Doku faktörü pozitif trombositlerin Tam Kan Akışı Sitometrik Niceleti: Uyumlu Çok Merkezli Bir İş Akışı

Özet

Burada, çok merkezli çalışmalarda doku faktörü pozitif trombositlerin akış sitometrisi nicelesi için uyumlu bir iş akışı sunuyoruz. Protokol, kan toplama, tam kan fiksasyonu, boyama ve cihaz uyumlaştırması için standartlaştırılmış prosedürleri tanımlar; laboratuvar yeteneklerine bağlı olarak analizlerin yerel veya merkezi olarak yapılmasına olanak tanır.

Özet

Doku Faktörü (TF)pos-trombositler, trombosit popülasyonunun bir alt kümesini temsil eder. Son zamanlarda, bu alt kümenin koroner arter hastalığı olan hastalarda kardiyovasküler ölüm oranını öngörebileceği gösterilmiş ve trombotik risk tabakalanması için faydalı bir biyobelirteç olarak kanıtlanmıştır. TF pos-trombositlerinin akış sitometrisiyle doğru nicel edilmesi, özellikle teknik değişkenliğin ölçümlerini etkileyebileceği çok merkezli çalışmalarda, ön analitik işleme, boyama prosedürleri ve cihaz ayarlarının sıkı standartlaştırılmasını gerektirir. Bu protokol, dolaşımdaki TF pos-trombositlerinin tam kan akışı sitometrisi değerlendirmesi için uyumlu bir iş akışını tanımlar; farklı teknik altyapılara sahip laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için tasarlanmıştır. Bu işlem, in vivo trombosit fenotipini korumak için standart kan toplama ve tam kan fiksasyonunu içerir. Yerel laboratuvar yeteneklerine göre örnek hazırlamak için iki farklı yöntem sağlanır: Akış sitometrisi olanakları olmayan merkezler için merkezi boyama, toplama ve analiz için sabit örneklerin Çekirdek Laboratuvar'a sevkili, akış sitometrisi cihazları ve eğitimli personelle donatılmış merkezler için yerel boyama ve toplama. TF pos-trombositlerinin yüzdesinin değerlendirilmesi, hedef protein ve trombosit popülasyon belirtecisini sırasıyla belirlemek için anti-TF Star Fluor 488 ve anti-CD41 PerCP-Cy5.5 antikorlarıyla doğrudan etiketlenerek gerçekleştirilir. Akış sitometre uyumlaştırması, ya aynı sitometre modelleri için ortak bir satın alma şablonu ile ya da farklı platformlar için boncuk tabanlı hizalama yoluyla sağlanır. İş akışı, ayrıca standart bir kapı yaklaşımı ve merkezi veri analizini de içererek TF pos-trombosit ölçümlerinin siteler arasında güvenilir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Temsil eden sonuçlar, bu iş akışının doğrulanmış çok merkezli satın alma ayarlarında TF pos-trombositlerinin tekrarlanabilir nicelenmesini desteklediğini göstermiştir. Bu protokol, trombotik risk tabakasında TF pos-trombositinin daha geniş uygulanmasını kolaylaştırabilir ve translasyonel ve klinik araştırmalarda trombosit akış sitometrisinin daha geniş standartlaştırılmasını destekleyebilir.

Giriş

Doku Faktörü (TF), kan pıhtılaşma zincirinin başlıca başlatıcısıdır ve trombin oluşumunun önemli belirleyicisidir. Subendotel hücreleri ve lökositler tarafından klasik ifadesinin ötesinde, TF dolaşımdaki^trombositler 1,2,3,4,5 ile de ilişkilidir. Trombopoezi sırasında, megakaryositler TF'yi trombositlerin bir alt^{kümesine aktarır 6}. Fizyolojik koşullarda, dolaşımdaki trombositlerin yaklaşık %20–30'u açık kanaliküler sistemde depolanmış TF içerir ve plazma faktörü^{VII 7'den} mekansal olarak ayrılmıştır. Bu bölümlenmiş durumda, TF işlevsel olarak dolaşımdaki koagülasyon faktörlerinden korunur ve hareketsiz kalır. Buna göre, sağlıklı bireylerden alınan tam kan akış sitometrisiyle analiz edildiğinde, trombositlerin yalnızca küçük bir kısmı tespit edilebilir yüzey TF gösterir ve bu da fizyolojik^{homeostaz 2,8'i} yansıtır. Trombosit aktivasyonu ve trombo-inflamatuar dengesizlikle karakterize edilen patolojik durumlar bu dengeyi bozabilir ve yüzeyde TF'nin artmasına yol açabilir. Birçok trombotik^{bozuklukta (}9,10,11,12,13,14,15) TF-pozitif (TF ^pos) trombositlerin yüksek oranları bildirilmiştir. Özellikle, koroner arter hastalığında, %4'ün üzerindeki TF pos-trombositleri 5 yıllık takipte kardiyovasküler ölüm oranını bağımsız olarak öngörür ve bu da TF^{pos-trombositlerinin} yüzdesini trombotik riskin klinik olarak önemli bir biyobelirteci^{olarak belirler 16}.

Bu nedenle, TF pos-trombositlerinin doğru ve tekrarlanabilir nicelendirilmesi, hem translasyonel hem de klinik araştırma uygulamaları için gereklidir. Daha önce yayımlanmış bir trombosit akış-sitometri iş akışı, TF pos-trombosit değerlendirmesi için bu proteinin tek merkezli ortamlarda incelenmesini^{geliştirmiş ve} seçilen ön analitik veya analitik adımların optimize edilmesi konusunda tavsiyeler vermiştir. Ancak bu yaklaşım, çok merkezli çalışmaların ek lojistik ve analitik zorluklarını, sevkiyat prosedürleri, standartlaştırılmış örnek işleme ve ayrıca farklı akış sitometre platformları arasında örnek alımını uyumlaştırma ihtiyacını göz önünde bulundurmak için özel olarak tasarlanmamıştır. Ayrıca, katılımcı merkezlerin farklı altyapı ve teknik uzmanlık seviyeleri de dikkate alınmalıdır.

