Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Summary

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Abstract

Çekirdek, ökaryot organizmaların karakteristik organelidir. Klasik ders kitabı görüşünün aksine, nükleer şekil canlı hücrelerde dinamiktir. Değişmiş veya deforme edilmiş nükleer şekil, hayvan hücrelerinde kanserin ve bitkilerde çevresel stresin ayırt edici bir özelliğidir. Nükleer zarf proteinleri, gen ifadesini düzenlemek için kromatin ile etkileşime girer. Ne yazık ki, abiotik stresin nükleer şekil, hareket ve kromatin dinamikleri üzerindeki etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu sorunu çözmek için, kontrol altında ve abiotik stres koşullarında Arabidopsis köklerinde nükleer ve kromatin dinamiklerini nicelendirmek için konfokal mikroskopi ve parçacık takip yazılımı kullanan bir boru hattı geliştirdik. Bu konfokal görüntüleme yöntemi, model bitki Arabidopsis thaliana'nın kökünün kontrollü ve tuz stresli koşullarda canlı hücre görüntülemesi yapmak için çift floresan etiketli işaretleyici çizgisi – nükleer zarf proteini ve kromatin – kullanır. Bu yakalanan filmler, TrackMate eklentisinin yardımıyla açık kaynak görüntü işleme yazılımı Fiji/ImageJ kullanılarak nükleer ve kromatin dinamiklerinin nicelendirilmesi için analiz edilir. Bu yöntemi doğrulamak için, kontrol ve tuz stresli köklerde kromatin hareketini görüntüledik ve nicelikledik; tuz stresli koşullarda kromatin hızında azalma olduğunu ortaya koyduk. Bu yöntem, bitki gelişimi ve çevresel stres sırasında kök nükleer şekli ve kromatin dinamiklerinin canlı hücre görüntülemesine olanak tanır; böylece abiotik stresörlerin neden olduğu nükleer ve kromatin dinamiklerindeki değişikliklerin analizini mümkün kılar.

Introduction

Nükleer şekil, farklı hücre tipleri arasında ve Arabidopsis thaliana ^{kökleri 1,2'de} gelişim sırasında değişkendir. Örneğin, nükleer şekil, aktif olarak bölünen meristematik bölgelerde küresel şekillidir. Meristematik bölgenin aksine, kök geçiş ve uzalma bölgesindeki çekirdekler daha az küresel konumdadır. Ayrıca, kök tüyleri gibi farklılaşmış hücrelerdeki çekirdekler, sıkı kök tüy tabanından geçer ve aktif olarak uzun^{çekirdeklere 3,4,5} dönüşür. Nükleer şekil ve hareketlerdeki dinamik değişiklikler,^{hücrenin işleyişi için kritik öneme sahiptir 6,7}. Nükleer şekildeki kusurlar, nükleer hareketin azalması gibi işlevsel bozulmalara^{yol açar 1,3}. Memeli hücrelerinde, hücre ve çekirdek şeklindeki değişiklikler doğrudan gen ifadesi ve protein sentezindeki^{değişikliklerle ilişkilidir 8}.

Ara faz sırasında, bir hücrenin DNA'sı kromatin olarak organize edilir. Kromatindeki DNA, histonların etrafında paketlenmiştir; bu histonlar DNA'yı sıkılaştırıp gevşetirek ifadeyi değiştirebilir. Benzer şekilde, kromatinin nükleer zarfına göre konumlanması ve nükleer çevreye yakınlığı da gen^{ifadesi 9} için önemlidir. Osmotik stres gibi çevresel stres, çekirdek şeklini değiştirir ve dolayısıyla A. thaliana ^{köklerinde dokunmaya duyarlı genlerin ifadesini değiştirir 10}. Bu bağlamda, nükleer şekil ve kromatin dinamiklerinin canlı hücre zaman geçişli görüntüleme yoluyla incelenmesi önemlidir. Nükleer dinamikin önemli bir yönü, çekirdeklerin hareket hızıdır; çünkü hücre içindeki nükleer konumlandırma gen ifadesini yönlendirir ve nükleer yeniden konumlandırma için nükleer hareket¹¹ gereklidir. Çekirdek içindeki kromatin hareket hızı da benzer şekilde önemlidir; çünkü çekirdek içindeki genlerin konumlanması, gen^{ifadesi 12'nin} belirlenmesinde kritik öneme sahiptir.

