Araştırma makalesi

Diyabetik Ayak Enfeksiyonlarından Staphylococcus aureus'ta Virulans Genlerinin Temsilci Hedefli Moleküler ve Genomik Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/71373

⸱

29 Mayıs 2026

 ,  , 
1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, diyabetik ayak enfeksiyonlarından kurtarılan Staphylococcus aureus izolelerinin antimikrobiyal direnç, virülans belirleyicileri ve genomik özellikleri için antimikrobiyal hassasiyet testi, PCR tabanlı virülans profili ve tüm genom dizileme yöntemleriyle karakterize edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik ayak enfeksiyonları (DFI'lar) önemli bir halk sağlığı sorunu oluşturur ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) en klinik açıdan önemli patojenlerden biridir. Bu çalışma, DFI hastalarından elde edilen çok ilaçlı dirençli S. aureus izolatlarının virülans genlerinin (can ve hlg) yaygınlığını, antimikrobiyal direnç profillerini ve temsil eden genomik özelliklerini inceledi. Ocak ile Aralık 2024 arasında diyabetik ayak enfeksiyonu olan 125 hasta üzerinde kesitsel bir gözlemsel çalışma yapıldı. Antimikrobiyal duyarlılık testi, Kirby–Bauer disk difüzyon yöntemi ve Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) yönergelerine göre sefokositin taraması kullanılarak gerçekleştirildi; kalite kontrol suşu olarak S. aureus ATCC 25923 kullanıldı. Vancomycin hassasiyeti minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) testiyle doğrulandı. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), virülans genlerini (can ve hlg) ve blaOXA-grup I genlerini tespit etmek için kullanıldı. Tam genom dizileme (WGS), bir çok ilaçta dirençli (MDR) izolat ve bir yaygın şekilde ilaç dirençli (XDR) izolat dahil olmak üzere iki temsilci izolat üzerinde gerçekleştirildi; ayrıca de novo dizileme yöntemiyle taslak genom montajları oluşturuldu. 125 klinik örnek arasında, bakteriyel büyüme 90 örnekte (%72) gözlemlendi ve bunların 45'i (%50) S. aureus olarak tanımlandı. Bu izolatlar arasında 35/45 (%77,78) MRSA olarak sınıflandırılmış, %36/45'i (%80) ise çok ilaç dirençliydi. Tüm izolatlarda hlg geni tespit edildiken, can geni 13/45 (%28,89) izolasyonda tespit edildi. BlaOXA-grup I geni tespit edilmedi. Genomik analiz, blaZ, tet(38), norA ve vanT dahil olmak üzere birden fazla dirençle ilişkili gen, CRISPR-Cas elementleri ve plazmidle ilişkili direnç belirleyicileri ile birlikte tespit edilmiştir. Bu bulgular, DFI'larda çok ilaca dirençli S. aureus'un yüksek yaygınlığını vurgulamakta ve klinik olarak önemli dirençli suşların genomik gözetiminin devam etmesinin önemini desteklemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok kolonizasyon ve virülans özellikleri, gram-pozitif bakteri Staphylococcus aureus (S. aureus) yaygın bir fırsatçı patojene dönüştürür; impetigo, yara enfeksiyonları, furunküller, deri apseleri, bakterisemi ve enfektif endokardit1 gibi geniş bir enfeksiyon yelpazesine neden olabilir. Bu enfeksiyonların bazıları ağır hastalığa ilerleyerek hastaneye yatış gerektirebilir; özellikle diyabet, immünosupresyon, malignite, idrar kateterizasyonu veya insan bağışıklık yetmezliği virüsüenfeksiyonu olan hastalarda 1.

Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) suşları, antimikrobiyal direnç belirleyicileri hızla edinebilme ve sağlık ortamlarında devam edebilme yetenekleri nedeniyle önemli hastalık ve ölümlülükleilişkilidir 1. Diyabet hastalarında nöropati, damar yetmezliği ve bağışıklık yanıtlarının bozulması nedeniyle sıklıkla diyabetik ayak ülserlerigelişir 2. Diyabetik ayak enfeksiyonları (DFI) karmaşık bir patofizyolojiye sahiptir ve klinik sonuçlar hem mikrobiyal hem de konak kaynaklı faktörlerden, bakteriyelvirülans 3 dahil olmak üzere, etkilenir. Diyabetik ayak ülserleri aerobik ve anaerobik bakteri ile mantarlardan oluşan polimikrobiyal topluluklar içerebilirken, S. aureus bu enfeksiyonlardan izole edilen baskın patojenlerden biri olmayadevam eder 4. Organizma, bağışıklık kaçışını, doku istilasını, kronik kolonizasyonu ve kalıcı enfeksiyonu kolaylaştıran çeşitli virülans belirleyicilerine sahiptir. Ayrıca, mecA/SCCmec aracılı metisicillin direnci ve diğer antimikrobiyal direnç belirleyicilerinin edinimi, DFI ile ilişkili enfeksiyonlar için terapötik seçenekleri önemli ölçüdesınırlamıştır 4,5. Önceki çalışmalar, diyabetik ayak enfeksiyonlarında çok ilaçlı dirençli (MDR) S. aureus izolelerinin yüksek yaygınlığını bildirmiş; direnç genellikle blaTEM, blaOXA ve blaCTX-M varyantları gibi β-laktamaz genleriyle ilişkilidir.

Birçok virülansla ilişkili gen, kronik yara enfeksiyonlarında S. aureus'un patogenliği ve kalıcılığına katkıda bulunur. Bunlar arasında, hlg geni, doku yok oluşu, iltihaplanma, bağışıklık kaçışı ve topluluktan alınanMRSA suşları 7,8'in davamlılığı ile ilişkili sitotoksik bir faktör olan γ-hemolizini kodlar. Can geni, kolajen açısından zengin dokulara bakteriyel yapışmayı kolaylaştıran ve kronik kolonizasyon ile enfeksiyon kalıcılığına katkıda bulunan kolajen bağlayan bir adezinikodlar. 8. Önceki araştırmalar, diyabetik ayak enfeksiyonlarından iyileşen MRSA izolatları arasında yüksek bir HL yaygınlığını tespit etmiş ve bu enfeksiyonlarda virülans ile antimikrobiyal direnç belirleyicilerinin birlikte ortaya çıktığınıvurgulamıştır 9. Uygunsuz antibiyotik maruziyeti, uzun süreli hastane yatışı, antimikrobiyal ajanların doku penetrasyonunun bozulması ve kronik yara ilerlemesi, DFI'li hastalarda MDR organizmalarının ortaya çıkmasına ve yayılmasına katkıdabulunur 10. Uluslararası tanımlara göre, çoklu ilaç dirençli (MDR) bakteriler üç veya daha fazla antimikrobiyal sınıfta en az bir antimikrobiyal ajana direnç gösterir, yaygın şekilde ilaç dirençli (XDR) bakteriler ise yalnızca bir veya iki antimikrobiyal sınıfa karşı duyarlıdır ve pandrug-resistant (PDR) bakteriler tüm test edilen antimikrobiyalsınıflara dirençlidir 10. S. aureus'un diyabetik ayak enfeksiyonlarında kabul edilen klinik önemine rağmen, bu bölgeden alınan klinik izolasyonlarda virülans belirleyicileri antimikrobiyal direnç profilleriyle ilişkilendiren entegre moleküler ve genomik bilgiler sınırlı kalır.

Bu nedenle, bu çalışma antimikrobiyal direnç desenlerini karakterize etmeyi, seçilmiş virulans genlerinin (hlg ve can) yaygınlığını belirlemeyi, blaOXA-grup I genlerinin oluşmasını araştırmayı ve diyabetik ayak enfeksiyonu hastalarından kurtarılan seçilmiş çok ilaca dirençli S. aureus izolelerinin temsili tüm genom dizilimi analizini yapmayı amaçladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hastaları İncelin

Bu çalışma, 24 Aralık 2023'te Anbar Üniversitesi, Irak Yüksek Eğitim ve Bilimsel Araştırma Bakanlığı Etik Onay Komitesi (Onay No. 145), Ramadi Şehri, Anbar Valiliği, Irak, tarafından onaylandı. İnsan katılımcıları içeren tüm işlemler, Anbar Üniversitesi'nin kurumsal etik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Kayıt öncesinde tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