Bu bağlamda, mevcut protokolün ek değeri, standartlaştırılmış kan toplama ve tam kan fiksasyonu, esnek örnek işleme protokolleri, platformlar arası alma uyumu ve veri analiziyle doğrudan boyama ile merkezi kalite kontrolü birleştiren ayrıntılı bir iş akışı sağlamakta yatmaktadır.

Bu çalışmanın amacı, akış sitometrisiyle tüm kan içinde TF pos-trombosit analizinin uyumlu çok merkezli uygulanması için operasyonel bir çerçeve sağlamaktır. Bu entegre tasarım, ön analitik, analitik ve enstrümanlar arası değişkenliği azaltır ve böylece çoklu merkezli ortamlarda TF pos-trombositlerinin tutarlı değerlendirilmesi için koşul oluşturur.

Protokol

Tüm kan bağışçıları, Kurumun Etik Komitesi tarafından onaylanan yazılı bilgilendirilmiş onay sundu (no.70/24, CE 18.06.24).

TF pos-trombositlerinin tam kan akışı sitometrisi nicelendirilmesi için çok merkezli iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Aşağıda detaylandırılan protokol, kullanıcıyı beş ana adımda yönlendirecektir.

Şekil 1: TF pos-trombosit analizi için çok merkezli iş akışı. Dolaşımdaki TF pos-trombositlerinin çok merkezli değerlendirmesi için analitik boru hattının şematik temsili tam kan akışı sitometrisiyle yapıldı. Katılımcı kaydı ve kan çekilmesinden sonra, örnekler her Klinik Ünitede mevcut teknik kaynaklara göre sabitlenir ve işlenir. Akış sitometrisi tesisi olmayan merkezler, sabit örnekleri boyama, alım ve analiz için Çekirdek Laboratuvar'a gönderir. Akış sitometreleriyle donatılmış merkezler, standart satın alma şablonları kullanarak sahada boyama ve alım işlemi yapabilir. Enstrüman uyumlaştırması, ya paylaşılan şablonlar (aynı enstrüman modeli), Çekirdek Laboratuvar'da oluşturulan şablonlar (hizalama için farklı modeller) veya doğrudan şablon uyumlaştırması mümkün olmadığında floresan boncuklarla kalibrasyon yoluyla sağlanır. Veri analizi, standart bir kapı iş akışı kullanılarak merkezi olarak gerçekleştirilir. Diyagram ChatGPT (OpenAI) kullanılarak oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kan toplama

NOT: TF pos-trombositleri değerlendirmesi maksimum 50 μL tam kan gerektirir.

1. 19 kalibre kelebek iğnesi kullanarak antekubital venden periferik venöz kan toplayın. Turniketi sadece venipturistik için uygulayın ve iğne yerleştirildikten hemen sonra serbest bırakın, böylece ex vivo trombosit aktivasyonu en aza indirilebilir.
2. İlk EDTA tüpünü at. Daha sonra kanı 0.129 M sodyum sitrat vakutaine alır ve tüpü üreticinin işaretine göre doldurarak doğru kan-antikoagülan oranını korur.
3. Kan ve antikoagülantı iyice karıştırmak için nazikçe 5 kez ters çevirin.
4. Tüpü oda sıcaklığında dik tutun, bu yüzden kışkırtma, soğutma veya pnömatik taşıma engel alın.
5. Numuneyi toplandıktan sonra 3 saat içinde işleyin.

2. Numune hazırlama

NOT: Tüm antikorlar Çekirdek Laboratuvarı tarafından satın alınmalı ve hepsi aynı partiden gelmelidir. Devam eden çalışma sırasında parti değişikliği gerektiğinde, yeni reaktif partisi aynı test koşulları altında paralel testlerle doğrudan kullanılan partiye köprülenmelidir ve yalnızca karşılaştırılabilir performans doğrulanırsa benimsenmelidir. Yaygın kullanılan reaktifler (örneğin, PBS – fosfatla tamponlanmış tuzlu su – ve PFA – paraformaldehit) her katılımcı merkez tarafından satın alınabilir; ancak ürün kodları Çekirdek Laboratuvar tarafından kullanılanlarla uyumlu olmalı ve çalışma boyunca parti tutarlılığı korunmalıdır.

