Dokudan Morfometriye: Yetişkin farelerde nöronal ve dendritik omurga analizi için adım adım bir Golgi–Cox iş akışı

Özet

Bu makale, yetişkin farelerde Golgi–Cox boyama için adım adım bir yöntemi anlatır; çözelti hazırlığı, doku emdirilmesi, kriyokoruma, kesitleme, geliştirme ve montajı kapsar. Bu yöntem, doku koruma ve homojen, düşük arka plan boyama üzerine vurgu yapar ve nöron morfolojisinin net görselleştirilmesini sağlar. Yöntem, dendritik arborları etiketler ve dendritik dikenlerin nicel morfometrik analizini destekler.

Özet

Sağlık ve hastalıklarda nöronal morfoloji analizi, beyin fonksiyonunu anlamak ve deneysel müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için temel bir unsurdur. Golgi–Cox boyama, tam nöronal arborlar ve dendritik dikenleri görselleştirmek için klasik ama son derece önemli bir teknik olmaya devam etmektedir. Ancak, yayımlanan protokoller kritik prosedürel adımlarda sıklıkla farklılık gösterir ve genellikle temel metodolojik detaylardan yoksundur; bu da kalitede önemli değişkenliklere yol açar ve laboratuvar standartlaştırmasını zaman alıcı ve zorlayıcı hale getirir. Burada, yetişkin fareler için kapsamlı ve adım adım bir Golgi–Cox protokolü sunulur; bu protokol, in vivo işleme ve doku işlemeden görüntüleme ve morfometrik veri çıkarımına kadar tüm iş akışını kapsar. Tohumlama verimliliğini, bölüm bütünlüğünü ve sinyal-gürültü oranını etkileyen pratik hususları ve yaygın tuzakları detaylandırır ve tekrarlanabilirliği artırmak için metodolojik rehberlik sağlar. Genel olarak, bu protokol tüm nöronların görselleştirilmesini ve nicel analizini, dendritik segmentlerin ve dendritik dikenlerin mümkün olmasını sağlar. Bu kaynağın, Golgi–Cox boyamanın daha tutarlılık, şeffaflık ve teknik titizlikle uygulanmasını kolaylaştıracağı ve yöntemin çeşitli laboratuvar ortamlarına uyarlanması için net bir çerçeve sunacağı öngörülmektedir.

Giriş

Golgi–Cox boyama yönteminin genel amacı, sabit beyin dokusunda dendritik arborlar ve dendritik dikenler dahil olmak üzere tam nöronal morfolojinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini^{sağlamaktır} 1,2,3,4. Bu teknik, karmaşık sinir devrelerindeki bireysel nöronların ayrıntılı yapısal analizini sağlar ve sinaptik plastisite, nörogelişim, nörodejenerasyon ve deneyime bağlı yapısal yeniden yapılandırma çalışmaları için özellikle değerli^{hale gelir 5,6}.

Golgi tabanlı yöntemlerin geliştirilmesi ve devam eden kullanımı, nadir ve tam nöronal^{emdirme üretme yetenekleri 1,2'de} yatmaktadır. İlk olarak 1873'te Camillo Golgi tarafından tanımlanan ve 1891'de Cox ^7,8 tarafından geliştirilen yöntem, sınırlı bir nöron alt kümesi içinde gümüş kromatının çökelmesine dayanır ve^3. etiketleme örtüşmeden tam morfolojik yeniden yapılandırmayı mümkün kılar. Golgi–Cox modifikasyonu, orijinal Golgi yönteminde kullanılan gümüş nitratı merkür klorür ile değiştirerek doku nüfuzunu ve boyama kıvamını^{iyileştirir.} Floresan protein ekspresyonu, viral izleme veya boya doldurma yöntemleri gibi alternatif nöronal etiketleme tekniklerine kıyasla Golgi–Cox boyama birçok avantaj sunar. Genetik manipülasyon, stereotaksik enjeksiyonlar veya özel mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve parlak alan^{mikroskopisi 1,2} altında yüksek kontrastlı dendritik dikenlerin görselleştirilmesine olanak tanır. Modern floresans tabanlı yöntemler hücre tipine özgüllük sağlasa da, Golgi–Cox boyama tarafsız morfolojik^{örnekleme 9,10} ve transjenik araçların bulunmadığı türler veya deneysel koşullarda kullanımı için özellikle avantajlıdır.