Ocak-Aralık 2024 tarihleri arasında Irak'ın Anbar Valiliği'ndeki Ramadi Eğitim Hastaneleri ve bağlı özel kliniklerde kesitsel bir gözlemsel çalışma gerçekleştirildi. Çalışma döneminde toplamda diyabetik ayak enfeksiyonu (DFI) ile ardışık 125 uygun hasta kayıt altına alındı. Örneklem büyüklüğü, çalışma döneminde uygun hasta sayısına göre belirlendi, istatistiksel hesaplamayla değil. Klinik olarak, DFI, tip 1 diyabet hastalarında (T1DM) veya tip 2 diyabet (T2DM) hastalarında herhangi bir derecede ayak ülserinin varlığı olarak tanımlanmıştır. Farklı ülser şiddetlerine sahip erkek ve kadın hastalar dahil edildi.

Hastalar, klinik olarak teşhis edilmiş diyabetik ayak ülseri varsa, katılımcı sağlık kuruluşlarına gitmiş ve bilgilendirilmiş onay vermiş olurlarsa, uygun olurlardı. Dışlama kriterleri arasında diyabet mellitusla ilgisi olmayan ayak ülserleri (örneğin, travmatik ülserler), diğer sağlık kuruluşlarından yönlendirme, kritik hastalık nedeniyle bilgilendirilmiş onay verememe, örnek alınmadan 48 saat önce antibiyotik tedavisi alınması ve polimikrobiyal enfeksiyonlar yer alıyordu. Polimikrobiyal enfeksiyonlu hastalar, Staphylococcus aureus izolatlarının doğru fenotipik, moleküler ve genomik karakterizasyonunu sağlamak için dışlandı. Yaş, cinsiyet, diyabet komplikasyonları, diyabet süresi, antibiyotik öyküsü ve eş zamanlı durumlar dahil olmak üzere demografik ve klinik veriler, yapılandırılmış bir anket kullanılarak toplanmıştır.

Klinik örnekler, toplandıktan sonra 2 saat içinde soğutucu koşullarda (4 °C) Amies ortamı içeren steril taşıma sürüntleriyle mikrobiyoloji laboratuvarına taşındı ve hemen mikrobiyolojik analiz için işlendi. Klinik örnekler, bakteriyel kültürler, antimikrobiyal duyarlılık testi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve ultraviyole (UV) görselleştirme içeren tüm işlemler, kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) laboratuvar koşullarında gerçekleştirilmiştir. Laboratuvar personeli, gerektiğinde laboratuvar önlükleri, tek kullanımlık eldivenler, cerrahi maskeler ve göz koruması gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) kullandı. Tüm mikrobiyolojik ve moleküler prosedürlerde kontaminasyon ve maruziyet risklerini en aza indirmek için sıkı aseptik prosedürler uygulandı. Çapraz kontaminasyonu önlemek için bakteri kültürünün işlenilmesi ve DNA amplifikasyon prosedürleri için özel çalışma alanları kullanıldı. Kültür plakaları, sürüntüler, pipet uçları ve tek kullanımlık maddeler dahil kirlenmiş maddeler, bertaraf edilmeden önce 121 °C ve 15 psi sıcaklıkta 15–20 dakika boyunca otoklavlanmıştır. Keskin silahlar, deliklere dayanıklı biyolojik tehlike kaplarında atıldı. Biyolojik atık, kurumsal biyomedikal atık bertaraf protokollerine göre yönetildi. Bu biyogüvenlik önlemleri, MRSA ve vankomisin dirençli izolasyonlar dahil olmak üzere çok ilaçlı dirençli organizmaların güvenli şekilde ele alınmasını sağlamıştır (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1: Çalışmada kullanılan klinik, mikrobiyolojik, moleküler, tam genom dizileme ve biyoinformatik iş akışının genel bakışı. Şekil, örnek toplama, mikrobiyolojik kültür, antimikrobiyal duyarlılık testi, PCR tabanlı moleküler tespit, tüm genom dizileme ve sonraki biyoinformatik analizleri özetlemektedir. Bu rakam, yapay zeka tabanlı tasarım platformu Gamma Pro'nun (Gamma Uygulaması) desteğiyle oluşturulmuş ve daha sonra yazarlar tarafından bilimsel doğruluk açısından incelenmiş, revize edilmiş ve doğrulanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Veriler SPSS yazılım sürümü 22.0 kullanılarak analiz edildi. Ortalama ve yüzdeler dahil olmak üzere tanımlayıcı istatistikler hesaplandı. Kategorik değişkenler arasındaki ilişkiler ki-kare testi kullanılarak analiz edildi. <0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

