (I–IV) oluşur. Bu kompleksler, diğer ko-enzimlerin yardımıyla, NADH ve FADH2 gibi indirgenmiş substratlardan elektronları son elektron alıcısı olan O_2'ye aktarır ve O 2 suya indirgenir. Seahorse ve Orobros O2k gibi çoğu çağdaş respirometri testi, doku işleme gerektirir, bu nedenle translasyon araştırması için uygulanmalarını^{sınırlar 4,5}. Mitokondriyal membran potansiyelinin (MMP) ölçülmesi, JC-1 gibi katyonik lipofilik floroforları ve mikroskobik görüntülemeyi kullanarak mitokondriyal disfonksiyonun değerlendirilmesinde bir diğer yöntemdir ve burada bağlı (sağlıklı) ve bağlanmamış (hasarlı) mitokondriler farklı dalga boylarına sahip^{floresans yapar 6}. Ancak, bu testler düşük^{hassasiyete sahip olabilir 5}. Boya kendisi yüksek konsantrasyonlarda yüksek sitotoksisiteye^{sahip olabilir 5}. Son olarak, respirometri ölçümleri gibi, bu teknik de doku işleme gerektirir. Spektroskopiye dayalı teknikler, son zamanlarda mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için invaziv olmayan yöntemler olarak kullanılmıştır. Örneğin, fosfor içeren metabolitlerin konsantrasyonlarını ölçerek hücresel metabolizmayı değerlendiren Fosfor Manyetik Rezonans Spektroskopisi (P-MRS), farklılaşma geçiren mühendislik yapımı adipojenik dokunun karakterizasyonu^{için kullanılmıştır 7}. Ancak bu teknik ayrıca özel ekipman ve eğitim gerektirir.

Grubumuz yakın zamanda, Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak organ yaşamalılığını belirtemek için mitokondriyal redoks durumunu ölçmek için gerçek zamanlı, invaziv olmayan ve son derece spesifik bir teknik gösterdi. RRS, mitokondriyal sitokromların redoks durumlarının nicelendirilmesi için fotonların elastik olmayan saçılmasını kullanır. Mitokondriyal sitokrom, hemoglobin ve miyoglobin gibi moleküllerin hem bölmelerindeki porfirin halkaları, 441 nm dalga boylu lazer8 ile uyarıldığında oksidasyon durumlarına bağlı olarak karakteristik bir Raman^{spektrumu üretir.} RRS sistemi 441 nm dalga boyu kullansa da, 420 nm ve 405 nm dalga boylarına sahip lazerler de kullanılabilir ve her biri tercihen farklı bir sitokrom kompleksini güçlendirir. İlgi çekici bilinmeyen bir örnekten elde edilen spektrum, tamamen oksitlenmiş veya indirgenmiş sağlam mitokondrilerden oluşan önceden kaydedilmiş kütüphanelerle çapraz referans olarak alınır ve bu da indirgenmiş toplam mitokondrilerin oranını veya yerinde ETC sitokromlarının ortalama redoks durumunu elde eder. Bu oran, Rezonans Raman İndirgenmiş Mitokondriyal Oranı (3RMR) olarak tanımlanır.

3RMR'nin 3 farklı hesaplaması/türü vardır: mitokondriyal 3RMR (mito-3RMR), kompleks III 3RMR (cIII-3RMR) ve kompleks IV 3RMR (cIV-3RMR). Bu indekslerin her biri, belirli bir bileşenin toplam sayısına indirgenmiş bir bölme üzerinden hesaplanır. Örneğin, cIII'ün 3RMR'si, azaltılmış cIII'ün dokudaki toplam cIII sayısına oranı (cIII-R/(cIII-O+CIII-R) olurdu. Aynı kalıp cIV için de geçerlidir. Dolayısıyla 3RMR-cIII, azaltılmış cIII'ün toplam cIII miktarına oranını, 3RMR-cIV ise azaltılmış cIV'in toplam cIV miktarına oranını ifade eder. Regresyon analizi ile, mitokondriyal redoks durumları (mito-3RMR) sağlam mitokondrilerin spektral kütüphaneleri kullanılarak hesaplanır ya da bireysel kompleks redoks durumları (cIII-3RMR ve cIV-3RMR) cIII ve cIV spektral kütüphaneleri kullanılarak hesaplanır. Yakın tarihli^{bir yayın 9} , mito-3RMR'nin cIII ve cIV redoks durumlarının (veya cIII-3RMR ve cIV-3RMR) ağırlıklı ortalamasını temsil ettiğini göstermiştir. CI ve cII'nin 441 nm dalga boyu boyunca Raman-aktif veya rezonanslı olarak güçlendirilmediğini belirtmek önemlidir. Sonuç olarak, mito-3RMR hesaplanırken hesaplanmazlar.

Bu tür 3RMR'lerden yararlanarak, 3RMR'nin optimal aralığını tanımlıyoruz. "Sağlıklı" organlarda mitokondriler sağlam ve yeterli oksijen kaynağı vardır. Buna karşılık, hasar görmüş organlar oksijen yetersiz ulaşımı veya kullanımı olabilir, bu da ETC komplekslerinin elektron birikmesine neden olabilir. Elektron birikimi "indirgeme stresine" neden olur; mitokondriler oksitlenmiş halden indirgenmiş hale kaydırır ve 3RMR değerlerini artırır. Kemirgen ve domuz modellerinde kalp ve karaciğer gibi çeşitli^{çalışmalar}, 3RMR için en uygun "sağlıklı" aralığı aydınlatmaya başladı; bu aralığın 10 ile 30 arasında olması önerilmektedir. Örneğin, Perry ve ark., memeli kalplerini hipoksiye maruz bıraktı; burada %30 RMR'nin hipoksik dokuyu tespit etmek için hassasiyet ve özellik açısından optimal dengeyi^{sağladığı gösterildi 8}. Bu eğilim, kardiyak doku^11,12 ve karaciğer^{greftleri 10} ile yapılan ek çalışmalarda da doğrulandı. Ayrıca, Nyugen ve ^ark.9, metabolizması durmuş dokularda 3RMR değerlerinin çok düşük (oksidlenmiş) değerlere düştüğünü, 3 saat normotermik makine perfüzyonu sonrası nakil edilmeyen sıcak-iskemik karaciğerlerde 3RMR seviyelerinin (7.667 ±± 4.926) olduğunu, taze ve nakil edilebilir sıcak-iskemik karaciğerlerde ise 3RMR değerlerinin 10'un üzerindeydi (~12–15) olduğunu^{göstermiştir9}.

3RMR'nin doku yaşamlılığını nasıl ölçebileceğine dair bu gösterimlerin ötesinde, RRS'nin hassasiyeti, özgüllüğü ve kullanım kolaylığı, hücresel metabolizma ve mitokondriyal fonksiyonun etkilendiği birçok diğer araştırma türüne de oldukça uygulanabilir hale getirir. Önceki çalışmalarda, RRS, optik sinir başında retinal ganglion hücrelerinin miyelinsiz aksonlarının metabolik aktivitesini değerlendirerek farelerde makula dejenerasyonu ve glokomu tespit etmek için^{kullanılmıştır 13}. Ayrıca, doğuştan kalp hastalığı modelinde sıçan modelinde aort koarktasyonunu (CoA) tespit etmek için kullanılmıştır; bu tanı genellikle yenidoğan kalp taramalarında gözden^{kaçırılır 12}. Bu teknoloji, organ nakli alanında ilgili çeşitli deneysel koşullarda organ fonksiyonu ve canlılığını anlamak için kullanılmıştır; bunlar arasında ex vivo makine perfüzyonu üzerinde organ canlılığını^{değerlendiren çalışmalar da vardır 10,11}, statik soğuk depolama sonrası reoksijenasyonu^{değerlendirir veya} sıcak iskemik karaciğerlerin reperfüzyon hasarını hafifletmek^dahildir.

Bu makale, RRS'yi mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için gerçek zamanlı, hassas bir araç olarak kurmayı amaçlamaktadır. Bir fare modelinden alınan tüm karaciğerler, mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için stres testi kapsamında çeşitli işemi ve oksijen reperfüzyona maruz bırakıldı. Bu oksijen stres testinde, taze karaciğerler 5 dakika başlangıç perfüzyon akışı, 5 dakika iskemi ve 5 dakika reperfüzyon ile tabi tutulur. Stres testi boyunca 3RMR ile laktat, K+, kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçümleri alındı. 3RMR ile oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analizlerine kıyasla daha hızlı bir yanıt gözlemlenmiştir. Bu deneylerde, RRS'nin kullanımı sadece mekanik çalışmalar için değil, aynı zamanda tanı yöntemi ve terapötik test platformu olarak da vurgulanmaktadır. Bu nedenle, paylaşılan protokol mitokondri ile çalışan çeşitli araştırmacılar için faydalı olabilir. Genel olarak, RRS, invaziv olmayan, gerçek zamanlı ve son derece spesifik yapısıyla hücresel metabolizma üzerinde önemli bir etki yaratabilir.