Daha önce, nükleer şekil ve kromatin dinamikleri ayrı ayrı görüntülenip nicelendiriliyordu; Sonuç olarak, nükleer şekil ile kromatin dinamikleri arasındaki ilişki keşfedilmemiş kaldı. Çekirdekler ve kromatin aynı anda görüntülenerek, birbirlerine göre konumları gözlemlenebilir; bu da nükleer dönüş ve nükleer içi kromatin hareketi gibi aksi takdirde gösterilmesi zor veya imkansız hareketleri ortaya çıkarabilir. Bu yöntemde, floresan etiketlenmiş dış nükleer zarf proteini WPP alan-etkileşimli protein 1 (WIP1)¹³ ve kromatin ile centromerik histon H3 (CENH3)¹⁴ dinamiği aracılığıyla kontrol ve tuz stres koşullarında aynı anda nükleer şekli görselleştirmek ve nicelleştirmek için canlı hücre görüntüleme tekniği sunuyoruz; amacı, abiotik stresörlerin neden olduğu nükleer ve kromatin dinamiklerindeki değişikliklerin analizini mümkün kılmaktır. Bu yöntemi mümkün kılmak için A. thaliana'nın WIP1-GFP/CENH3-mRFP hattı oluşturduk. Ayrıca, açık kaynak ImageJ/Fiji yazılımının TrackMate eklentisini kullanarak kromatin dinamiklerini nicel olarak inceledik. Burada sunulan çift floresan çizgi ve kromatin dinamiği tekniklerini tuz stres koşullarında test ettik ve stres koşulları nedeniyle centromerik odak morfolojisi ve dinamiklerinde bir değişiklik keşfettik. Bu basit ve tekrarlanabilir yöntem, çeşitli abiotik stres koşulları altında Arabidopsis köklerinde nükleer ve kromatin dinamiklerinin yüksek verimlilikte izlenmesi için idealdir.

