Yöntem makalesi

Kök Leydig Hücrelerinde Matris Sertliği Etkilerini İncelemek İçin Ayarlanabilir Poliakrilamid Hidrojel Üretimi

DOI:

10.3791/71387

⸱

5 Haziran 2026

 ,  ,  ,  , 
1Scientific Research Center, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2School of Medicine, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University, 3Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 4Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering, Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, matris mekaniğinin kök Leydig hücre davranışı üzerindeki etkilerini kontrol edilen iki boyutlu kültür sisteminde incelemek için ayarlanabilir sertlikte poliakrilamid hidrojellerin üretimini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstraselüler matriks (ECM) sertliği, kök hücre davranışını kritik bir şekilde düzenler. Daha önce, yaşlanma sırasında matriks sertliğindeki patolojik artışların kök Leydig hücresi (SLC) homeostazını bozduğunu ve bunun testosteronda düşüşe yol açtığını göstermiştik. Bu keşfe dayanarak, burada laboratuvarımızda geliştirilen, testis mikro ortamını in vitro modellemek için ayarlanabilir sertlikle poliakrilamid (PA) hidrojelleri üretmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, jellerin 1–100 kPa sertlik aralığında tekrarlanabilir dökümünü sağlar ve fizyolojik ve patolojik koşulları kapsar. Önemli adımlar arasında akrilamid/bis-akrilamid hassas karışımı, jel şişme dengesi, yüzeyin Sulfo-SANPAH ile aktivasyonu ve SLC yapışmasını ve kültürünü desteklemek için kolajen kaplaması yer alır. Hedef sertlikler için optimize edilmiş formülasyonlar ve eksik polimerleşme ile zayıf hücre bağlanması gibi yaygın sorunlar için sorun giderme rehberliği sunuyoruz. Bu sistem, substrat sertliğinin SLC proliferasyonu, farklılaşması ve steroidojenik fonksiyonunu tanımlanmış 2B koşullar altında nasıl modüle ettiğine dair sistematik incelemeye olanak tanır. Üreme biyolojinin ötesinde, diğer hücre tiplerinde mekanik biyolojik çalışmalar ve sertlikle ilişkili işlev bozukluğuna yönelik tedavilerin taraması için değerli bir platform olarak hizmet vermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrasellüler matriksin (ECM) mekanik özellikleri, kök hücre kaderinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar; çoğaltma, farklılaşma ve fonksiyonel bakım 1,2,3,4 dahildir. Testiste, yaşa bağlı ECM sertleşmesi testosteron üretiminin azalmasında rol oynamıştır. Ancak, altta yatan mekanobiyolojik mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır; bunun bir nedeni testiküler nişin fizyolojik sertlik aralığını sadakatle özetleyen standartlaştırılmış in vitro modellerin eksikliğidir. Genç fare testis dokusunun fizyolojik sertliği yaklaşık 1–15 kPa iken, yaşlı veya fibrotik doku 20–30 kPa veya daha fazla olabilir.

Poliakrilamid (PA) hidrojeller, akrilamid ile bis-akrilamid oranının değiştirilmesiyle tam olarak ayarlanabildikleri için hücre-matris etkileşimlerini incelemek için çok yönlü bir platform olarak ortayaçıkmıştır 5,6. Kolajen kaplı cam veya ticari hidrojeller gibi diğer substratlara kıskandığında, PA jelleri sertlik ve biyokimyasal ligand yoğunluğu üzerinde bağımsız kontrol sunar ve mekanik ipuçlarının sistematik olarak diseksiyon yapılmasını sağlar. PA jel üretimi 7,8,9 için birkaç protokol olmasına rağmen, genellikle belirli hücre tipleri için, özellikle SLC'ler gibi nadir birincil hücreler için ayrıntılı optimizasyon eksikliği vardır.

