Şizofrenide SUCNR1 ve GPR37L1'nin Biyoinformatik ve Nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyon Analizi

Özet

Bu çalışma, GSE54913 veri setinin entegre biyoinformatik analizi, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) doğrulaması ve bağımsız bir kohortta sözel hafıza ile korelasyon analizi yoluyla SUCNR1 ve GPR37L1'yi şizofreni ile ilişkili molekuler işaretleyiciler olarak değerlendirmektedir.

Özet

Şizofreni, birçok genetik yatkınlık unsurunu içeren şiddetli, karmaşık ve çok faktörlü bir ruhsal bozukluktur ve önemli engellilik, hastalık ve ölümlülüğe yol açar. Patofizyolojisi ve etiyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere rağmen, şizofreni için spesifik tanısal biyobelirteçler hâlâ ulaşılamamaktadır. Bu çalışma, şizofreniyle ilişkili aday moleküler belirteçleri belirlemeyi amaçladı. Entegre bir biyoinformatik analiz GSE54913 kamuya açık mikroarray veri seti üzerinde gerçekleştirildi. Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol analizleri, en anlamlı zenginleştirilmiş GO terimlerinin kanal aktivitesiyle ilişkili olduğunu ortaya koydu; bunlar arasında pasif transmembran taşıyıcı aktivitesi, iyon kanalı aktivitesi, kapalı kanal aktivitesi ve substrat-özgül kanal aktivitesi yer alıyor. En zenginleştirilmiş beş KEGG yolu insülin salgılanması, cAMP sinyal yolu, nukleotid eksizyon onarımı, TNF sinyal yolu ve glutatyon metabolizmasıydı. Doğrulama, Wuhan Rongjun Youfu Hastanesi'nden bağımsız bir örnek seti üzerinde nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak gerçekleştirildi. qRT-PCR sonuçları büyük ölçüde mikroarray analiziyle tutarlıydı (Pearson r = 0.89, %95 GA: 0.66–0.97). Protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi, GO terimi 'iyon kanalı aktivitesi' ile anlamlı ilişkili olan ve KEGG yolu 'insülin salgılanması'nda zenginleşen iki merkez geni, SUCNR1 ve GPR37L1'yi tespit etti. Ayrıca, SUCNR1 ifadesi sözel hafıza puanlarıyla negatif bir korelasyon gösterdi (r = -0.54, P = 0.015), iken GPR37L1 ifadede pozitif korelasyon vardı (r = 0.59, P = 0.0034). Bu bulgular, değişen SUCNR1 ve GPR37L1 ifadesinin şizofreniyle ilişkili olabileceğini ve daha fazla araştırma için aday moleküler belirteçleri temsil edebileceğini göstermektedir.

Giriş

Şizofreni, tanımlanamayan etiyolojiye sahip kronik ve karmaşık bir ruhsal bozukluktur ve şiddetli beyin işlevsizliği, bilişsel bozukluk ve psikososyal eksikliklerle karakterize^{edilir 1}. Dünya çapında 21 milyondan fazla insanı etkileyen büyük bir küresel sağlık^{yükü oluşturmaktadır 2}. Son elli yılda tanısal ve tedavi yaklaşımları önemli ölçüde gelişmiş olsa da, temel patogenezi belirsizdir ve önemli engellilik, morbidite ve ölüm oranlarıyla ilişkili uzun vadeli sonuçlar belirgin şekilde^{iyileşmemiştir 3}. Bu nedenle, potansiyel kritik genleri ve düzenleyici hedefleri belirlemek şarttır.

Şizofreninin patofizyolojisi tam olarak açıklanmasa da, genetik polimorfizmalar ve ifade varyasyonlarına yaygın olarak atfedilir⁴. Örneğin, östrojen alfa genindeki genetik varyasyon, alternatif gen düzenlemesi ve transkript işleme yoluyla şizofreniye yatkınlığı etkileyebilir⁵. Benzer şekilde, NRG1'in fonksiyonel bir promotor varyantı şizofreni ile ilişkilendirilmiş ve tip III NRG1^{izoformu 6'nın} azalmış ekspresyonuyla korelasyon göstermiştir. Otopslama sonrası çalışmalar, şizofrenik beyinlerde PDE4B izoformlarının ifadesinin anlamlı şekilde azaldığını göstermiş olup, bunun öngörü potansiyelini^{göstermektedir 7}. Diğer adaylar arasında dopamin taşıyıcısı (DAT), veziküler monoamin taşıyıcısı (VMAT2) ve monoamin oksidaz (MAO) bulunur; bunlar sinaptik dopamin seviyelerini düzenleyip biyobelirteç^{olarak hizmet verebilir 8}. Ayrıca, TCP1,^{şizofreni 9'da} yanlış aktin katlanması yoluyla sitoskelet defzuklarına katkıda bulunabilir. Bu nedenle, şizofreninin patogenezinde gen ifade profillerinin aydınlatılması, risk tahmini, mekanik anlayış ve terapötik değerlendirme konusunda içgörüler sağlayabilir.