Protokol

Deneyler için tüm hayvanlar Ulusal Araştırma Konseyi yönergelerine uygun olarak bakımı yapıldı ve Massachusetts General Hospital'daki (Boston, MA, ABD) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. RRS'nin kurulması ve kullanımı

1. Cihaz açıklaması:
   NOT: Taşınabilir RRS sistemi (Pendar Technologies; ürün sadece araştırma amaçlıdır) bu dalga boyunda mitokondriyal sitokromların Raman spektrumunun rezonans artırılması nedeniyle 441 nm lazer kullanır. Lazer 4 mW ile 8 mW arasında çalışır.
   1. Lazer uyarılma kaynağını özel yapım bir proba fiber optik kablo aracılığıyla bağlayın. Prob, dokuya 2 mm çapında bir lazer noktası parlar ve yayılan spektrumu toplar. Spektrum daha sonra bir bant geçişli filtreden geçer ve bir yük-bağlı cihaz (CCD) dizisi tarafından toplanır. Spektrum, 180 saniyelik bir zaman diliminde her saniye toplanır ve analiz için ham ve gürültü azaltılmış bir spektrum oluşturmak üzere ortalaması alınır.
   2. Yazılım, bu elde edilen spektrumu önceden ölçülmüş spektral kütüphanelerle regresyon analiziyle karşılaştırır.
2. Kütüphanelerin ön kayıt prosedürü
   NOT: Bu makalede sunulan deneyler için, mitokondri, kompleks III ve kompleks IV, hemoglobin ve miyoglobin kütüphanelerinin indirgenmiş ve oksitlenmiş formları oluşturulmuş ve kullanılmıştır. Tüm kütüphanelerin RRS sinyalleri oda sıcaklığında (21 °C) siyah bir kutuda alındı. Bu kütüphane dosyaları, analiz yazılımıyla ayrı ayrı sağlanır. Ancak, ilgilenilen dokuya ve diğer Raman-aktif moleküllerin varlığına bağlı olarak, aşağıdaki protokolü uygun şekilde uyarlayarak başka kütüphaneler de oluşturulabilir. Hemoglobin, miyoglobin ve oksitlenmiş/indirgenmiş kompleks III/IV kütüphanelerinin ham RRS spektrumları şu adreste sunulmaktadır: Ek Şekil 1.
   1. Hemoglobin kütüphaneleri (Ek Şekil 1C):
      1. Hayvan kanını boşaltma yoluyla taze kemirgen kanı toplayın. Toplanan kanı %100 oksijenle oksijenlendirin veya %100 azot kullanarak cam bir küvette sodyum ditionat ekleyerek oksijensizleştirin.
      2. Her durumun RRS'sini cam küvet duvarından 10 dakika boyunca ölçün; RRS probu cam küvetten 9 mm uzakta konumlandırılmıştır.
      3. Oksijensizleşmiş durumu doğrulamak için 1356 ^cm-1'deki spektral zirveleri ve oksijenli durumu doğrulamak için 1376 ^cm-1'deki zirveleri kullanın.
   2. İndenmiş/oksitlenmiş mitokondriyal kütüphaneler (Şekil 1)
      1. Mitokondrileri, homojenleştirilmiş ve arındırılmış kemirgen kalplerinden cam bir küvette izole edin. Raman probunu cam küvetten 9 mm uzaklığa yerleştirin ve bu mitokondrilerin spektrumlarını cam duvardan ölçün.
      2. Mitokondrilere %100 oksijen akışı sağlayarak tamamen oksitlenmiş koşullar oluşturun. 1357 ^cm-1'de indirgenmiş RR zirvesi yokluğu nedeniyle oksitlenmiş durumu doğrulayın.
      3. Mitokondrileri %100 azotla az miktarda hidrojen sülfüre maruz bırakarak tamamen indirgenmiş koşullar oluşturun. 1371 ^cm-1'de oksitlenmiş RR işaretleyici zirvesinin olmaması nedeniyle azaltılmış koşulları doğrulayın.
   3. Oksitlenmiş/indirgenmiş kompleks III/IV (Ek Şekil 1A,B):
      1. Başka yerlerde tanımlandığı gibi Kompleks III ve IV'ü^{izole edin} 9,15,16,17. Kısaca, başlangıç malzemesi olarak izole mitokondrilerden oluşan stok bir örnek (200 nanomol sitokrom a'ya karşılık gelir) kullanın.
      2. Mitokondrileri buz gibi soğuk tampon C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8.45) içinde 10 nmol sitokrom A/mL olarak seyreltin. Sonra, %10 w/v n-β-D-dodesil maltozid (DM) damla-damla ekleyin ve buz üzerinde nazikçe karıştırın.
      3. Ekstraktı 40.000 × g sıcaklığında 40 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendirin. Üst katmayı, daha önce 5 sütun hacmi tampon C (%0,02 w/v DM içeren) dengelenmiş değişim reçineyi ile doldurulmuş 2,5 cm × 20 cm cam bir kolona uygulanın.
      4. İki sütun hacmi tampon C ile yıkandıktan sonra, aynı tamponda 0–400 mM doğrusal bir NaCl gradyanı uygulayarak mitokondriyal kompleksleri elülasyon yapın ve elyutu 4 mL fraksiyonlarda toplayın.
      5. Kompleks IV'ü içeren yeşil fraksiyonlar, gradyanın ortasına yakın (~180 mL NaCl) ölüasyonlu, Kompleks III'ü içeren kırmızımsı fraksiyonlardan önce. Her kompleksi içeren biriktirilmiş fraksiyonları 20–30 nmol sitokrom a/mL'ye yoğunlaştırın.
      6. Bireysel kompleksler izole edildikten sonra, her birini oksitleyici ve indirgeme koşullarına maruz bırakın. Tris tamponunda 11 mM Kompleks III örneğini sitokrom c1 indirgençliği için 2 mL askorbat (1 M) ve sitokromları b_{L ve b} H'yi tamamen indirgemek için 2 mL askorbat (1 M) ile 2 mL HS (hidrosülfit) ile indirgençleştirin.
      7. Kompleks IV çok aşamalı bir katalitik oksidasyon sürecinden geçtiği için, Tris tamponunda 18,67 mM Kompleks IV örneğini birden fazla adımda indirgesin. Kompleks IV'ü tamamen azaltmak için iki adet 2 mL H₂O₂ (10 mMM) ve ardından 2 mL HS ekleyin.
      8. Her eklemeden sonra kütüphane spektrumlarını toplayarak döngünün her adımını yakalayın. Kompleks IV'in sabit durumlarını temsil etmek için nihai referans kütüphanesine tamamen oksitlenmiş ve indirgenmiş spektrumlar ekleyin.
      9. Tüm örnekleri 1 mL'lik cam şişede hazırlayın ve sonda lensin 9 mm mesafesinde sabit bir konumda tutun ve ışık kirliliğini önlemek için siyah bir kutuya yerleştirin. Her kompleks ve oksidasyon durumu için 600 saniye boyunca RRS spektrumları toplayın.
      10. Daha önce açıklandığı gibi izole cIII ve cIV'in saflığını^{doğrulayın 17} ve izole cIII ve cIV spektral kütüphanelerinin tam mitokondriyal spektrumları açıklamada yeterliliğini^{doğrulayın 9}.
   4. Miyoglobin kütüphaneleri (Ek Şekil 1D):
      1. Benzer oksijen ve azot (çözünmüş sodyum ditionit ile) akışları kullanılarak, miyokard miyoglobin özünün oksimiyoglobin doygunluğunu %0 ile %100 arasında değiştirin. Raman spektrumlarını, 1355 ^cm-1 ve 1376 ^cm-1 işaretleyici zirvelerle doğrulayın.