1. Numuneyi düzelt.
   NOT: Kan işlem başlatmadan önce, %4 PFA ile oda sıcaklığında PBS ile seyreltilerek %1 PFA hazırlayın.
   DIKKAT: PFA toksiktir ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruma) takılırken kimyasal bir kapüşon içinde ele alınmalıdır. Solumaktan ve cilt ya da gözlerle temas etmekten kaçının. ATI BERTARAF ETMİŞLER: Tüm PFA içeren çözeltileri, sabit örnekleri ve kirlenmiş tüketim malzemelerini kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun şekilde etiketlenmiş, kapalı tehlikeli atık konteynerlerine toplamak.
   1. Vakutaineri nazikçe 5 kez ters çevirerek kan ve antikoagülant karıştırın.
   2. 50 μL kanı, %1 PFA içeren 2 mL tüpte aktarın.
   3. Numuneyi nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 1 saat 30 dakika kuluçka yapın.
   4. 500 μL PBS ekleyin.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g santrifüj yapın.
   6. Süpernatantı çıkarın ve pelleti 1 mL PBS ile yeniden askıya alın.
      NOT: Teknik kontrol noktası: Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarmadan önce peletin görünür olup olmadığını doğrulayın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın, pelleti rahatsız etmeden. Yeniden süspansiyondan sonra, numunenin homojen olup olmadığı ve görünür kümeler veya agregalardan arınmış olduğundan emin olun.
   7. Sabit numune, fiksasyondan sonra 24 saat içinde 2-8 °C sıcaklıkta tutulan sıcaklık kontrollü ambalajda Çekirdek Laboratuvarı'na gönderin. Donma. Belge toplama süresi, fiksasyon süresi ve sevkiyat süresi.
2. Akış sitometrisi analizi için örnek etiketleme.
   NOT: Anti-TF Star Fluor 488 (klon HTF1; anti-CD142) Doku Faktörü'ne karşı yönlendirilirken, anti-CD41 PerCP-Cy5.5 trombosit integrin alphaIIb'yi tanır. Boyama işlemine başlamadan önce, antikorları 17000 x g ile +4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj ile agrega¹⁸ çıkarabilirsiniz. Anti-TF Star Fluor 488 antikorunu (1:100) PBS ile seyreltin. Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 ara seyreltme gerektirmez ve üreticinin önerdiği hacimde kullanılmalıdır.
   1. Dört adet 2 mL polipropilen tüpü hazırlayın.
   2. Her tüpte 80 μL sabit numune dağıtın.
   3. Her tüpte, Tablo 1'de  (Gün 1) belirtildiği gibi doğru hacimli PBS ve anti-TF Star Fluor 488 antikoru ekleyin.
   4. Örnekleri nazikçe karıştır.
   5. O/N'yi karanlıkta 4 °C'de kuluçka edin.
   6. Ertesi gün (2. Gün), Tablo 1'de belirtildiği gibi tüpler 3 ve 4'e anti-CD41 PerCP-Cy5.5 ekleyin.
   7. Örnekleri nazikçe karıştır.
   8. Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
   9. Her tüpü 300 μL PBS ile seyreltin.
   10. Lekeli örnekleri akış sitometrisi alınana kadar karanlıkta saklayın.
       NOT: Örnekler 4 °C'de üç güne kadar^{saklanabilir 17}. Daha uzun depolama sinyal düşüşüne yol açıyor ve kaçınılmalıdır.

		1. Gün		2. Gün
Hayır.	Tüp Kimliği	1X PBS (μL)	Anti-TF Star Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Lekelenmemiş	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tablo 1: TF pos-trombosit değerlendirmesi için boyama protokolü.

3. Akış sitometre alımının standartlaştırılması

1. Bir satın alma şablonunun ayarlanması (Çekirdek Laboratuvar tarafından).
   1. Flow Cytometer A için şablon oluşturuldu.
      1. Yazılımı açın A v2.6.
      2. Hücre popülasyonlarını görselleştirmek için log ölçeğinde FSC-A/SSC-A nokta grafiki [Tüm Olaylar] oluşturun (Şekil 2A).
      3. Bir [Trombositler] kapısı içindeki trombositleri tanımlamak için log-scale'de CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A nokta grafiki [Tüm Olaylar] oluşturun (Şekil 2B).
      4. Bir PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A pseudocolor grafiği [Tüm Olaylar] oluşturun ve yayılma/telafi olup olmadığını kontrol edin (Şekil 2C).
      5. [Platelets] kapısında bir FSC-A/FSC-H nokta grafiki oluşturun ve tekletleri tanımlamak için bir bölge tanımlayın ([Singlets]; Şekil 2D).
      6. [Singlets] kapısında bir CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A nokta grafiki oluşturun ve TF pos-trombositlerini belirleyin (Şekil 2E).
      7. SSC-H'de eşik değerini 1000'e ayarlayın.
      8. Akış hızını "Yavaş" olarak ayarlayın.
      9. Pozitif ve olumsuz olaylar arasında optimal ayrım sağlamak için B525 kazancını 315'e ayarlayın; Gerekirse kullanılan enstrumana göre ayarlama yapabilir.
      10. B690 kazancını günlük kalite kontrolüne göre ayarlayın. Edinim, yalnızca CD41 trombosit popülasyonu negatif arka plandan tamamen çözüldüğünde ve alım sırasında şablonda belirlenen önceden tanımlanmış referans kapısında kalındığında kabul edilebilir.
      11. "Export Experiment Template" kullanarak şablonu dışa aktarın.
      12. İndir: Akış Sitometresi A'da TF pos-trombosit analizi için alınım şablonu, Ek Dosya 1 ve Ek Şekil 1 olarak indirilebilir.
          NOT: Bu çok parametrik analiz için zorunlu olmasa da, yayılma/telafi için kontrol edilen bir grafik (Şekil 2C) dahil edilmiştir. Yine de, bu protokolde önerilen florokrom kombinasyonlarından farklı bir kombinasyonun kullanılıp kullanılmayacağı düşünülmelidir.
   2. Flow Sitometre B için bir şablon oluşturun.
      1. 3.1.1'de tanımlandığı gibi tüm satın alma kurulumunu içeren bir protokol dosyası oluşturun.
      2. Şablonu yazılım B v1.6'daki "Export Protocol" fonksiyonuyla dışa aktarın ve bir protokol dosyası oluşturun.
      3. Alıcı enstrumanda, protokol dosyasını yazılım içindeki "Protokolü İçe Aktar" fonksiyonuyla aktarın.
   3. Flow Cytometer C için şablon oluşturma.
      1. 3.1.1'de tanımlandığı gibi tüm satın alma kurulumunu içeren bir çalışma alanı dosyası oluşturun. ve ihraç eder.
      2. Alıcı enstrumanda, C v3.1 yazılımının "Kopyala" fonksiyonunu kullanarak çalışma alanı dosyasını içe aktarın.
2. Akış sitometrelerinin uyumlaştırılması, kalibrasyon boncukları kullanılarak.
   NOT: 6-peak Rainbow kalibrasyon boncukları kullanın.
   1. Hedef Değer Tanımı.
      NOT: B525 floresan kanalındaki ilk zirvenin Medyan Flüoresans Yoğunluğunu (MdFI) tanımlamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      MdFI_CU =
      burada CU: Klinik Birim Aletleri ve RI: Referans Enstrümantı.
   2. Örnek Hazırlığı.
      1. Boncuk şişesini vortex et.
      2. Bir örnek tüpüne 5 damla boncuk ekleyin.
      3. 1 mL PBS ekleyin.
      4. 5-10 saniye girdap yapın.
   3. Boncuk edinimi.
      1. Log ölçekli bir FSC-A/SSC-A nokta grafiki oluşturun ve [Tüm Olaylar] göstererek [Beads] adlı bir bölge tanımlayın (Şekil 3A).
      2. [Beads] kapısında bir FSC-A/FSC-H nokta grafiki oluşturun ve tekletikleri [Singlet] tanımlamak için bir bölge tanımlayın (Şekil 3B).
      3. Star Fluor 488 floresan kanalı (B525) için bir histogram grafiki oluşturun.
      4. Histogramda yalnızca [Singlet] i gösterin.
      5. İlk zirvenin ( Şekil 3C'deki B bölgesi) tüm genişliği boyunca bir kapı çizin.
      6. İstatistik şeridinde, X Medyan (X-Med) değerlerini gösterin.
      7. Mevcut tazminatları kaldırın.
      8. Akış hızını "Yavaş" olarak ayarlayın.
      9. "Çalıştır" modunda edinmeye başlayın.
      10. "Acquisition settings"ten, B525 voltaj/kazancı hedef değerine göre hesaplanan X-Med hedefine ulaşacak şekilde değiştirin.
      11. [Singlet] kapısında 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyasını ancak kabul kriterine ulaştıktan sonra kaydedin. Hedef aralığı sağlanana kadar çalışma örnekleri alınmamalıdır.

