CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Summary

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

Abstract

Konnektom çalışmaları, çeşitli türlerin sinir sistemlerinde sinaptik bağlantının anlaşılmasını büyük ölçüde genişletmiştir. Sinaptik partnerlerin elektron mikroskopisi (EM) kullanılarak karakterizasyonu ayrıntılı anatomik bilgi sağlarken, nöronal ağların fonksiyonel yönleri tamamlayıcı yaklaşımlar gerektirir. Drosophila'da yapılan son çalışmalar, sadece larvanın tam konnektomunu değil, erkek ve dişi yetişkin merkezi sinir sistemini de ortaya çıkarmıştır; aynı zamanda larva nosiseptif ağı gibi belirli davranışları düzenleyen nöronal ağların hücresel bileşenlerini de ortaya koymuştur. Üçüncü instar larva evresinde, sınıf IV dendritik arborizasyon (cIVda) multidendritik duyusal nöronlar (nosiseptörler), Basin-4 internöronlarla çoğu sinaptik temas kurar. Bu anatomik bağlantıların işlevsel önemini değerlendirmek için, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi CaMPARI (Kalsiyum Modüle Edilmiş Fotoaktiflenebilir Ratiometrik Integratör), canlı, diseksiye edilmemiş üçüncü instar larvalarda cIVda nöronları ile Basin-4 internöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı değerlendirmek için aktiviteye bağlı bir raporlayıcı olarak kullanıldı. CaMPARI, yükselen hücre içi kalsiyum seviyelerine yanıt olarak emisyon spektrumu değişen ratiometrik floresan bir göstergedir. Başlangıç koşullarında, CaMPARI yeşil floresan; Yüksek kalsiyum konsantrasyonları ve fotodönüşüm ışığına (~400 nm) maruz kaldığında, geri dönüş edilemez şekilde kırmızı floresansa geçer. Postsinaptik nöronlara kalsiyum akışı sinaptik aktivasyonun ayırt edici özelliği olduğundan, CaMPARI fotodönüşümü fonksiyonel sinaptik sinyalleşmenin bir göstergesini sağlar. Üçüncü instar larvaları, kırmızıya kaydırılmış kanalrhodopsin CsChrimson kullanılarak mikroskop slaytında immobilize edilen ve Basin-4 nöronlarında eşzamanlı CaMPARI fotodönüşümü ile birleştirilerek cIVda nosiseptörlerinin optogenetik aktivasyonu için adım adım bir yöntem sunulmaktadır. Basin-4 nöronlarında kalsiyuma bağımlı fotodönüşüm, iç hareketlere ve odak düzlemindeki değişikliklere rağmen, bu hücreler arasındaki sinaptik bağlantının fonksiyonel kanıtı sunar. Bu, CaMPARI'nin sağlam ve diseksek olmayan Drosophila larvalarında presinaptik optogenetik uyarımla birlikte kullanılmasının ilip kanıtı olarak hizmet eder.

Introduction

Merkezi sinir sisteminde (CNS) kesin sinaptik partnerlerin tanımlanması, sinir sistemi gelişimi sırasında sinaptik bağlantıların oluşumu ve iyileştirilmesini izlemeyi sağlar. Buna göre, çabalar hacimsel elektron mikroskopisi (EM) kullanılarak yalnızca Caenorhabditis elegans ^1,2 ve Drosophila melanogaster ^3,4,5 gibi güçlü genetik model organizmalarda tam konnektomları değil, aynı zamanda fare birincil görsel^{korteksi 6} ve insan temporal^{korteksi 7} dahil olmak üzere karmaşık memeli beyinlerinin milimetre ölçekli EM hacimlerini yeniden inşa etmek için odaklanmıştır . Bu çalışmalar, anatomik düzeyde sinaptik bağlantının temelinde duran organizasyonel ilkelere benzersiz bir bakış açısı sunmaktadır. Ancak, sinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu, nöronal bağlantıya tamamlayıcı bir bakış sunar ve anatomik bulguları doğrulamak için gereklidir.

Drosophila, nöronal bağlantıların incelenmesi için birçok avantaj sunar;^{larva 3} ile dişi⁴ ve erkek⁵ yetişkin merkezi sinir sistemi için tam konnektomların bulunabilirliği ve öngörülebilir davranışları düzenleyen iyi karakterize edilmiş nöronal devreler ^8,9,10. Larval nosiseptif ağı, hassas sinaptik bağlantıyı incelemek için bu tür çok uygun^{devrelerden biridir 11}. Bu ağın EM rekonstrüksiyonu, nosiseptif uyarıcının işlenmesi için gerekli olan ayrıntılı sinaptik ortaklıkları ortaya koymuştur ve bu da nocifensif yuvarlanma olarak bilinen karakteristik kaçış^{davranışına yol açmıştır 12,13}.

Bu ağ içinde, sınıf IV dendritik arborizasyon (cIVda) nöronları¹⁴, ağrı tespitinden sorumlu birincil duyusal nosiseptör^{olarak işlev görür 11,12,13,15,16}. Hücre gövdeleri ve dendritleri vücut duvarında periferik olarak konumlanırken, aksonları larva ventral sinir kordonuna (VNC)¹⁵ doğru projeksiyon yapar. MSS içinde, cIVda nöronları aksonal terminallerini stereotipik bir desenle arborize eder ve Basin-4^{interneuronları} 11,12,13,17 ile sinaptik temaslarının çoğunluğunu oluşturur. Bu tanımlanmış sinaptik ilişki, cIVda nöronları ve Basin-4 internöronları in vivo sinaptik bağlantının fonksiyonel değerlendirmesi için ideal bir çift olarak konumlandırır. Bireysel olarak tanımlanan sinaptik partnerler arasındaki fonksiyonel bağlantıları analiz etme yöntemlerinin geliştirilmesi, özellikle genetik olarak yönetilebilir ve stereotipli sinir devrelerine sahip sistemlerde sinaptik gelişim ve iyileştirmenin altında yatan mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıracaktır.

CaMPARI (Kalsiyum Modülasyonlu Fotoaktiflenebilir Ratiometrik Integratör)¹⁸, yükselen hücre içi kalsiyum seviyelerine yanıt olarak emisyon spektrumu değişen genetik olarak kodlanmış bir ratiometrik floresan göstergesidir. Başlangıç koşullarında, CaMPARI yeşil floresan; Yüksek kalsiyum konsantrasyonları ve fotodönüşüm ışığına (~400 nanometre (nm)) maruz kaldığında, geri dönüşü olmayan şekilde kırmızı floresans^18'e dönüşür. Postsinaptik nöronlara kalsiyum akışı sinaptik aktivasyonun ayırt edici özelliği olduğundan, CaMPARI fotodönüşümü fonksiyonel sinaptik sinyal^19,20 okumasını sağlar.

CaMPARI'nin yanı sıra, nöronal aktivite GCaMP veya RCAMP²¹ gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI) ve Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ veya VARNAM²⁵ gibi genetik kodlanmış voltaj göstergeleri (GEVI)² gibi geri dönebilir sensörlerle görselleştirilebilir. Bu hızlı ve geri çevrilebilir sensörler, geçici aktiviteleri gerçek zamanlı izlemek için çok uygun olsa da, in vivo görüntüleme sırasında hareket artefaktlarına karşı hassastır. Buna karşılık, CaMPARI'nin bütünleşik ve geri dönüşü olmayan fotodönüşüm özellikleri, belirli bir zaman aralığında aktivitenin yakalanmasını sağlar ve görüntüleme²⁰ sırasında odak düzlemleri kaydığında bile nöron aktivasyonunun tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, CaMPARI fotodönüşümü menekşe ışığın yoğunluğunu ayarlayarak ayarlanabilir; bu da azalmış sinaptik güç veya alt eşik^{girdilerinin tespitini sağlar 26}. Bu özellikler, fare korteks²⁷, zebrafish beyni²⁸, C. elegans²⁹ ve yetişkin Drosophila²⁰ üzerinde yapılan çalışmalar dahil olmak üzere, başı fiksasyonu veya bağlanma olmadan serbest hareket eden hayvanlarda aktivite haritalamasını mümkün kıldı.

Fonksiyonel sinaptik partnerlerin CaMPARI fotodönüşümü ile presinaptik optogenetik uyarımla konfigür ve konfokal mikroskopi ile bütün, diseksiyon edilmemiş Drosophila larvalarında görselleştirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşımda, CaMPARI, canlı üçüncü instar larvalarda cIVda nöronlarının optogenetik aktivasyonu sonrası Basin-4 internöronlarında postsinaptik kalsiyum akışını tespit etmek için kullanılır. cIVda nöronları kırmızı ışıkla aktive edilen kanalrodopsin CsChrimson 30,31'i ifade ederken, Basin-4 internöronları CaMPARI'yi ifade eder. Kırmızı ışığa maruz kalmak, nosiseptörleri seçici olarak aktive eder ve zamansal kontrollü bir şekilde nosiseptif uyarıcıyı^{taklit eder 16,30}. Bu strateji, presinaptik aktivasyonun postsinaptik nöronlarda kalsiyuma bağlı CaMPARI fotodönüşümünü indükleyip indüklemediğini değerlendirmeye olanak tanır ve böylece sinaptik bağlantının fonksiyonel kanıtı sağlar.

CIVda–Basin-4 bağlantısının analizinde CaMPARI'nin CsChrimson ile birlikte kullanılmasını destekleyen çeşitli teknik avantajlar vardır. İlk olarak, cIVda dendritleri larva vücut duvarının tam, örtüşmeyen bir döşemesini^{oluşturur 32}, böylece diseksiyon kaynaklı hasardan kaynaklanan kafa karıştırıcı etkiler olmadan sağlam duyusal nöronların optogenetik aktivasyonu^{mümkün kılar 16}. İkincisi, larvalar mikroskop slaytında fiziksel olarak hareketsiz olsa da, iç hareketler görüntüleme sırasında sıklıkla CNS konumunu ve odak düzlemini değiştirir; CaMPARI fotodönüşümü bu tür hareket artefaktlarına karşı daha az duyarlıdır ve nöron aktivitesinin kararlı, zamanla entegre bir okumasını sağlar. Üçüncü olarak, CaMPARI'nin bütünleyici ve ayarlanabilir özellikleri, erken gelişim aşamalarında sinaptik güç veya temas sayısı azaldığında bile sinaptik aktivitenin tespit edilmesini sağlar ve böylece sinaps oluşumu ve arıtılması üzerine gelecekteki çalışmaları destekler.

Protocol

Drosophila melanogaster ile ilgili tüm deneysel prosedürler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Genotip w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (RRID:BDSC_54899¹² ve RRID:BDSC_32079^16'nın yeniden birleştirilmesiyle elde edilen) optogenetik ve CaMPARI ekspresyonunu sürmek için kullanıldı (w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2 hattı kullanılarak; SP/Cyo, sırasıyla pre- ve postsinaptik partnerlerde RRID:BDSC_81085 ile ikinci kromozom belirteçleriyle yeniden birleştirilerek elde edilmiştir. Bu protokolde kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Larvaların hazırlanması

1. Bakire dişi UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; Örneğin, BDSC_81085 iki ikili sistem içeren bir sinek hattından erkekler, ilgi duyulan presinaptik nöron GAL4 ifadesini yönlendiriyor ve ilgilenilen postsinaptik nöron LexA ^33,34'ü yönlendiriyor.
2. Standart mısır unu agar^{ortamı 35,36,37,38} içeren plastik şişelerde genetik çaprazlamaları 0.5 mM all-trans retinal (ATR) ile takviye edilmiş ve CsChrimson ^{aktivasyonu 30,33} için ayarlanmıştır. ATR olmadan paralel şişeleri ATR kontrolleri olarak hazırlayın.
   NOT: Mısır unlu agar ortamını kaynatmadan eritin. Sertleşmeden soğumasına izin verin. 40 mM ATR stok çözeltisi (üretici talimatlarına göre %95 etanol ile seyreltilmiş toz ATR) hazırlayın, ardından ortamda 0,5 mM kadar seyreldin ve iyice karıştırın.
3. Şitilleri tamamen alüminyum folyo ile kaplayın, böylece ışığa maruz kalmayı önleyin.
   NOT: ATR'nin ışığa duyarlı olması nedeniyle sürekli karanlıkta yetiştirme koşullarını sürdürmek ve istenmeyen nöronal aktivasyonu önlemek için gereklidir. CsChrimson en çok kırmızı ışığa (590–680 nm) duyarlı olsa da, diğer görünür dalga^{boyları 31,39} tarafından da aktive edilebilir.
4. Şişeleri 25 °C'de kuluçka altına geçirin ve larvaları üçüncü instar aşamasına yükseltin.

2. Larva immobilizasyonu

1. Bir fırça ile üçüncü bir larva toplayın. Larvaları 0,1 M PBS içeren üç kuyruklu mikro spot plakada yıkayarak yiyecekleri çıkarabilirsiniz.
   NOT: Fazla PBS'yi çıkarmayın; Hidrasyonun korunmasına yardımcı olur.
2. Temiz bir örtü örtüsünün her köşesine (18 × 18 mm) az miktarda modelleme kilini yerleştirin. Larvayı coverslip üzerindeki bir damla PBS içine yerleştirin ve ventral tarafı aşağıya doğru yönlendirilmesini sağlayın.
   NOT: Ventral sinir kordonunun (VNC) görüntülenmesi için, larvayı dorsal tarafına monte ederek ventral yüzeyin örtü slipine temas etmesi sağlanır. Bu yönelim, VNC'deki Basin-4 internöronlarının coverslip üzerinden hedefe bakmasını sağlar.
3. Larvanı içeren kapak parçasının üzerine temiz bir mikroskop slaytı yerleştirin.
4. Köşelere ek modelleme kil uygulayarak örtü kıvılcımını sabitleyin. Larvanı hareketsiz hale getirmek için yeterli baskı uygulayın, larvanın yırtılması veya örtü kayması önlenmesini önleyin.

3. Uyarım, fotodönüşüm ve görüntüleme iş akışı

1. Yeşil (488 nm, %0,8 lazer gücü) ve kırmızı (~561 nm, %0,8 lazer gücü) kanallarını kullanarak CaMPARI'yi ifade eden postsinaptik nöronlardan oluşan temel z-yığını edinin. 40×/1.2 objektif konfokal mikroskopta 1 μm, 256 × 256 piksel çözünürlük, çizgi ortalaması 2, çift yönlü tarama ve 9 tarama hızı kullanın. Tüm görüntülemeyi karanlık bir ortamda yapın. Deney boyunca aynı z-stack parametrelerini koruyun.
   NOT: Larva VNC'de stereotipik pozisyonlarda parlak yeşil hücre gövdeleri bekleyin ve başlangıçta tespit edilebilir kırmızı floresans yok.
2. Larvayı 30 saniye boyunca eşzamanlı fotodönüşüm ışığı (405 nm, %0,5 lazer gücü) ve optogenetik uyarım ışığı (594 nm, %0,8 lazer gücü) kullanarak sürekli uyarın.
3. Hem kırmızı (~561 nm) hem de yeşil (488 nm) kanallarda 3.1. adımdaki parametrelerle uyarılma sonrası z-yığını elde edin. VNC hücre gövdelerinin biçek konumlara benzer konumlarda olması bekleniyor. ATR ile beslenen larvalarda uyarı sırasında aktive olan nöronlarda kırmızı CaMPARI floresansını tespit etmek, ATR olmadan kontrol sistemlerinde minimum fotodönüşüm ile gerçekleşir.
   NOT: İş akışı ve parametreler Şekil 1'de özetlenmiştir.

Şekil 1: Uyarım, fotodönüşüm (PC) ve görüntüleme için iş akışı. Basin-4 nöronlarında kalsiyum aktivitesini değerlendirmek için üç ardışık görüntüleme aşaması kullanıldı. Temel aşamada, z-yığınları uyarılmadan önce yeşil ve kırmızı CaMPARI floresansını yakalamak için 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak alındı. Uyarım aşamasında, cIVda nöronları CsChrimson (594 nm) ile optogenetik olarak aktive edilirken, eşzamanlı 405 nm aydınlatma fotodönüştürülmüş aktif CaMPARI'yi yeşilden kırmızıya flüoresans; Bu 30 saniyelik dönemde görüntüleme yapılmadı. Uyarılma sonrası aşamada, z-yığınları Basin-4 hücre gövdelerinde fotodönüştürülmüş kırmızı sinyal tespit etmek için başlangıçtaki lazer ayarlarıyla yeniden alındı. Tüm z-yığınları, 1 μm Z-adımı, 2 çizgi ortalaması 2 ve karanlık koşullarda 40×/1.2 NA objektif ile donatılmış konfokal mikroskop kullanılarak karanlık koşullarda 256 × 256 piksel aralığında elde edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Görüntüleme analizi

1. Fiji'de (RRID:SCR_002285) z-stack görsellerini Bio-Formatlar etkin iken açın. Stack görüntülemeyi Hyperstack, Renk modunu Kompozit olarak ayarlayın ve Otomatik Ölçeklendirmeyi etkinleştirin. Z-düzlemleri arasında kaydırın ve optimal odaklı düzlemi seçin. Seçilen düzlemi çoğaltmak (Görüntü → Çoğaltma; Kanallar: 1–2; seçilmiş Z-düzlem).
2. Kırmızı ve yeşil kanalları bölünmüş (Görsel → Renk → Bölünmüş Kanallar).
   NOT: Her iki kanal için Görüntü → Parlaklık/Kontrast → Otomatik → Parlaklık Ayarlaması ile parlaklık ve kontrastı ayarlayın.
3. Her iki kanaldan (Süreç → Arka Plan Çıkarma) arka planı 50 px yuvarlanan top yarıçapı kullanarak çıkarın.
4. Ölçümleri (Analiz → Set Ölçümleri) Alan, Ortalama gri değeri, Entegre yoğunluk (IntDen), Standart sapma ve Minimum & Max gri değerleri içerecek şekilde yapılandırın.
5. Yeşil kanaldaki her hücrenin etrafında Freehand aracı ile ilgi alanlarını (ROI) çizin. ROI Manager'a yatırım getirisi ekleyin ve ölçün. Aynı yatırım getirisi oranlarını kırmızı kanala uygulayın ve ölçün.
6. Tüm ölçümleri, larva ve hücre tanımlayıcıları dahil olmak üzere bir elektronik tabloya kaydedin.
   NOT: Hem uyarı öncesi hem de sonrası görüntüler için ölçümler yapın.
7. Her hücre için (R/G)_post ve (R/G)_pre elde etmek için Entegre Yoğunluk değerleriyle kırmızı-yeşil floresans oranlarını hesaplayın. Larva başına ortalama hücre düzeyi değerleri.
   NOT: Entegre Yoğunluk (Alan × Ortalama), farklı boyutlardaki hücreler arasında karşılaştırma imkanı sağlar.
8. Larva ortalamalarını kullanarak Δ(R/G)'ni (R/G)_post − (R/G)_pre olarak hesaplayın. Pozitif Δ(R/G) değerlerini, fotokonversiyon sırasında artan postsinaptik kalsiyum aktivitesi olarak yorumlayın.
   NOT: Negatif Δ(R/G) değerleri gürültü veya arka plan asimetrisinden kaynaklanabilir. Negatif değerleri 0'a ayarlayın. Bu veri setinde, bir larva negatif değer (−0.008) gösterdi ve bu değer 0 olarak ayarlandı.

Results

Bu protokole tabii, canlı, diseksiye uğramamış D. melanogaster üçüncü instar larvalarda cIVda nöronları ile Basin-4 internöronlar arasındaki fonksiyonel bağlantı CaMPARI kullanılarak değerlendirildi (Şekil 2). Fotodönüşümlü (PC) ışık veya optogenetik aktivasyonla herhangi bir uyarımdan önce, Basin-4 internöronları sitozolik CaMPARI ekspresyonu nedeniyle yeşil floresans göstermiştir (Şekil 2A). Başlangıç koşullarında kırmızı floresans tespit edilmedi (

Discussion

Burada tanımlanan protokol, sağlam D. melanogaster larvalarında tanımlanmış sinaptik partnerler arasındaki sinaptik bağlantının niteliksel ve nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, cIVda duyusal nöronların optogenetik uyarımını ve aktive postsinaptik Basin-4 internöronlarının CaMPI tabanlı görselleştirmesini kullanarak diseksiye uğramamış larvaların merkezi sinir sistemindeki (MSS) sinaptik aktiviteyi izler. D. melanogaster'de CaMPARI'nin önceki uygulamal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Kimyasallar larvaları nemlendirmek ve monte etmek için çözeltide kullanılır
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Optogenetik araçları aktive etmek için yemeğe eklenen kimyasallar
Konfokal Mikroskop	ZEISS	LSM900 Konfokal	Konfokal mikroskop, Objektif lens (40×/1.2 NA), Işık/lazer kaynağı (405, 488, 561 nm)
Kapak camları (18x18mm)	VWR	48366-205	Görüntüleme için hayvanların monte edilmesinde kullanılır
Etanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	ATR tozu için solvent olarak kullanılır
Fiji (ImageJ)	Açık kaynak	RRID:SCR_002285	Görüntüleme analizi için kullanılır
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	İstatistiksel analiz için kullanılır
Mikroskop slaytları	VWR	48300-041	Görüntüleme için hayvanların monte edilmesinde kullanılır
Modelleme kili	Flinn scientific	FB0600	Larva arasındaki mikroskopla kapak camını tutturmak için kullanılır
Boya fırçası	Genesee scientific	59-204	Larvaları farklı yerler arasında taşımak için kullanılır
Standart mısır unu agar ortamı	Genesee scientific	66-123	Benzer standart tarifler ve malzemeler kullanılarak yiyecek de hazırlanabilir
Standart Drosophila plastik tüpleri (25mm x 95mm Drosophila dar tüpleri)	Genesee scientific	32-109	Büyük tüpler veya şişeler de kullanılabilir
Üç kuyucuk mikro leke plakası	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Bireysel larvaları ayırmak ve temizlemek için kullanılan plaka
Drosophila stoğu (genotip: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	RRID:BDSC_54899 ve RRID:BDSC_32079'un birleştirilmesinden elde edilir
Drosophila stoğu (genotip: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	RRID:BDSC_81085	RRID:BDSC_81085'in ikinci kromozom belirleyicileriyle birleştirilmesinden elde edilir