Son hesaplamalı yaklaşımlar, entegre ağ analizi ve makine öğrenimi yöntemleri 10,11,12 yoluyla hastalıkla ilişkili genlerin tanımlanmasını ilerletmiştir^. Çok sayıda genetik çalışmaya rağmen, şizofreni için klinik uygulamada güvenilir kan bazlı tanısal biyobelirteçler kullanılmamıştır. Bu boşluğu gidermek için, mevcut çalışma, şizofreni hastalarından ve sağlıklı kontrol gruplarından alınan kan kaynaklı transkriptomik verileri içeren GSE54913 veri setini yeniden analiz etmek için entegre bir biyoinformatik yaklaşım kullandı. Veri seti, (1) çevresel kan örneklerinin minimal invaziv ve klinik olarak pratik olması, (2) kamuya açık şizofreni mikroarray veri setleri arasında nispeten büyük bir örneklem boyutunu içermesi ve (3) ham verilerin yeniden analiz için mevcut olması nedeniyle seçildi. Bu çalışmanın amaçları şunlardı: (1) şizofreni hastalarında sağlıklı kontrol genlerine kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri GSE54913 veri seti kullanılarak tanımlamak; (2) merkez genlerini belirlemek için fonksiyonel zenginleştirme ve PPI ağ analizleri yapar; (3) aday genlerin qRT-PCR ile bağımsız bir kohortta ifadesini doğrulamak; ve (4) hub gen ifadesinin sözel hafıza performansı ile ilişkisini araştırır. Yazarların bildiği kadarıyla, bu çalışma SUCNR1 ve GPR37L1'yi şizofreni için kan bazlı aday moleküler belirteçler olarak tanımlayan ilk çalışmadır.

Protokol

Bu çalışma, Wuhan Rongjun Youfu Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış (proje tanımlama kodu, YF-IRB202310215) ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm katılımcılar Çinli topluluğun sakinleriydi ve yazılı bilgilendirilmiş onay verdiler.

Çalışma denekleri ve kan örneklemi
Şizofreni tanısı konan on yetişkin ve üç nesil içinde ailede ruhsal hastalık öyküsü olmayan on sağlıklı kontrol gönüllüsü kaydedildi. Şizofreni hastaları için dahil etme kriterleri: (1) DSM-5 kriterlerine göre şizofreni tanısı iki bağımsız kıdemli psikiyatrist tarafından doğrulandı; (2) 18–65 yaş arası; (3) kan numunesi alınmadan önce en az 4 hafta boyunca antipsikotik ilaçlarda değişiklik olmaması; (4) yazılı bilgilendirilmiş onay sağlama istekliliği. Dışlama kriterleri: (1) eşzamanlı büyük tıbbi hastalıklar (örneğin, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, kanser); (2) son 6 ay içinde madde bağımlılığı veya bağımlılık; (3) zihinsel engellilik; (4) hamilelik veya emzirme. Sağlıklı kontroller için dahil etme kriterleri: (1) herhangi bir ruhsal hastalıktan (üç nesil içinde) kişisel veya aile öyküsü yok; (2) mevcut veya geçmişte antipsikotik ilaç kullanmamak; (3) yaş ve cinsiyet şizofreni grubuna göre eşleştirilmiş; (4) büyük tıbbi hastalık yok. Şizofreni hastalarının ortalama hastalık süresi 12,5 ± 6,8 yıl idi; Tüm hastalar stabil antipsikotik ilaç kullanıyordu (6 kişi risperidon, 4 kişi olanzapin); ortalama PANSS toplam puanı 76,4 ± 12,3 idi. Kontrol kontrol grupları yaş (±5 yaş) ve cinsiyet (her grup başına 5 erkek, 5 kadın) açısından eşleştirildi. Sözlü hafıza, Hopkins Sözel Öğrenme Testi–Revize (HVLT-R) kapsamında toplam hatırlama puanı kullanılarak değerlendirildi. Tüm denekler 1 Ocak ile 31 Temmuz 2025 tarihleri arasında Wuhan Rongjun Youfu Hastanesi'nden işe alındı. Temel demografik bilgiler Tablo 1'de özetlenmiştir.