Ek Dosya 1: Flow Cytometer A üzerinde TF^pos-platelet analizi için satın alma şablonu indirilebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Flow Cytometer A'da TF^{pos-trombosit} analizi için alınım şablonunun ekran görüntüsü. (A) FSC-A vs SSC-A nokta grafiki, genel olay dağılımının görsel bir temsilidir. (B) Trombositler CD41 ile SSC-A grafiklerinde tanımlanır ve [Trombositler] olarak kapatılmıştır. (C) Olası yayılmayı değerlendirmek için PerCP-Cy5.5 ile Star Fluor 488 grafiki dahil edilmiştir. (D) Çiftler, [Trombositler] kapısı içinde FSC-A ile FSC-H grafiki kullanılarak dışlanır ve [Singlet] popülasyonunu tanımlar. (E) TF^pos -trombositler, PerCP-Cy5.5 ve Star Fluor 488 floresansına dayanarak [Singlets] kapısında tanımlanır. (F-H) Şablonda uygulanan örnek akış hızı (Yavaş), birincil eşik (SSC) ve dedektör kazançları (B525 ve B690) dahil olmak üzere alım ayarları gösterilmiştir. Satın alma kurulumu ve iş akışının tam detayları bölüm 3.1'de verilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: TF pos-trombositlerinin tanımlanması için satın alma şablonu ve kapı stratejisi. (A) FSC-A/SSC-A nokta grafiki (log ölçeki) tüm tespit edilen olayları gösterir. (B) Trombosit popülasyonunu tanımlamak için kullanılan CD41-A/SSC-A nokta grafiki. (C) Spektral yayılma ve telafi gereksinimlerini değerlendirmek için kullanılan PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 psödo renk grafiki. (D) [Platelets] kapısındaki FSC-A/FSC-H grafiki, dubletleri dışlamak ve singletleri tanımlamak için kullanılır. (E) [Singlets]'te TF pos-trombositlerini tanımlamak için kullanılan PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 nokta grafiki. Parantez içinde gösterilen istatistik alanları, örnek alınırken şablon uygulandığında otomatik olarak örnekle özel değerlerle doldurulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Boncuk tabanlı cihaz kalibrasyon prosedürü. (A) Boncuk olaylarını tanımlamak için kullanılan FSC-A/SSC-A haritası. (B) Boncuk olayları içindeki FSC-A/FSC-H grafiki, agregaları dışlamak ve tekleleri tanımlamak için kullanılır. (C) Star Fluor 488 histogramı, ilk boncuk zirvesine geçitleme uygulanarak ortalama floresans yoğunluğunun belirlenmesi. Görselleştirilmiş istatistikler temsil edici olarak değerlendirilmelidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. TF pos-trombosit analizi için akış sitometrisi örneği elde edilmesi

1. Bir FCM şablonu kullanarak satın alın.
   1. Satın alma şablonunu yazılım A içindeki "Şablonu İçe Aktar" fonksiyonuyla içe aktarın.
   2. 2. adımda hazırlanan örnekleri edinin.
   3. Veri kaydetmeden önce trombosit ve singlet kapılarının referans grafik geometrisiyle eşleştiğinden emin olun. Gerekirse kapıları ayarlayın.
   4. 5–10 saniyelik stabil akıştan sonra kayda başlayın. [Singlets] kapısında  20.000 olaydan oluşan bir veri dosyasını kaydedin (bkz. Şekil 2D). Ücretsiz .fcs dosyalarını kaydedin ve bunları Çekirdek Laboratuvar'a iletin.
2. FCM şablonu olmadan satın alma.
   1. 3.1 bölümünde bildirildiği gibi, tanımlanan beş grafik ve kapı hiyerarşisi dahil olmak üzere bir satın alma çalışma sayfası yeniden oluşturun: Tüm Olaylar > Trombositler > Tekleler > TF/CD41 dörtreleri.
   2. SSC-H'de eşik değerini 1000'e ayarlayın.
   3. Akış hızını "Yavaş" olarak ayarlayın.
   4. 3.2.3'te tanımlandığı gibi B525 voltaj/kazanç ayarlayın.
   5. Adım 2'de hazırlanan örneği alın. 5–10 saniyelik stabil akıştan sonra kayda başlayın; [Singlets] kapısında 20.000 etkinlik edinebilir. Ücretsiz .fcs dosyalarını kaydedin ve bunları Çekirdek Laboratuvar'a iletin.
      NOT: Satın alma yalnızca günlük QC enstrümanı geçirilirse kabul edilebilir. Eğer 20.000 CD41 trombosit hedefine ulaşılamıyorsanız, en az 10.000 CD41^{trombosit olayı} edinin.