Burada, fare SLC'lerinin kültürlenmesi için özel olarak tanımlanmış sertlikte (1–100 kPa) PA hidrojel hazırlamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Yöntem, jel döküm, şişme dengesi, Sulfo-SANPAH ile yüzey fonksiyonelleştirmesi ve hücre yapışmasını teşvik etmek için kollajen kaplama için adım adım talimatları içerir. Bu protokolü takip ederek, araştırmacılar genç (yumuşak) ve yaşlı (sert) testislerin mekanik ortamını taklit eden, ayarlanabilir sertliğe (1 ila 100 kPa) sahip substratlar üretebilir ve bu da sertliğe bağlı SLC yanıtlarının nicel olarak incelenmesini mümkün kılar. Sistem ayrıca diğer mekanosensitif hücre tiplerine uyarlanabilir ve sertlikle ilgili patolojileri hedefleyen ilaç taraması için bir platform sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri Sun Yat-sen Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. SYSU-IACUC-2026-B1278) ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Birincil fare SLC'lerinin izolasyonu ve kültürü

  1. C57BL/6 farelerinden testisleri disseksiye edin ve tunica albuginea'yı dikkatlice çıkarın.
  2. Testisleri küçük parçalara indir.
  3. Seminifer tübülerden interstisyel hücreleri 1 mg/mL kollagenaz tip IV içinde DMEM/F12'de 37 ºC'de 15 dakika boyunca inkubasyon ederek ayırın.
  4. Kolajen aktivitesini durdurmak için %10 fetal sığır serumu içeren DMEM/F12 ekleyin.
  5. Oda sıcaklığında 1500 × g sıcaklıkta 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Pelleti PBS'de yeniden askıya alın ve 70 μm filtreyle filtreleyin.
  7. CD51⁺ hücrelerini, Influx Cell Sorter kullanarak floresansla aktive hücre ayırtma (FACS) ile zenginleştirin.
  8. Zenginleştirilmiş hücreleri, DMEM/F12 içeren SLC kültür ortamında tohumlayın; bunlar 1 nM deksametazon, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L insülin-transferrin-sodyum selenit, %5 tavuk embriyosu ekstraktı, 0,1 mM β-merkaptoetanol, %1 önemsiz amino asitler, %1 N2, %2 B27, 20 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü, trombosit köklü büyüme faktörü ve onkostatin M.
  9. SLC'leri standart koşullarda (37 °C, %5 CO₂) yetiştirin, ta ki hidrojellere tohumlama için istenen yoğunluğa ulaşana kadar.

2. Jel döküm cam kabının montajı

  1. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) jellerinin dökümü için kullanılan özel cam plakalar ve ara plakaları dikkatlice inceleyin ve temizleyin; toz, hasar ve kalıntılardan arınmış olduklarından emin olun.
  2. Cam plakaları, ara parçaları ve kelepçeleri üreticinin talimatlarına göre doğru şekilde monte edin; jel döküm sırasında sızıntıyı önlemek için montajın iyi kapalı olduğundan emin olun.
  3. Monte edilen cam kabı laboratuvar standına güvenli bir şekilde yerleştirin ve döküm için hazır hale getirin.
    NOT: Döküm düzeni, standart Western blot (sodyum dodesil sülfat [SDS]-PAGE) cam plakaları kullanır; sabit aralıklar 1,0 mm kalınlığında olur; bu da tekrarlanabilir jel kalınlığı ve hücre kültürü için düz bir yüzey sağlar.

3. PAGE jel karışımı çözeltiyi hazırlanıyor

  1. Deneysel tasarıma göre ( bkz. Tablo 1) 15 mL veya 50 mL steril santrifüj tüpüne aşağıdaki reaktifleri hassas bir şekilde ölçün: %40 Akrilamid stok çözeltisi, %2 Bis-akrilamid stok çözeltisi, 1M HEPES tamponu (pH 8.5), steril ddH₂O.
    DIKKAT: Akrilamid ve bis-akrilamid nörotoksinlerdir. Kuru tozu tartırken cilt temasını ve havadaki partiküllerin solumasını önlemek için her zaman eldiven ve toz maskesi takın. İşlemler bir duman davlumbazında yapılmalıdır.

4. İnisiyatör ve katalizör eklemek ve jelin dökülmesi

  1. Karışık çözeltiye sıralı olarak şunları ekleyin: %10 Amonyum Persülfat (APS): Polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için başlatıcı olarak görev yapar. N,N,N',N'-Tetrametiletilenediamin (TEMED): Polimerleşme reaksiyonunu hızlandıran katalizör olarak görev yapar. Toplam jel hacmi 6 mL için, %10 APS ve 6 μL TEMED ekleyin (ölçeklendirme için Tablo 1'e bakınız).
    NOT: Polimerizasyon reaksiyonu, TEMED eklendikten hemen sonra başlar; bu nedenle, sonraki adımlar hızlıca yapılmalıdır.