NOT: Yukarıda detaylandırılan çoğu spektral bileşen, örneğin hemoglobin veya oksitlenmiş/indirgenmiş mitokondriler, hem içeren moleküllerdir ve aynı dalga boyu tarafından uyarılırlar. Bu RRS sistemi, her molekül için benzersiz spektral sinyal temelinde bir regresyon kütüphanesi oluşturarak sinyal örtüşmesini önler. Elde edilen dağılmış spektrumlar, seçilen kütüphanelere karşı bir regresyon algoritması üzerinden çalıştırılır. Regresyon algoritması, her kütüphane spektrumu için, kaydedilen spektrumdaki göreceli katkısının en iyi uyum tahminini ve dolayısıyla dokudaki göreli konsantrasyonunu temsil eden bir faktör verir. Algoritma, dalga sayıları aralığında en iyi uyumu kullandığı için, çeşitli kütüphane bileşenlerinin spektral zirvelerinin konumu veya yoğunluğundaki küçük farklılıklar, regresyonun yakın ilişkili kromoforları bile ayırt etmesine olanak tanır. Regresyon algoritması ve spektral kütüphaneler sayesinde, RRS sistemi toplam, dağılmış sinyali benzersiz spektral zirvelerine göre çeşitli bileşenlere ayırabilir ve heme içeren moleküllerden sinyal örtüşmesini önler. Hemoglobin ile mitokondri arasındaki ilişkiyi göstermek için, karaciğer perfüzyonundan alınan spektrumların, ölçülen sinyalete, en iyi uyum çizgisine ve bireysel spektral tepelerdeki farklılıklardan kaynaklanan açıklanamayan kalıntıya bölünmüş Ek Şekil 2 dahil edilmiştir. Panel A'da, indirgenmiş ve oksitlenmiş hemoglobin ile indirgenmiş ve oksitlenmiş mitokondri regresyon kütüphaneleri seçilir. Kütüphaneler ve regresyon analizi boyunca seçilen en iyi uyum çizgisi ölçülen sinyalle düzgünce örtüşüyor ve açıklanamayan kalıntılar çok azdır. Panel B'de yalnızca oksitlenmiş ve indirgenmiş mitokondri kütüphaneleri seçilir. Büyük, açıklanamayan bir kalıntı yapısı olduğundan, mitokondriyal spektral zirve, regresyon analizine dahil edilmemiş olan hemoglobin zirvesinden birkaç dalga numarası kaydırılır. Ayrıca, Nguyen ve ^ark.9'un ek figürlerinde, yazarlar mitokondri ile bireysel kompleksler (cIII ve cIV) arasındaki ilişkiyi ve bireysel^{kompleksler 16} arasındaki ilişkiyi açıklar; burada kompleks III daha keskin, düşük frekanslı zirveler gösterirken, kompleks IV daha geniş, yukarı kaymış bantlar gösterir. Ayrıca, yazarlar indirgenmiş Kompleks III ve Kompleks IV kütüphanelerinin, indirgenmiş tüm mitokondrilerin ölçülen spektrumunu tam olarak açıkladığını ve bunun sonucunda minimum açıklanamayan kalıntı elde ettiğini göstermektedir.

Şekil 1: Tam oksitlenmiş ve indirgenmiş mitokondrilerin spektral kütüphaneleri. RRS kütüphane spektrumları, izole mitokondrilere sırasıyla (A) %100 oksijen veya %100 azot (B) sağlanarak oksitlenmiş ve indirgenmiş durumlara ulaştıktan sonra elde edilmiştir. Bu durumlar, RR (C) oksijenli ve indirgenmiş (D) işaret zirvelerinin varlığıyla doğrulandı. Bu tepelerdeki kayma, oksijen varlığında moleküler titreşim modlarındaki değişikliklere karşılık gelir. Her zirvenin yoğunluğu, bu 441 nm uyarılma dalga boyu kullanılarak azaltılmış durumun artırılması daha yüksek olduğu için 1 rastgele yoğunluk birimine (AU) normalize edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. RRS kullanarak veri toplama