5. Veri analizi

NOT: Aşağıda açıklanan analiz iş akışı, merkezi veri işleme ve kalite kontrolünden sorumlu Çekirdek Laboratuvarın faaliyetlerini desteklemeyi amaçlamaktadır.

1. Yeni bir analiz çalışma sayfası açın ve .fcs dosyalarını yükleyin.
2. Her örnek için, Şekil 2'de gösterildiği gibi bir analiz şablonu oluşturun. Aynı olmayan platformlar için, aynı kapı yapısı ve istatistiksel çıktılara sahip eşdeğer platforma özgü bir şablon kullanın.
3. Kapı kapatmanın trombosit popülasyonunu önceden tanımlanmış saçılım özellikleri ve singlet-ayrım stratejisine göre doğru şekilde tanımladığını doğrulayın (Şekil 4A,B,D).
4. Bir sahte renk grafiki ile yayılma/telafi olup olmadığını kontrol edin [Tüm Olaylar] (Şekil 4C).
   NOT: Florokrom Star Fluor 488'in spektral emisyonu 520 nm'dir; PerCP-Cy5.5'in spektral emisyonu ise 676 nm'dir; bu da örtüşme eksikliğini ve hiç telafi gerektirmemesini açıklar.
5. Star Fluor 488 nokta grafikinde aşağıdaki kapı dizisini uygulayın (Şekil 5):
   1. Lekelenmemiş: Kadranları boyasız kontrol kullanılarak tanımlayın, böylece arka plan TF^{pos-olayları} trombosit olaylarının %0,01'inde veya altında kalsın, burada trombosit otofloresansı hariç tutulur (Şekil 5A).
   2. TF: Lekelememiş örnekte tanımlanan dörtlü koordinatları tek boyalı örneklerde TF^{pos-sinyalini} tanımlamak için uygulayın (Şekil 5B).
   3. CD41: Trombositlerin arka plan floresansını dışlamak için tek boyalı CD41 örneğini kullanarak dörtgenleri tanımlayın (Şekil 5C).
   4. TF/CD41: TF/CD41 boyalı örneklerde TF^pos-sinyali tanımlamak için aynı dörtlü koordinatları uygulayın (Şekil 5D).
      NOT: Nihai TF pos-trombosit yüzdesi, analiz yazılımı tarafından oluşturulan istatistiklerden elde edilir ve kapalı trombosit popülasyonunun TF^{pos-dörtreğenine} giren CD41^{pos-olaylarının} yüzdesi olarak bildirilir.
6. Dosya adı tanımlama, reaktif partileri, fiksasyondan satın alma aralığına, nakliye sıcaklığına, olay sayısına ve istisna floresan dağılımlarına merkezi kalite kontrolü yap. Yerel taşıma, gönderim, sabitleme zamanlaması veya satın alma ayarlarında belgelenmiş sapmaları gösteren dosyalar, çalışmaya özgü sapma yönetim planına göre işaretlenmeli, merkezi olarak incelenmeli ve ya hariç tutulmalı ya da tekrarlanmalıdır.

Şekil 4: TF pos-trombosit analizi için ardışık kapı stratejisi. Temsilci analiz iş akışı, .fcs dosyaları yüklendikten sonra trombosit popülasyonlarının tanımlanmasını gösterir. (A-B) Trombosit popülasyonlarının doğru kapıtmasını doğrulayan nokta grafikleri. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 pseudocolor grafiki, spektral yayılmayı değerlendirmek için kullanılır. (D) Trombosit kapısı içindeki FSC-A/FSC-H grafiki, dubletleri hariç tutmak ve tekleleri tanımlamak için kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Veri analizi için şablon. (A)'nın temsil eden nokta grafikleri, temel otofloresans ve kuadrant konumlandırmayı tanımlamak için kullanılan lekelenmemiş kontrol. (B) TF tek boyalı numune; (C) Kadran konumlandırmasını tanımlamak için kullanılan CD41 tek boyalı numune. (D) TF pos-trombosit analizinde kullanılan TF/CD41 çift boyalı numune. Rakamlar, temsil eden bir örneklemdeki TF pos-trombositlerinin yüzdesini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu iş akışı, heterojen teknik altyapıya sahip merkezlerin TF pos-trombositlerinin nicelendirilmesini gerektiren çok merkezli çalışmalara katılmasına olanak sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Şekil 1, dolaşımdaki TF pos-platesitlerini tam kan akışı sitometrisiyle ölçmeyi amaçlayan çok merkezli çalışmaları desteklemek için tasarlanmış organizasyonel iş akışı diyagramını göstermektedir. Katılımcı merkezlerde mevcut teknik kaynaklara bağlı olarak farklı örnek hazırlama prosedürleri uygulanır. Özellikle, (i) bir Klinik Birimin akış sitometrisi tesisi veya eğitimli personeli olmadığında, tam kan örnekleri toplandıktan hemen sonra fiksasyona tabi tutulur ve ardından merkezi boyama, toplama ve analiz için Çekirdek Laboratuvar'a gönderilir. (ii) Alternatif olarak, akış sitometrisi tesislerine sahip merkezler yerel olarak boyama ve satın alma işlemi yapabilir. Bu durumlarda, veri toplama Çekirdek Laboratuvar tarafından tanımlanan uyumlu bir iş akışını takip eder. Eğer cihaz modeli Çekirdek Laboratuvar'da kullanılanla eşleşiyorsa, satın alma Çekirdek Laboratuvar tarafından sağlanan standart bir şablon kullanılarak gerçekleştirilir. Farklı enstrüman modelleri kullanıldığında, uyumlandırma ya Çekirdek Laboratuvarda hizalama için mevcut olan şablon transferiyle ya da örnek toplamadan önce boncuk tabanlı kalibrasyon prosedürleriyle sağlanabilir. Numuneler daha sonra standartlaştırılmış iş akışına göre alınabilir ve analiz edilebilir.