5. Karışık çözeltiyi dökmek

  1. Hemen pipet yapın veya karışımı çözeltiyi cam kabın bir kenarına düzenli olarak dökerek baloncukların oluşmasını önleyin.

6. Jelin polimerize olmasına izin vermek

  1. Dökme jel kabı oda sıcaklığında rahatsız edilmeden bekletin.
    NOT: Polimerizasyon genellikle oda sıcaklığında (20–25 °C) 15–30 dakika sürer.
  2. Polimerize olmamış jel karışımı ile polimerize jel arasında net bir arayüz göründüğünde ve jel tamamen katı olduğunda (kap eğildiğinde jel akmaz) bir sonraki adıma geçin.
  3. Dökümden hemen sonra, jel karışımının üzerine dikkatlice ince bir mutlak etanol (veya suya doygun etanol) tabakası serin; böylece radikal polimerizasyonu engelleyen atmosferik oksijen dışlanır. Etanol ayrıca düz bir üst yüzey oluşturmasına yardımcı olur.
  4. Polimerizasyondan sonra, plakaları sökmeden önce etanolü çıkarın.

7. Kabı söküp jelin hasat edilmesi

  1. Kelepçeleri dikkatlice sökün ve plastik bir kama veya spatula kullanarak cam plakaları nazikçe ayırın, böylece polimerize PAGE jeli tek bir plakada sağlam kalsın.
  2. Bol miktarda steril PBS içeren bir kültür tabağı hazırlayın.
  3. Jeli spatula veya eldivenli el ile dikkatlice cam plakadan soyusun ve PBS'ye pürüzsüzce kaymasına izin verin.
  4. Jel içeren kabı PBS ile mühürleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
    NOT: Bu adım çok önemlidir. Yeni hazırlanan jel susuz bırakılır ve suyu tamamen emip PBS'de son boyutlarına kadar şişirmelidir. Bu adım atlanır ve jel doğrudan kesilirse, sonraki hücre kültür ortamında genişlemeye devam eder, muhtemelen kültür kuyusunun alanını aşar ve jel kullanılamaz hale gelir. Şişlikten sonra jel kalınlığı 1 mm'dir. Bu kritik çünkü jel kalınlığı 100 μm'nin altına düştüğünde, hücreler alttaki sert kültür plakasının sertliğini hissedebilir ve bu da amaçlanan mekanobiyolojik ölçümlere müdahale edebilir.

8. Jeli kesip kültür plakasına aktarmak

  1. Ertesi gün, jeli 4 °C'den al. Steril bir biyopsi delici veya bıçak kesici (çapı kültür plakasının boyutuna uygun çapa sahip, örneğin 6-kuyu plaka) kullanılarak jel steril koşullarda kesilir.
  2. Bir biyogüvenlik dolabında, steril penslerle kesilmiş jel diski nazikçe alıp boş, steril bir kültür kuyusunun ortasına yerleştirin.

9. İlk yıkama ve UV ışınlanması

  1. Jelin bulunduğu kuyuya yeterli steril PBS ekleyin ve tamamen suyun altında kaldığından emin olun.
  2. Kültür plakasını nazikçe sallayarak jel yüzeyini yıkayın.
  3. PBS'yi pipet kullanarak aspire edin.
  4. Bu yıkama sürecini bir kez daha tekrarlayın, toplamda iki yıkama olur, her biri 3 dakika sürer.
  5. Yıkamadan sonra, jelin tekrar üstünü kapatacak kadar steril PBS ekleyin. Kapağı biraz aralık olan tüm kültür plakasını UV lambasının altına (biyogüvenlik kabini veya özel bir UV çapraz bağlayıcı içinde) yerleştirin ve temel sterilizasyon için 1 saat ışınlama yapın.