Örneklem büyüklüğü, iki kuyruklu bağımsız t-testi için örnek boyutu hesaplama yazılımı kullanılarak belirlendi; etki boyutu 1.2, α = 0.05 ve güç (1-β) = 0.80 oldu; böylece grup başına en az dokuz denek elde edildi.

Venöz kan EDTA antikoagülasyonlu tüplere çekilir ve gecikmesiz işlenmiştir. Çevresel kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), yoğunluk gradyanı ortamı kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüjasyonu ile örneklerden ayrıldı. Kısa bir süreliğine, kan fosfatla tamponlu tuzlu (PBS, pH 7.4) ile 1:1 oranında seyreltildi, yoğunluk gradyanı ortamına katmanlandı ve fren kapalı olarak 20 °C'de 30 dakika boyunca 400 × g'de santrifüj edildi. Santrifüjlemeden sonra, PBMC içeren arayüz dikkatlice yeni bir tüpe aktarıldı. Hücreler PBS ile iki kez durulandı, her yıkama ardından 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapıldı ve son pelet PBS ile askıya alındı. Yaşamlılık, trypan blue boya dışlama yöntemiyle değerlendirildi ve yalnızca %95 canlı hücre ≥içeren preparatlar kullanıldı. İzole PBMC'ler alkotasyonla tutulup RNA çıkarımından önce en fazla 3 ay boyunca −80 °C'de saklandı.

Mikroarray verileri
Çalışmanın iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroarray veri seti GSE54913 GEO veritabanından indirildi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Bu veri seti seçildi çünkü (1) biyomarker keşfi için minimal invaziv ve klinik olarak pratik olan periferik kan örneklerinden alınan transkriptomik veriler içeriyor; (2) kamuya açık şizofreni mikroarray veri setleri arasında nispeten büyük bir örneklem büyüklüğünü içerir (18 hasta, 12 kontrol); (3) ham veriler yeniden analiz için mevcuttu. GEO kaydına göre, örnekler plazmadan değil, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) alınmıştır. Önceki versiyondaki orijinal tanım 'plazma örnekleri' bir hata olmuş ve düzeltilmiştir.

Veri ön işleme ve farklı olarak ifade edilen gen (DEG) taraması
Ham veri (. CEL dosyaları) mikroarray ön işleme yazılımı kullanılarak önceden işlenirdi. Arka plan düzeltmesi Robust Multichip Average (RMA) yöntemiyle gerçekleştirildi, ardından quantil normalizasyon ve log2 dönüşümü yapıldı. Gen açıklaması olmayan probesetler filtrelendi. Örnekler arasında %>20 eksik değere sahip problar hariç tutuldu; Kalan problar için eksik değerler, eksik değer imputasyon yazılımında uygulanan K-en yakın komşular algoritması (k = 10) kullanılarak atveledildi. GEO kaydına göre tüm örnekler tek bir partide işlendiği için parti etkileri yoktu. Ön işlemeden sonra, 17.200 genin ifade değerleri alındı ve ardından analiz yapıldı. Şizofreni hastaları ile sağlıklı kontroller arasındaki DE'ler, diferansiyel ifade analiz yazılımı kullanılarak tespit edilmiştir. Yanlış keşif oranı (FDR) 0,05<, mutlak katlama değişimi (FC) > 1,2 ve P < 0,05 olan genler farklı olarak ifade edilen kabul edildi. Görece düşük bir FC eşiği (mutlak FC >1.2) seçildi çünkü şizofreni, bireysel gen ifade farklılıklarının genellikle dramatik değil, ince olduğu karmaşık bir psikiyatrik bozukluktur.

GO ve yol zenginleştirme analizleri
Gen Ontolojisi (GO) terimleri ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolları için fonksiyonel zenginleştirme analizleri fonksiyonel zenginleştirme analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Arka plan gen seti, ön işlemeden geçen tüm genlerden (17.200 gen) oluşuyordu. Ham P-değerleri 0.05 < zenginleştirme terimleri ve yolları rapor edilmiştir. GO ve KEGG zenginleştirme çıktıları için ham P-değerleri kullanıldığı için, bu sonuçlar keşif amaçlı olarak yorumlanmalıdır.

PPI ağ analizi ve hub gen tanımı
PPI ağı oluşturmak için protein-protein etkileşim veritabanı kullanıldı ve eşik olarak 0.9 > birleşik etkileşim puanı belirlendi. Ağ, ağ görselleştirme yazılımı kullanılarak görselleştirildi. Hub genleri, Degree algoritmasına sahip bir hub gen tanımlama eklentisi kullanılarak tanımlandı. En yüksek derece puanına sahip ilk 10 düğüm merkez genleri olarak seçildi. Ana merkez genlerinin alt ağı, varsayılan parametrelere sahip bir alt ağ çıkarma eklentisi kullanılarak çıkarıldı (derece kesme = 2, düğüm skor kesme noktası = 0.2, K-çekirdek = 2, maksimum derinlik = 100).