Daha geniş literatürde, Golgi tabanlı yöntemler öğrenme ve hafıza⁵, stres ve psikiyatrik^{bozukluklar 11},^{yaşlanma 12} ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar (^12,13,14) çalışmalarında dendritik omurga yoğunluğu ve morfolojisini niceliklendirmek için kapsamlı şekilde kullanılmıştır. Onlarca yıl boyunca devam eden kullanımı, yapısal nöroanatomi^{için güvenilirliğini vurgular.} Bu yöntem, tüm hücre görselleştirmesi gerektiğinde beyin dokusunda dendritik mimariyi ve omurga morfolojisini analiz eden araştırmacılar^{için özellikle uygundur 1}. Deneysel gruplar arasında karşılaştırmalı morfolojik çalışmalar için oldukça uygundur. Ancak, hücre tipi özgüllüğü, canlı görüntüleme veya moleküler kololokalizasyon gerektiren araştırmacılar, floresan veya genetik olarak kodlanmış etiketleme^{yaklaşımlarından daha fazla fayda sağlayabilir 9,10}.

Protokol

Bu çalışmada yetişkin dişi vahşi tip B6129SF2/J fareleri (n = 3) kullanıldı. Ancak, benzer boyama yetişkin evrede her iki cinsiyette de gerçekleştirilebilir. Tüm deneysel prosedürler önceden Biyoetik Komitesi onayı almıştır. (#117.A, Nörobiyoloji Enstitüsü (INb), Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi)

1. Çözeltilerin hazırlanması

DIKKAT: Mercürik klorür son derece zehirli ve aşındırıcıdır. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruyucu takarak kimyasal bir buharlı başlıkta tutun. Atıkları etiketli tehlikeli atık konteynerine atın. Potasyum dikromat ve potasyum kromat, toksik ve kanserojen oksitleyicilerdir. Kimyasal bir duman başlıkta tutun ve cilt temasından veya solumadan kaçının.

1. Stok emdirme çözeltilerini hazırlayın
   1. 15 g potasyum dikromat ağırlığında bulun. 300 mL çift damıtılmış suda çözerek %5 (w/v) bir çözelti elde edin.
   2. 15 g merkürik klorür ağırlığında ol. 300 mL çift damıtılmış suda çözerek %5 (w/v) bir çözelti elde edin.
   3. 15 g potasyum kromat ağırlığındadır. 300 mL çift damıtılmış suda çözerek %5 (w/v) bir çözelti elde edin.
   4. Tüm kapları alüminyum folyoya sarıp oda sıcaklığında, ışıktan korunarak saklayın.
2. Golgi–Cox çalışma çözümünü hazırla
   1. 50 mL potasyum dikromat çözeltisi, 50 mL merkürik klorür çözeltisi ve 40 mL potasyum kromat çözeltisi karıştırın.
   2. 100 mL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın.
   3. Karışımı oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 48 saat kuluçka edin.
   4. Çökeltinin çökmesine izin verin. Doku emdirme için sadece süpernatantı kullanın.
      NOT: Golgi–Cox çözeltisi ışıktan korunduğunda 1 aya kadar saklanabilir. Reaktif atıklarını azaltmak ve çözelti tazeliğini sağlamak için, deney için gereken stok çözelti ve nihai Golgi–Cox çözeltisi için yalnızca gerekli hacmi hazırlayın. Çökelti kaybından sonra 20 mL kullanılabilir üst yüzey elde etmek için beyin başına en az 23 mL hazırla.
3. Kriyoprotektan çözelti hazırlayın
   1. 300 g sukrozu 0,1 M fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS), pH 7,4 içinde çözersiniz; bu sıvısız sodyum fosfat dibazik, monohidratlı sodyum fosfat monobazik ve sodyum klorür ile hazırlanır.
   2. Son hacmi 1 L'ye ayarlayın.
   3. 4 °C'de bir haftaya kadar saklanın.