1. Cihaz kurulumu:
   1. Spektrometre ünitesini (kompakt bir kutu içinde bulunan) doğru akım (DC) güç kaynağına ve verilen kablolarla güç adaptörüne bağlayın. Spektrometre ünitesi, hizalama girintileri olan yuvarlak bir fişe sahiptir.
   2. Yuvarlak fişin girintilerini, güç adaptörüne bağlanan kablonun girintileriyle hizalayın. Portları bağlamadan önce temizlik gerekmez (Şekil 2).
   3. Analizi çalıştıran bilgisayarı, spektrometre ve güç kaynağını sağlayan aynı güç adaptörüne verilen kablolarla bağlayın.
   4. Lazer probu prob tutucusuna yerleştirin. Deneyin başında bu probun konumunu ayarlayın.
   5. Spektrometre kontrol yazılımını (Cellular Energetics Software) açın.
2. Yazılım kurulumu:
   NOT: Sistemle birlikte farklı doku türleri için ayar dosyaları ve regresyon kütüphaneleri sağlanır. Bu dosyalar, RRS sisteminin regresyona hangi kütüphaneleri dahil etmesi, regresyon penceresinde kaç spektrumun dahil olduğu ve lazer gücü gibi diğer parametreler hakkında bilgi içerir. Varsayılan ayarlar değiştirilebilir ve gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere yeni bir ayar dosyası kaydedilebilir. Aşağıda detaylandırılan yazılımın ekran görüntüleri Ek Şekil 3'te sunulmaktadır.
   1. Spektrometre kontrol yazılımı açıldığında, yüzde 3RMR, Oksijen Doygunluğu (StO₂) ve miyoglobin doygunluğunu gösteren bir grafik görünecektir. Bu ekran, ölçümler boyunca seçilirse gerçek zamanlı olarak gösterilecek metriklerdir. Sayfanın sol alt köşesindeki Ayarlar sekmesine tıklayın.
   2. Bilgi sekmesinden, Oturum Adı altına oturum bilgilerini ve gerekli detayları Oturum Açıklaması sekmesine girin.
   3. İki veri toplama modu vardır. Belirli kalite metrikleri (örneğin, hedef sigma veya regresyon penceresi/spektrum sayısı) sağlanana kadar spektrum biriktirmek için Spot Check modunu kullanın, ardından kaydı durdurun. Dur düğmesine basılana kadar spektrumları kaydetmek için Sürekli Mod kullanın. Her iki modda da, tüm veriler, hem 3RMR sonuçları hem de bireysel spektrumlar otomatik olarak saklanır. Bu deney Sürekli Mod kullanır.
   4. Tüm oturum bilgileri girildikten sonra, Sistem sekmesine tıklayın.
   5. Settings File bölümünden, projeye uygun protokolü seçin (hücresiz fare karaciğer perfüzyonları için Rat Liver Acellular protokolünü seçin). Bu, ölçüm türünü, ortalama ölçüm süresini (regresyon penceresi) ve hedef sigmayı otomatik olarak ayarlar.
      1. Yeni bir ayar dosyası oluşturmak için, yukarıda listelenen bileşenlerden herhangi birini ayarlayın ve ardından Kaydet butonuna tıklayın. Bu, bu parametreleri ayrı bir ayar dosyası olarak kaydetmelidir ve ardından sisteme aktarılabilir.
      2. Yeni bir ayar dosyası içe aktarmak için, Varsayılan (Mod) yanındaki açılır menüye tıklayın ve Yeni Ayarlar Dosyasını İçe Aktar'ı seçin. İçe aktarılacak yeni Ayarlar Dosyasına tıklayın.
   6. Regresyon Kütüphaneleri altında, veri toplama ve analiz için kullanılacak kütüphanelerin kombinasyonunu seçip onaylayın. Bu deney için indirgenmiş ve oksitlenmiş mitokondriler [Sadece Mito] kütüphaneleri seçildi. Diğer kullanıcılar, Gelişmiş Kütüphane altında bulunan hemoglobin, miyoglobin veya diğer kompleksleri de içeren kütüphaneleri tercih edebilir.
   7. Tercih edilen Pencere Genişliği Modu'nu seçin ve onaylayın.
      1. Adaptif genişlik modu: Adaptif genişlik modunu kullanarak ortalama spektruma bireysel spektrumlar ekleyin, maksimum sigma hedefine ulaşana kadar. Eğer sigma hedefi ulaşılmazsa, kayıt ayarlanmış regresyon penceresinin üst sınırına (yani kaydedilmesi gereken maksimum spektrum sayısına) ulaştığında durur. Minimum sigma hedefine ulaşıldıktan sonra ölçüm sonuçları ekranda gösterilecektir.
      2. Sabit genişlik modu: Sabit genişlik modunu kullanarak hedef spektrum sayısı dahil edilene kadar (ortalama uzunluk altına ayarlanır) bireysel spektrumlar eklenir.
   8. Sistem ayarları tamamlandıktan sonra Plot sekmesine tıklayın.
   9. Ana Seri altında, ölçümler sırasında ekranda gösterilecek ve çizilecek bileşenleri seçin.
   10. Seçilen tüm ölçüm bileşenlerinin ilgi duyulan protokolle uyumlu olduğunu doğrulayın.
3. Veri edinimi:
   NOT: Raman ölçümleri karanlık bir alanda yapılmalıdır. Veri toplamaya başlamadan önce, çalışma alanının mümkün olduğunca ışıktan korunduğundan emin olun. Oda tamamen ışıktan korunamazsa, RRS sistemi ortasında dikdörtgen bir açıklığı olan siyah bir kapakla gelir (gösterilmiştir: Şekil 2), bu sistemin içine lazer probun yerleştirilebileceği bir nokta vardır. Kutu, RRS ölçümlerinin alındığı organ örneğini/bölümünü kaplayabilir. RRS lazeri ile çalışırken, doğrudan veya uzun süreli göz maruz bırakmaktan kaçının. Lazeri doğrudan göze veya yansıtıcı yüzeylere tutmayın. Lazeri yalnızca doğrudan ilgilenilen dokuya yerleştirildiğinde aktive edin. RRS lazeri, 4 mW'ta kullanıldığında Sınıf 3R lazer, 10 mW'ta kullanıldığında ise Sınıf 3B lazeridir. Lazer doku teması için güvenlidir.
   1. Uygun, önceden kaydedilmiş ayarları, kayıt parametrelerini ve kütüphane dosyalarını seçin.
   2. Lazer probu doğrudan ilgi duyulan doku/organın üzerine yerleştirin. Probu mümkün olduğunca dik ve dokudan 1 cm uzakta konumlandırın. Orgun yüzeyinden doğru şekilde 1 cm yüksekliği ölçmek için bir cetvel kullanın. Sinyal net değilse, probu 1 cm'den daha yakın konumlandırın. Ancak, probun dokuya asla dokunmadığından emin olun.
      NOT: Prob elde tutulabilir, ancak ayarlanabilir ve stabil kalan bir prob tutucu/stand kullanılması önerilir. Probu mümkün olduğunca dik ve dokudan 1 cm uzakta konumlandırın. Bir cetvel kullanılarak orgun yüzeyinden 1 cm mesafeyi doğru ölçülebilirdi. Sinyal net değilse, sonda 1 cm'den daha yakın konumlandırılabilir. Ancak, prob asla dokuya dokunmamalıdır.
   3. Lazer noktasının sol lateral lobda, portal venlere mümkün olduğunca yakın olduğunu doğrulayın.
   4. Seçilen tüm kütüphanelerin, regresyon ayarlarının, hedef sigma'nın, regresyon penceresinin ve edinim modlarının doğru ve istendiği gibi olduğunu doğrulayın.
      1. Odanın mümkün olduğunca karanlık olduğundan emin olun. Probun camda özellikle kan gibi herhangi bir kirlenme olmadığını doğrulayın. Kontaminasyon durumunda, Quartz penceresini temizlemek için tüy içermemiş, aşındırıcı olmayan ve %70 izopropil alkol içeren bir mendil kullanın, ardından kuru bir mendil ile iyice kurutunuzu ve ardından devam edin.
      2. Yoğun kirlenme durumunda, probu yukarıda açıklandığı gibi mümkün olduğunca iyice silin. Sonra, lazeri siyah bantla kaplanmış koyu bir muhafaza yerleştirerek cihazı kalibre edin ve Take Dark tuşuna basın. Kalibrasyon yaklaşık 5–10 dakika sürer. Kirlenme olursa olsun, cihazı ayda bir kalibre edin, otomatik hatırlatma mesajları gönderir.
         NOT: Her kalite kontrol metriğinin açıklamaları, bu tür kalite kontrol metriklerinin örnekleri ve optimal ve alt optimal kayıtlardan elde edilen ham spektral sinyal (Ek Dosya 1, Şekil 3, Ek Şekil 3). Bu kalite kontrol kriterleri fare modelinden tüm karaciğerler için optimize edilmiştir. Farklı bir organ/hayvan modeli kullanan yeni geliştirilen herhangi bir protokol, bu metrikleri buna göre iyileştirmeli ve ayarlamalıdır.
   5. Ana sayfada, veri toplamaya başlamak için Başlat butonuna tıklayın. Seçilen ayarlara bağlı olarak, yazılım hedef hata değeri (sigma) veya 180 saniyeye ulaşana kadar kayıtları alır. Veri toplama işlemi artık tamamlandı.
      1. Bu grafiklerden RRS sinyalinin kalitesini çıkararak prob konumunun veya ölçüm koşullarının ayarlanmasını mümkün kılın (Şekil 3). Elde edilen RRS sinyali bu kalite kontrol kriterlerini karşılamazsa, probu mümkün olduğunca dik olacak şekilde ve yüzeyden prob penceresine yaklaşık 9 mm mesafede ayarlayın.
   6. Veri toplama/deneysel protokol tamamlandıktan sonra, tüm karaciğer/doku biyolojik tehlike kutusuna atılır. Organ/doku ile temas eden herhangi bir sistemi veya yüzeyi %70 etanol ile temizleyin.
      1. Perfüzyon sistemi ile çalışıyorsanız, DI suyu enzimatik temizleyici (7.8 mL 1 L deiyonize [DI] suya seyreltilmiş şekilde) karıştırın, ardından temiz DI suyu kullanın.
         NOT: Her kayıt, yeni bir oturum dosyası altında ayrı bir analiz dosyası olarak kaydedilir. 3RMR ve mitokondriyal sinyal gücü (r3RMR) için sonuçlar ana pencerede çizilmiştir. Ham spektrum da görüntülenebilir. Kalıntı sinyal gücü ve toplam sinyal gücü gibi diğer kalite kontrol metrikleri Spectrum sekmesi altında gösterilecektir.
4. Veri analizi:
   1. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, deneysel dosyayı açmak ve sonuçları görmek için ekranın altındaki İnceleme klasörünü tıklayın.
   2. Alternatif olarak, sonuçları içeren bir metin dosyası açın. İlgilendiğiniz oturum dosyasını seçin. Tüm elde edilen ölçümleri içeren bir analiz dosyası açılacaktır. Her parametre ve sigma değeri kendi sütunu olur. Örneğin, her saniye elde edilen 3RMR değerleri "3RMR" sütununun altında, sigma değeri ise "sigma_3RMR" altında listelenir.
   3. Her sütunun son satırı, o oturum dosyasının her parametresi için nihai değerleri içerir. Bu değeri çizim için kullanın.
   4. Her oturum dosyası/kayıt için adımları tekrarlayın. Grafik, istendiği gibi değerleri elde etti.

Şekil 2: RRS cihaz kurulumu. RRS sistem kurulumunun bir şeması. Prob, lazer uyarılma kaynağı ve spektrometreyi içeren RRS sistemine optik fiber kablo ile bağlanır. Bu kurulum, veri toplama ve analiz için spektrometre kontrol uygulamasını içeren herhangi bir dizüstü bilgisayara bağlanır. Hem bilgisayar hem de spektrometre ünitesi bir güç prizine bağlıdır. RRS ölçümleri karanlıkta yapılmalıdır. Oda tamamen ışıktan korunamazsa, RRS sistemi ortasında dikdörtgen bir açıklık bulunan siyah bir kapakla gelir; lazer probu burada konumlandırılabilir. Kutu, RRS ölçümlerinin alındığı organ örneğini/bölümünü kaplar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Düşük kalite ve optimal kalite izlerinin örnek izleri ve kalite kontrol metrikleri. Kalıntı sinyal (gürültü) turuncu bir braketle, mitokondriyal sinyal ise yeşil bir braketle işaretlenir. (A) Optimal olmayan bir Raman sinyalinden örnek iz. Kalıntı sinyal, mitokondriyal sinyalden ayırt edilemeyecek kadar büyüktür. Spektral zirveler ölçülen sinyal boyunca ayırt edilemez. (B) Optimal Raman sinyalinden örnek iz. Mitokondriyal sinyal gözle görülür şekilde daha büyüktür ve kalıntı sinyalinden farklıdır. Elde edilen ölçümden elde edilen spektral zirveler ayırt edilebilir. (C) Her sinyalden elde edilen kalite kontrol metrikleri. Genel olarak, suboptimal okumada elde edilen toplam sinyal, optimal okumadan daha azdır. Optimal kayıtta daha fazla mitokondriyal sinyal, suboptimal kayda kıyasla ölçülür; mitokondriyal sinyal toplam sinyalin %17 ve %14'ünü oluşturur. Sinyal, optimal okumada %4,3 hatayla ölçüldü, iken suboptimal okumada %18,5 hataya karşılık. Benzer şekilde, açıklanamayan kalıntı sinyal suboptimal kayıtta toplam sinyalin %11'ini oluştururken, optimal kayıtta %3,6'sını oluşturur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. RRS kullanarak mitokondriyal sağlığın değerlendirilmesi

NOT: Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) teknolojisi, nakil organların yaşamlılığını gösteren mitokondriyal canlılık ölçütü (3RMR) geliştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışma, oksijenlenmedeki ve dolayısıyla hücresel solunumdaki değişikliklerin, laktat ve K⁺ gibi geleneksel hasar biyobelirteçleriyle karşılaştırıldığında 3RMR trendlerinde nasıl yansıtıldığını göstermeyi amaçlamaktadır. Burada bir oksijen stres testi kullanılır; 5 dakika sürekli perfüzyonun ardından, oksijenli perfüzyon akışı 5 dakika duraklatılır, ardından 5 dakika devam eder. Stres testi boyunca RRS ölçümleri ile giriş ve çıkış perfüzyon örnekleri alınır.

