Araştırma makalesi

Diyabetik Nefropatide Danzhi Jiangtang Kapsülü'nün Ağ Farmakolojisi, Makine Öğrenimi ve In Vivo Doğrulaması

51 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71328

⸱

28 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Danzhi Jiangtang Kapsülü (DJC), biyoinformatik ve in vivo doğrulama ile desteklenen kemokin sinyal ve piroptoz belirteçlerindeki değişikliklerle kanıtlandığı gibi, diyabetik nefropatiyi (DN) zayıflatabilir.

Özet

Danzhi Jiangtang Kapsülü (DJC), diyabet için klinik olarak kullanılan geleneksel bir Çin bitkisel preparatı olmasına rağmen, diyabetik nefropati (DN) sırasında böbreği nasıl koruyabileceği tam olarak açıklanmamıştır. Bu araştırma, DJC'nin DN'yi etkilediği potansiyel mekanizmaları incelemek için tasarlandı; odak ise NLR ailesi pirin alanı içeren 3 (NLRP3)/Kaspaz-1/Gasdermin D (GSDMD) piroptozla ilgili sinyal zincirine odaklandı.

Ağ farmakolojisi ve makine öğrenimini birleştiren entegre bir strateji kullanıldı. Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu (TCMSP) ile Geleneksel Çin Tıbbının Moleküler Mekanizması için Biyoinformatik Analiz Aracı (BATMAN-TCM), biyoaktif bileşenleri ve DJC'nin karşılık gelen protein hedeflerini taramak için kullanıldı. DN ile ilişkili genler, Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards ve Online Mendel Inheritance in Man (OMIM) programlarından alındı. Ana aday hedefleri birden fazla makine öğrenimi algoritması kullanılarak tarandı ve sıralandı. DJC'nin aktif bileşenleri ile çekirdek hedefler arasındaki bağlanma yakınlığı moleküler kenetlenme yoluyla değerlendirildi. Son olarak, db/db diyabetik farelerde terapötik etkinlik ve öngörülen mekanizmalar değerlendirildi.

Ağ farmakoloji analizi, DN ile paylaşılan 599 DJC hedefi ve 68 örtüşen gen tespit etti. Makine öğrenimi algoritmaları kullanılarak, C-C motifi kemokin ligandı 2 (CCL2) ve CASP1 öncelikli aday hedefler olarak belirlendi. Moleküler kenetlenme, DJC aktif bileşenleri ile bu çekirdek proteinler arasında olası güçlü bağlanma eğilimlerini öngördü. Fonksiyonel zenginleştirme analizleri (GO/KEGG), DJC modülasyonunun inflamatuar yanıtlar ve MAPK yolu ile ilişkili olduğunu göstermiştir. In vivo doğrulama, DJC tedavisinin böbrek hasarını ve fibroz belirteçlerini zayıflattığını gösterdi. Bu bulgular, DJC'nin kısmen CCL2/C-C motifi kemokin reseptörü 2 (CCR2) ile ilişkili pirooptoz sinyal değişiklikleri yoluyla DN'yi zayıflatabileceğini göstermektedir.