2. Örneklerin işlenmesi ve toplanması

Diyabetik ayak ülserlerinin derin kısmından derin sürüntü tekniği kullanılarak örnekler toplandı. İki steril pamuk çubuk, steril bir stortu ile debridasyon ve steril tuzlu suyla temizlendikten sonra yara tabanı üzerinde sıkıca döndürüldü; böylece mikroorganizmaların kolonileştirmesiyle kontaminasyonu en aza indirdi. Bir sürüntü gram boyama için, ikinci sürüntü ise mikrobiyolojik kültür için kullanıldı. Doğrudan gram boyalı smearlar mikroskobik olarak incelendi.

Kemik dokusu örnekleri, cerrahi debridman sonrası steril koşullarda klinik olarak şüpheli osteomiyelit hastalarından alındı. Numune toplamadan önce, ülser yüzeyleri yüzeysel kontaminasyonu azaltmak için steril normal salin ile temizlendi. Kemik dokusu örnekleri steril cerrahi aletlerle aseptik olarak toplandı ve mikrobiyolojik işlem için hemen steril kaplara aktarıldı.

Örnekler steril koşullarda homojenize edildi veya ince kıyma yapılarak kan agar, Mannitol Tuz Agar (MSA), MacConkey agar ve besin agara aşılandı. Plakalar 37 °C'de 18–24 saat boyunca aerobik olarak kuluçka edildi. Kan agarı ve besin agar, gram-pozitif ve gram-negatif organizmaların büyümesini desteklerken, MSA, S. aureus dahil olmak üzere Staphylococcus türlerinin seçici izolasyonu ve farklılaşması için kullanılmıştır. MacConkey agari, gram-negatif bakterilerin iyileşmesi için kullanıldı. Kultura plakaları kuluçkadan sonra incelendi ve 48 saat sonra görünür büyüme olmayan örneklerde "büyüme yok" olarak bildirildi.

Ön bakteri tanımlaması koloni morfolojisi, gram boyama ve biyokimyasal özelliklere dayandı, ardından S. aureus'un PCR geninin amplifikasyonu kullanılarak moleküler doğrulanması yapıldı. Biyokimyasal tanımlama, katalaz testi, kaydırak ve tüp koagülaz testleri, mannitol fermantasyonu ve DNaz testini içeriyordu. Doğrulanmış izolasyonlar, VITEK 2 Compact sistemi ve VITEK 2 GP kimlik kartı kullanılarak ayrıca tanımlandı. Tanımlama sonuçları ancak güven seviyesi %≥95 olduğunda kabul edilmiştir. Uyumsuz veya düşük güvenli sonuçlar, tekrar edilen biyokimyasal analiz ve tekrarlayan VITEK testi kullanılarak yeniden test edildi. Saf izolatlar, sonraki moleküler ve genomik analizler için beyin kalp infüzyonu (BHI) çorbasında hazırlanan %20 gliserolde korundu (Şekil 1).

3. Antimikrobiyal duyarlılık testi

Antimikrobiyal duyarlılık testi, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) 2022 yönergelerine uygun olarak Kirby–Bauer disk difüzyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Testler, 4 mm standart agar derinliğinde Mueller–Hinton agarında gerçekleştirilmiştir. Taze bakteriyel kültürler, aşılamadan önce densitometre kullanılarak 0,5 McFarland standardına ayarlandı. Agar yüzeylerinin eşit şekilde aşılanması için steril sürüntüler kullanıldı.

Aşağıdaki antimikrobiyal diskler kullanıldı: ampisilin (10 μg), gentamisin (10 μg), amikasin (30 μg), sefoxitin (30 μg), sefuroksim (30 μg), piperasilin/tazobaktam (100/10 μg), meropenem (10 μg), amoksisilin–klavulanik asit (30 μg), oksasilin (1 μg), levofloksasin (5 μg), klindamisin (2 μg), tigesiklin (15 μg), siprofloksasin (5 μg), eritromisin (15 μg), trimethoprim–sülfametoksazol (25 μg), linezolid (30 μg), ve vankomisin (30 μg). Plakalar 37 °C'de 16–18 saat boyunca aerobik olarak inkubasyon edildi. Bölge çapları CLSI kırılma noktalarına göre yorumlanmıştır.