1. Karaciğer alımı:
   1. Hayvanları %3–%5 isofluran kullanarak indüksiyon odasında sedat etmektir. Fazla buharı aktif kömürle filtreleyin.
   2. Erkek Lewis farelerine tam hepatektomi yapın (150 g). Portal damarın dallarını bağlayın. IVC üzerinden 50 U sodyum heparin enjekte edin. Ameliyat sırasında portal ven 16 G kateterle kanülasyon yapılır ve karaciğeri 50 ml salin ile yurur.
   3. Temin edilen karaciğerleri, 30 mL Wisconsin Üniversitesi (UW) çözeltisi içeren bir Petri kabına buzun üzerine yerleştirin.
2. Subnormotermik makine perfüzyonu (SNMP) kurulumu ve rezonans Raman ölçümleri:
   1. RRS cihazını daha önce tarif edildiği gibi kurun. Spektrometre kontrol yazılımında Acellular Rat Liver Protokolünü ayarlayın; bu protokol otomatik olarak genişlik modunu uyarlanabilir genişliğe, ortalama uzunluğu 180'e ve hedef sigma'yı 1.5'e ayar. Ayrıca ölçüm parametreleri olarak 3RMR ve Floresans'ı , regresyon kütüphanesi olarak ise sadece Mito'yu seçer. Alma modunu sürekli moda ayarlayın.
   2. SNMP sistemini başka bir yerde tarif edildiği gibi^{kur 18}.
      1. Kısaca, perfüzyon kurulumunun bir perfüzyon odası, bir peristaltik pompa, bir membran oksijenatörü ve bir baloncuk tuzağından oluştuğundan emin olun.
      2. Oksijenin atmosferik karışımla (%95 O₂ ve %5 CO₂) iletedilmesi; PO_2'yi 400–500 mmHg arasında tutun. Bir basınç sensörüyle intrahepatik basıncı izleyin ve 3–5 mmHg arasında tutun. Örnekleri örnekleme portları aracılığıyla toplayın.
   3. Yazılım ve perfüzyon sistemi kurulduktan sonra, PV'yi delen kanülü perfüzyon makinesinin giriş tüpüne bağlayın. Organı, perfüzyonu ve perfüzyon kurulumunu oda sıcaklığında (21 °C) su banyosu olmadan tutun.
   4. Perfüzyo, peristaltik pompa kullanarak PV'deki kanül aracılığıyla organa iletin.
      1. Perfüzyonu hazırlamak için 500 mL fenol kırmızısı içermeyen Williams Medium ile 5 g Bovine Serum Albumin (BSA), 12 mg suda çözünen deksametazon, 5 mL penisillin-streptomisin, 5 mL L-glutamin, 2,5 μL insülin ve 1000 U heparin karıştırın.
      2. Tüm bileşenleri bir karıştırma plakasında yaklaşık 20 dakika veya tüm bileşenler çözünene kadar karıştırın. Perfüzyon akışlarını artırarak 3–5 mmHg basınç elde edin.
   5. Sonra, RRS lazer kaynağını prob tutucusuna yerleştirin ve karaciğerin en büyük lobun 1 cm yukarısında, PV'ye mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Perfüzyon akışını 5 dakika (T₅) durdurun ve 10 dakikada (T₁₀) devam edin. Stres testini 15 dakikada (_{T 15}) yapın.
   6. Tüm stres testi boyunca RRS ölçümleri alın; T_0'dan başlayarak her 5 dakikada bir giriş ve çıkış ölçümleri alın (Şekil 4). T₀,_{T 5}, T₁₀, T₁₅ (n = 3) için 3RMR değerlerini, ayrıca çıkış K⁺ seviyeleri ve laktat seviyelerini çizin (Şekil 5).
   7. Oksijenin giriş/çıkış kısmi basıncını (pO₂) plazmadaki oksijenin çözünürlüğü katsayısı (0.00314) ile çarparak T₀, T 5, T₁₀, T_15'te oksijen tüketim oranını (OCR) hesaplayın. OCR'yi T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ için çizin (Şekil 5).
      NOT: Bir karaciğerden perfüze (T₅), iskemik (T₁₀) ve tekrar perfüze (T₁₅) durumlarda örnek Rezonans Raman spektral izleri gösterilmiştir (Şekil 6)

Şekil 4: Deneysel akışı gösteren diyagram. Dişi Lewis farelerine tam hepatektomi yapıldı. Temin edilen karaciğer, subnormotermik makine perfüzyona konmuş ve ilk 5 dakika boyunca oksijenli perfüzyon ile sağlanmıştır. Perfüzyon portal ven üzerinden karaciğere akar ve peristaltik pompa (perfüzyon akışı mavi oklarla gösterilmiştir) yoluyla dolaşır. Oksijenli perfüzyon sonraki 5 dakika boyunca T5'te duraklatıldı ve T10'da 5 dakika daha başlatıldı. Stres testi boyunca alınan 3RMR ölçümleri (lazer olarak gösterilir). Perfüzyon örnekleri T0, T5, T10 ve T15'te alındı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Taze karaciğerler, oksijen stres testi kullanılarak iskemi ve reperfüzyon dönemlerine maruz bırakıldı. Daha sonra, stres testi boyunca 3RMR'deki gerçek zamanlı değişiklikler, T₀, T 5, T₁₀, T₁₅ perfüzyon analizinden elde edilen oksijen tüketim oranı, çıkış laktat ve potasyumla karşılaştırıldı. Sağlıklı koşullarda, 3RMR değerlerinin %10 ile %30 arasında olması beklenmektedir (Şekil 5A). Beklendiği gibi, T₀ ve T_5'teki 3RMR değerleri bu aralık içindedir, çünkü karaciğer bu zaman aralıkları arasında sürekli oksijenli perfüzyon ile beslenmiştir (Şekil 5A). Ancak, iskemik dönemin sonunda (T₁₀) 3RMR değeri optimal aralığın dışındadır (Şekil 5A). Bu artış, mitokondrilerin indirgenmiş hallerine kaydığını gösterir; elektronlar deoksijenleşme nedeniyle taşıma zinciri boyunca birikir. T_10'da oksijenli akış yeniden başlatılır; Reperfüzyon dönemi başlar. Reperfüzyon döneminin sonunda (T₁₅), 3RMR değerleri optimal seviyelere döner; ETC'nin aktivitesi son elektron alıcı olarak oksijenin yeniden eklenmesiyle yeniden sağlanır. Bu oksijen akışındaki değişiklikler ham spektrumlarda da görülür. T₀ ve T_15'teki ham RRS spektrumları, oksitlenmiş mitokondrilere benzer spektral özelliklere sahiptir (Şekil 6A,C), örneğin 1371 ^cm-1'de spektral işaretleyici zirvesi (Şekil 6D,F). Benzer şekilde, T_10'daki ham Raman spektrumları (Şekil 6B), 1357 ^cm-1'de spektral bir işaretleyici zirvesi gibi azaltılmış RR işaretçileri gösterir (Şekil 6E). Sonuç olarak, RRS mitokondriyal redoks durumlarındaki değişimleri gerçek zamanlı olarak tanımlar; bu hem ham spektral sinyalde hem de mitokondriyal sağlık metriği (3RMR) olarak gösterilir.