Protocol

1. A. thaliana fidelerinin yetiştirilmesi

1. Büyüme ortamı hazırlığı
   1. 800 mL saf suyu 1 litrelik bir kaba karıştırma tabağı üzerine yerleştirin. Kaba bir karıştırma çubuğu ekleyin.
   2. Karıştırma plakasını 600 rpm'de açın.
   3. Kaba 10 g sakaroz ekleyin.
   4. Kaba 2,16 g Murashige ve Skoog (MS) büyüme ortamı ekleyin.
   5. İki 1 L medya şişesine 5 mg agar ekleyin.
   6. Bir şişesini "1/2 MS" etiketi, diğerini ise "100 mM NaCl" etiketle.
   7. Her iki şişe kapağını da otoklav bantla etiketleyin.
   8. "100 mM NaCl" etiketli şişeye 5,84 g NaCl ekleyin.
   9. Kabı 1 litre saf suyla doldurun.
   10. Kabı karıştırma tabağına geri koyup sukroz ile MS eriyene kadar bekle.
   11. Kab içeriğini 1 L dereceli bir silindire dök.
   12. Her şişeye 500 mL derecelendirilmiş silindir içeriği dök.
   13. Otoklav büyüme ortamı ve 250 mL saf su, 121 °C'de 60 dakikalık sıvı döngüsü.
       NOT: Medya ve suyu otoklavlarken, olası patlamaları önlemek için kapakların gevşek olduğundan emin olun.
   14. Büyüme ortamı kapaklarını yeniden vidalayın.
   15. Büyüme ortamı şişelerini 7 kez ters çevirerek agarın tam olarak dağıtıldığından emin olun.
   16. Büyüme ortamını 4 °C soğudolabında ihtiyaç duyulana kadar saklayın ve sıvılaştırmak için mikrodalgada pişirin.
2. Büyüme plakaları ve tohumların sabitlenmesi
   1. Bir akış başlığında, her on plakaya 50 mL büyüme ortamı pipetlemek için pipet tabancası kullanın (Şekil 1A).
   2. Medya katılaşırken, WIP1-GFP x CENH3-mRFP tohumlarını 1 mL %70 etanol içeren bir mikrosantrifüj tüpünde 10 dakika boyunca su basarak temizleyin (Şekil 1B).
      NOT: Etanolü tutarken, çevrede açık alev olmadığından emin olun.
   3. 10 dakika sonra, akış başlığında etanolü çıkarın ve tohumları 1 mL otoklavlı suyla iki kez durulayın (Şekil 1C).
   4. Medya berbat olduktan sonra, temizlenmiş tohumları iki sıra halinde her plakada 14 tohum olan büyüme plakalarına yerleştirmek için 1000 μL pipet kullanın (Şekil 1D).
   5. Plakaları kalıcı bir işaretleyiciyle etiketleyin ve akış başlıktan çıkmadan önce mikrogözenek bantla kapatın (Şekil 1E).
3. Çimlenme fideleri
   1. Büyüme plakalarını alüminyum folyoya sarıp 4 °C bir buzdolabında en az 2 gün boyunca soğuk tabakaya yerleştirin (Şekil 1F).
   2. Soğuk tabakalaşmadan sonra, buzdolabından plakaları çıkarın ve en az 4 gün boyunca büyüme ışıkları altında (~80 μmol/^{m 2}/s) dikey olarak bırakın (Şekil 1G).
   3. Plakaların yarısını akış başlıktaki 100 mM NaCl büyüme ortamına aktarın, ardından plakaları mühürleyip etiketleyin (Şekil 1H).
   4. Görüntülemeden önce 2 gün boyunca yetiştirme ışıkları altında plakalar yetiştirin (Şekil 1I).

2. A. thaliana kök çekirdekleri ve kromatinin canlı hücre görüntülemesi

1. Kaydırma hazırlığı
   1. 60 μL saf suyu cam bir slayta pipet yapın (Şekil 2A).
   2. Suya 3 adet 6 günlük A. thaliana fidanı kökü bırakın (Şekil 2B).
   3. Yaprakları kaplamadan köklerin üzerine 22 mm × 22 mm #1.5 sürgülü örtü yerleştirin (Şekil 2C).
2. Konfokal mikroskop ayarları
   1. Lazer pozlama süresini 1000 ms (1 s) olarak ayarlayın.
   2. Lazer kombinerde, 488 nm lazeri yeşil floresan protein (GFP) için %50, kırmızı floresan protein (RFP) için ise %50 olarak 561 nm ayarlayın (Şekil 2D). Optik zoom olmadan 20× objektif lensle görüntü. 10 dakikadan uzun kaydediyorsanız, fotobeyazmayı azaltmak için yoğunluğu azaltın.
   3. Z-dilim adım boyutunu 0.3 μm olarak ayarlayın.
   4. Aralığı 1 dakikaya, toplam süreyi ise 10 dakikaya ayarlayın.
3. Görüntüleme
   1. Kökleri bulun ve 20'ye kadar z-dilim seçerek 16-bit görüntüler elde edin.
   2. Timelapse'ı başlat.
   3. Timelapse'ı kayıpsız sıkıştırma ile TIFF dosyası olarak kaydet.
   4. Verileri analiz için bilgisayara aktarın.

3. Verilerin takibi ve analizi

NOT: TrackMate'in önceden yüklü olduğu açık kaynak yazılım ImageJ'nin (v. 1.54 önerilen) Fiji versiyonuna ihtiyaç duyulacak.