Giriş

Diyabetin (DM) küresel yükü giderek artmaya devam ediyor ve büyük bir halk sağlığı sorunu oluşturuyor. Yıllık tahmini 5,2 milyon ölüm DM ve ona bağlı komplikasyonlardankaynaklanmaktadır 1. DN, şiddetli bir mikrovasküler komplikasyon olarak sayılır ve son evre böbrek hastalığı (ESRD) gelişimine önemli katkılardan biridir; diyabet popülasyonunun yaklaşık %30-40'ınıetkiler 2,3. DN patolojik ilerlemesine metabolik disfonksiyon, hemodinamik yeniden modellenme ve kalıcı inflamatuar yanıtlar dahil olmak üzere birden fazla iç içe geçmiş faktör katkıda bulunur. Yüksek glikoz ve hiperlipidemi gibi patolojik hakaretler, NLRP3/kaspaz-1/GSDMD aracılı piroptoz yolunu aktive eder; bu da böbrek mezangial ve tübüler epitel hücrelerinde inflamatuar programlanmış ölüme ve ardından ilerleyici tubulointerstisiyel lezyonlarayol açar 4. Piroptoz, plazma zarının yırtılması ile karakterize edilir; bu da IL-1β ve IL-185 salınımını tetikler. Bu proinflamatuar faktörler, C-C motifi kemokin ligand 2 (CCL2) transkripsiyonunu artırır, makrofaj infiltrasyonunu teşvik eder ve piroptotik aktivasyonu daha da güçlendirerek böbrek hasarını aşamalı olarakkötüleştirir 6. Klinik uygulamada, bu durum ilerleyici albuminüri ve glomerüler filtrasyon oranının kademeli azalmasıyla ortaya çıkar; bu durum geri dönüşü olmayan böbrek hasarı ve etkilenen bireylerin yaşam kalitesinde belirgin bir bozulma ile sonuçlanabilir 7,8. Tıbbi bakımdaki gelişmelere rağmen, esas olarak sıkı glisemik ve kan basıncı kontrolüne odaklanan mevcut tedavi stratejileri genellikle hastalığın ilerlemesini tamamen durduramıyor. SGLT2 bloke ajanları, GLP-1 agonistleri ve mineralokortikoid reseptör blokerleri gibi yeni farmakoterapiler ile kök hücre tedavileri ve diyet müdahaleleri önemli ilgi görmüş ve uygulamada daha yaygın halegelmiş olsa da, DN'nin kalan riski yüksek kalır. Bu nedenle, yenilikçi terapötik maddeler geliştirmek, özellikle geleneksel tıptan gelen, aynı anda birden fazla patolojik yolu hedefleyebilen maddeler acil bir araştırma önceliği olmaya devam etmektedir.

Danzhi Jiangtang Kapsülü (DJC), Anhui Çin Tıp Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi'nde geliştirilen hastaneye özel bir formülasyon (Anhui İl Tıp Kurumu Hazırlık Onayı No. Z20090006; Patent No. ZL200310112845.1; Parti No. 20220427), umut verici bir terapötik adaydır. Mühürlü olmalı, kuru, havalandırılan bir ortamda saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. Formül, altı geleneksel Çin bitkisinden oluşmaktadır: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex) ve Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. Klinik uygulamada, DJC diyabetik hastalarda önemli hipoglisemik etkinlik ve böbrek yaralanması belirteçlerini azaltma yeteneği göstermiştir11. Önceki araştırmalar, DJC'nin kan şekeri seviyelerini ve lipid metabolizmasını düzenleyerek renoprotektif etkigösterebileceğini göstermektedir 12,13,14. DJC'nin önceki çalışmaları ağırlıklı olarak sistematik olmayan hedef seçimiyle tek yol doğrulamasına odaklanmıştır. Bu nedenle, aktif bileşenleri taramak ve çekirdek hub genlerini belirlemek için ağ farmakolojisi ve makine öğrenimini entegre ettik, ardından ön in vivo doğrulama yaptık, böylece analizi güçlendirdik.

Ağ farmakolojisi, karmaşık bitkisel reçeteleri incelemek için etkili bir strateji sunar. Bu çerçeve, biyoinformatik ve sistematik biyolojik yaklaşımları, hesaplamalı kimya ve farmakolojiyi entegre ederek ilaç etkilerinin "çok bileşenli, çok hedefli ve çok yollu" mekanizmalarınıçözür 15,16,17. Bu bütüncül yaklaşım, bitkisel bileşikler ile hastalık spesifik ağlar arasındaki karmaşık etkileşimlerin yapılandırılmış bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır ve TCM18'in doğasında bulunan sinerjik etkileri ortaya çıkarır. Ancak, geleneksel ağ farmakolojisi bazen veride aşırı gürültü yaratabilir. Bunu aşmak için, makine öğrenimi algoritmalarının entegre edilmesi, büyük ölçekli veri setlerinden temel karakteristik genlerin hassas taramasını mümkün kılar. Ayrıca, moleküler kenetlenme, potansiyel ilaç-biyomolekül bağlanma eğilimlerini tahmin etmek için sezgisel ve dinamik bir bakış açısı sağlar19.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Biyoaktif bileşiklerin ve DJC'nin potansiyel hedeflerinin taraması