RRS ayrıca cIII ve cIV'in redoks durumlarına dayalı olarak 3RMR değerlerini hesaplayabilir. Benzer bir desen cIII ve cIV 3RMR değerlerinde de gözlemlenmiştir (Şekil 5B). T_0'da, cIV için tam oksitlenmiş 3RMR değerleri ve cIII için optimal aralıkta 3RMR değerleri gözlemlendi. Kompleksler arasındaki bu redoks dengesi fizyolojiktir; çünkü elektronlar cIII'ten cIV'e akarak hızla oksitlenir. Iskeminin başlangıcı olduğunda, her kompleks için 3RMR seviyelerinde artış gözlemlendi. İskemik dönemde, ETC üzerinden elektron birikmesi cIII ve cIV üzerindeki indirgentici gerilimi artırır, bu da cIII-3RMR ve cIV-3RMR'yi artırır. Ancak, oksijen yeniden eklendiğinde, her iki kompleksin 3RMR değerleri optimal seviyelere geri döner: tam oksitlenmiş cIV ve fizyolojik olarak indirgenmiş cIII (Şekil 5B). Her iki kompleksteki 3RMR eğilimleri, oksijenin kesilmesinin tüm ETC'yi etkilediğini ve hiçbir bireysel kompleksin akışsız iskemiye karşı özellikle savunmasız olmadığını göstermektedir.

Öte yandan, oksijenasyon dinamiklerindeki değişiklikler perfüzyon analizinden elde edilen hasar biyobelirteçleri ve kan gazı analitlerinde yansıtılmadı. Başlangıçta iskemi ile laktat ve K⁺ seviyelerinin yükselmesi beklenmektedir; çünkü hücre aerobik solunuma dayanmaya başlar ve yavaşça parçalanarak hücrelerarası K⁺ salgılar. Ayrıca hücrelerin hücresel solunumu sürdürmek için yeterli enerji üretmemesi nedeniyle OCR'nin azalmasını bekliyoruz. Akışsız bir iskemi döneminden sonra bile, oksijen tüketiminde hasar belirtisi yoktu. Çıkış laktatı ve K⁺ seviyeleri, oksijenasyondaki değişikliklere rağmen stres testi boyunca nispeten tutarlı kalır (Şekil 5D–E).

Şekil 5: Oksijen stres testi boyunca 3RMR'deki değişiklikler ve hasar biyobelirteçleri. Iskeminin başlangıcı ve reperfüzyon dönemleri sırasıyla 5. ve 10. dakikalarda noktalı çizgilerle gösterilir. Ayrıca, oksijenli akış dönemleri mavi çizgilerle, iskemi dönemleri ise kırmızı çizgilerle gösterilir. (A) Mitokondriyal test boyunca 3RMR değerleri. 3RMR değerleri, oksijenli akış duraklatıldığında artar ve akış yeniden başlatıldığında tekrar optimal seviyelere geri düşer. (B) Kompleks III ve kompleks IV'ün 3RMR değerleri. Akışın durması, her iki kompleksin de azalmasına yol açar. (C) Stres testi boyunca ortalama çıkış K⁺ değerleri. K⁺ değerleri, oksijenasyon dinamiklerindeki değişikliklere rağmen stres testi boyunca tutarlı kalır. (D) Stres testi boyunca ortalama çıkış laktat seviyeleri. Laktat çıkışı stres testi boyunca tutarlı kalır. (E) T₀, T₁₀, T₁₅ oksijen tüketim oranları. pO₂ değerleri akış tabanlı ölçümler olduğundan, OUR akışsız bir iskemi dönemi için hesaplanamaz. Anlamlı bir değişiklik gözlemlenmedi (p-değeri: 0.2500) (n = 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Stres testi boyunca taze bir fare karaciğerinin örnek ham spektral izleri. (A) oksitlenmiş, (B) iskemik ve (C) tekrar perfüze edilmiş durumlarda karaciğerin tam spektral profilleri. Oksijenli RR işaretçisinden indirgenmiş RR işaretleyicisine kayma, mitokondrinin spektral zirvesine yakınlaştırıldığında görünür ve her spektral profilde kırmızı bir kutu ile işaretlenmiştir. (D–F) Oksitlenmiş RR işaret zirveleri (1371 ^cm-1) (D) oksitlenmiş ve (F) yeniden perfüze edilmiş hallerde bulunur ve kırmızı noktalı çizgiyle işaretlenir. Azaltılmış RR işaret zirvesi (1357 ^cm-1) (E) iskemik durumda bulunur ve mavi kesik çizgiyle işaretlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: İngencele ve oksitlenmiş kompleks III, kompleks IV, hemoglobin ve miyoglobinin spektral izleri. (A) Complex III, (B) kompleks IV, (C) hemoglobin ve (D) miyoglobin. Regresyon analizi, toplanan spektrumları bu spektral kütüphanelerle (seçilirse) karşılaştırır ve her kütüphane spektrumu için kaydedilen spektrumdaki göreceli katkısının ve dolayısıyla dokudaki göreli konsantrasyonunun en iyi uyum tahminini temsil eden bir faktör elde eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Örtüşen heme içeren molekülleri (hemoglobin ve oksitlenmiş/indirgenmiş mitokondriler) parçalamak için regresyon kütüphanelerinin kullanılmasına örnek. (A) Hücresel perfüzyolla perfuze edilmiş karaciğer dokusundan ham spektral izler, hemoglobin, oksitlenmiş hemoglobin, indirgenmiş mitokondri ve oksitlenmiş mitokondri gibi tüm gerekli regresyon kütüphaneleriyle birlikte seçildi. Kütüphanelerden ve regresyon analizinden türetilen en iyi uyum çizgisinin, ölçülen sinyalle düzgünce örtüştüğü ve açıklanamayan bir köküntü olmadığı açıktır. (B) Aynı dokudan ham spektral iz, ancak yalnızca oksitlenmiş ve indirgenmiş mitokondri kütüphaneleri seçilmiş. Büyük, açıklanamayan bir kalıntı yapısı olduğundan, mitokondriyal spektral zirvenin regresyon analizine dahil edilmemiş hemoglobin zirvesinden birkaç dalga numarası kaydığı açıktır. Bu şekil, yüksek çözünürlüklü spektrometre ve tüm spektruma karşı regresyon analizinin yakın ilişkili spektrumları ayırt edebildiğini göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Ekran görüntüsü yazılımı gösteriyor. (A) Zaman boyunca ölçüm değerlerini gösteren ana pencere. 3RMR, StO2 ve diğer seçilmiş seriler ölçüm sırasında burada gösterilecektir. Ayrıca, her serinin sinyal gücü grafikte kesik çizgi olarak gösterilecek ve ekranın sağ tarafında altında bir değer gösterilecektir. Örneğin, burada yakalanan katı çizgi bir dokunun 3RMR'sini, kesikli çizgi ise r3RMR'yi (3RMR'nin sinyal gücü) temsil eder. Kaydedilen spektrumların kalitesini görmek isteyen biri mor ile dairelendirilmiş Spektrum göster sekmesine tıklayabilirdi. (B) Dokunun ham spektrumlarını gösteren ekran. Bu, ölçülen spektrumların gücü ile kalan gürültü arasında sinyalin kalitesini değerlendirebildiği sekmedir. (C) Deney boyunca seri eğilimleri gösteren sekme. Örneğin, bir deney boyunca birden fazla 3RMR ölçümü alınırsa, her ölçüm bu sekmede zaman boyunca gösterilecektir. Diğer serilerdeki trendler de seçilirse burada gösterilecektir. Bu sekme, ana ekrandaki Trendler butonuna tıklayarak erişilebiliyordu ( A üzerinde yeşil ile daire çizilmiş). (D) Bilgi sekmesi, oturum adı ve açıklama gibi deneysel bilgilerin girilebileceği bir bölüm. (E) Sistem sekmesi, burada önceden yüklenmiş protokoller yüklenebilir. Örneğin, LiverContAcell protokolü seçildiğinde, bu protokol regresyon kütüphanesini, hedef regresyon penceresini ve sigma'yı fare karaciğerleri için hücresiz perfüzyon protokolüne göre ayarlar. Bir protokolü içe aktarmak için, Dosyadan Ayarları İçe Aktar seçeneğine tıklayıp ilgilendiğiniz protokolü aktarabilirsiniz. Kendi protokolünü oluşturmak isterseniz, (F) Regresyon Kütüphanesi açılır menüsünden gerekli kütüphaneleri seçebilir, hedef sigma ve regresyon penceresini, ayrıca alarmları ayarlayabilir ve sol alt köşedeki Kaydet (disk ile gösterilmiş) tuşuna tıklayabilir. (F) Ana pencerede hangi serinin gösterileceğini seçebileceğiniz konu sekmesi . Bir spektrumu yeniden analiz etmek ve önceki ölçümlerine daha fazla seri eklemek istemek, Recal bölümü altından ilgi duyduğunuz seriyi seçebilirler. Yeniden kalibrasyon sırasında (Recal), yazılım ölçülen ham spektrumları yeniden analiz eder ve yeni seçilen serilerin sonuçlarını gösterir. Ayrıca bu sekmeden seçilmiş serilerin sinyal gücünü göstermeyi seçebilirsiniz. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Her kalite kontrol metriğinin açıklamaları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, mitokondriyal sağlığın ölçülmesinde taşınabilir Rezonans Raman Spektroskopisi sistemi kullanılarak, kompakt bir probda bir lazerden oluşan ve fiber optik kablo ile lazer pompasına bağlanan bir yöntemi ortaya koymaktadır. Bu yöntem, oksidasyon durumlarına bağlı olarak benzersiz spektral sinyaller üreten mitokondrileri uyarmak için 441 nm lazer kullandı. Böylece, RRS, mitokondrinin her durumunu spektral imzaları üzerinden nicelikle ölçebilir ve yayılan spektrumları önceden ölçülmüş spektral kütüphanelerle regresyon analiziyle karşılaştırabilir. Daha sonra, azaltılmış ve toplam mitokondri oranına dayalı bir mitokondriyal sağlık ölçütü oluşturuldu: Azaltılmış Rezonans Raman Mitokondriyal Oranı (3RMR).