Aşağıdaki temsilci sonuçlar, resmi çok merkezli test doğrulaması sağlamak yerine iş akışı fizibilitesini ve temel uyum aşamalarını göstermek amacıyla tasarlanmıştır. Güvenilir TF tespitini sağlamak için, boyama stratejisi önce spektral uyumluluk ve sinyal kararlılığı açısından değerlendirildi. Trombositler anti-CD41 PerCP-Cy5.5 kullanılarak tanımlandı, TF tespiti ise Star Fluor 488 ile konjuge edilmiş anti-TF monoklonal antikora dayandı. Tespit kanalları arasında floresan yayılmasının yokluğunu doğrulamak için tek boyalı kontroller kullanıldı. Şekil 6A'da gösterildiği gibi, CD41 PerCP-Cy5.5 tek boyalı örnekler Star Fluor 488 kanalında tespit edilebilir sinyal üretmemiştir. Tutarlı olarak, çift boyalı örneklerde ölçülen TF pos-trombositlerin yüzdesi, TF tek boyalı örneklerde elde edilenle karşılaştırılabilirdi (Şekil 6B).

Şekil 6: Boyama özgüllüğünün doğrulanması. (A) Sinyal özgüllüğünü doğrulamak için PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 nokta grafikinde analiz edilen tek boyalı anti-CD41 PerCP-Cy5.5 örneği. (B) TF tek boyalı ve çift boyalı örneklerde ölçülen TF pos-trombositlerin yüzdeleri, bireysel çift ölçümler (noktalar) ve ortalama ± SD (n = 18 bağımsız denek) olarak gösterilir. Veriler, Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler imzalı sıralama testiyle analiz edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.Önerilen testin analitik hassasiyeti, n=200 sağlıklı denek örneklerinde değerlendirildi. Biyolojik olarak boş örnekler kullanıldığında, hesaplanan boşluk sınırı (LoB) %0,39, tespit sınırı (LoD) %0,77 ve nicelik sınırı (LoQ) %1,12 idi, CV ile ilişkili en düşük seviye %20 olarak tanımlanmıştır≤ Geçiş stratejisinin operatörler arası tekrarlanabilirliği, önceden tanımlanmış analiz şablonu kullanılarak 6 operatör tarafından analiz edilen 40 bağımsız örneklemde değerlendirilmiş ve ICC 0.985 (%95 GA: 0.978-0.990) olarak sonuçlanmıştır.

Tam kan fiksasyonundan sonra TF tespit kararlılığı, sabit örneklerin boylamasına boyanmasıyla değerlendirildi. Fiksasyon gününde boyanan başlangıç örnekleriyle (D0) karşılaştırıldığında, TF pos-trombosit seviyeleri fiksasyondan sonra (D3-D4) dört güne kadar sabit kaldı ve D3-D4'te yalnızca yaklaşık %22'lik anlamlı olmayan bir azalma gösterdi (TF^{pos-trombositlerinde} %77,8 ± %7,2 - göreli yüzde) D0 seviyesine göre bu oran. Boyama D5-D6 seviyelerinde yapıldığında, TF pos-trombosit tespiti %53,8 ± %20,7'ye anlamlı şekilde düştü (TF^{pos-trombositlerinde} göreli oran; p< 0.0001; Şekil 7). Bu sonuçlar, sabit örneklerin fiksasyondan sonraki dört gün içinde yalnızca mütevazı bir sinyal kaybı ile güvenilir şekilde analiz edilebileceğini göstermektedir.

Şekil 7: Örnek fiksasyonundan sonra zaman süreci analizi. Fiksasyondan sonra farklı zaman noktalarında ölçülen TF pos-trombositlerinin nicelendirilmesi x-ekseninde şu şekilde gösterilmiştir: D0 = kan toplama günü; D1 = 1. gün; D2 = 2. gün; D3-4 = 3 veya 4. gün; D5-6 = 5. veya 6. gün. Veriler, D0 ile karşılaştırıldığında ortalama ± SD göreli yüzdesi olarak ifade edilir (n = 7-10 sağlıklı denek, belirtilen fiksasyon sonrası zaman noktalarında değerlendirilir). Veriler Anova kullanılarak analiz edildi ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Uyumlu satın alma iş akışının performansı daha sonra farklı akış sitometri platformlarında değerlendirildi. Şablon tabanlı uyumlaşma ilk olarak referans sitometre olarak FACSLyric ve MACSQuant aletleri kullanılarak değerlendirildi. Aynı modellerin dış tesislerde bulunan ek aletleri test platformları olarak kullanıldı. Dinlenme trombositleri içeren tam kan örnekleri, standart alım şablonu kullanılarak hem referans hem de test cihazlarında alındı. Şekil 8A,B'de gösterildiği gibi, referans ve test sitometrelerinde karşılaştırılabilir TF pos-trombosit yüzdeleri elde edilmiş ve paylaşılan şablon yaklaşımının tekrarlanabilirliğini doğrulamaktadır.