DJC'deki altı bitkinin biyoaktif bileşikleri: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) ve Whitmania pigra (Hirudo) TCMSP veritabanından alınmıştır. Tarama, farmakokinetik parametrelere göre yapıldı: oral biyokullanılabilirlik (OB) ≥% 30 ve ilaç benzerliği (DL) ≥ 0.18. TCMSP'de veri bulunmayan Whitmania pigra için, aktif bileşikleri ve hedefleri BATMAN-TCM'den alındı; seçim kriterleri olarak ≥ 20 puan ve P-< 0.05 puanı kullanıldı. UniProt, toplanan tüm hedefleri standart bir gen adlandırmasında birleştirmek için uygulanmıştır.

DN ile ilgili genlerin edinimi

DN ile ilgili genler üç kaynaktan toplanmıştır. İlk olarak, GeneCards ve OMIM "diyabetik nefropati" kelimesiyle arama terimi olarak kullanıldı. GeneCards'tan ilgililik puanı > 1 olan genler korundu. İkinci olarak, GEO deposundan üç mikroarray profili (GSE30529, GSE104948, GSE96804) alındı. GSE30529'daki örnekler böbrek tübüllerinden alınmışken, GSE104948 ve GSE96804 örnekleri böbrek glomerüllerinden alınmıştır. Tüm veritabanı aramaları 15 Aralık 2024'te gerçekleştirildi. GSE30529 veri setindeki DN hastalar ile sağlıklı kontroller arasında farklı olarak eksprese edilen genler (DEG), R yazılımındaki limma paketi kullanılarak tanımlandı. Tarama kriterleri ayarlanmış p-değeri < 0.05 ve |log2(Fold Change)| > 0.5. Volkan grafikleri ve ısı haritaları farklı şekilde eksprese edilen genleri gösteriyordu.

DN için DJC'nin olası terapötik hedeflerinin tanımlanması

Venn diyagram analizi, DJC hedef havuzu ile GeneCard, OMIM ve GSE30529 DEG'lerden DN ilişkili genler arasında ortak lokuslar tespit etti. Bu ortak lokuslar, tüm sonraki araştırma prosedürleri için aday terapötik genler olarak hizmet verdi.

Protein etkileşim (PPI) ağlarının oluşturulması ve profillenmesi

Varsayılan terapötik lokuslar, protein-protein etkileşim ağı oluşturmak için STRING'e yüklendi ve etkileşim kesme noktası 0.4 güven değerinin üzerinde belirlendi. Cytoscape, ağ veri setlerini görsel sunum için işledi. Degree gibi topolojik indeksler, ağ genelinde çekirdek düğümleri belirlemek için CytoNCA eklentisi aracılığıyla hesaplanmıştır.

Zenginleştirme analizi

Aday hedeflere bağlı biyolojik rolleri ve sinyal zincirlerini tanımlamak için, fonksiyonel zenginleştirme R'de clusterProfiler paketiyle org kullanılarak analiz edildi. Hs.eg.db annotasyon için ve ggplot2 görselleştirme için. Gen Ontolojisi (GO) terimleri, biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF) kategorileri arasında değerlendirildi. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolları, zenginleştirme p-değeri 0.05 olduğunda < korundu.

CytoHubba algoritmasının Kullanımı

Cytoscape'teki CytoHubba eklentisi, her ağ düğümü için dört topolojik merkeziyet endeksi hesaplamak için kullanıldı. Derece, doğrudan bağlı komşuların sayısı, her proteinin etkileşimlerinin genişliğini yansıtır. Düğümün komşuluk alt grafındaki en büyük bağlı bileşenin boyutunu niceleyen bir metrik olan maksimum komşuluk bileşeni (MNC), yerel düzenleyici etkiyi ölçür. Kenar perkolasyonlu bileşen (EPC), simüle edilmiş rastgele kenar çıkarımı ve ortalama bağlı bileşen boyutunun nicelendirilmesiyle küresel yapısal önemi değerlendirir. Her indeks için ilk 20'de yer alan genler, kesişerek nihai hub genleri ortaya çıktı.