Bu makale, örnek işleme gerekmeden doğal doku ile oksijenlenmenin bir fonksiyonu olarak 3RMR'deki gerçek zamanlı değişiklikleri göstermeye odaklanmaktadır. Bu, oksijen stres testiyle sağlandı: 5 dakika sürekli oksijenli perfüzyon sonrası, perfüzyon akışı 5 dakika duraklatılır ve 5 dakika daha yeniden başlatılır. Stres testi boyunca 3RMR ölçümleri alınır. İskemik ve oksijenli dönemler arasında geçiş yaptığımız bir stres testi modeli, mitokondriyal redoks durumlarındaki sürekli değişiklikleri ve dolayısıyla mitokondriyal fonksiyonu takip etmemize olanak tanır. Başka bir deyişle, oksijen stres testi, 3RMR'deki eğilimleri oksijenlenmenin bir fonksiyonu olarak takip etmemize olanak tanır. Grubumuz, 3RMR değerlerinin artmasını iskemik koşullara bağladı; bu da perfüzyon akışını bozdu ve ETC'den geçen elektronların birikmesine neden oldu; çünkü O₂ nihai elektron alıcısı olarak mevcut değil. Bu elektron birikimi azalmış bir duruma yol açar ve bu da 3RMR değerlerinde artışa dönüşür. Ancak, O₂ yeniden eklendiğinde, sağlıklı mitokondrilerin ETC aktivitesine yeniden başlaması ve fizyolojik redoks durumlarına dönmesi beklenmektedir; çünkü yapısal ve fonksiyonel unsurları sağlam kalır.

Beklendiği gibi, bu makalede, iskemik dönem boyunca gerçek zamanlı ve sürekli 3RMR artışı gözlemlenmiştir (Şekil 5A). Benzer şekilde, 3RMR reperfüzyon dönemi boyunca kademeli olarak optimal seviyelere döner (Şekil 5A). Mitokondriyal redoks durumlarındaki bu gerçek zamanlı değişim, mitokondriyal zirve iskemik dönem boyunca oksitlenmiş (1371 ^cm-1) hallerden indirgenmiş (1357 ^cm-1) hale geçer ve reperfüzyonun sonunda tekrar oksitlenmeye döner (Şekil 6). İskemik dönemde diğer azaltılmış RR işaretleyici zirveleri de ortaya çıkar. Geleneksel mitokondriyal sağlık testlerinin aksine, Resonance Raman kompleks III ve kompleks IV'ün redoks durumlarını nicelikle ölçebilecek kadar hassastır; bu durum, iskemi-reperfüzyon yaralanmalarının ETC üzerindeki spesifik etkisine mekanik bir bakış açısı sağlamış ve sağlamıştır. Sağlıklı mitokondrilerde, elektronlar ETC'deki çeşitli komplekslerden geçer; kompleks I'den başlayıp Son elektron_alıcısı olan O 2'ye ulaşana kadar. Oksijen akışındaki bir duraklama, elektronların ETC boyunca birikmesiyle her kompleksi indirgenmiş bir duruma kaydırabilir. Beklendiği gibi, iskeminin başlangıcında cIII ve cIV 3RMR değerlerinde gerçek zamanlı artış gözlemlendi. Bu, O₂ eksikliğinin belirli bir kompleksi değil, tüm ETC'yi etkilediğini gösterir (Şekil 5B). Aşağıda tartışacağımız gibi, RRS'nin hassasiyeti ayrıntılı mekanik çalışmaları kolaylaştırır ve IRI için hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesini sağlar.

Geleneksel olarak, oksijen yokluğunda ATP üretmek için anaerobik metabolizmaya dayandıkları için, iskemik organlarda da yüksek laktat seviyeleri gözlemlenmemizi bekleriz. Benzer şekilde, hasarlı organlarda K⁺ seviyelerinde artış bekleniyordu, çünkü hücrelerin zar bütünlüğü bozuldu ve hücreler arası K⁺ akışına yol açtı. Son olarak, ağır hasar görmüş hücrelerin metabolizması daha düşük olabilir, çünkü metabolik yolları iskemi kaynaklı metabolik atık ve ROS'dan etkilenir ve bu da oksijen tüketiminin azalmasına yol açar. Ancak, iskemik dönem sırasında veya sonrasında laktat, K⁺ veya oksijen tüketiminde herhangi bir değişiklik gözlemlenmez. Aslında, değerler oksijen akışının durduğunu göstermez ve stres testi boyunca nispeten tutarlı kalırlar (Şekil 5B–D). Özünde, oksijen stres testi kullanılarak yapılan bu çalışma, 3RMR değerlerinin iskemi-reperfüzyon sırasında mitokondriyal redoks durumlarındaki değişimleri geleneksel hasar biyobelirteçlerine göre daha hızlı, gerçek zamanlı ve daha hassas yansıttığını göstermektedir (Şekil 5). Bu çalışmanın 3RMR dinamiklerini, laktat ve OCR gibi mitokondriyal sağlık dolaylı göstergeleriyle karşılaştırdığını kabul ediyoruz; NAD+/NADH ve ATP gibi daha doğrudan aşağıdan karşılaştırıcılar yerine. Bu çalışma 3RMR'deki değişiklikleri ATP/NADH konsantrasyonlarıyla açıkça ilişkilendirmese de, önceki^{çalışma 9,14}, 3RMR'nin bu aşağı akış biyobelirteçlerindeki değişiklikleri öngörebileceğini göstermiştir. Örneğin, Nguyen ve ^ark.9, düşük 3RMR değerlerine (%<10) sahip 3 saat sıcak-iskemik (WI) karaciğerlerin, 1 saat WI karaciğerlerine (3RMR değerleri ~15%) göre anlamlı derecede daha düşük ATP konsantrasyonlarına ve NAD/NADH oranlarına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Jain ve ^ark.14, 3RMR'de anlamlı fark olmayan gruplarda NAD+/NADH oranı veya EC açısından anlamlı bir fark görmemiştir. Ayrıca, hücresel perfüzyon sonrası 24 saat soğuk-iskemik (CI) karaciğerlerde NAD+/NADH oranları ve EC'nin, hücresel perfüzyon ile karşılaştırıldığında anlamlı farklı olduğunu gözlemlediler; bu karaciğer de istatistiksel olarak anlamlı olarak anlamlı 3RMR değerleri gösterdi. Bir arada, bu sonuçlar mitokondriyal ve ETC fonksiyonunun daha doğrudan ölçümlerindeki değişiklikleri yansıtan 3RMR değerlerini gösteriyor.