Toplam RNA izolasyonu ve qRT-PCR
β-Aktin, iç referans (temizlik) geni olarak kullanıldı. Örnekler arasında β-aktin ekspresyonunun stabilitesi, şizofreni ile kontrol grupları arasında Ct değerlerinde anlamlı bir fark olmamasıyla doğrulandı (P > 0.05). Göreceli niceliklendirme 2^−ΔΔCt yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Tüm reaksiyonlar üçlü olarak gerçekleştirildi ve hesaplamada ortalama Ct değeri kullanıldı (bkz. Tablo 2'deki primer dizileri). Mikroarray verilerinin genel güvenilirliğini doğrulamak için ilk qRT-PCR doğrulaması için en iyi on DEG'ler (en önemli şekilde yukarı regule edilen beşi ve katlanma değişimiyle en belirgin şekilde aşağı regule edilen beşi) seçildi. Daha sonra, SUCNR1 ve GPR37L1 üç kritere göre odaklanmış doğrulama için seçildi: (1) PPI ağ analizinde hub genleri olarak tanımlandılar (derece ≥ 7); (2) en yüksek zenginleştirilmiş GO terimi 'iyon kanalı aktivitesi' ve KEGG yolu 'insülin salgılanması' ile anlamlı ilişkilendirilmişti; (3) her ikisi de şizofrenide bilinen ilaç hedefleri olan GPCR'leri kodlar.

İstatistiksel analiz
Normallik Shapiro–Wilk testi ile değerlendirildi. Yaklaşık normal dağılıma sahip değişkenler (P > 0.05) parametrik yöntemlerle analiz edildi; bunlar arasında iki grup karşılaştırmaları için Student t-testi ve iki gruptan fazla olan karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA da bulundu. Normallik varsayımı karşılanmadığında, uygun olduğunda Mann–Whitney U veya Kruskal–Wallis testleri kullanıldı. Tüm istatistiksel testler iki kuyrukluydu. Birden fazla karşılaştırma için (örneğin, ANOVA sonrası testlerde) Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) yöntemi uygulandı ve FDR eşiği 0.05 oldu. Korelasyon analizleri için çoklu karşılaştırma düzeltmesi uygulanmadı, çünkü sadece iki korelasyon yapıldı; ham P-değerleri temkinli şekilde bildirilir.

Sonuçlar

DEG'lerin tanımlanması ve hiyerarşik kümelenme
GSE54913 veri setinin analizi, şizofreni hastaları ile kontrol hastaları arasında 357 yukarı regülasyonlu ve 116 aşağı regülasyona sahip 473 farklı şekilde eksprese edilen gen (DEG) tespit etti (Şekil 2A,B). Bu DEG'lerin hiyerarşik kümelenmesi, şizofreni örneklerini kontrol örneklerinden ayırt eder (Şekil 2C).

DEG'lerin fonksiyonel zenginleştirme analizi
GO zenginleştirme analizi, kanal aktivitesiyle ilgili terimleri tespit etti; bunlar arasında pasif transmembran taşıyıcı aktivitesi, iyon kanalı aktivitesi, kapılı kanal aktivitesi ve substrata özgü kanal aktivitesi (ham P < 0.05; Tablo 3). KEGG yol analizi, insülin salgısını, cAMP sinyal yolunu, nükleotid eksizyon onarımını, TNF sinyal yolunu ve glutatyon metabolizmasını en zengin yollar olarak belirledi (ham P < 0.05; Şekil 3C ve Tablo 4).

En üst DEG'lerin qRT-PCR ile doğrulanması
En üst beş aşağı regülasyona sahip gen (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 ve BRIP1) ve en üst beş yukarı regülasyona sahip gen (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS ve C12orf68) qRT-PCR ile doğrulandı. Doğrulanan genler ve ilgili mikroarray logFC değerleri Tablo 5'te listelenmiş, qRT-PCR doğrulaması Şekil 4'te gösterilmiş, ham CT değerleri ise Ek Tablo S1'de sunulmuştur. qRT-PCR katlama değişiklikleri, tüm on gen için mikroarray verileriyle yönsel olarak tutarlıydı (Mann-Whitney U testinde tüm P < 0.05). Mikroarray logFC ile qRT-PCR logFC arasındaki Pearson korelasyonu r = 0.89 (%95 GA: 0.66–0.97, P = 0.0004) idi, bu da güçlü bir uyumu gösterir. SUCNR1 ve GPR37L1 ifade farklılıkları da doğrulandı (Şekil 5A,B).