Makine öğrenimi tabanlı çekirdek gen taraması

GSE30529 veri setinden ifade profillerine üç makine öğrenimi yaklaşımı uygulanarak aday hedefler arasında güvenilir hub genleri belirlendi.

(1) LASSO (En Az Mutlak Küçülme ve Seçim Operatörü): Düzenleme parametresi λ, beş katlı çapraz doğrulama ile ayarlandı; optimal değer katlamalar arasındaki ortalama performansla belirlendi. Giriş gen ekspresyonu özellikleri, ekspresyonun büyüklüğünün etkilerini ortadan kaldırmak için otomatik Z-puan standartlaştırmasından geçti. Ceza parametresi saf LASSO düzenlemesi için 1 olarak sabitlendiğinde α tarama için önceden tanımlanmış 100 λ değer paneli kullanıldı. L1 cezası, düşük alakalı özelliklerin katsayılarını sıfıra indirdi; böylece eşzamanlı özellik seçimi ve karmaşıklık kontrolü mümkün kaldı, çapraz doğrulama ile ayarlanmış düzenleme gücü ise aşırı uyum riskini azalttı.

(2) SVM-RFE (Destek Vektör Makine-Özyinelemeli Özellik Eliminasyonu): Sağlam özellik taraması sağlamak için iki katmanlı 5 katlı çapraz doğrulama çerçevesi kullanıldı. Beş örtüşmeyen alt küme, tüm veri setinin stokastik olarak bölünmesiyle oluşturuldu; bunlardan dördü eğitim için, biri ise beş iterasyonda test için kullanıldı; katlanabilir ortalama, tek örneklem bölünmesinden kaynaklanan önyargıyı azaltıyor. Özellik boyutluluğunu azaltmak ve model karmaşıklığını kısıtlamak için özyinelemeli özellik elemesi uygulandı; böylece aşırı uyumu hafifletti. Sınıflandırma hata oranı ve doğruluğu, optimal özellik sayısını belirlemek için performans metrikleri olarak hizmet verdi.

(3) Rastgele Orman (RF): Başlangıçta 500 ağaçlık rastgele bir orman oluşturuldu ve optimal ağaç sayısı, nihai modeli yeniden eğitmek için minimum sınıflandırma hata oranıyla belirlendi. Kalan tüm hiperparametreler, her düğüm bölünmesinde rastgele özellik alt kümesi boyutu dahil, varsayılan paket ayarlarında tutuldu. Son modelden elde edilen gen önem puanları, hastalık imzası gen seti oluşturmak için azalan sırayla sıralandı. Son çekirdek gen seti, bu üç algoritmanın sonuçlarının kesişmesiyle belirlendi.

Hub gen ifadesinin bağımsız veri seti tabanlı doğrulaması

Merkez genlerinin transkript seviyelerini doğrulamak için iki bağımsız harici veri seti olan GSE104948 ve GSE96804 kullanıldı. Gen ifade veri setleri normalizasyondan geçti; DN vakaları ile sağlıklı kişiler arasındaki ifade farkları, R'nin ggplot2 ve ggsignif araç setleri kullanılarak çizildi.

Moleküler kenetleme

Hub hedef proteinlerinin 3D konformasyonları (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00) Protein Veri Bankası'ndan alındı. Biyoaktif bileşik 3D konformasyonları PubChem aracılığıyla alındı. Ursolik asit, 3β-hidroksiyur-12-en-28-oik asit ve quercetin kenetlenmek için seçildi çünkü ağ farmakolojisi bu aktif bileşikler ile çekirdek hedefler CCL2 veya CASP1 arasındaki etkileşimleri öngördü. Protein yapıları, doğal ligandlar ve su molekülleri sökülerek önceden işlenir, kutup hidrojenleri eklenir ve ardından AutoDock Vina kullanılarak moleküler kenetlenmeye tabi tutulur. Bağlanma eğilimi, kenetlenme skoruyla (kcal/mol cinsinden) temsil edilir ve etkileşimlerin gücünü değerlendirmek için kullanılmıştır. Moleküller arası kararlı etkileşimleri tanımlamak için −5.0 kcal/mol bağlanma enerjisi eşiği ayarlandı. Bağlanmış konformasyonlar PyMOL kullanılarak görselleştirildi.