CLSI önerilerine göre metisilin-dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), sefoxitin (30 μg) taraması kullanılarak tespit edilmiştir. Kalite kontrol testi S. aureus ATCC 25923 kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm deneyler tekrarlanabilirliği sağlamak için ikili kez gerçekleştirildi. Çok ilaçlı dirençli (MDR), yaygın şekilde ilaç dirençli (XDR) ve pandrug-resistant (PDR) izoleler, antimikrobiyal direnç profillerine dayalı uluslararası standart tanımlara göre sınıflandırılmıştır (Şekil 1).

4. Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) Tespiti

MRSA tespiti için fenotipik yöntem olarak bir sefoxitin (30 μg) disk difüzyon testi kullanıldı. ≥22 mm inhibisyon bölgesine sahip izolatlar metisiline duyarlı S. aureus (MSSA) olarak sınıflandırılırken, inhibisyon bölgesi ≤21 mm olan izolatlar CLSI kriterlerine göre MRSA olarak sınıflandırılmıştır (Şekil 1).

5 Minimum Inhibitör Konsantrasyon (MIC) Testi ile Vancomycin Direncinin Belirlenmesi

Vancomycin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIC), CLSIyönergelerine 11 göre et suyu mikro seyreltme yöntemiyle belirlendi. Mueller–Hinton çorbasında vankomisinin seri iki katlı seyreltmeleri (4–512 μg/mL) hazırlandı. Bakteriyel süspansiyonlar 0.5 McFarland standardına ayarlandı ve yaklaşık 1 × 105 CFU/mL'ye seyreltildi.

37 °C'de 24 saat kuluçka sonrası, MIC, görünür bakteri büyümesinin gözlemlenmediği en düşük konsantrasyon olarak tanımlandı. Vancomycin hassasiyeti CLSI kriterlerine göre şu şekilde yorumlandı: hassas (≤2 μg/mL), ara (4–8 μg/mL) ve dirençli (≥16 μg/mL)11,12 (Şekil 1).

6. Moleküler algılama

6.1 DNA çıkarımı

Staphylococcus aureus izoleleri, 37 °C'de 24 saat boyunca beyin kalp infüzyonu (BHI) çorbasında kültürlendi. Bakteriyel genomik DNA, ticari bir kit ve otomatik bir nüklein asit çıkarma sistemi kullanılarak çıkarıldı. Çıkarılan DNA, kullanılana kadar −20 °C'de saklanırdı. DNA konsantrasyonu PCR amplifikasyonu için uygunluk değerlendirilmek amacıyla florometre kullanılarak ölçüldü. Ortalama DNA konsantrasyonu 85 ± 8.2 ng/μL idi.

Can, hlg ve sınıf D β-laktamaz (blaOXA-grup I) genlerini hedefleyen primerler ticari olarak elde edilmiş ve Tablo 113,14,15,16'da listelendiği gibi PCR amplifikasyonu için kullanılmıştır.

Tablo 1: Bu çalışmada incelenen hedef genlerin PCR amplifikasyonu için kullanılan primer dizileri. Tablo, diyabetik ayak enfeksiyonlarından kurtarılan Staphylococcus aureus izolatlarında hedeflenen genleri, primer dizileri, beklenen amplikon boyutları, tavlama sıcaklıkları ve PCR amplifikasyonu için kullanılan referansları özetlemektedir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

6.2 PCR ile virülans ve sınıf D β-Laktamaz (blaOXA-grup I) genlerinin moleküler tespiti

Bu çalışmada kullanılan primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir. MecA, nuc, virülansla ilişkili genler ve sınıf D β-laktamaz (blaOXA-grup I) genlerinin PCR amplifikasyonu, 12,5 μL GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL MgCl2, 3 μL genomik DNA şablonu, 1 μL ileri ve geri primerler (10 pmol/μL) ve 7 μL nukleazsız su içeren 25 μL reaksiyon karışımında gerçekleştirildi.