PPI ağ analizi
Tüm DEG'lerden (etkileşim puanı > 0.9; Şekil 6A). Bağlantı derecesine göre en iyi on hub proteini RTP5 (derece = 14), CXCL1 (derece = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (derece = 7) ve ATM (derece = 5) idi (Şekil 6B ve Tablo 6). Ana merkez genlerinden oluşan bir alt ağı, varsayılan parametrelere sahip bir alt ağ çıkarma eklentisi kullanılarak çıkarıldı. Alt ağ çıkarma algoritması, RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 ve SUCNR1 içeren yoğun bağlantılı bir küme tanımladı ve küme puanı 6.2'dir. ATM, çekirdek küme ile daha düşük bağlantıya sahip olduğu için alt ağa dahil edilmemiştir (Şekil 6C).

Sözel hafıza ile SUCNR1/GPR37L1 arasındaki ilişki
Şizofreni hastalarında sağlıklı kontrol gruplarına kıyasla SUCNR1 ifadesi anlamlı şekilde yükselmiş, GPR37L1 ise azalmıştı (Şekil 5A,B). SUCNR1 ifadesi sözel hafıza puanlarıyla negatif bir korelasyon gösterdi (r = -0.54, %95 CI: -0.79 ila -0.13, R² = 0.287, P = 0.015; Şekil 5C), oysa GPR37L1 ifadede sözel hafıza puanlarıyla pozitif bir korelasyon gösterildi (r = 0.59, %95 GÜ: 0.20 ila 0.82, R² = 0.349, P = 0.0034; Şekil 5D). 10 şizofreni hastası ve 10 sağlıklı kontrol kontrol ünitesi dahil olmak üzere 20 denek üzerinde korelasyon analizleri yapıldı. 20 kişilik örneklem büyüklüğüyle, çalışmanın %80 gücüne sahip olduğu gibi, |r| > 0.6 α = 0.05. Mütevazı örneklem büyüklüğü göz önüne alındığında, bu korelasyonel bulgular ön plandadır ve daha büyük bağımsız kohortlarda doğrulama gerektirir.

Veri Erişilebilirlik Beyanı
Bu çalışmada analiz edilen GSE54913 veri seti, Gene Expression Omnibus tarafından kamuya açık olarak erişilebilir. Ham qRT-PCR Ct değerleri Ek Tablo S1'de sağlanmıştır. Analiz betikleri, DEG çıkış dosyaları, zenginleştirme sonuçları, PPI ağ dosyaları ve şekil kaynak dosyaları https://sandbox.zenodo'de mevcuttur.org/records/514960 veya 10.5072/zenodo.514960.

Şekil 1: Akış diyagramı: veri toplama, ön işleme, analiz ve doğrulama. GSE54913'dan elde edilen PBMC'ler üzerinde mRNA mikroarray analizleri. DEG'lerde GO fonksiyonel ve yol zenginleştirme analizleri yapıldı. Kıvrım değişikliğine göre sıralanan en iyi 10 gen, mikroarray verilerinin qRT-PCR kullanılarak doğrulanması için seçildi. PPI ağ analizi iki hub geni tespit etti. Son olarak, SUCNR1 ve GPR37L1 adlı iki hub geninin ex vivo analizi yapıldı. Kısaltmalar: DEGs = farklı şekilde ifade edilen genler; mRNA = haberci RNA; PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreler; qRT-PCR = nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; PPI = protein–protein etkileşimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DEG seçimi ve hiyerarşik kümeleme analizi. (A) DEG'lerin volkan karsayı. Yatay eksen log₂ (katlama değişimi), dikey eksen ise –log₁₀(P değeri) değerini temsil eder. Yeşil ve kırmızı noktalar farklı şekilde ifade edilen genleri, siyah noktalar ise farklı olarak ifade edilmeyen genleri temsil eder. (B) Aşağı ve yukarı düzenlenen DEG'lerin sayıları. (C) Farklı şekilde ifade edilen genlerin ısı haritası. Kırmızı yukarı düzenlemeyi, yeşil ise aşağı düzenlemeyi gösterir. Kısaltma: DEGs = farklı şekilde ifade edilen genler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: DEG'lerin GO ve KEGG zenginleştirme analizleri. (A,B) GO zenginleştirme ve (C) KEGG zenginleştirme ham P-değerlerine dayanarak gösterilmiştir. Kısaltmalar: DEGs = farklı şekilde ifade edilen genler; GO = Gen Ontolojisi; KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; BP = biyolojik süreç; CC = hücresel bileşen; MF = moleküler fonksiyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: qRT-PCR kullanarak en çok düzensiz olan on gen için mikroarray verilerinin doğrulanması. (A) En üst beş dereceyi aşağıya düşürdü. (B) En üst beş dereceyi yükseltti. Veri, ortalama ± ortalama standart hatasıdır. P değerleri ilgili panellerde gösterilmiştir. Kısaltmalar: DEGs = farklı şekilde ifade edilen genler; qRT-PCR = nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Şizofreni hastalarında ve sağlıklı kontrol gruplarında SUCNR1 ve GPR37L1 ekspresyonu. (A) SUCNR1 ve (B) GPR37L1 ekspresyonu qRT-PCR ile belirlenmiştir. Sözel hafıza ile (C) SUCNR1 ve (D) GPR37L1 ifadesi arasındaki korelasyon. Veriler, ortalama ± ortalama standart hata olarak gösterilir, eğer uygulanırsa. Korelasyonlar için P değerleri ilgili panellerde gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Protein-protein etkileşim ağı analizi. (A) Protein-protein etkileşim veritabanı kullanılarak analiz edilen PPI ağı. (B) PPI ağındaki ilişki derecesine göre sıralanmış proteinler. (C) Alt ağ çıkarma analizinden sonra ağ görselleştirme yazılımı kullanılarak görselleştirilen alt ağ. Kısaltma: PPI = protein-protein etkileşimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Değişken	Kontrol denekleri (n = 10)	Şizofreni hastaları (n = 10)
Yaş (yıl)	36.5 ± 10.6	44.5 ± 9.5
Kadın cinsiyet, n (%)	5 (50)	5 (50)
Günlük uyku süresi (s)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Vücut kütle indeksi (BMI; kg/m²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
Sözlü hafıza puanı	61 ± 18	30.2 ± 10.8
Veriler ortalama ± standart sapma veya sayı (%) olarak sunulur.