Hayvanlar ve deneysel tasarım

Mevcut çalışmada, belirli patojensiz (SPF) derecede 30 adet 8 haftalık erkek db/db fare ile birlikte yaşına uygun 10 erkek SPF db/m faresi kullanıldı. Tüm deneysel fareler, SPF sınıflı bir tesiste 12 saat ışık-karanlık bir fotoperiyot altında yetiştirildi ve stabil koşullarda tutuldu: 22 ± 2 °C, %50–70 göreli nem ve düzenli yemek ile içme suyuna sınırsız erişim. Tüm in vivo deneysel protokoller için etik onay, Anhui Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından verildi (Onay No. AHUCM-mouse-2023059).

Kemirgenler, rastgele gruplamadan önce (her biri 6 hayvan) ve 8 haftalık günlük müdahaleden önce 7 günlük adaptasyon aşamasından geçti. Tüm deneysel hayvanlarda açlık kan şekeri ölçüldü; hayvanlar rastgele sayı tablosu kullanılarak tahsis edildi ve histoloji, IHC ile western blot nicel ölçümü kör değerlendirme altında gerçekleştirildi.

Normal kontrol (CTL) grubu: db/m fareler, oral garajla salin alıyor.

Model (M) grubu: db/db fareler, oral garajla tuzlu bir su alır.

DJC-Orta Doz (DJC-M) grubu: db/db fareler, 0.78 g/kg (yetişkinler için klinik günlük doza eşdeğer) DJC alır.

DJC-Yüksek Doz (DJC-H) grubu: db/db farelerde 1.56 g/kg (yetişkinler için klinik günlük dozun iki katı) DJC alıyor.

Dozaj hazırlığı

İnsan-sare doz ölçeklendirmesi, Farmakolojik Deneyler Metodolojisi'nde belirtildiği gibi vücut yüzeyi normalizasyon yaklaşımı kullanılarak türetildi ve dönüşüm katsayısı 9.1'dir. 70 kg ağırlığındaki bir yetişkin için günlük klinik doz 6 g (0,0857 g/kg) olup, fare eşdeğeri 0,78 g/kg (1 kat klinik doz) ve 1,56 g/kg (2 kat klinik doz) oldu. Tüm farelere 10 mL/kg sabit hacimde intragastrik uygulama verildi. DJC tozu hassas şekilde tartıldı ve %0,5 CMC-Na çözeltisinde askıya alınarak 78 mg/mL (orta doz) ve 156 mg/mL (yüksek doz) seviyelerinde uniform süspansiyonlar oluşturuldu.

Günlük uygulamanın 8 haftasından sonra, %1 sodyum pentobarbital kullanılarak tüm deneysel farelerde anestezi indüklenmiştir. Kan örnekleri karın aortu üzerinden toplandı ve kit tabanlı biyokimyasal testler için süpernatanları izole etmek üzere santrifüj edildi. Metabolik kafesler fare idrar örnekleri toplamak için kullanıldı. Kısmi böbrek dokuları, hematoksilin-eozin (HE) ve Masson boyama için %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Sıvı azotta snap-dondurulan kalıntı böbrek dokuları, aşağı akış analitik testleri için −80 °C'de korundu.

Histolojik analiz

%4 paraformaldehit ile fiksasyonun ardından, böbrek dokuları dereceli etanol dehidrasyonu, temizleme, parafin gömülmesi ve sonraki HE ile Masson trikrom boyama için 4 μm seri kesitleme geçirdi. HE boyama, standart prosedürler (deparafinizasyon, rehidrasyon, hematoksilin nükleer boyama, asidilenmiş etanol farklılaşması ve mavileşme, eozin karşı boyama, dehidrasyon, temizlenme ve nötr balsam montajı) takip ederek böbrek histopatolojik değişiklikleri gözlemledi. Bölümler 3 dakika boyunca hematoksilin boyama ile batırıldı, ardından 15 saniye boyunca eozin karşı boyama yapıldı. Masson'ın trikrom boyama işleminde, bölümler deparafinizasyon, rehidrasyon, ardışık boyama, farklılaşma ve asetik asit renk ayrımı yapıldı, ardından dehidrasyon, temizleme ve montaj işlemleri yapıldı; böylece böbrek kollajen birikimi ve fibrotik değişiklikler değerlendirildi. Parlak alan mikroskopisi, tüm lekeli doku kesitlerini 200× büyütmede incelemek ve fotoğraflamak için kullanıldı. HE boyalı kesitler Glomerüler Skleroz İndeksi (GSI) kullanılarak puanlandı. Masson'ın trikrom boyaması için, mavi kolajen kanalını izole etmek için Masson Trikrom ön seti uygulandı ve kolajen alanı ile kırmızı boyalı doku alanı oranı hesaplandı.