Termal döngü koşulları, başlangıçta 95 °C'de 5 dakika denatürasyon adımı ve ardından 30–35 amplifikasyon döngüsünden oluşuyordu; bunlar arasında 95 °C'de 30 s–1 dakika denatürasyon, primer setine göre 50–62 °C'de 30 s–1 dakika boyunca tavlama ve 72 °C'de 30 s–1 dakika uzatma dahildir. Son uzatma işlemi 72 °C'de 7–19 dakika boyunca gerçekleştirildi.

Amplifikasyonlu PCR ürünleri, %1,5–%2 agaroz jellerinde Safe Red ile boyanmış ve ultraviyole aydınlatma altında jel dokümantasyon sistemi kullanılarak görselleştirilmiştir. Her PCR denemesinde amplifikasyonun geçerliliğini doğrulamak için negatif kontroller dahil edildi.

7. Tam genom dizileme (WGS)

Diyabetik ayak enfeksiyonu hastalarından alınan kemik dokusu örneklerinden elde edilen iki temsilci klinik Staphylococcus aureus izolesi üzerinde tam genom dizileme (WGS) gerçekleştirildi. Seçilen izolasyonlar arasında, fenotipik antimikrobiyal duyarlılık testi ve MIC onaylı direnç profilleriyle tanımlanan bir çok ilaçlı dirençli (MDR) ve kapsamlı şekilde ilaç dirençli (XDR) izolat bulunuyordu. Bu strateji, klinik olarak önemli dirençli izolasyonların temsil eden genomik karakterizasyonunu mümkün kıldı (Şekil 1).

Genomik DNA kalitesi, konsantrasyonu ve bütünlüğü, kütüphane hazırlığı ve sonraki biyoinformatik analiz için uygunluk sağlamak amacıyla dizileme öncesi değerlendirildi. DNA, florometre kullanılarak nicelendirildi ve bütünlük, 150 V'da %1 agaroz jel elektroforezi ile 40 dakika boyunca doğrulandı. Yaklaşık 200–400 bp uzunluğundaki DNA parçaları manyetik boncuk arıtımı ile boyut seçildi, ardından son onarım, 3′ adenilasyon ve adaptör ligasyonu yapıldı.

Tek zincirli dairesel DNA molekülleri, splint oligonukleotitleri kullanılarak adaptör ligasyonlu fragmentlerin amplifikasyonu, saflaştırılması ve daireselleştirilmesi yoluyla üretilmiştir. DNA nanotopları (DNB'ler) daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu yoluyla üretildi. DNBSEQ platformunda dizileme işlemi kombinatoryal Prob-Çapa Sentezi (cPAS) kimyası kullanılarak gerçekleştirildi.

Ham dizileme okumaları, düşük kaliteli okumaları, adaptör kirlemesini, belirsiz okumaları ve tekrarlanan dizileri kaldırmak için kalite kontrol prosedürlerinden geçti. Temiz okumalar sonraki analizler için kullanıldı. Genom montajı, genom boyutu, GC içeriği ve dizileme kapsama derinliğini tahmin etmek için gerçekleştirildi. Nihai taslak genom montajları FASTA, GenBank ve NCBI gönderim formatlarında oluşturuldu.

Genom açıklaması, kodlayan dizileri (CDS), transfer RNA'sını (tRNA), ribozomal RNA (rRNA) ve küçük RNA (sRNA) genlerini tanımladı. Tahmin edilen genlerin fonksiyonel açıklaması, Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB ve CARD dahil olmak üzere birden fazla veri tabanı kullanılarak virülans ve antimikrobiyal dirençle ilişkili genler için gerçekleştirildi.

8. Biyoinformatik analiz

Genom montajı ve notasyonu Bakteriyel ve Viral Biyoinformatik Kaynak Merkezi (BV-BRC) kullanılarak gerçekleştirildi. Filogenetik analizler PATRIC araçları kullanılarak gerçekleştirildi. Kodlama dizilerini, GC içeriğini, GC yağışını, antimikrobiyal direnç belirleyicileri, virulansla ilişkili genleri ve mobil genetik unsurları göstermek için dairesel genom görselleştirme haritaları oluşturuldu.