10. Sulfo-SANPAH çapraz bağlayıcısının aktivasyonu

  1. Biyogüvenlik dolabının içinde, kuyudan PBS'yi dikkatlice aspire edin.
  2. Aspirasyon öncesi, jelin sıvı yüzey gerilimi nedeniyle zarar görmesini önlemek için pipet ucu kullanarak jeli kuyu duvarlarından ve tabanından nazikçe ayırın.
  3. Jeli, steril forseps kullanarak aynı kültür plakasında başka bir temiz kuyuya aktarın.
    NOT: Jel transfer edilirken, önce temiz kuyuya az miktarda PBS eklemek, yerleştirildiğinde kuyu altı ile jel arasında sıkışmış hava kabarcıklarının dışarı çıkmasına yardımcı olur ve ayrıca ek bir yıkama işlevi görür.
  4. Çapraz bağlayıcı çalışma çözeltisi hazırlayın: 0,2 mg/mL Sulfo-SANPAH çalışma çözeltisi, stok çözeltiyi steril su veya önerilen tampon (örneğin PBS) ile seyreltirerek taze hazırlayın.
    NOT: Çözeltiyi ışıktan koruyun.
  5. Jelin kaplanması için yeterli miktarda Sulfo-SANPAH çalışma çözeltisi ekleyin (örneğin, 12 kuyuluk plaka için 250 μL, 6 kuyu plaka için 500 μL), böylece jel tamamen kaplı olur.
  6. Plakayı 365 nm dalga boyu / 120 mJ/cm 2 UV ışığı altına yerleştirin ve 1 saat boyunca ışınlayın.
    NOT: Bu adım, Sulfo-SANPAH'ı aktive eder ve jel yüzeyindeki fonksiyonel gruplara bağlanmasını sağlar.

11. Çapraz bağlayıcı aktivasyonu ve son yıkamalar

  1. Aşıtmadan sonra, biyogüvenlik kabini içindeki kuyiden Sulfo-SANPAH çözeltisini aspire edin.
  2. Kuyuya yeterince steril PBS ekleyin, jel yüzeyini hafifçe kayalayın ve PBS'yi aspirasyonla çekin.
  3. Bu yıkama işlemi bir kez daha tekrarlayın; toplamda her biri 3 dakika süren iki yıkama yapın ve reaksiyona girmemiş Sulfo-SANPAH'ı iyice çıkarabilirsiniz.

12. Fare kuyruğu tip I kolajen çalışma çözeltisi hazırlanıyor

  1. Fare kuyruğu tip I kolajen stok çözeltisini seyreltmek için 0,02 M asetik asit çözeltisi kullanın.
  2. Son çalışma çözeltisi konsantrasyonunu 60–100 μg/mL olarak ayarlayın. Örneğin, kolajen stok konsantrasyonu 4 mg/mL ise, 985–975 μ5 μL 0,02 M asetik asit ile 15–25 μL stok ekleyerek 1 mL çalışma çözeltisi elde edilir.

13. Kolajen kaplaması ve kuluçka

  1. Aktife jeli içeren her kuyuya plaka tipine göre uygun hacimde kolajen çalışma çözeltisi ekleyin: 6 kuyruklu bir plaka için 2 mL, 12 kuyruklu bir plaka için 1 mL ekleyin.
  2. Kültür plakasını nazikçe döndürerek kolajen çözeltisi jel ve kuyu altını eşit şekilde kapladığından emin olun.
  3. Plakayı kapatın ve 37 °C, %5 CO₂ oranında bir kuluçka içinde gece boyunca kuluçka yapın, böylece kollajen Sulfo-SANPAH çapraz bağlanmasıyla jel yüzeyine sabitlenebilir.