İmmünohistokimya (IHC)

%4 paraformaldehit ile 24 saatlik fiksasyondan sonra, doku örnekleri seri etanol gradyanlarıyla kurutulmuş, ardından parafinle gömülülüp sıralı 5 μm kesitlere kesilmiştir. Deparafinizasyondan sonra, bölümler antijen geri alma ve endojen peroksidaz blokajı geçirmiştir. Bloklamadan sonra, doku slaytları gece boyunca nemli bir odada 4 °C sıcaklıkta seyreltilmiş primer antikorlarla kuluçka edildi. PBS yıkamalarından sonra slaytlar, oda sıcaklığında ikincil bir antikor kuluçka aldı ve optimal boyama yoğunluğu sağlanana kadar DAB kromojenik reaksiyonu uygulandı. Bölümler daha sonra ardışık hematoksilin karşı boyama, farklılaşma, mavrulaşma, dehidrasyon, temizleme, örtü kalı montajı ve parlak alan mikroskobik görüntüleme işlemlerinden geçti. Antijen toplama işlemi 10 dakika boyunca otoklavlama yoluyla yapıldı, ardından oda sıcaklığına doğal soğutma yapıldı. Oda sıcaklığında %5 keçi serumu ile 60 dakika bloke edildikten sonra, bölümler birincil antikor (1:200 seyreltme) ve ardından HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan antikoru IgG ikincil antikoru (1:300 seyreltme) ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkubasyon edildi. DAB kromojenik reaksiyonu oda sıcaklığında 3–5 dakika boyunca gerçekleştirildi, mikroskobik olarak izlendi ve damıtılmış suyla durulama ile sonlandırıldı. Görüntüler ×200 büyütmede alındı ve pozitif boyama alanı yüzdesi ImageJ kullanılarak nicel edildi.

ELISA tespiti

Test adımları, kit üreticileri tarafından sağlanan resmi protokollere uygundu. Yıkama tamponu ve seri seyreltilmiş standartlar önceden hazırlanmıştı. Boş, standart ve örnek kuyuları reaktiflerle doldurulur ve karanlıkta kuluçka altına alınırdı. Plakalar kuluçkadan sonra iyice yıkanır, ardından karanlıkta enzim konjugat ile inkubasyon edilir. Yıkamadan sonra, ışıkla korunan renk reaksiyonu için kromojenik bir alt eklendi; standart kuyularda belirgin mavi gradyanlar ortaya çıkınca stop buffer ile sonlandırıldı. Her kuyunun soğurma noktası (OD) hedef dalga boyunda mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Serum IL-1β ve IL-18 konsantrasyonları, standart konsantrasyonların (seyreltilmemiş serum örnekleri; 450 nm ölçülü absorbans; her örnek başına sekiz teknik replika kuyu) OD değerlerinden oluşturulan kalibrasyon eğrileriyle nicelendirildi. İdrar kreatinin ve 24 saat idrar proteini, 24 saat metabolik kafeslerle toplanan seyreltilmemiş idrar örneklerinde ölçüldü (absorbans 546 nm; örnek başına sekiz teknik tekrar).

Gerçek zamanlı nicel PCR (RT-qPCR)

Toplam RNA böbrek dokularından izole edildi ve saflığı ile konsantrasyonu spektrotometri ile belirlendi. Arıtılmış RNA, cDNA şablonları oluşturmak için tersine transkribe edildi. RT-qPCR, şu termal döngü programıyla gerçek zamanlı bir PCR cihazında gerçekleştirildi: 5 dakika önceden denatürasyon (95 °C), ardından 40 amplifikasyon turu: 95 °C'de 15 saniye, 60 °C'de 1 dakika. RT-qPCR, 5 μL SYBR Green Master Mix, 0,2 μL ön astar, 0,2 μL ters primer içeren 10 μL reaksiyonda gerçekleştirildi. 1 μL cDNA şablonu ve 3,6 μL RNase-içermeyen su. cDNA sentezi için ters transkripsiyon, toplam 20 μL reaksiyon hacminde gerçekleştirildi. Amplifikasyon özgüllüğünü doğrulamak için erime eğrisi analizi yapıldı ve her örnek üç teknik kopyada analiz edildi. Transkript seviyeleri, 2⁻ΔΔCq normalizasyonu ile β-aktine değerlendirildi ve tüm primer dizileri Tablo 1'de listelendi.

Western Blot analizi

Her fare kohortundan yaklaşık 40 mg böbrek dokusu örnekleri alındı, buzda doğrandı ve protein lizis tamponunda tamamen homojenleştirildi. 4 °C'de 12.000 rpm'de 15 dakikalık bir dönüş yaptıktan sonra, doku homojenlerinden elde edilen toplam protein içeren süpernatan toplandı, aliquote edildi ve −80 °C'de kriyokonserve edildi. Protein süpernatantı yükleme tamponu ile karıştırıldı ve su banyosunda kaynatarak denatüre edildi. Yaklaşık 10 μL normalize protein örneği her şerit başına yüklendi ve %10 SDS-poliakrilamid jellerine ayrıldı. Hedef proteinler, ıslak elektroblotlama yoluyla nitroselüloz filtrelerine aktarıldı. Transfer, buz banyosunda sabit 400 mA akımda 30–45 dakika boyunca gerçekleştirildi. Transferden sonra, blotlar soğuk yağsız sütte 2 saat kuluçka altına alındı, ardından gece boyunca 4 °C'de 1:1.000 primer antikor ile inkübe edildi. Yıkanmış lekeler, 4 °C'de 2 saat boyunca uyumlu ikincil antikorlarla (1:10.000) kaplandı ve ImageJ yazılımı kullanılarak leke fotoğraflarından parlak bant sinyalleri kaydedilip nicelendirildi. GSDMD-N için, beklenen moleküler ağırlığı (~35 kDa) GAPDH (~36 kDa) ile örtüşmesi nedeniyle yük kontrolü olarak Tubulin kullanılmıştır. Tüm western blot deneyleri üç bağımsız biyolojik kopya ile gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz

Nicel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. İki grup arasındaki farklar, eşleşmemiş bir öğrenci t-testi ile analiz edilirken, birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile ve ardından Tukey'nin sonradan yaptığı test ile değerlendirildi. P< değeri 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DJC biyoaktif bileşen ve hedef tanımlama

DJC'yi oluşturan altı bitkiden tarama kriterlerini karşılayan toplam 66 biyoaktif bileşik (OB ≥ %30 ve DL ≥ 0.18) tespit edilmiştir. Bunlar arasında Pseudostellaria heterophylla'dan 26 bileşik, Paeonia suffruticosa'dan 6, Cuscuta chinensis'ten 8, Alisma orientale'den 6, Rehmannia glutinosa'dan 10 ve Whitmania pigra'dan 10 bileşik vardı. Hedef etiketl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

DN, henüz tam olarak anlaşılamamış karmaşık ve çok faktörlü bir patogenezle karakterize edilen ESRD'nin önde gelennedenlerinden biri olmaya devam etmektedir 20,21. DJC, DN'yi iyileştirmede umut verici klinik etkinlik göstermiş olsa da, altta yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde anlaşılmazkalmıştır 22. Bu çalışmada, DJC'nin farmakolojik etkilerini incelemek için ağ farmakolojisi, makine öğrenimi araçla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Anhui İl Üniversitelerinin Ana Araştırma Projeleri (Hibe No. 2024AH050968) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxylin Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
yazılım adısürüm
AutoDock Vina1.2.3
Cytoscape software3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
R software4.2.0

Kaynaklar

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiyolojiSay 233Say 233Bo De erSayPiroptozisCCL2 CCR2 ekseni

İlgili makaleler