2. Doku toplama ve hamile ile

1. İntrakardiyak perfüzyon yapın
   1. Hayvanı sodyum pentobarbital (252 mg/kg, i.p.) ile anestezi edin. Pedal çekilmesinin olmaması nedeniyle anestezi derinliğinin yeterli olduğunu doğrulamadan önce devam edin.
   2. Yaklaşık 30 mL 0.1 M PBS (pH 7.4) ile intrakardiyak perfüzyon yapılarak atık sıvı temizlenene kadar beyin dokusundan kanın tamamen alınmasını sağlar. Herhangi bir fiksasyon kullanılmadı; Golgi–Cox çözümü ise bu iş akışında sabitleyici olarak hizmet eder.
   3. Beyni dikkatlice çıkarıp damıtılmış suda durulayın. Beynin düzgün perfüze olduğundan ve kalıntı kandan arındırıldığından emin olun (Şekil 1A).
2. Dokuyu emdirin
   1. Beyni, hamile etmeyi iyileştirmek için bir beyin matrisi kullanarak yarımkürelere veya koronal bloklara (~3 mm kalınlığında) bölünür. Daha küçük doku blokları daha düzgün emdirmeyi kolaylaştırır ve değişkenliği azaltırken, daha büyük örnekler daha uzun kuluçka süreleri gerektirebilir ve daha az homojen boyama gösterebilir.
   2. Beyni 10 mL Golgi–Cox çözeltisine yerleştirin. Işıktan korun.
      NOT: 10 mL Golgi–Cox çözeltisi hacmi, tüm yetişkin bir fare beyni için yeterlidir. Tek bir yarımküre veya daha küçük koronal bloklar (~3 mm kalınlıkta) kullanılırken, dokunun tamamen daldırılmış kalması koşuluyla çözeltinin hacmi orantılı olarak azaltılabilir. Tüm beyin kullanılırsa, optimal reaktif penetrasyonu ve homojen emdirme sağlamak için ilgi alanını koruyarak bölümlere ayrılması önerilir.
   3. Oda sıcaklığında 24 saat kuluçka yapın.
   4. Yerine 10 mL taze Golgi–Cox çözeltisi verin. Karanlıkta 22–25 °C sıcaklıkta 10-14 gün kuluçka yapın.
      DURAKLAMA NOKTASI: Golgi–Cox çözeltisinde dokuyu 15 güne kadar büyük bir canlılık kaybı olmadan sakla.
      NOT: Golgi–Cox hamile kaldıktan sonra beyin koyu altın rengi bir görünüm kazanır ve son derece kırılgan hale gelir; bu nedenle, dikkatli davranın (Şekil 1B). Çelik malzemelerle kimyasal reaksiyonları önlemek için manipülasyon için plastik cımbız kullanılması önerilir.

3. Kriyokoruma

1. Dokuyu 10 mL kriyoprotektan çözeltiye (%30 sakaroz (w/v) 0.1 M PBS, pH 7.4, 1.3. adımda hazırlanmış) içine aktarın.
2. 24 saat (4 °C) kuluçka için.
3. Aynı sıcaklıkta (4 °C) taze kriyoprotektan çözelti ile değiştirin ve en az 4–7 gün kuluçka yapın.
   DURAKLAMA NOKTASI: Kesitlemeden önce, dokuyu 4 °C'de 3 haftaya kadar kriyoprotektan çözeltide saklayın.