Tablo 1: Şizofreni hastalarının ve kontrol deneklerinin başlangıç özellikleri.

Gen sembolü	İleri primer dizisi (5'→3')	Ters primer dizisi (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGAT	CCTCCCACTGGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGGGGAAG	AATATTTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCTCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
DÖNEMLER	AGTCTATTATTTCGGGCACC	CCTTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAAGTCAG
β-Aktin	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu.

Tablo 2: qRT-PCR için PCR primerleri.

GO ID	Terim	Ham P-değeri	Kont
GIT:0015267	Kanal Aktivitesi	0.000000056	13
GIT:0022803	Pasif transmembran taşıyıcı aktivitesi	5.78E-08	13
GIT:0005216	İyon kanalı aktivitesi	0.000000127	12
GIT:0022839	İyon kapılı kanal aktivitesi	0.000000131	11
DEVAM ET:0022836	Kapılı kanal aktivitesi	0.000000136	11
DEVAM ET:0022838	Substrata özgü kanal aktivitesi	0.00000017	12
GIT:0005261	Katyon kanalı aktivitesi	0.00000668	9
GIT:0015276	Ligand-kaplı iyon kanalı aktivitesi	0.000315	5
DEVAM ET:0022834	ligand-kapılı kanal aktivitesi	0.000315	20
GIT:0022890	İnorganik katyon transmembran taşıyıcı aktivitesi	0.000487	20
DEVAM ET:0008324	Katyon transmembran taşıyıcı aktivitesi	0.0009	18
GIT:0099094	ligand-kapılı katyon kanalı aktivitesi	0.00128	16
GIT:0005244	Voltaj kapılı iyon kanalı aktivitesi	0.001382	16
GIT:0022832	Voltaj kapılı kanal aktivitesi	0.001382	18
GIT:0046873	Metal ion transmembran taşıyıcı aktivitesi	0.001836	21
GIT:0022824	Verici-kapılı iyon kanalı aktivitesi	0.002762	19
GO:0022835	Verici kapılı kanal aktivitesi	0.002762	13
Not: P-değerleri ham ve ayarlanmamıştır; anlamlılık ham P < 0.05 olarak tanımlandı.

Tablo 3: Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin gen ontolojisi analizi (ham P < 0.05).

ID	Tanım	Ham P-değeri	Kont
hsa04911	İnsülin salgılanması	0.007066	6
HSA04024	cAMP sinyal yolu	0.010661	10
hsa03420	Nukleotid eksizyon onarımı	0.013724	4
hsa04668	TNF sinyal yolu	0.023694	6
HSA00480	Glutatyon metabolizması	0.02466	4
hsa04740	Koku transdüksiyonu	0.032104	15
hsa05222	Küçük hücreli akciğer kanseri	0.03572	5
hsa00590	Araşidonik asit metabolizması	0.035991	4
hsa04080	Nöroaktif ligand-reseptör etkileşimi	0.037546	12
hsa05031	Amfetamin bağımlılığı	0.045653	4
hsa05203	Viral karsinogenez	0.046404	8
hsa04933	Diyabet komplikasyonlarında YAŞ-ÖFKE sinyal yolu	0.04831	5
Not: P-değerleri ham ve ayarlanmamıştır; anlamlılık ham P < 0.05 olarak tanımlandı.