14. İkincil UV ışınlanması ve fiksasyonu

  1. Ertesi gün plakayı çıkarın ve yaklaşık 120 mJ/cm 2 UV ışığı altında 1 saat boyunca tekrar ışın yapın.

15. Bağlanmamış kolajen ve tohum hücrelerini çıkarın

  1. Biyogüvenlik kabini içinde, kuyulardan dikkatlice fare kuyruğu tip I kolajen çalışma çözümünü aspire edin.
  2. Kuyruklara steril PBS ekleyin, jel yüzeyini hafifçe kayalayın ve PBS'yi aspire edin.
  3. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın, toplamda iki yıkama olur, her biri 3 dakika sürer.
  4. Yıkamadan sonra jel matrisi hazırdır. Hazırlanmış kök Leydig hücrelerini tam SLC kültür ortamında (bileşim 1. adımda detaylandırılmıştır) yeniden süspansiyona alın.
  5. Hücre süspansiyonunu doğrudan jel yüzeyine tohumlayın. Önerilen tohumlama yoğunluğu 2 × 104 hücre/cm2 (örneğin, standart 6 kuyululuk plaka için yaklaşık 2 × 10,5 hücre).
  6. Kültür plakalarını nemlendirilmiş, %5 CO₂ içeren bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçka yapın.
  7. Optimal hücre canlılığını ve steroidojenik fonksiyonu korumak için, kültür ortamını her 48 saatte bir değiştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarılı uygulanması, kültür plakasına sıkıca bağlı kalan ve sağlam SLC yapışmasını ve yayılmasını destekleyen belirgin sertliğe (1 ila 100 kPa) sahip poliakrilamid hidrojeller elde eder. Şekil 1, jel dökümden hücre tohumlamasına kadar tüm iş akışının şematik bir genel görünümünü sunar ve kullanıcıların protokolün ana aşamalarını görselleştirmesini sağlar.

Poliakrilamid hidrojellerin mekanik doğrulaması (hedef sertli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriksin mekanik özellikleri, kök hücre davranışının düzenlenmesinde temel bir rol oynarken, üreme hücrelerinde bu etkileri sistematik olarak incelemek için araçlar sınırlıdır. Önceki çalışmalarımız, yaşlanma sırasında patolojik matriks sertleşmesinin kök Leydig hücresi (SLC) homeostazını Piezo1/ROS/Gli1 ekseni boyunca bozduğunu ve testosterondüşüşüne yol açtığını göstermiştir. Bu keşfe dayanarak, substrat sertliğinin SLC fonksiyonunu doğrudan nasıl mo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu projenin finansmanı, Çin Kök Hücre ve Translasyonel Araştırma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFA1100601), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82371608), Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023B1515020016) ve Shenzhen Temel Araştırma Programı (JCYJ20240813150417024, JCYJ20240813150422030) tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asitSigma-AldrichCat#A6283Fare kuyruğu kolajeni için seyreltici (0,02 M)
Acryiamide     Sangon BiyoteknolojiCat#A100341-0500Poliakrilamid jel hazırlamak için monomer
Amonyum persülfat (APS) & nbsp;Sangon BiyoteknolojiCat#A100486-0100Jel polimerizasyonu için başlatıcı
B27 takviyesiInvitrogenCat#A1486701Antioksidanlar ve hormonlar açısından zenginleştirilmiş tanımlanmış takviye; Nöronal ve kök hücre hayatta kalma desteğini destekler (%2 v/v)
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)InvitrogenCat#13256029Mitojenik büyüme faktörü; SLC proliferasyonunu ve gövdesini destekler (20 ng/mL)
Bis-akrilamid Şanghay Yuanye Biyo-TeknolojisiCat#S14002Poliakrilamid jeller için çapraz bağlama
Tavuk embriyosu ekstraktıUS BiologicalsCat#C3999Büyüme faktörleri ve besin açısından zengin bir kaynak; SLC büyümesini ve uygulanabilirliğini destekler (%5 v/v)
Fare kuyruğundan Tip I kolajen,YEASENCat#40125ES50SLC yapışmasını ve kültürünü teşvik etmek için Sulfo-SANPAH ile aktive edilmiş poliakrilamid hidrojel yüzeyini kaplar.
Kollagenaz Tip IVGibcoCat#17104-019DMEM/F12 içinde testis dokusu sindirimi için 1 mg/mL
CYP11A1 antikorGeneTexCat#GTX56293Batı blotlama için
DeksametazonSigma-AldrichCat#D1756Glukokortikoid reseptör agonisti; SLC proliferasyonunu ve gövde bakımını destekler (1 nM)
DMEM/F12 ortaGibcoCat#11320033Sindirim, yıkama ve SLC kültürü için bazal ortam
Epidermal büyüme faktörü (EGF)PeproTechCat#AF-100-15SLC proliferasyonunu uyarır ve farklılaşmamış durumu korur (20 ng/mL)
Fetal Sığır Serumu (FBS)VISTECHCat#SE100-011%10 oranında kollagenaz aktivitesini durdurmak için kullanılır
FijiYokhttps://imagej.net/FijiGörüntü analiz yazılımı
GADPH antikoruProteintechCat#60004-1-IgBatı blotlama için
Jel sindirim enzimleri Doğru BiyoteknolojiCat#GXDLFATestis dokusu sindirimi ve SLC izolyasyonu için enzim karışımı
HEPES CytivaCat#SH30237.01pH 7.0&ndash tutmak için tampon kullanın; 7.4
HSD3β AntikorSanta CruzCat#sc-515120Batı blotlama için
Giriş Hücre AyırıcıBDhttps://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
İnsülin-Transferrin-Sodyum Selenit (ITS)Sigma-AldrichCat#11074547001Hücre hayatta kalmasını, glikoz alımını ve antioksidan savunmayı destekler (5 μ g/L)
KnockOut serum replasmanı (KSR)  GibcoCat#10828-028SLC kültür ortamı için serum ikamesi
LIF (Lösemi Engelleyici Faktör)MilliporeCat#LIF1010Kök hücre pluripotensiyi ve kendini yenilemeyi (1 ng/mL) koruyan sitokin
Fare testisleriBu makaleYokC57BL/6 farelerinden izole edilmiş
Fare Testosteron ELISA Kitiİnce BiyoteknolojiCat#40203ES80Kültür süpernatantlarında testosteronun nicelenmesi için
Mouse: C57BL/6 Shenzhen TopBiotechYokTestis toplama için kullanılan fare suşu
Fare: Testiküler Kök Leydig Hücreleri (SLC) & nbsp;Bu makaleYokFare testislerinden izole edilen birincil hücreler
N2 takviyesiInvitrogenCat#17502001Sinirsel ve kök hücre kültürlerini destekleyen tanımlanmış serumsuz takviye (%1 v/v)
Esansiyiz olmayan amino asitlerHyCloneCat#SH30050.03Protein sentezi ve hücre metabolizması için azot kaynakları sağlar (%1 v/v)
Oncostatin M (OSM)PeproTechCat#300-10TSLC farklılaşma regülasyonu ve Leydig hücre olgunlaşmasında rol alan sitokin (20 ng/mL)
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)GibcoCat#10010023Yıkama ve yeniden süspansiyon tamponu
Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)PeproTechCat#100-14BHücre çoğalması, göçü ve hayatta kalmayı destekler (20 ng/mL)
Prism 9.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/İstatistiksel analiz ve grafikleme için yazılımlar
StAR antikoruProteintechCat#67130-1-IgBatı blotlama için
Sulfo-SANPAH MACKLINCat#102568-43-4Jel yüzeyi aktivasyonu için heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı
TEMED PhygeneCat#PH0341Polimerizasyon için katalizör
β-MerkaptoetanolInvitrogenCat#21985023Oksidatif stresi azaltır ve kültürde hücre büyümesini destekler (0,1 mM)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  2. Smith, L. R., Cho, S., Discher, D. E. Stem cell differentiation is regulated by extracellular matrix mechanics. Physiology. 33 (1), 16-25 (2018).
  3. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nature Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  4. Nellinger, S., Kluger, P. J. How mechanical and physicochemical material characteristics influence adipose-derived stem cell fate. Int J Mol Sci. 24 (4), 3551(2023).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  6. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Curr Protoc Cell Biol. , (2010).
  7. Sanzari, I., et al. Parylene C topographic micropattern as a template for patterning PDMS and polyacrylamide hydrogel. Sci Rep. 7 (1), 5764(2017).
  8. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  9. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. J Vis Exp. 46, e2173(2010).
  10. Huang, J., et al. High matrix stiffness triggers testosterone decline in aging males by disrupting stem Leydig cell pool homeostasis. Cell Rep. 44 (9), 116207(2025).
  11. Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses. J Vis Exp. 97, e52643(2015).
  12. Zheng, Y. C., et al. Islet transplantation ameliorates diabetes-induced testicular interstitial fibrosis and is associated with inhibition of TGF-β1/Smad2 pathway in a rat model of type 1 diabetes. Mol Med Rep. 23 (5), 376(2021).
  13. Trottmann, M., et al. Shear-wave elastography of the testis in the healthy man - determination of standard values. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (3), 273-281 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Polyacrylamide HydrogelsMatrix StiffnessStem Leydig CellsExtracellular MatrixHydrogel FabricationCollagen CoatingSubstrate StiffnessCell DifferentiationMechanobiologySteroidogenic Function

İlgili makaleler