4. Gömme ve bölümleme

1. Gömülü doku
   1. %8 (w/v) agarozu sıcak damıtılmış suda hazırlayın. Yaklaşık 40 °C'ye kadar soğumasına izin verin.
   2. Dokuyu gömülü kalıplara yerleştirin ve uygun şekilde yönlendirin.
   3. Agaroz dokunun üzerine dökülün ve oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de 30 dakika katılaşmasına izin verin (Şekil 1C).
   4. Bloktan fazla agarozu kesin (Şekil 1D).
2. Kesitli doku
   1. Agaroz bloğunu yapışkan kullanarak vibratom aşamasına sabitleyin. (Şekil 1E)
   2. Kesme odasını kriyoprotektan çözelti ile doldurun.
   3. 100–200 μm kalınlığında kesitli doku. Daha ince kesitler (örneğin, 100–120 μm) dendritik omurga analizinde görüntüleme çözünürlüğünü artırmak için önerilirken, daha kalın kesitler (örneğin 150–200 μm) tüm nöron rekonstrüksiyonu için kullanılabilir. Bu çalışmada, kesitler 120 μm aralığında kesildi (Şekil 1F).
   4. Bölümleri yumuşak bir fırça ile toplayın.
      NOT: Vibratom ayarlarını Malzemeler Tablosu'na kaydedin. Parçalar monte edildikten sonra sürgüleri hiçbir koşulda durulamayın. Sakroz, gelişim aşamasına kadar dokuyu koruyacaktır.

5. Montaj

1. Jelatin kaplı slaytların hazırlanması
   1. 0,5 g jelatini 100 mL (%0,5 w/v) damıtılmış suda kaynatarak bir kaplama çözeltisi hazırlayın.
   2. Jelatin tamamen çözünene kadar karıştırın ve çözeltinin oda sıcaklığına kadar soğumasına izin verin.
   3. 0,05 g krom potasyum sülfat (%0,05 w/v) ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın. Gerekirse kalan köpüğü çıkarın.
   4. Jelatin çözeltisini filtre kağıdından geçirerek çözünmemiş partikülleri ve kalıntı köpüğü çıkararak slaytların eşit bir kaplama sağlanmasını sağlar.
   5. Cam sürgüleri nötr deterjan ve suyla yıkayın, iyice durulayın ve ardından damıtılmış suyla durulayın.
   6. Slaytları %96 etanole daldırarak görünür damlacıklar kalmayınca.
   7. Kuru kaydırmaları fırında 50–60 °C sıcaklıkta 30 dakika veya tamamen kuruyana kadar kullanın.
   8. Sürgüleri jelatin çözeltisine daldırın ve fazla çözeltiyi boşaltın.
   9. Sürgüleri 50–60 °C sıcaklıkta fırına 30 dakika veya tamamen kuruyana kadar koyun.
   10. Doğru yapışma sağlamak için kaplama ve kurutma işlemini en az beş kez tekrarlayın.
   11. Son kurutma adımından sonra, sürgüleri tozsuz bir ortamda (örneğin kimyasal bir buhar davlumbazının içinde) oda sıcaklığına kadar soğutun ve kullanıma kadar temiz, kapalı bir kapta saklayın.
       NOT: Kaplama yapılacak slayt sayısı için gereken jelatin çözeltisi hacmini hazırlayın. Reaktif miktarları, belirtilen konsantrasyonları (w/v) koruyarak orantılı olarak ölçeklenebilir.
2. Bölümleri jelatin kaplı mikroskop slaytlarına yumuşak bir fırça ile yerleştirin
   NOT: En az beş kat %0,5 jelatin ile kaplanmış mikroskop slaytları kullanın. Slaytları taze hazırlayarak geliştirme sırasında doku bütünlüğünü sağlayın. Elektroşarjlı kaymalar bu protokolde test edilmemiştir.
3. Emici kağıdı kriyoprotektan çözeltisiyle ıslatın ve bölümlerin üzerine yerleştirin.
4. Avuç içi ile nazikçe bastırarak hava kabarcıklarını ortadan kaldırın ve doku bölümü ile jelatin kaplı slayt arasında eşit bir temas sağlanır; böylece sonraki işlem sırasında stabil yapışma sağlanır.
   NOT: Nazik basınç, kesit ile jelatin tabakası arasındaki teması maksimize ederek yapışmayı artırır ve sulu gelişim sırasında ayrılma riskini azaltır.
5. Kağıdı dikkatlice çıkarın ve slaytları oda sıcaklığında 2–3 gün boyunca karanlıkta kurumasına izin verin.
   NOT: Düşük nemli bir ortamda kurutmak, stabil yapışma için kritiktir. Işık koruması, kromat tuzlarının varlığı nedeniyle ışığa hassas olan Golgi–Cox emdirilmiş dokunun fotokimyasal değişikliklerini en aza indirir. Ayrıca, kalıntı agaroz gelişim sürecini önemli ölçüde etkilemez ve gelişmiş bölümde dokunun çevresinde gözlemlenebilir (Şekil 2A). Agarozun varlığı, dokunun montaj sırasında daha güvenli bir şekilde ele alınmasını sağlar; çünkü Golgi–Cox ile emdirilmiş doku oldukça kırılgandır. İstenerse, fazla agaroz, bölümler kaydırımlara monte edildikten sonra dikkatlice manuel olarak çıkarılabilir.
   DURAKLAMA NOKTASI: Kaydırakları ışıktan koruyun.

6. Gelişim

DIKKAT: Ksilen solunma yoluyla yanıcı ve toksiktir. Kimyasal bir buhar davlumonu ile tutun ve açık alevlerden kaçının. Amonyak aşındırıcı ve tahriş edici buharlar üretir. Bir duman davlumbazında tutun.

1. Yeniden Hidret Bölümleri
   1. Kaydırakları 5 dakika boyunca damıtılmış suya batırın.
   2. 5 dakika boyunca taze damıtılmış suya aktarın.
   3. %50 etanol içinde 5 dakika batırın.
      NOT: %50 etanol aşaması, sulu koşullardan dehidrasyona kademeli geçiş sağlar, reaktif nüfuzunu kolaylaştırır ve gelişim aşamasından önce doku bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur.
2. Boyama Geliştir
   1. Slaytları, %25 amonyak hacimi ile 1 hacim damıtılmış su (2:1, v/v) karıştırarak hazırlanmış sulu amonyak çözeltisinde 8 dakika boyunca inkübe yapın
   2. 5 dakika boyunca damıtılmış suda yıkayın.
   3. 5 dakika boyunca damıtılmış suda tekrar yıka.
   4. %5 (w/v) sodyum tiosülfatta distile suda 10 dakika karanlıkta kuluçka yapın.
   5. 1 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın.
   6. Tekrar damıtılmış suda 1 dakika yıka.
      NOT: Başlattıktan sonra geliştirme sürecini kesintisiz tamamla.
3. Susuz bırakın ve temiz olun
   1. Slaytları %70 etanol içinde 5 dakika daldırın.
   2. Slaytları %96 etanol içinde 5 dakika daldırın.
   3. Slaytları %100 etanol içinde 5 dakika daldırın.
   4. Slaytları en az 6 dakika boyunca ksilen içine aktarın.

7. Kalıcı montaj

1. Her bölüme Permount® montaj ortamı (kırılma indeksi ~1.52) uygulayın.
   NOT: Montaj ortamının kırılma indeksi, optimum görüntü kalitesi sağlamak için yağ batdırma objektifleriyle uyumlu olmalıdır.
2. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatlice bir örtü kullanabilirsiniz.
3. Kenarları şeffaf oje ile kapatın.
4. Sürgüleri oda sıcaklığında 48 saat karanlıkta kurutmaya bırakın.

8. Görüntüleme

NOT: Görüntüleme yöntemleri ve satın alma konfigürasyonları mikroskop markasına göre değişir; Her sistem için optimal ayarlar belirlenmelidir.

1. Mikroskobu aç.
2. Mikroskop yazılımını aç
3. Mikroskop sahnesine bir slayt yerleştirin.
4. Beyin kesitinin 2D geniş görüşlü görüntüsünü düşük büyütme objektif (örneğin 1X/0.04 N.A. veya 4x/0.10) kullanarak yakalayın (Şekil 2A, B).

9. Tüm nöronların görüntülenmesi

1. İlgilenen nöronu içeren alanın yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını, 10x/0.25 N.A. veya 20x/0.40 N.A. objektif kullanarak yakalayın (Şekil 2C).
   NOT: Analiz için seçilen nöronlar tam ve homojen Golgi–Cox emdirme göstermeli, net tanımlanmış dendritik arborlar ve minimum arka plan boyama ile olmalıdır. Kesiklenmiş süreçlere, tam emdirilmemiş, örtüşen yapılara veya yüksek arka plan sinyali hücreler, doğru morfometrik analiz için hariç tutulmalıdır.
2. Görüntüyü odaklayın ve kamera ayarlarını, pozlama ve beyaz dengesini ayarlayın.
3. Görüntü yığını için üst ve alt sınırları belirle.
4. Görüntü alma penceresinde adım mesafesini 0.5 μm olarak ayarlayın.
5. Yığın edinimi için yazılım komutunu kullanarak görüntü yığınını yakalayın.
6. İlgi alanlarını yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
7. Veri dosyasını kaydedin ve tüm görüntü dosyalarını kaydedin. Dış işlem için TIFF formatı.

10. Dendritik dikenlerin görüntülemesi

1. İlgilenen nöronu içeren alanın yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını, uygun parlak alan mikroskopunda 63x/1.4 N.A. yağ battırma objektif kullanarak yakalayın (Şekil 2D).
   NOT: Mevcut el yazmasında, Şekil 2D'de gösterilen dendritik dikenlerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri, Zeiss modeli LSM 780'in konfokal mikroskobunun parlak alan modu kullanılarak alınmıştır. Ancak, diğer parlak alan mikroskopları, parametreleri her laboratuvar tarafından standartlaştırılması gereken 63x yüksek kaliteli z-stack görüntüleri elde etmek için kullanılabilir.
2. Sürgüye 1–2 damla daldırma yağı uygulayın ve objektif kaydırığın üzerine yerleştirin; böylece objektif ile yağ arasında temas sağlandığından emin olun.
3. Görüntüyü odaklayın ve kamera ayarlarını, pozlama ve beyaz dengesini ayarlayın.
4. Görüntü yığını için üst ve alt sınırları belirle.
5. Görüntü alma penceresinde adım mesafesini 0.3 μm olarak ayarlayın.
6. Yığın edinimi için yazılım komutunu kullanarak görüntü yığınını yakalayın.
7. İlgi alanlarını yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın
8. Veri dosyasını kaydedin ve tüm görüntü dosyalarını harici işlem için TIFF formatında kaydedin.
   NOT: 9. ve 10. adımlar için. Mikroskop Z-yığını alımı için motorlu bir aşama ile donatılmamışsa, mikrometrik odak ayarlanarak görüntüler manuel olarak toplanabilir. Ancak, optik bölümler arasındaki mesafe daha az hassas olabilir. Bu durumda, Z-yığınları daha sonra elde edilen görüntü dizisinden görüntü işleme yazılımında (örneğin ImageJ) yeniden oluşturulabilir.

11. Morfometrik analiz

NOT: Bu amaçla çeşitli yaklaşımlar ve özel yazılım programları kullanılabilir. Dendritik omurga analizi için bazı ücretsiz erişim araçları arasında ImageJ veya bu çalışmada olduğu gibi PyReconstruct¹⁵ bulunmaktadır. PyReconstruct ve nöronal rekonstrüksiyon ile morfometrik analiz için işlevselliğinin daha ayrıntılı bir tanımı için referans verilen kaynağa bakınız.

1. Dendritik omurga morfometrik analizi prosedürü
   1. Dosya ImageJ'de açıldıktan sonra, Image > Type > RGB Color seçeneğini seçerek formatı RGB olarak değiştirin.
   2. Z-yığınlarını ImageJ'de bir görüntü dizisine dönüştürün: Dosya > Görüntü Dizisi Olarak Kayd> tıklayın. Her görüntü dizisini sonraki analiz için ayrı bir klasörde kaydedin. PyReconstruct'ta, File > New > From Images'a tıklayarak görüntü dizisini yükleyin.
   3. Bir diyalog penceresi açılır ve dosyaya bir isim atanmasını önerir (örneğin, WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Ardından ardışık üç diyalog penceresi belirir. İlk pencerede, kalibrasyon değerini (μm/px) girin. Bu bilgiler Z-yığını meta verilerinde mevcuttur ve ImageJ'de erişilebilir.
   5. İkinci pencerede, ardışık her optik kesitin (μm) kalınlığını girin. Son olarak, görüntü serisi otomatik olarak yüklenmeye başlar (Ek Şekil 1A).
   6. İlgi alanındaki segment belirlendikten sonra, araştırmacı tarafından tanımlanan dahil etme kriterlerine göre nicel veriler elde etmek için takip etmeye devam edin.
   7. Her iz türü için ayrı bir isim ve alan alanı atayın. Alanları alt panelde konumlandırın; burada farklı renkli geometrik şekillerle temsil edilirler (Ek Şekil 1B).
   8. İstenen örnek uzunluğuna uygun bir çizgi çizerek kalem aracı kullanın. Sonra, Z aracı kullanarak dendritik segment boyunca Z-yığını boyunca ikinci bir iz oluşturulur.
   9. Uygun segment uzunluğunu belirlemek için ilk izi kullanın ve bunu Listler > Z-iz Listesi (Ek Şekil 1B) altında doğrulayın.
   10. Z-stack'te gezin ve dendritik omurga başlarını optimal odakla belirleyin. Kalem aracıyla, her omurga başının en geniş distal bölgesini izleyin. Sonra, Z aracıyla omurga boynunu Z-yığını boyunca izleyin (Ek Şekil 1C, D). Bu prosedür, seçilen dendritik segment içindeki tüm omuzga başları ve boyunlar izlenene kadar tekrarlanın.
2. İhracat omurga başı ölçümleri
   1. Omurga başı genişliği ve uzunluğu ölçümlerini içeren listeleri açın. Bunlara sırasıyla Lists > Trace List (genişlik için) ve Lists > Z-trace List (uzunluk için) alt alt bölümlerinden erişin.
   2. Verileri bilgisayarda istenen konuma aktarın. Her biri ilgili ölçüm verilerini içeren iki ayrı Excel dosyası oluşturulacak.
3. Omurga morfolojisini sınıflandırın ve yoğunluğu hesaplayın
   1. Omurga başı ve boyun genişliği ölçülerini önceden oluşturulan Excel dosyalarından çıkarın.
   2. Veriler, morfolojik sınıflandırma için aşağıdaki kriterlere göre Genişlik ve Uzunluk olarak etiketlenmiş ilgili^{sütunlara düzenlenmelidir 16}: filopodia (>2 μm), ince (< 2 μm), kısa (uzunluk-baş genişlik oranı ≤1) ve mantar (baş genişliği >0,6 μm). (Ek Şekil 1E). Filopodia analiz edilen dendritik segmentlerde nadiren gözlemlendiği için analize dahil edilmedi.
   3. Bu aşamada analiz edilen dendritik segment başına toplam diken sayısı, omurga yoğunluğu (doğrusal μm başına dikenler) ve her omurga alt tipinin türü ve sayısı belirlenir. Bu analiz için kullanılan Excel^{şablonu 16} , referans verilen kaynakta mevcuttur. Bu yöntemle, 12 aylık dişi farelerde hipokampusun CA1 bölgesinde bazal dendritik omurga yoğunluğu nicelendirilmiştir.
   4. Nicel verileri ihraç etmek ve veri analizi, grafikleme ve istatistik için tasarlanmış özel bilimsel yazılım uygulamalarıyla grafikler oluşturmak ve raktikler oluşturmak için kullanılır. Burada, Şekil 3'teki grafik GraphPad Prism yazılımıyla oluşturulmuştur.

Sonuçlar

Doku emdirme ve kesitleme
Burada açıklanan Golgi–Cox protokolü, yetişkin fare beyin dokusunda güvenilir ve homojen nöron boyama sağlamıştır. Golgi–Cox çözeltisinde emdirildikten sonra beyin, boyama çözeltisinin doku boyunca başarılı bir şekilde yayıldığını gösteren karakteristik koyu altın rengi kazandı. Vibratom kesitleme, nöronal somatların ve dendritik süreçlerin yapısal bütünlüğünü korudu.

Nöronal görselleştirme
Brig...

Tartışma

Golgi–Cox boyama yöntemi, sabit beyin dokusunda nöronal morfoloji ve dendritik dikenlerin görselleştirilmesinde en yaygın kullanılan^{tekniklerden biri olmaya devam etmektedir 3,4}. Küçük ve rastgele bir nöronlar alt kümesini emdirerek, bu yöntem minimum arka plan boyama ile tam dendritik ağaçların görselleştirilmesini sağlar. Mevcut protokolde, bu teknik, hipokampus piramidal nöronların ve dendritik dikenlerinin net görselleştirilm...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Yaşam Teknolojileri	15510-027	CAS 9012-56-6
Amonyak çözeltisi %25	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Tehlikeli.
Susuz sodyum fosfat dibazi	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Parlak alan Mikroskobu	Nikon	Eclipse Ci
Krom potasyum sülfat	Sigma-Aldrich	243361
Konfokal Mikroskop	Zeiss	LSM 780
Dijital denge	Accuris Instruments	W3200-1200
Göme kalıpları	Merck	E6032	Boyutlar: 22x22 mm
Etanol	Meyer	394
Deneysel hayvanlar	Jackson Laboratuvarı	2124-01	B6129SF2/J fare türü
Jelatin tozu	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad Prizma Yazılımı	GraphPad Software Inc.		Sürüm 8.0.2
ImageJ Fiji Software	ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü		sürüm 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Merkürik klorür	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Tehlikeli.
Mikroskop Kamerası	Nikon	DS-Vi1
Mikroskop hedefi (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0.25 N.A.
Mikroskop hedefi (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.
Mikroskop hedefi (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0.40 N.A.
Mikroskop hedefi (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
Mikroskop hedefi (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. petrol DIC
Mikroskop slaytları	Sigma-Aldrich	S8902
Monohidratlı sodyum fosfat monobazik	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Tırnak ojesi	GÜNAHKAR RENKLER	KALIN RENK	Şeffaf
Permount montaj ortamı	Fisher Scientific	SP15-500
Potasyum kromat	Productos Quí micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Tehlikeli.
Potasyum dikromat	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Tehlikeli.
PyReconstruct Yazılımı	Texas Üniversitesi, Austin		sürüm 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Sodyum klorür	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Sodyum tiosülfat	Productos Quí micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Tehlikeli.
Sucrose	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66.55 ve derece; Özel rotasyon, ACS reaktifi
Vibratom	Leica Biosystems	VT1200S	HIZ 20 mm/s, AMPL ve ndash; 0.60 mm
Ksilen	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Tehlikeli.