Filogenetik ilişkiler, Mash/MinHash analiziyle en yakın referans genomlardan tanımlanan PATRIC küresel protein aileleri (PGFams) kullanılarak belirlendi. Protein hizaları MUSCLE kullanılarak oluşturuldu ve ilgili nukleotid hizalamaları protein ailelerine eşlendi. Filogenetik ağaçlar, hızlı önyükleme analiziyle RAxML kullanılarak oluşturulmuştur (Şekil 1).

Genom bileşenleri, antimikrobiyal direnç genlerinin türlerinin doğrulanması ve tespiti için Pathogenwatch kullanılarak ayrıca analiz edildi. Virulansla ilişkili genler ABRicate kullanılarak analiz edildi. PATRIC Genom Annotasyon Servisi, antimikrobiyal direnç genlerini tanımlamak ve fonksiyonel açıklamalar, antimikrobiyal sınıflar ile direnç mekanizmalarını atamak için k-mer tabanlı bir yaklaşım kullandı. Temsil MDR ve metisiline dirençli S. aureus izolatlarının dairesel genom görselleştirmeleri, daha önce tanımlandığı gibioluşturuldu 17. Ek Tablo 1 , genomik analizlerde kullanılan tüm biyoinformatik araçları, yazılım sürümlerini, veritabanlarını ve analitik parametreleri özetler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek işleme ve kültür pozitifliği

Bu çalışmada toplam 125 klinik örnek toplanıp analiz edilmiştir. %90/125 örnekte (%72) bakteriyel büyüme gözlemlendi. Bu kültür pozitif örnekler daha sonra bakteriyel tanımlama ve antimikrobiyal duyarlılık testi için işlendi. Sıklıkla ve yüzdeler dahil olmak üzere tanımlayıcı istatistikler, tüm klinik örnekler ve kültür pozitif örnekler arasında bakal izolatların dağılımı özetlemek için kullanıldı. Bu aşamada...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok ilaçlı dirençli (MDR) mikroorganizmalar tarafından neden olan diyabetik ayak enfeksiyonları (DFI'lar) küresel olarak artmaktadır; zayıf glisemik kontrol ve yetersiz ayak hijyeni, artan hastalık ve ölümoranlarına katkıda bulunmaktadır 18,19,20,21. DFI'lar sıklıkla polimikrobiyal olsa da, Staphylococcus aureus bu enfeksiyonlardan izole edilen baskın ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen bir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.

Yazarlık katkısı:

Shaymaa H. Al-Kubaisy, orijinal taslak el yazmasının kavramsallaştırılması, metodoloji geliştirme, araştırma, biçimsel analiz ve hazırlanmasına katkıda bulundu. Rawaa A. Hussein, orijinal taslak el yazmasının onaylanması, araştırılması ve hazırlanmasına katkıda bulundu. Mushtak T.S. Al-Ouqaili, kavramsallaştırma, denetim, proje yönetimi, araştırma ve el yazması incelemesi ile düzenlemesine katkıda bulundu.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Şekil 1'in üretiminde yapay zeka tabanlı tasarım platformu Gamma Pro'nun (Gamma Uygulaması) kullanıldığını kabul etmektedir. Oluşturulan tüm içerikler, bilimsel doğruluk, tutarlılık ve bütünlük sağlamak için yazarlar tarafından dikkatlice incelendi, düzenlendi ve doğrulandı. Yazarlar, bu makalenin araştırması, yazarlığı ve/veya yayımlanması için herhangi bir maddi destek almadılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Abrikat YazılımıGitHub (T. Seemann)Açık kaynakVirulans gen tespiti
AgaroseInvitrogen, ABD16500-500Jel elektroforezi
Agencourt AMPure XP KitiBeckman CoulterA63881DNA arıtması ve boyut seçimi
Amikacin (30 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0107BAST
Antibiyotik Diskler (Ampisilin 20 ve mikro; g)Oxoid, Birleşik KrallıkCT0003BAntimikrobiyal duyarlılık testi
Kan Agar TabanıOxoid, Birleşik KrallıkCM0055Gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin izolasyonu
Beyin Kalp İnfuzyonu (BHI) SuyuOxoid, Birleşik KrallıkCM1135İzolatların kültürlenmesi ve depolanması
Sefoxitin (30 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0119BMRSA tespiti
Sefuroksim (30 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0026BAST
Siprofloksasin (5 & mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0425BAST
Klindamisin (2 & mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0064BAST
DNBSEQ PlatformuBGI, ÇinÇeşitliTüm genom dizileme
Eritromisin (15 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0020BAST
FastQCSimon Andrews, Babraham Enstitüsü'nde (Babraham Biyoinformatik)NAKuyruk sistemi
Gel Dokümantasyon SistemiBio-Rad, ABDGel Doc™ XR+Elektroforez jellerinin görüntülemesi
Gentamicin (10 ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0024BAST
Gliserol (Moleküler Derece)Sigma-AldrichG5516Uzun süreli izolat koruması için %20 oranında kullanılır
GoTaq Green Master Mix (2& kez;)Promega, ABDM7122PCR amplifikasyon karışımı
Levofloksasin (5 & mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT1587BAST
Linezolid (30 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, Birleşik KrallıkCM0007Gram-negatif bakteriler için seçici ortam
Mannitol Tuz Agar (MSA)Oxoid, Birleşik KrallıkCM0085Staphylococcus türleri için seçici/diferansiyel ortam.
Meropenem (10 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0774BAST
MgCl2 ÇözümPromega, ABDÇeşitliPCR reaksiyon bileşeni
Mueller-Hinton AgarOxoid, Birleşik KrallıkCM0337Kirby&ndash için kullanılmıştır; Bauer disk difüzyon testi
KAS Hizalama AracıAçık kaynakÇeşitliProtein dizisi hizalanması
Nükleazsız SuPromega, ABDP1193PCR reaksiyon bileşeni
Besin AgarıOxoid, Birleşik KrallıkCM0003Genel amaçlı büyüme ortamı
Oksasilin (1 µ g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0159BAST
PathogenWatchWellcome Sanger EnstitüsüÇevrimiçi AraçTür Kimliği & AMR gen tespiti
PATRIC / BV-BRCBakteriyel Biyoinformatik Kaynak MerkeziÇevrimiçi PlatformGenom montajı ve Açıklama
Piperacillin/Tazobactam (100/10 & mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT1628BAST
Proksee Genom Görselleştirme AracıToronto ÜniversitesiÇevrimiçi AraçGenom haritası görselleştirme
Kuantüm florometrePromega, ABDE6150DNA nicelik
Kubit florometreThermo Fisher ScientificQ33238WGS için DNA niceliği
RAxML YazılımıAçık kaynakÇeşitliFilogenetik analiz
S. aureus ATCC 25923ATCC, ABD25923AST için kalite kontrol suşu
Güvenli Kırmızı LekeiNtRON BiyoteknolojisiÇeşitliDNA jel boyama
SaMag Bakteriyel DNA Çıkarma KitiSacace Biotechnologies, İtalyaÇeşitliGenomik DNA çıkarımı
SaMag-12 Otomatik Çıkarma SistemiSacace Biotechnologies, İtalyaSMG-12Otomatik nükleik asit çıkarıcısı
Steril Pamuk ÇubuklarıÇeşitli üreticilerÇeşitliDerin swab tekniği örnek toplama için kullanılır
Steril Normal SalinÇeşitli üreticilerÇeşitliÖrneklemeden önce ülser yüzeyini yıkamak için kullanılır
Steril Smalı BıçaklarıÇeşitli üreticilerÇeşitliNumune almadan önce ülser debridmenti için kullanılır
Tigecycline (15 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT1849BAST
Trimetoprim-Sülfametoksazol (25 & mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0052BAST
UV TransilluminatörÇeşitli üreticilerÇeşitliPCR ürünlerinin görselleştirilmesi
Vancomycin (30 yaş ve mikro; g) DiskOxoid, Birleşik KrallıkCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMé Rieux, FransaÇeşitliOtomatik tanımlama sistemi
VITEK 2 GN Kimlik KartlarıBioMé Rieux, FransaÇeşitliGram-negatif bakterilerin tanımlanması

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metisiline Diren liAntimikrobiyal DirenT m Genom Dizilemeok la Diren liPolimeraz Zincir ReaksiyonuGenomik S rveyansKirby Bauer Y ntemi
Video yakında

İlgili makaleler