Şekil 8: Paylaşılan satın alma şablonları kullanılarak çapraz enstümanlar arası tekrarlanabilirlik. Referans ve test FACS ile alınan n=6 sağlıklı denek tam kanda ölçülen TF^{pos-trombositlerinin} yüzdeleri, ortak bir alım şablonu aracılığıyla alınmıştır. Veriler bireysel belirlemeler (noktalar) ve ortalama SD ± olarak ifade edilir. Veriler eşleştirilmiş bir t-testi ile analiz edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, farklı konfigürasyonlara sahip enstrümanları hizalamak için boncuk tabanlı uyum değerlendirildi. Referans cihaz olarak Sitometre A, test aleti olarak ise FACSymphony kullanıldı. Hizalama, FACSymphony 488 nm dedektör voltajını ayarlayarak 6-peak Gökkuşağı kalibrasyon boncukları kullanılarak gerçekleştirildi; boncukların floresans yoğunluğu önceden belirlenmiş hedef aralığına düşene kadar. Hizalama öncesi ve sonrası boncuk zirve dağılımlarını gösteren histogram profilleri Şekil 9A'da gösterilmiştir. Kalibrasyondan önce ve sonra test cihazında tam kan örnekleri alındı. Uyumlaştırmadan önce, TF pos-trombosit yüzdeleri iki platform arasında farklıydı. Boncuk tabanlı hizalama sonrası, referans sitometrede elde edilen değerlerle (Şekil 9B) yakından eşleşmiş ve başarılı çapraz platform uyumlaştırma ile tekrarlanabilir TF nicelenmesini göstermiştir.

Şekil 9: Boncuk tabanlı enstrüman uyumları. (A) Kırmızı tepelerden önce ve sonra (yeşil tepeler) alet hizasından önce elde edilen 6-pikli gökkuşağı kalibrasyon boncuklarının temsil floresans histogramı. (B) Test cihazında (Pre) ve (Post) uyumdan önce alınan n=6 sağlıklı denek ile hazırlanan dinlenme örneklerinde ölçülen TF pos-trombositlerin yüzdeleri. Referans cihazda elde edilen ölçümler karşılaştırma için gösterilir. Veriler, eşleştirilmiş bir t-testi ile analiz edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, TF pos-trombositlerinin tam kan akışı sitometrisi olarak adım adım bir iş akışı sunar ve çok merkezli bir uygulama için özel olarak tasarlanmıştır. Trombosit akışı sitometrisi analizine dayalı geleneksel iş akışlarına göre temel metodolojik avantajı, kan toplama ve tam kan fiksasyonundan örnek etiketlemesine, örnek alınmadan önce cihaz uyumlaştırmasına ve merkezi analiz ile veri kalitesi kontrolüne kadar tüm analitik süreci standartlaştırmasıdır. Bu, numune işleme yeteneği olmayan merkezlerin çok merkezli çalışmalara katılmasını sağlar; eğer kan örnekleri sağlayabiliyorlarsa. Mevcut iş akışı, trombositlerin yalnızca çok küçük bir kısmının fizyolojik koşullarda tespit edilebilir yüzeyle ilişkili TF gösterdiği göz önüne alındığında, merkezler arası değişkenliğin pratik kaynaklarını ele^{almaktadır 7,8}. Bu kaynaklar arasında yerel örnek işleme, akış sitometrisi olanaklarına erişim, cihaz konfigürasyonu ve operatöre bağlı veri analizindeki farklılıklar yer alır.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, tüm kan toplandıktan kısa süre sonra sabitlenir, bu da in vivo trombosit fenotipini stabilize eder ve hemen etiketleme ile örnek alma ihtiyacını ortadan kaldırır. Temsilci sonuçlar, bu sabit örneklem yaklaşımının doğrulanmış fiksasyon sonrası aralık içinde gecikmeli merkezi işlemeye olanak sağladığını göstermektedir. Bu, sahada akış sitometrisi olanakları olmayan merkezlere çalışma katılım potansiyelini genişletirken, tutarlı bir ön analitik iş akışını korur. Protokolün ikinci avantajı, basit iki renkli panelle basitleştirilmiş bir doğrudan boyama stratejisinin kullanılmasıdır ve bu da prosedürün karmaşıklığını azaltır.

Panelde, TF'nin katalitik yerini tanıyan ve faktör VII bağlanmasıyla rekabet eden, iyi karakterize edilmiş anti-TF monoklonal antikor klonu HTF1'i kullandık; bu da trombositler 14,16,17'de TF tespit için mevcut en güvenilir reaktiflerden biri olmuştur. Antikor, FITC'ye spektral olarak benzer ancak sinyal kararlılığını artıran parlak, fotostabil florokrom olan Star Fluor 488'e konjuge edildi. Önemli olarak, 488 nm'de uyarılma, giriş seviyesi cihazlar da dahil olmak üzere neredeyse tüm geleneksel akış sitometrelerinde bulunan mavi lazer konfigürasyonu ile örnek algılanmasına olanak tanır. Epitop özgüllüğü ve doğrudan florokrom tespitinin bu kombinasyonu, birden fazla yerde analitik hassasiyeti ve ölçeklenebilirliği artırır. Bu testte, pozitiflik eşikleri, düşük frekanslı popülasyonlarda eşik yerleştirme izotip kontrolüne kıyasla daha iyi bir seçenek olarak lekelenmemiş ve FMO kontrolleri kullanılarak^{tanımlanmıştır 18}.