Bu makale sistemin performansını göstermek için 15 dakikalık perfüzyon boyunca RRS kullansa da, diğer yayımlanmış çalışmalar RRS'nin uzunlamasına çalışmalarda faydasını göstermiştir. Daha spesifik olarak, önceki bir çalışmamızda, RRS'nin mitokondriyal sağlık ve fonksiyon hakkında geleneksel yöntemlerden önemli ölçüde farklı olan daha uzun organ perfüzyonları boyunca geleneksel biyobelirteçleri tamamladığını göstermiştik. Örneğin, çalışma, subnormotermik^{perfüzyon 10} boyunca nakledilebilir (24 saat SCS) ve nakil edilmeyen (72 saat SCS) soğuk iskemik fare karaciğerlerinin canlılığını değerlendirmek için RRS kullandı. Her iki grupta da oksijenasyona ilk yanıt benzer olsa da, nakil edilmeyen karaciğerlerin 3RMR'si perfüzyon ile artmışken, nakil edilebilir karaciğerin 3RMR'si SNMP ile tutarlı kaldı. Benzer şekilde, 72 saat CI karaciğerlerde potasyum seviyeleri ve genel kilo alımı, SNMP boyunca 24 saat CI karaciğerlere kıyasla daha yüksekti. Çalışma, RRS'nin uzun perfüzyonlar boyunca geleneksel biyobelirteçleri tamamlamadaki faydasını gösterdi. Başka bir çalışmada, soğuk-iskemik (CI) sıçan karaciğerlerinin reoksijenlenme dinamiklerini ve metabolik iyileşmesini anlamak için RRS^{kullandık 14}. Minimal iskemik (15 dakika soğuk iskemi) ve 24 saat soğuk iskemik karaciğerleri ya alüler ya da RBC dolu perfüzyon (pRBC) ile perfüze ettik. 24 saat CI karaciğerleri hücresiz perfüzyolla perfüze edildiğinde, pRBC ile perüze edildiğinde 3RMR'de gizli bir azalma gözlemledik. Çalışma, 3RMR'deki bu gecikmeli artışı, soğuk iskemi sırasında mitokondriyal sitokromlarda elektron birikmesine bağladı; bu elektronlar, pRBC bazlı perfüzyon durumunda bol oksijen moleküllerine hızla aktarılabilir. Ancak, hasarın diğer belirteçleriyle birleştiğinde, pRBC ile perüze edilen 24 saat CI karaciğerlerinde daha fazla karaciğer hasarı gözlemledik. Çalışma, RRS ile mitokondriyal oksijenasyonun gerçek zamanlı olarak ölçülmesinin mitokondriyal iyileşme konusunda içgörü sağlayabileceği ve bunun uzun perfüzyon stratejilerinin optimize edilmesi için faydalı olabileceği sonucuna vardı. Özünde, bulgular geleneksel biyobelirteçlerin (örneğin laktat, OCR, ATP) mitokondriyal redoks durumları ve oksijenasyon dinamiklerine dair RRS odaklı içgörülerle birleştirilmesin, mitokondriyal iyileşmenin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağladığını göstermektedir.

Diğer çalışmalar, RRS'yi ETC^9'un iskemi-reperfüzyon hasarını hafifletmeye yardımcı olabilecek terapötikler için test platformu olarak kullanmıştır. Uzun süreli iskemi dönemlerinde, elektronlar ETC içinde birikir ve elektronların özellikle reperfüzyon sırasında çeşitli komplekslerden kaçma kapasitesi sağlanır. Bireysel komplekslerin redoks durumunu iskemi-reperfüzyonun bir fonksiyonu olarak anlamak, yaralanmanın konumunu daha derin bir şekilde anlama ve daha hedefli müdahaleler için potansiyel sunabilir. Örneğin, grubumuz sıcak iskemik domuz karaciğerlerinde kompleks-III disfonksiyonu için terapötik müdahaleler geliştirmek için RRS'yi kullanmıştır. Nguyen ve ark. (2026)⁹ tarafından yapılan bir çalışmada, 1 saat ve 3 saat WI karaciğerleri SNMP'ye 3 saat süreyle yerleştirildi. Daha önce belirtildiği gibi, üç saatlik WI karaciğerlerinin ETC'ye zarar verdiği bilinir; bu da aşırı oksidasyona ve metabolizmanın azalmasına neden olur. Taze ve 1 saat WI karaciğerler için 3RMR değerleri perfüzyon boyunca optimal aralıkta olsa da, 3 saat WI karaciğerlerinin 3RMR değerlerinin sürekli düştüğünü gözlemledik ve 3 saat içinde optimal aralığın (%10) altına ulaştı. Ayrıca, her iki grup arasında cIV'in 3RMR değerlerinde herhangi bir fark gözlemlemedik; her iki grupta cIV tamamen oksitlenmişti. cIII'ün hiperoksitlenmesi ve cIV'de gözlemlenen sağlıklı bir redoks durumu birleşince, kompleks III'te reperfüzyon kaynaklı aşırı oksidasyonu gösterir. Bu bilgiyle donanmış olarak, Nyugen ve ark. (2026)⁹, cIII'ün işlev bozukluğunu aşabilecek bir terapötik seçebildiler: metilen mavisi (MB), cI ile sitokrom c arasında elektron mekiği olarak görev yapar, cIII'ü atlayıp elektronları doğrudan cIV'e aktarır. 3RMR sonuçları, MB'nin mitokondri üzerindeki terapötik etkisini yansıttı; 3 günlük WI karaciğerlerinin SNMP'si sırasında 3RMR değerleri artarak elektronların doğrudan cIV'ye taşındığını ve karaciğer metabolizmasının yeniden başladığını yansıttı. MB'nin hafifletici etkisi ayrıca çıkış laktatının azaltılması ve oksijen tüketim oranlarının iyileştirilmesiyle doğrulandı. Özünde, RRS'nin özgüllüğü, sıcak iskemi sonrası mitokondriyal ihtiyaçlara uyarlanmış bir terapötik yolun geliştirilmesini mümkün kıldı.

Bu makale boyunca, Rezonans Raman Spektroskopisi'ni mitokondriyal sağlığı ölçmek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı ve son derece spesifik bir yöntem olarak sunuyoruz. Çalışma, RRS'nin redoks durumlarındaki ince değişimleri, bu tür fizyolojik değişikliklerin sonraki etkileri olmadan dokuyu rahatsız etmeden nasıl ölçebileceğini gösteriyor. Ancak, Rezonans Raman sisteminin birkaç sınırlamasına dikkat etmek önemlidir. İlk olarak, RRS, bir dokuda rezonans olarak güçlendirilmiş tüm moleküllerin regresyonda tanımlanıp hesaba alınmasını gerektirir; her molekülün göreceli sinyal güçlerini hesaba katmak için farklı güçlendirme faktörleri vardır. Belirli bir dalga boyu ve dokuda tüm bu bileşenler için spektral kütüphaneler oluşturmuş olsak da, kullanıcının ilgilendiği her doku ve dalga boyu için yeni kütüphaneler oluşturup doğrulaması gerekebilir. Ayrıca, bazı dokularda karmaşık spektral elemanlar bulunabilir ve bu da daha düşük konsantrasyonlarda bulunan mitokondriyal sitokromların ölçülmesini zorlaştırabilir. Örneğin, domuz veya insan karaciğerleri beta-karoten içerirken, kan hemoglobin içerir; her ikisi de güçlü spektral sinyallere sahiptir ve bu sinyaller RRS'nin regresyonda hesaba katması gereken spektral imza sayısına katkıda bulunur. Son olarak, bu ölçümler için kullanılan 441 nm lazerin ışın çapı 2 mm, nüfuz derinliği ise 1 mm'den azdır. Bu tür lokalize yüzey ölçümleri, organın diğer bölgelerindeki redoks durumundaki farklar göz ardı edilebildiği için örnekleme hatasını teşvik edebilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, organın çekirdeğinden alınan biyopsilerden ölçümler alınabilir veya çoklu lazer kurulumu, daha geniş bir yüzey alanında ölçümler yapılarak tüm organ sağlığının daha kapsamlı anlaşılmasını sağlayabilir.

Sonuç olarak, Rezonans Raman Spektroskopisi'nin kan gazı analitlerine kıyasla mitokondriyal dinamiklerdeki ince değişikliklere karşı hassas olduğunu gösteriyoruz. Sistemin kurulumu ve işletilmesi hakkında ayrıntılı bir açıklama burada sunulmaktadır. RRS'nin invaziv olmayan, son derece spesifik ve gerçek zamanlı değerlendirme niteliğini vurguluyor ve bunun tanısal ve mekanik bir yaklaşım olarak nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Ayrıca mitokondriyal işlev bozukluğu için özel terapötik yolların geliştirilmesinde kullanıldığını vurguluyoruz. Gelecekteki çalışmalar, RRS sisteminin mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için biyopsilerden, hassas kesimli doku dilimlerinden veya translasyon araştırmaları için insan dokusu dahil olmak üzere diğer doku kaynaklı ürünlerden değerlendirmeye odaklanabilir. RRS'nin benimsenmesi, metabolik araştırmalarda güçlü bir yaklaşım sunar ve geleneksel yöntemlere göre hücresel biyoenerjetik süreçleri daha kolay anlamamızı sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Portal ven kanülasyonu için kullanılır
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Anastezi sırasında fazla buhar filtrelemek için kullanılır
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Perfüzyon bileşimi
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfüzyon bileşimi
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Perfüzyon bileşimi
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Karaciğer boyunca perfüzat akışını sağlamak için kullanılır
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Karaciğer boyunca perfüzat akışını sağlamak için kullanılır
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Perfüzyonu oksijenlendirmek için kullanılır.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Perfüzyon bileşimi
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Kan gazı analizi için
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Bu ürünle ilgili sorular için Pendar Technologies ile iletişime geçin