Tablo 4: Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi, genlerin zenginleştirme analizi (ham P < 0.05).

Gen sembolü	Resmi tam adı	logFC	Ham P-değeri
Aşağı Düzenlemeler
HCN3	Hiperpolarizasyonla aktive edilmiş siklik nükleotid-kaplı kanal 3	-1.489	0.0001
OLFML2A	Olfactomedin benzeri protein 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH oksidaz 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Mas ile ilişkili G-protein bağlı reseptör üyesi X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Fanconi anemi grubu J proteini	-1.699	0.0018
Düzenleme Yükseği
CCL22	C-C motifi kemokin 22	2.517	0.0041
PNMA2	Paraneoplastik Ma antijenleri	2.159	0.0062
TBX20	T-box transkripsiyon faktörü TBX20	1.866	0.0001
DÖNEMLER	GTPase Dönemleri	1.846	0.0008
C12orf68	184 içeren sarmal bobin alanı	1.839	0.0002
Not: logFC ve ham P-değerleri mikroarray diferansiyel ifade analizinden alınmıştır.

Tablo 5: Yukarı ve aşağı regülasyona sahip genlerde katlama değişimine göre sıralanan ilk on DEG.

Gen sembolü	Tanım	Ortak genler (n)	P-değeri
RTP5	Reseptör taşıyıcı protein 5	14	0.000276
CXCL1	Büyüme ile düzenlenmiş alfa protein 1	8	0.011423
CXCL10	C-X-C motifi kemokin 10	7	0.046144
GPR37L1	Prosaposin reseptörü GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Hidroksikarboksilik asit reseptörü 1	7	0.046572
OPRL1	Nosiseptin reseptörü 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Somatostatin reseptörü tip 4	7	0.006742
SUCNR1	Süksinat reseptör 1	7	0.000105
ATM	Serin-protein kinaz ATM	5	0.004961
PPI: protein-protein etkileşimi; DEG'ler: Farklı şekilde eksprese edilen genler.

Tablo 6: DEG'ler için PPI ağında tanımlanan ilk 10 hub geni.

Ek Tablo 1: Ham qRT-PCR CT Değerleri, Tam Biyoinformatik Analiz İş Akışı ve İşlenen Sonuçlar (DEG, GO/KEGG ve PPI) Çalışmanın İçin Lütfen buraya tıklayın ve bu dosyayı indirin.

Tartışma

Şizofreni, çok sayıda genetik duyarlılık faktörünü içeren şiddetli, çok faktörlü bir^{hastalıktır 13,14}. Patofizyolojisinin anlaşılmasında ilerleme kaydedilmiş olsa da, güvenilir tanısal biyobelirteçler hâlâ eksiktir. Bu çalışmada, entegre bir biyoinformatik yaklaşım, şizofreni hastalarından alınan kan örneklerinde 473 DERECE tespit edilmiştir. GO ve KEGG analizleri, insülin salgılanması, cAMP sinyalizasyonu, nukleotid eksizyon onarımı, TNF sinyalizasyonu ve glutatyon metabolizması gibi kanal aktivitesiyle ilgili terimler ve yollarda zenginleşmeyi öne çıkardı. PPI ağ analizi SUCNR1 ve GPR37L1'yi merkez genler olarak ayrıca tanımladı ve bunların ifade edilmesi sözlü hafıza performansıyla ilişkilendirildi; bu da şizofreniyle ilişkili moleküler belirteçler olarak potansiyel önemlerini gösterdi.

"Kanal aktivitesi" GO terimlerinin zenginleştirilmesi, önceki şizofreni araştırmalarıyla örtüşmektedir. Voltaj kapılı kalsiyum kanalları (örneğin, CACNA1C, CACNB2) ve potasyum kanalları (ör. Kv3, Kv2.1) şizofreniye yatkınlık ve nöronal uyarılma 15,16 ile ilişkilendirilmiştir. Benzer şekilde, belirlenen en üst KEGG yolları mevcut literatürle tutarlıdır. Erken şizofrenide hiperinsülinimemi ve insülin salgısı anormallikleri rapor^{edilmiştir 17}. cAMP sinyal yolu giderek hastalık patofizyolojisi¹⁸ ile ilişkilendirilmektedir. Histon varyantı H2AX modifikasyonu dahil olmak üzere nükleotid eksizyon onarım mekanizmaları da rol^oynayabilir 19,20,21,22. Ayrıca, TNF sinyalizasyonu ve glutatyon metabolizması şizofreni patogenezi^{ile ilişkilendirilmiştir 23,24}.