Farklı akış sitometrelerinin kullanımı, çok merkezli akış sitometrisi çalışmalarında değişkenlik kaynağı^olabilir 19,20,21. Daha önce ön analitik işleme, boyama kurulumu ve yerel enstrüman optimizasyonu¹⁷ konularında tavsiyeler vermiştik. Ancak bu önlemler, farklı platformlar arasında tutarlı floresans sinyallerini garanti etmez. Mevcut iş akışı, merkezi analiz ile potansiyel satın alma uyumlaştırmasını birleştirerek bu sorunu ele almaktadır. Ortak edinim şablonları aynı sitometreler mevcut olduğunda kullanılabilirken, farklı platformların dahil edilmesi gerektiğinde boncuk tabanlı hizalama uygulanabilir. Bu çift strateji, heterojen yerel alımdan sonra yalnızca merkezi analizlere dayanan çok merkezli analitik modellere karşı pratik bir avantaj sunar; veri analizinin başlangıçta değişkenliğini azaltır ve siteler arasında daha tekrarlanabilir kapı uygulamasını destekler.

İş akışının genellenebilirliği abartılmamalıdır. Protokol, belirli tam kan fiksasyon koşulları, anti-TF-Star Fluor 488 ve anti-CD41 PerCP-Cy5.5 reaktif kombinasyonu, uyumlaştırma prosedürleri ve sınırlı bir akış sitometre konfigürasyonları seti kullanılarak doğrulandı. Diğer anti-TF klonları, florokrom kombinasyonları, fiksasyon zamanlamaları veya fiksatif konsantrasyonlar veya önemli ölçüde farklı optiklere sahip akış sitometreleri kullanılırsa, iş akışının analitik performansı kontrol edilmelidir. Genel olarak, herhangi bir protokol hatası, önerilen önceden tanımlanmış sapma kuralları üzerinden yönetilmelidir. Sapmanın şiddetine bağlı olarak, veriler çalışmaya özgü sapma planına göre işaretlenebilir, tekrarlanabilir veya hariç tutulabilir. Bu sınırlar içinde, mevcut protokol TF pos-trombosit analizinin çok merkezli uygulanması için operasyonel bir çerçeve olarak değerlendirilmelidir. Resmi analitik doğrulama, daha geniş laboratuvarlar arası performans değerlendirmesi, sevkiyat doğrulaması ve test tekrarlanabilirliği dahil, şu anda Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği tarafından hazırlanmış özel bir uluslararası standartlaştırma çalışmasında ele alınmaktadır. Doğru TF pos-trombositlerinin nicel olarak ölçülmesinin klinik önemi, koroner arter hastalıklarında prognostik değerini gösteren kanıtlarla vurgulanmaktadır; burada %4'ü aşan TF^{pos-trombositleri} beş yıllık takipte uzun vadeli kardiyovasküler ölüm oranını bağımsız olarak öngörmektedir¹⁶. Bu nedenle, TF^{pos-platesitlerini} bir biyobelirteç olarak doğrulamak ve uygulamanın ileriye yönelik klinik denemeler ile gerçek dünya kayıtlarına genişletilmesi için güvenilir çok merkezli ölçüm gereklidir. Gelecekteki otomatik normalizasyon algoritmaları ve otomatik stratejilerin uygulanması, operatör önyargısını daha da azaltabilir ve merkeziyetsiz analizi desteklerken sahalar arası^{karşılaştırılabilirliği koruyabilir 22,23}.

Sonuç olarak, bu uyumlu iş akışı, çoklu merkezli ortamlarda tam kan akışı sitometrisiyle TF pos-trombositlerinin nicelendirilmesi için pratik ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Standartlaştırılmış ön analitik prosedürleri, basitleştirilmiş örnek işleme ve cihaz uyumlaştırma stratejilerini birleştirerek, protokol TF pos-trombositlerinin güvenilir çapraz karşılaştırmasını sağlar. Burada açıklanan ilkeler, trombotik riskin biyobelirtecisi olarak TF pos-trombositlerinin değerlendirilmesini desteklemenin yanı sıra, translasyonel ve klinik araştırma uygulamaları için trombosit akış sitometrisinin daha geniş standartlaştırılmasına katkıda bulunabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Antikorlar ve numune seyreltme için
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Platelet popülasyon belirteci olarak kullanılan anti insan CD41a monoklonal antikoru; Temel Laboratuvar tarafından sağlanmalıdır
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anti insan Doku Faktörü (CD142) monoklonal antikoru; Temel Laboratuvar tarafından sağlanmalıdır
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	katalog dışı ürün	Metinde, Akış Sitometrisi B
BD FACSuite yazılım v1.6	BD	katalog dışı ürün	Metinde, yazılım B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Kan alma için
CytExpert Yazılım	Beckman Coulter	katalog dışı ürün	Metinde, yazılım A
CytoFLEX S akış sitometrisi	Beckman Coulter	katalog dışı ürün	Metinde, Akış Sitometrisi A
MACSQuant Akış Sitometrisi	Miltenyi Biotec	katalog dışı ürün	Metinde, Akış Sitometrisi C
MACSQuantify yazılım v3.1	Miltenyi Biotec	katalog dışı ürün	Metinde, yazılım C
Eppendorf tüpleri 2 mL	Eppendorf	120094	Tam kan fiksasyonu için
Paraformaldehit	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Numuneleri sabitlemek için
Pipet uçları 10 µL	Gilson	F161630	Kan örneklerini transfer etmek için
Pipet uçları 1000 µL	Gilson	F161670	Kan örneklerini transfer etmek için
Pipet uçları 200 µL	Gilson	F161930	Kan örneklerini transfer etmek için
Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp 5 mL	Corning	352052	Akış sitometrisi alımı için gerekli
Rainbow kalibasyon boncukları (6 zirve)	Spherotech (BD)	556286	Akış sitometrisi uyumlu hale getirme için
Vacutainer EDTA	BD	368857	Kanın ilk 3ml'sini toplamak için
Vacutainer çoklu numune luer adaptörü	BD	367300	Kan alma için
Tek kullanımlık Vacutainer tutucu	BD	364815	Kan alma için
0,129 M sodyum sitratlı Vacutainer	BD	363079	Kanı toplamak için