1. Başlatma
   1. Aç GörselJ/Fiji.
   2. .vsi dosyasını ana ImageJ/Fiji uygulama penceresine tıklayıp sürükle (Şekil 3A).
   3. Bio-Formatlar İç Aktarma Seçenekleri başlıklı bir uyarı görünecektir; sağ alt alttaki Ok'a tıklayın (Şekil 3B).
   4. Bio-Formatlar Serisi Seçenekleri başlıklı bir prompt görünecektir. Seri 1'in seçildiğinden emin olun ve sol alt köşedeki Ok'ye tıklayın (Şekil 3C).
      NOT: Dosyanın yüklenmesi bir dakika sürebilir, özellikle çok sayıda Z-katmanı veya zaman noktası varsa.
   5. Görüntü açıldıktan sonra (Şekil 3D), ana ImageJ penceresinden Görüntü > renk > bölünmüş kanallara (Şekil 3E) sinyalleri ikiye ayırın. Bu, GFP etiketli çekirdekler ve RFP etiketli kromatin için olmak üzere iki ayrı pencere oluşturacaktır (Şekil 3F).
2. Kromatinin ön işlemesi
   1. İki pencereden hangisinin kromatine karşılık geldiğini belirleyin.
   2. Kromatin penceresine (Şekil 3F) tıklayın ve ana ImageJ penceresinden Z projesi > > yığınlarına (Şekil 4A) giderek Z-projesi işlemini uygulayın.
   3. Projeksiyon tipini Maksimum Yoğunluk'a değiştirin ve Tüm Zaman Çerçeveleri'nin aktif olduğundan emin olun, sonra Tamam'a tıklayın (Şekil 4B).
   4. Kontrast menüsünü Ctrl+Shift+C tuşlarına basarak veya ana ImageJ penceresinden görüntü > Parlaklık/Kontrast > ayarlamak için gezin (Şekil 4C).
   5. İkinci çubuğu ( Maximum olarak etiketlenmiş) kromatin kolayca görünene kadar sola kaydırın (Şekil 4D).
3. Kromatini takip etme
   1. Eklentilere gidin (Şekil 5A).
   2. Eklentiler menüsündeki aşağı okuna tıklayarak takip seçeneğine kaydırın (Şekil 5A).
   3. Takip et, sonra TrackMate'e tıklayın.
   4. İlk ayarlar görünecek. Kalibrasyon ayarlarının doğru olduğundan emin olun, ardından Sonra'ya tıklayın (Şekil 5B).
   5. Thresholding Detector'ı seçin ve Sonraki'ye tıklayın (Şekil 5C).
   6. Görüntü penceresinde, zaman geçişinin son karesine (Şekil 5D) geçin.
   7. Yoğunluk eşiğinin yanında Otomatik tuşuna tıklayın, ardından Önizlemeye tıklayın.
   8. Yoğunluk eşiğini ayarlayın ve Önizleme'ye tıklayın. Önizleme tüm kromatini içerene ve minimum gürültü içerene kadar eşiği tekrar tekrar ayarlayın ve önizleyin, ardından Sonra'ya tıklayın (Şekil 5D).
   9. İlk eşik tespit gerçekleşir; Sonraki'ye tıklayın (Şekil 5E).
   10. Sadece kromatin görünene kadar manuel olarak eşik edin, sonra Sonra'ya tıklayın (Şekil 5F).
   11. Bu sayfa noktaların filtrelenmesine izin verir. Bunu görmezden gelip Sonra'ya tıklayın (Şekil 6A).
   12. Basit LAP takip cihazını seçin ve Sonraki'ye tıklayın (Şekil 6B). LAP takip cihazı, takip edilen nesneler birleşmediğinde veya bölünmediğinde geçerlidir.
   13. Bağlantı mesafesini maksimum 5 mikron, boşluk kapatma mesafesini 15 mikron ve boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğunu 1 olarak ayarlayın. Sonraki'ye tıklayın (Şekil 6C).
   14. Takip gerçekleşecek. Pistler orijinal görüntü penceresinde görünecektir. Sonraki'ye tıklayın (Şekil 6D).
   15. Bu sayfa iz filtrelemesine izin verir. Filtre oluşturmak için sol alt yeşil + düğmesine basın, ardından pist modunda nokta sayısını seçin ve Otomatik tuşuna basın (Şekil 6E).
   16. Modun Yukarı olarak ayarlandığından emin olun. Bu, hızla ortaya çıkan ve kaybolan lekeleri ortadan kaldırır.
   17. Sonraki'ye tıklayın (Şekil 6E).
   18. Görüntüleme seçenekleri sayfası, verilerin csv dosyası olarak dışa aktarılmasına olanak tanır. Sayfanın alt kısmında İzler butonuna tıklayın, ardından CSV'ye Dışa Aktar (Şekil 7A).
   19. Bu sayfa yerleşik kurgu yapmaya izin verir; görmezden gelip Sonraki'ye tıklayın.
   20. Son sayfada, videoyu Capture overlay ile kaydedin ve uygula tuşuna basın. Tıklayın, ardından dosyaya gidin > GIF olarak kayd> (Şekil 7B).
4. Temel hız analizi
   1. Ray CSV'sini bir tablo yazılımında açın.
   2. TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME ve RADIUS hariç tüm sütunları silin.
   3. Her parçadaki yerler sırasız olacak. Sıralamak için önce en üst dört satırı dondurun, ardından TRACK_FRAME başlıklı yeni bir sütun oluşturun ve bu formülü şu sütuna kopyalayıp yapıştırın: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. TRACK_FRAME sütununu seçin, sağ tıklayın, ardından A–Z sayfalarını Sıralama'ya tıklayın. Her parçadaki yerler artık sıralı olmalı.
   5. Hiçbir parçanın ortasında hiçbir noktanın eksik olmadığını doğrulamak için yeni bir sütun oluşturun ve şu formülü kullanın: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Her parçanın ilk noktasının "NA" ve geri kalanların 1 olduğunu sağla.
   6. Speed (mikron/çerçeve) için bir sütun oluşturun ve içine aşağıdaki formülü yapıştırın: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Bu, iki nokta arasındaki mesafeyi hesaplamak için Pifaqor teoremini kullanacaktır.
   7. Bunu Hız (mikron/saniye) olarak dönüştürmek için yeni bir sütun oluşturun ve içine şu formülü yapıştırın: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Bu, saniyeleri/kareyi bulur ve buna göre mikronları/kareleri çevirir.

Results

Nükleer zarfın canlı hücre görüntülemesi ve kromatin dinamikleri
Dış nükleer zarf proteini WIP1-GFP ve centromerik kromatin CENH3-mRFP'yi içeren çift floresan bir işaretleyici çizgisi oluşturduk (Şekil 8). 4 günlük fidanlar, kontrol plakasına veya 100 mM NaCl içeren plakalara 2 gün boyunca aktarıldı. 2 günlük kuluçkadan sonra, daha önce bildirildiği gibi tuz tedavisinde net bir kök büyüme inhibitörü^{gözlemlenmiştir 15}

Discussion

Burada sunulan yöntem, kromatin dinamiklerini takip etmek için idealdir. Önceki canlı hücre görüntüleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, çekirdeklerin ve kromatinin eşzamanlı görüntülenmesi, nükleer ve kromatin dinamikleri arasındaki ilişkinin araştırılmasına olanak tanır. Bu, nükleer rotasyon ve nükleer içi kromatin hareketi gibi gösterilmesi zor olan hareketleri ortaya çıkarabilir.

Canlı hücre görüntüleme yöntemi olarak, tüm süreç boyunca tutarlı sinyalle...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Murashige ve Skoog (MS) medyası	bioWorld	30630058
3M mikro gözenek bantları	Amazon	A-1530-0
Bağlantı yazılımı	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Kapak slipi	Genesee	29-116
Cam kaydırağı	Genesee	29-101
Image/Fiji	Açık kaynak	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mikroskop	Olympus/Evident	IX83
Sodyum klorür	Fisher Scientific	BP358-212
Dönen disk	Yokogawa	CSU-W1
Kare petri kapları	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987