Sözlü hafıza bozukluğu, şizofrenide temel bir bilişsel eksikliktir, hastalığın başlangıcında bulunur ve fonksiyonel sonuçlarla ilişkilidir. Hopkins Sözel Öğrenme Testi–Revize (HVLT-R), sözel öğrenme ve hafızanın iyi doğrulanmış bir ölçüsüdür. Aday belirteç ifadesi ile sözlü hafıza performansı arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi, şizofrenide engelliliğin başlıca belirleyicisi olduğundan, bilişsel bozukluk klinik önemi belirlemeye yardımcı olur.

qRT-PCR ile doğrulanan ilk on DEG, mikroarray verileriyle eşleşse de, birincil GO/KEGG bulgularıyla yakından örtüşmemiştir. Buna karşılık, SUCNR1 (yukarı regülasyonlu) ve GPR37L1 (aşağı regülasyonlu) "iyon kanalı aktivitesi" ile anlamlı ilişkilendirilmiş ve "insülin salgılanması" açısından zenginleştirilmiştir. Her iki gen de antipsikotiklerin kritik hedefleri olan ve iyon kanalı^{aktivitesini modüle eden G protein-bağlı reseptörleri (GPCR) kodlar.}

SUCNR1 (GPR91), metabolik stresi insülin salgısı ve dirençle^{ilişkilendirir 26,27} ve insülin direnci şizofreni için bilinen bir risk^{faktörüdür 28}. GPR37L1, beyinde yüksek şekilde ekspresyona sahip yetim bir reseptör olup, serebellar gelişim ve motor^{fonksiyon 29'da} rol oynar ve Parkinson hastalığı³⁰ ile böbrek sodyum^{taşımasında (31}) rol oynamaktadır. Şizofrenideki rolü, iyon kanalı aktivitesinin modülasyonunu içerebilir.

Sözlü hafıza bozukluğu, şizofreninin temel bir özelliğidir ve genetik sorumluluk ile hastalığın şiddetini^{yansıtır 32,33}. SUCNR1 ifadesinin ters korelasyonu ile GPR37L1 ifadesinin sözlü hafıza puanlarıyla pozitif korelasyonu, şizofreni için potansiyel önemini daha da desteklemektedir.

Birkaç sınırlama kabul edilmelidir. Birincisi, doğrulama kohortu için örneklem büyüklüğü (n = 10 grup başında) küçüktü ve bu da istatistiksel gücü ve genellenebilirliği sınırlar. İkinci olarak, tüm şizofreni hastaları antipsikotik ilaç alıyordu, bu nedenle gözlemlenen ifade değişiklikleri hastalık patolojisinden ziyade ilaç etkilerini yansıtabilir. Gelecekteki çalışmalar, ilaçtan naif olan ilk epizod hastalarını içermelidir. Üçüncüsü, doğrulama kohortu RNA-seq onayından yoksundu; Daha büyük bağımsız gruplarda transkriptom çapında dizileme gereklidir. Dördüncüsü, kesitsel tasarım, biyobelirteç seviyeleri ile hastalık ilerlemesi arasındaki nedensel ilişkilerin değerlendirilmesini engeller. Beşincisi, sözlü hafıza ile yapılan korelasyon analizleri keşif niteliğindeydi ve tekrarlama gerektiriyordu. Altıncı olarak, GSE54913 veri seti, RNA-dizisinden daha düşük hassasiyete sahip bir mikroarray platformunda oluşturuldu. Gelecekteki yönler arasında, hastalık ve tedavi sürecinde SUCNR1 ve GPR37L1 seviyelerini takip etmek için uzunlamasına çalışmalar, bu GPCR'lerin şizofreni patofizyolojisindeki mekanik rollerini aydınlatmak için fonksiyonel çalışmalar ve bu biyobelirteçler için klinik olarak doğrulanmış bir testin geliştirilmesi yer almaktadır.

Özetle, bu entegre analiz değişen SUCNR1 ve GPR37L1 ifadesinin şizofreni ve sözsel hafıza performansıyla ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu genler, şizofreniyle ilişkili moleküler belirteçleri temsil edebilir. Ancak, sınırlamalar arasında nispeten küçük bir örneklem büyüklüğü ve şizofreninin şiddetinin sözlü hafıza yoluyla kısmi değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu bulguları doğrulamak için daha fazla çalışma gerekmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction