Drosophila beyninde Genişleme Destekli Hibritizasyon Zincirleme Reaksiyonu-smFISH ve İmmünohistokimya

Özet

Bu protokol, Drosophila beyninde RNA ve protein ifadesinin nicel ve hücre tipine özgü analizi için genişleme destekli HCR-smFISH ve immünohistokimya iş akışını tanımlar; bunlar arasında ışık tabakası veya konfokal mikroskopiyle görüntüleme ve nükleer ile sitoplazmik transkriptlerin otomatik nicelenmesi dahildir.

Özet

Gen ifadesinin nicel ve mekansal çözümlü analizi, hücre tipine özgü moleküler profillerin değerlendirilmesi için gereklidir. Drosophila görsel sisteminde, kapsamlı genetik araçlar, tanımlanmış nöronal popülasyonlarda hem RNA hem de protein seviyelerinin doğrudan değerlendirilmesi için bir çerçeve açmaktadır. Burada, genetik olarak tanımlanmış görsel sistem nöronal tiplerinde hücre tipine özgü moleküler profillerin nicel analizini mümkün kılmak için genişleme destekli HCR-smFISH (hibritizasyon zincir reaksiyonu tek moleküllü floresans in situ hibritizasyon) ile immünohistokimya ile birleştiren adım adım bir protokol sunuyoruz. İş akışı, nükleer lokalize veya membrana bağlı belirteçlerle etiketlenmiş hücreler için optimize edilmiştir; böylece aynı nöronlarda transkript ve protein seviyelerinin ölçülmesine olanak tanır. Doku genişlemesinden sonra, örnekler hızlı hacim alımı için ışık tabakası mikroskopisiyle görüntülenir; standart ters lazer tarama ve döner disk konfokal mikroskopları için alternatif montaj ve görüntüleme iş akışı gösterilir. Ayrıca, nükleer ve sitoplazmik transkriptleri ayıran otomatik bir segmentasyon algoritması sunarak transkripsiyon durumu ve subhücresel RNA lokalizasyonunun analizlerini mümkün kılıyoruz. Sinyal kalitesi, doku bütünlüğü ve nicel performansı etkileyen deneysel parametreler ve yaygın tuzaklar hakkında pratik rehberlik sağlanmaktadır. Temsilci uygulamalar arasında, RNA ve protein seviyelerindeki karşılık gelen değişikliklerin nicelendirilmesiyle hücre tipine özgü RNA girişiminin doğrulanması yer alır. Hücre tipi özgüllüğüyle entegre RNA ve protein düzeyinde ölçümleri mümkün kılarak, bu yaklaşım hipotez odaklı moleküler analiz için ölçeklenebilir bir strateji sunar ve hedefli bağlamlarda tek hücreli transkriptomik testlere pratik bir alternatif sunar. Bu protokol, hücre tipine özgü moleküler bozulmaları doğrulamak için pratik bir yaklaşım sunarken, sağlam Drosophila beyninin anatomik bağlamını korur.

Giriş

Drosophila melanogaster görsel sistemi, gelişimsel sinirbilimde nöronal farklılaşma ^1,2, hücre^tipi spesifikasyonu ^3,4 ve beyin kablolarının moleküler mantığı ^5,6,7 gibi geniş bir yelpazede soruları ele almak için güçlü bir model olarak hizmet vermiştir. Bu ilerleme, hücre tipine özgü genetik sürücü^{hatlarının büyük koleksiyonları 8,9,10}, son kapsamlı konnektomik^{rekonstrüksiyonlar 10,11,12} ve giderek daha ayrıntılı tek hücreli transkriptomik^13,14 ve multiomik¹⁵ dahil olmak üzere olağanüstü zengin bir deneysel araç setiyle desteklenmiştir veri setleri. Bu kaynaklar birlikte, nöronal tipleri çoklu modal bir şekilde tanımlar ve hassas genetik manipülasyonları mümkün kılar. Sonuç olarak, alan artık belirli genlerin nöronal kimliği, bağlantıyı ve işlevini nasıl düzenlediğine dair giderek daha öngörücü hipotezler^{üretebiliyor 16}.. Tek hücreli RNA dizilemesi transkripsiyon durumları hakkında güçlü bilgiler sağlarken, RNA bolluğu her zaman protein^{ifadesini tahmin etmez 17} ve birçok perturbasyon deneyi nihayetinde aynı nöronlarda hem RNA hem de proteinin doğrudan, nicel ölçümünü gerektirir.

Tek moleküllü floresans in situ hibridizasyonu (smFISH^)18,19, anatomik bağlamı korurken hücresel ve subhücresel çözünürlükle transkript bolluğunun nicel ölçümünü sağlar. smFISH'in genleşme^{mikroskopisi 20,21,22} ile birleşmesi, şişebilir bir hidrojel içinde dokuyu fiziksel olarak büyüterek moleküler kalabalıklığı azaltarak, optik erişimi iyileştirerek ve etkili mekansal çözünürlüğü artırarak sağlam beyinlere faydasını daha da genişletmiştir. Hibritleşme zincir reaksiyonu (HCR) tabanlı sinyal^{amplifikasyonu 23} ile birleştiğinde, genişleme destekli smFISH, kalın sinir dokusunda ayrık transkriptlerin sağlam bir şekilde tespit edilmesini sağlar ve ışık tabakası veya konfokal mikroskopi kullanılarak tüm beyin görüntülemesini destekler.

Drosophila beynine farklı deneysel öncelikleri yansıtan çeşitli yerinde RNA görüntüleme yaklaşımları uygulanmıştır. Genişleme destekli yinelemeli HCR-FISH, tüm beyin, mekansal olarak çözülen RNA^{tespitini mümkün kılmıştır 24}. Paralel olarak, genetik olarak etiketlenmiş nörlerde RNA ölçümleri için genleşmesiz tam montajlı FISH yaklaşımları da kullanılmıştır; bunlar arasında hemen erken^{genler 25} üzerine odaklanan HCR tabanlı aktivite haritalama stratejileri ve membranla bağlı genetik olarak kodlanmış belirteçler kullanılarak segmentasyon tabanlı transkript sayma iş^{akışları da bulunmaktadır 26}. RNAscope gibi ticari prob tabanlı yöntemler, hedeflenen hücre popülasyonlarını tanımlamak için genellikle immünohistokimya ile birleştirilerek tüm beyinlerde çoklu RNA tespitini^{mümkün kılmıştır 27}. Bu yaklaşımlar birlikte, sinek beyninde mekânsal çözülmüş RNA analizinin teknik olarak mümkün olduğunu ortaya koyar. Ancak, hipotez odaklı bozulma deneyleri, mevcut tek bir iş akışı tarafından tam olarak ele alınmayan daha spesifik gereksinimler seti getirir. Birçok yöntem, çoklu keşif tarzı transkript haritalamasına, aktivite durumu profiline veya yalnızca RNA niceliklendirmeye öncelik verir; immünboyama genellikle hücre tanımlayıcısı olarak hizmet verir; bozuk proteinin eşleştirilmiş bir okuması olarak değil veya genetik hücre tipi ataması²⁸ olmadan uygulanır. Ayrıca, rutin uygulamalar birden fazla görüntüleme platformuyla uyumluluktan ve otomatik, ölçeklenebilir analiz boru hatlarından fayda sağlayacaktır.

Burada, Drosophila görsel sistemi için, genişleme destekli HCR-smFISH'i genişleme öncesi yapılan immünohistokimya ile birleştiren, aynı biyolojik örnekte aynı nöronlarda RNA ve protein seviyelerinin eşleştirilmiş ölçümünü mümkün kılan entegre ve adım adım bir iş akışını sunuyoruz. Daha önce geliştirdiğimiz FlySeg^{çerçevesi 29} üzerine inşa ederek, nükleer ve sitoplazmik noktaları ayırt eden, hem toplam ifade ölçümlerini hem de transkripsiyon durumuna duyarlı analizleri destekleyen nükleer segmentasyon ve transkript sayımı için otomatik bir niceltme hattı sunuyoruz. Protokol, hem ışık tabakası mikroskobu hem de alternatif montaj ve görüntüleme iş akışlarıyla iki konfokal sistemde gösterilmektedir. Son olarak, entegre RNA–protein okumasının faydasını temsil eden bir pertürbasyon-doğrulama deneyiyle (yani tanımlanmış bir hedefin RNAi aracılı etkisi olarak) gösteriyoruz ve sinyal kalitesini, doku bütünlüğünü ve nicel performansı etkileyen parametreler ve tuzaklar hakkında pratik rehberlik sağlıyoruz.

Bu protokol genellikle Drosophila'da tüm beyin RNA tespiti için daha önce^{açıklanan 24} EASI-FISH çerçevesi üzerine inşa edilir ve temel prensiplerini olan RNA sabitleme, hidrojel genişleme ve HCR tabanlı sinyal güçlendirmesini korur. Mevcut protokol, aynı nöronlarla eşleşen RNA ve protein ölçümlerini mümkün kılmak için genişlemeden önce immünohistokimya entegre ederek bu yaklaşımı genişletir ve geliştirir; iş akışı boyunca birden fazla işlem ve işleme adımını revize ederek sağlamlığı ve tekrarlanabilirliği artırır, hem ışık tabakası hem de geleneksel ters konfokal mikroskoplar için pratik montaj ve görüntüleme stratejileri sunarak, otomatik soma segmentasyonu ve transkript nicelendirmesini dahil ederek nükleer ve sitoplazmik RNA havuzlarının açık ayrımıyla birlikte.

Bu iş akışı, genetik olarak tanımlanmış nöronlarla tanımlanmış RNA ve protein okumalarını niceliklendirmek ve anatomik bağlamı korumak olan hedefli deneyler için en uygun şekilde uygundur. Özellikle, tanımlanmış bir genin veya küçük bir aday gen setinin yukarı veya aşağı regülasyonunu ölçmek, genotipler veya gelişim evreleri arasında ifadeyi karşılaştırmak veya nükleer ile sitoplazmik transkript lokalizasyonu yoluyla transkripsiyon durumunu değerlendirmek olduğunda moleküler bozulmaları doğrulamak için özellikle faydalıdır. Tarafsız transkript keşfi veya yüksek plex tüm beyin ifade eşlemesi için daha az uygundur; burada tek hücreli dizileme, mekânsal transkriptomik veya yinelemeli çoklayıcı FISH yaklaşımları daha uygun olabilir.

Protokol

Etik bildirisi

Bu protokol Drosophila melanogaster kullanır. Omurgalı hayvan veya insan denek kullanılmadı. Bu nedenle kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayı gerekmiyordu.

NOT: Tüm süreçte RNase-clean tekniğini kullanın. Eldiven takın, yüzeyleri ve aletleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile silin ve tüm çözeltileri RNase içermeyen suyla hazırlayın.

Şekil 1. Örnek hazırlama protokolünün adım adım iş akışı (A) Protokolün şematik zaman çizelgesi, yaklaşık gün gün ilerleyişi ve gece kuluçka adımlarını gösterir. (B–J) Beyin diseksiyon ve fiksasyonundan immünohistokimya, RNA/protein çapraz bağlama, hidrojel gömme, sindirim, prob hibridizasyonu ve HCR sinyal güçlendirmesine kadar ana örnek hazırlama adımlarının şematik genel bakışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Beyin diseksiyonu, fiksasyon ve immünohistokimya (1–3. Gün)

NOT: Tüm adımları Terasaki tarzı çoklu kuyu plakasında yap, aksi belirtilmedikçe. Kuluçka ve yıkama için her kuyu başına 10 μL kullanın. Nemi koruyun, plakanın bir köşesine nemli bir laboratuvar mendilini yerleştirin.

DIKKAT: Paraformaldehit ve glyoksal fiksatörler toksik/tahriş edicidir. Bir duman kaputu ile tutun ve uygun PPE takın.

1. Beyinleri buz gibi soğuk S2 böcek ortamında diseksiye edin. Beyinleri kuyulara aktarın, her kuyu başına 10 beyne kadar (Şekil 1B–C).
   NOT: Burada gösterilen temsil deneyler için 72 adet katlanmış pupa beyin kullanılmıştır.
2. S2 orta kuyuyu başına 10 μL fiksatif ile değiştirin, bir kez değiştirin.
3. Addax asitsiz glioksal ile %5 (w/v) sukroz ile gece boyunca 4 °C'de sabitlenin (Şekil 1C).
4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 μL PBST (%0,5 Triton X-100 PBS) içinde beyin 3× yuyu.
   DIKKAT: Triton X-100 bir tahriş edicidir; Cilt ve göz temasından kaçının.
5. Beyinleri 10 μL birincil antikor çözeltisinde (PBST içinde, Malzeme Tablosu'nda listelenen seyreltmelerde) 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçka yapın (Şekil 1D).
6. Beyinleri 10 μL PBST'de 4 °C'de 10 dakika boyunca 3× yıka. Her yıkamada, kuluçkanın ortasında (her yıkamada iki değişim) çözeltiyi değiştirin.
7. Beyinleri 10 μL ikincil antikor çözeltisinde (PBST'de, Malzeme Tablosu'nda listelenen seyreltilerde) 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçka yapın (Şekil 1D).
   NOT: Örnekleri ışıktan koruyun.
8. Beyinleri 10 μL PBST'de 4 °C'de 10 dakika boyunca 3× yıka. Her yıkamada, kuluçkanın ortasında (her yıkamada iki değişim) çözeltiyi değiştirin.
   NOT: Standart tam montaj immünohistokimyasal konsantrasyonlarından 2–3 kat daha yüksek birincil ve ikincil antikor konsantrasyonları kullanın
   DURAKLAMA NOKTASI: Beyinleri 10 μL 1× PBS içinde 4 °C'de 96 saate kadar depolayın.

2. RNA ve proteinlerin kovalent sabitlenmesi (4. Gün) (Şekil 1E)

DIKKAT: RNA sabitleyen alkilatörler ve AcX tehlikelidir (toksik/tahriş edici; bazıları kanserojen şüphelidir). Uygun PPE'lerle kimyasal bir buhar davlumbazında çözelti hazırlayın ve işleyin. Tüm atıkları tehlikeli kimyasal atık olarak toplayın.

1. Beyinleri 10 μL 20 mM MOPS tamponunda (pH 7.7) 37 °C'de 20 dakika boyunca kuluçka yapın.
2. Ankraj çözeltisi için %49,5 (v/v) 20 mM MOPS, %49,5 (v/v) Melphalan stoku (DMSO'da 2,5 mg·^mL-1 ) ve %1 (v/v) AcX stoku (10 mg·^mL-1 DMSO) karıştırın. Bu, nihai konsantrasyonları 1,24 mg·^mL-1 melphalan ve 0,10 mg·^mL-1 AcX olarak verir.
3. MOPS'u her kuyu başına 7–8 μL ankraj çözeltisi ile değiştirin, çözeltiyi bir kez değiştirin ve gece boyunca 37 °C'de karanlıkta inkubasyon yapın.
   NOT: Tam örnek kapsayıcılığını koruyarak taşma ve çapraz karışımı en aza indirmek için 7–8 μL kullanın.

3. Jelasyon (beyinleri hidrojele gömme) ve proteinaz K sindirimi (5. gün)

DIKKAT: Akrilik monomerler, APS ve TEMED tahriş edici/toksiktir. PPE ile ilgilenin; Uçucu/ekzotermik bileşenleri bir buharlı davlumbona hazırlayın.

1. 0,5 mm kalınlığında yapışkan silikon contanı şarjsız cam mikroskop sürgüsüne (Şekil 1F, alt sol) takın, tam temas ve sızdırmazlık için sıkıca basın.
2. Odaya 200 μL poli-L-lizin çözeltisi ekleyin ve yüzeyi kaplamak için eşit şekilde yayın, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın ve çözeltiyi pipetle çıkarın.
3. Poli-L-lizin tamamen buharlaşmasına izin verin, yüzey gözle görülür şekilde kuruyana kadar.
   NOT: Poli-L-lizin buharlaşması yavaştır. Güvenilir sonuçlar için odaları önceden hazırlayın ve tozsuz bir ortamda gece boyunca kurumasına izin verin. Alternatif olarak, kullanım gününde 37 °C inkubatörde ≥ saat kuru odalarda kullanabilirsiniz.
4. Beyinleri 10 μL 1× PBS ile 2× oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın.
5. Jel monomer çözeltisi hazırlayın ve hemen kullanmadan önce polimerizasyon reaktifleri ekleyin; monomer çözeltisi 4HT, TEMED ve APS (taze yap) ile 47:1:1:1 oranında karıştırılır. Son jelleşme çözeltisi 1 M sodyum akrilat, %14 akrilamid, %0,1 bis-akrilamid, 1× PBS, %0,01 4HT, %0,2 TEMED ve %0,2 APS içerir.
6. Kısa bir süre vortex yapın ve son jelleşme çözeltisini buz üzerinde tutun. Çözümü hemen kullanın.
7. Beyinleri 10 μL soğuk jelasyon çözeltisinde 15 dakika buz üzerinde kuluçka yapın.
8. Ön dengeleme sırasında, yeni bir jilet bıçağı kullanarak, dolgu sırasında havanın çıkmasını sağlamak için silikon contanın her iki yanında dar bir kanal açın (Şekil 1F, sol üst)
9. Pipet ucu kullanarak, beyinleri hazırlanmış jelasyon odasına aktarın, böylece her beynin her zaman jelasyon çözeltisinde su altında kalmasını sağlar.
   DIKKAT: Sıkıştırma ve denge sağlandıktan sonra beyinler yüksek yapışkan hale gelir ve kolayca plastik yüzeylere yapışır. Örnek kaybını önlemek için, geniş delikli pipet uçları kullanın veya standart bir ucun ucunu keserek açıklığı genişletin.
10. Yüzeydeki silikon conta yapıştırıcısından koruyucu astarı çıkarın ve temiz bir 1,5H cam kapak parçasını haznenin üzerine nazikçe yerleştirin, böylece hava kabarcıkları sıkışmasını önleyin.
11. Yan kanallardan birinden 200 μL yeni yapılmış jelleşme çözeltisini yavaşça pipetleyin, oda tamamen dolana kadar.
12. Kapalı odayı koyu bir kaba koyup 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
    NOT: Suyla nemlendirilmiş laboratuvar mendillerini kapın içine yerleştirin. Kaydırağın sıvı suyla doğrudan temas etmediğinden emin olun.
13. RNase içermeyen suda 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA ve %0.5 (v/v) Triton X-100 içeren sindirim tamponu hazırlayın.
14. Kullanımdan hemen önce, 20 mg·^mL-1 stokundan 1:100 derecesinde Proteinaz K ekleyin ve nihai konsantrasyon 0,2 mg·^mL-1'e getirilir.
    DIKKAT: Proteinaz K bir tahrişleyicidir ve eldivenle ele alınmalıdır; Soluma ve cilt temasından kaçının.
15. Kaydırı oda sıcaklığında 5 dakika soğutun ve ardından kapak kapağını çıkarın. Jeli bir bistüriyle dikdörtgen şekline kesin, tek, düz kesimler kullanın. Her beynin etrafındaki fazla jel hacmini en aza indirin (Şekil 1F, sağ üst).
16. Her kesilen jeli, 1000 μL sindirim çözeltisi içeren 24 kuyruklu bir plakanın ayrı bir yuvasına yerleştirin. Jellerin tamamen suya batırıldığından emin olun.
17. Plakayı Parafilm ile kapatın ve oda sıcaklığında 0,11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında gece boyunca kuluçka yapın (Şekil 1G).

4. DNaz sindirimi ve HCR-smFISH prob hibritizasyonu (6. Gün)

1. Sindirim çözeltisini, jelin temas etmemesini veya deformasyonunu önlemek için kuyunun kenarına yerleştirilmiş bir pipet kullanarak dikkatlice aspire edin.
2. Yıkama jelleri 3× 500 μL 1× PBS ile oda sıcaklığında, 0.11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında 15 dakika boyunca kullanın.
   DURAKLAMA NOKTASI: Jelleri 500 μL 1× PBS içinde 4 °C'de 7 güne kadar batırılarak devam ettirin.
3. Jel başına 500 μL DNaz çalışma çözeltisi, QIAGEN RNase-Free DNase Set 1:10 oranında DNase I stokunu RDD tamponunda seyreltirerek hazırlayın. Son çalışma çözümü yaklaşık 0.27 Kunitz birimi·^μL-1 içerir.
4. Jelleri 500 μL DNaz çalışma çözeltisinde 2 saat boyunca 37 °C'de hafif sallama ile inkübe edin (Şekil 1H).
5. Oda sıcaklığında 500 μL RNase içermeyen 1× PBS ile 4× jelleri 15 dakika boyunca her biri oda sıcaklığında yıkayın.
6. Jelleri 500 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponunda 37 °C'de 30 dakika boyunca dengeleyin
7. HCR smFISH sonda stokunu seyreltir (1 μM; Moleküler Aletler) prob hibridizasyon tamponunda 1:300 ile ~3.3 nM nihai konsantrasyona ulaştı. Vortexing ile karıştırma
8. Dengeleme tamponunu jel başına 500 μL prob karışımıyla değiştirin ve 0,11g g'de 37 °C'de bir yörünge sallayıcısında gece boyunca kuluçka yapın (Şekil I).
   DIKKAT: Prob hibritleşme tamponları zehirli olan formamid içerir. Eldiven kullanın ve solumaktan kaçının.

5. Hibritleşme Zincirleme Reaksiyonu (7. Gün) (Şekil 1J)

1. Jeller 3× 500 μL önceden ısıtılmış prob yıkama tamponu ile 30 dakika boyunca 37 °C'de 0.11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında uygulanır.
   DIKKAT: Prob yıkama tamponları zehirli olan formamid içerir. Eldiven kullanın ve solumaktan kaçının.
2. 3× jelleri 500 μL 1× PBS ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 0.11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında kullanın.
3. Jelleri 1 mL 1× PBS içinde oda sıcaklığında, 0.11 g yörünge sallayıcısında gece boyunca bırakın.
   NOT: Uzun bir gece yıkama, hedef dışı sonda bağlanmasını ve arka plan noktalarını azaltarak sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Aynı gün işlem için doğrudan HCR amplifikasyonuna geçin.
   DURAKLAMA NOKTASI: Hibridizasyon sonrası yıkamalardan sonra, jelleri oda sıcaklığında 1 mL 1× PBS veya 4 °C'de HCR amplifikasyonundan önce 96 saate kadar saklayın.
4. PBS'yi kuyu başına 500 μL amplifikasyon tamponu (önceden oda sıcaklığına dengiliber) koyup 0.11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın .
5. Her sonda seti için, h1 ve h2 saç tokalarını seyreldin (3 μM stok; Molecular Instruments) amplifikasyon tamponu 1:100 tamponda (30 nM nihai konsantrasyon) kullanılmıştır. Her kuyu başına 350 μL seyreltilmiş saç tokası karışımı hazırlayın.
6. PCR tüplerinde 95 °C'de 90 saniye boyunca termal döngücü veya ısı blokunda ısıya seyreltilmiş saç tokası çözeltileri. Eşit ısıtma ve sıcaklık dengesi sağlamak için tüp başına toplam 100 μL hacmi kullanın.
   NOT: HCR yönergeleri genellikle saç tokası H1 ve H2'nin ayrı ayrı ısıtılmasını ve sadece soğuduktan sonra birleştirilmesini önerir; Alternatif olarak, basitleştirilmiş işlem gerektiğinde H1 ve H2'yi snap-ısıtmadan önce birleştirebilirsiniz.
7. Saç tokalarını karanlıkta 10 dakika boyunca oda sıcaklığında soğutmaya izin verin, rahatsızlık vermeden.
8. Amplifikasyon tamponunu çıkarın ve her kuyu başına 350 μL saç tokası karışımı ekleyin.
9. Jelleri oda sıcaklığında, karanlıkta 0.11 g ağırlığında bir yörünge sallayıcısında 2 saat kuluçka edin.
10. 3× jelleri 500 μL 5× SSCT ile oda sıcaklığında 0.11 g ağırlığında yörge sallayıcısında 10 dakika boyunca aşındırın.
11. Saç tokası çözeltilerini amplifikasyondan sonra geri kazanın, ışıktan koruyun ve tekrar kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
12. Jelleri 500 μL 1× PBS'ye aktarın ve 3× oda sıcaklığında 30 dakika yıkasın.
13. Jelleri 500 μL 1× PBS içinde, 4 °C'de, ışıktan korunarak sakla.
    DURAKLAMA NOKTASI: Amplifikasyonlu jeller, görüntülemeden önce minimum sinyal kaybıyla 2 haftaya kadar saklanabilir.

6. Genişletilmiş örneklerin hazırlanması, montajı ve görüntülemesi (8. Gün) (Şekil 2)

1. DAPI içeren 1× PBS içinde jelleri 4 °C'de gece boyunca 0.11 g ağırlığında yörünge sallayıcısında kuluçka edin.
2. Jel içindeki beyni görselleştirmek için kısa bir UV aydınlatması kullanın. Numuneyi yönlendirin ve fazla jeli gerektiğinde kesin.
   DIKKAT: Numune yerleştirme ve montaj sırasında UV aydınlatması kullanılır. Uygun göz koruyucu takın.
3. Örnekleri 1× PBS ile DAPI (1:1000) ile desteklenerek seçilmiş görüntüleme platformu için uygun yapılandırma kullanılarak monte edin ( bkz. Tablo 1).
4. Numunelerin alınmadan önce en az 1 saat dengelenmesine izin verin.
5. Genişletilmiş jel üzerinden görüntü almak için yeterli çalışma mesafesi olan suya batma objektif kullanın.
6. Görüntü örnekleri ışık tabakası mikroskobi, lazer taramalı konfokal mikroskopi veya dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak yapılır. Bu çalışmada kullanılan temsil platforma özgü montaj ve edinim parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir.
   NOT: Görüntülemeden sonra, yukarıda açıklandığı gibi DNaz sindirimiyle problar ve HCR saç tokası çıkarılabilir. Jeller daha sonra ek prob hibridizasyonu ve HCR amplifikasyonuna tabi tutulabilir.

Platform	Örnek görselleştirme, montaj ve konumlandırma	Amaç / dedektör	Temsilci satın alma ayarları
Zeiss Lightsheet 7	Jeldeki beyin konumunu görselleştirmek için kısa bir UV aydınlatması kullanın. Fazla jeli kesin ve her beyni tespit hedefine yönlendirin. 5–6 jel, 1 × 1 cm poli-L-lizin kaplamalı bir örtü üzerine geller dışa bakacak şekilde yerleştirilin (Şekil 2A). Kapak parçasını LS7 numune tutucusuna küçük bir UV ile kürlenebilen yapıştırıcı damlası ile takın; Yapıştırıcı uygulamadan önce UV lambayı kapatın. LS7 odasına monte edin ve ZEN Black canlı görüntüyle beyin bölgelerini konumlandırın.	20×/1.0 NA suya batma tespit hedefi; 2,5× optik zoom (toplam büyütme× 50).	z-step, 0.4 μm ve 2.5 yakınlaştırma× 2× genişleme. Pivot taraması etkinleştirildi. Tüm kanallar için 50 ms pozlama. Lazerler: %5'te 405 nm, 2'de 488 nm, %8'de %8'de 561 nm. Yayılım: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Şekil 2C, solda)
Nikon Ti2-E AXR NSPARC lazer taramalı konfokal	Jel içindeki beyni görselleştirmek için kısa bir UV aydınlatması kullanın. Tek bir jel, beynin ters hedefe doğru aşağıya bakması için yönlendirin. 1× PBS + DAPI ile doldurulmuş cam tabanlı görüntüleme kabına aktarın (Şekil 2B). Beyni 4× hedefle bulmak, 20× hedefli yatırım getirisi noktalarını belirlemek ve NIS-Elementlerde X-Y pozisyonlarını kaydetmek. Daldırma ortamı ekleyin, kayıtlı yatırım getirileri yeniden gözden geçirin ve onları odaklaştırın.	40× uzun çalışma mesafesi suya batma objektif (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1.15 NA Lambda S, 0.61 mm çalışma mesafesi); NSPARC dedektörü süper çözünürlük modunda.	Galvanometre taraması, 2048 × 2048 piksel, 1.6 μs/piksel, 8.0× zoom. Lazerler: %2'de 488 nm, %20'de 640 nm. Yayılım: 502–546 nm ve 666–732 nm.
			(Şekil 2C, ortada)
Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1 dönen disk konfokal	Ters konfokal görüntüleme için örnekleri monte edin: jeli beyin hedefe bakacak şekilde yönlendirin ve 1× PBS + DAPI ile cam tabanlı görüntüleme kabına yerleştirin (Şekil 2B). CellSens yazılımı kullanılarak lazer-taramalı konfokal mikroskopi için tanımlanan ilgi alanlarını belirleyin.	60× uzun çalışma mesafesi suya batma objektif (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, 1,5 mm çalışma mesafesi); Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII kamera (2304 × 2304 piksel; 6.5 × 6.5 μm piksel boyutu).	%75 güçte 488 nm uyarılma, 200 ms pozlama; %100 güçte 640 nm uyarılma, 800 ms pozlama. Yayılım: 500–550 nm ve 665–705 nm.
			(Şekil 2C, sağda)

Tablo 1: Mikroskopi platformlarında temsil montaj, örnek lokalizasyonu ve görüntüleme parametreleri. Işık levhası ve konfokal mikroskopi platformlarında kullanılan örnek montaj stratejileri, lokalizasyon yaklaşımları, hedefler ve alım parametrelerinin özeti.

7. RNA ve protein ifadesinin nicel analizi

NOT: Deneysel hedefe göre analiz iş akışını seçin. Bu yaklaşımların karşılaştırması Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

1. FlySeg kullanılarak popülasyon ölçeğinde transkript nicelendirmesi.
   NOT: Analiz, FlySeg²⁹ boru hattının güncellenmiş versiyonuna dayanmaktadır. Analiz iş akışının şematik genel özeti Şekil 3A–B'de gösterilmiştir
   1. Python tabanlı bir paket olan FlySeg'i, aşağıdaki kullanarak bir Conda ortamı oluşturarak kurun:
      conda env create -f environment.yml
   2. Analizden önce ortamı şu şekilde etkinleştirin:
      conda activate flyseg
   3. Analizi şu şekilde başlatın:
      python main.py --file <input_file>
      CZI veya NPY dosyaları dahil olmak üzere desteklenen giriş formatlarını kullanın.
   4. Analizi ihtiyaç duydukça isteğe bağlı argümanlarla özelleştirin, bunlar arasında:
      Kanal sayısı (--kanallar)
      Çekirdek kanalı (--nuclei_ch veya --nuclei_wavelength)
      Sitoplazma kanalı (--cytoplasm_ch veya --cytoplasm_wavelength)
      Çekirdek tespit parametreleri (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Nükleer genişleme faktörü (--nuclei_dilation)
      FISH tespit eşikleri (--fish_threshold_range)
      Çıkış dizini (--output_dir)
      Napari üzerinden görselleştirme (--visualize)
   5. Tüm mevcut seçenekleri şu şekilde gösterin:
      python main.py –help
   6. Görüntü meta verilerini şu şekilde inceleyin:
      python main.py --metadata_only.
      Voxel boyutunu, kanal sayısını ve kanal kimliğini doğrulayın.
   7. Analizi, veri setine uygun şekilde ayarlanmış parametrelerle çalıştırın. Genellikle, toplam kanal sayısını, çekirdek kanalını, sitoplazma kanalını (varsa) ve nükleer genişleme faktörünü belirtin.
      NOT: İstenen nükleer/sitoplazmik sınır için uygun --nuclei_dilation değerini ayarlayın. Örnek olarak Şekil 3C–D'ye bakınız.
   8. İşlem günlüğünü izleyin. Tüm çıktılar, giriş dosyasının adını taşıyan bir klasörde kaydedilir.
   9. Aşağıdaki analizler için birincil çıktıları belirleyin:
      1. -Nuclei-df.csv
         bu kanal, her FISH kanalı için çekirdek başına özellik ölçümlerini ve ilgili nokta sayılarını içerir ve istatistiksel analiz için nicel veriler sağlar.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Bu, nükleer boyut ve yoğunluğa dayalı segmentasyon outlier'larını belirlemek için kullanılan bir saçılım grafikidir; Dış değerler olarak işaretlenen çekirdekleri daha fazla analizden hariç tutun.
   10. Gerekirse ileri son işlem için ek ara çıktılar (örneğin, segmentasyon maskeleri, puncta tespit tabloları ve birleştirilmiş FISH özet dosyaları) kullanın.
2. Imaris kullanılarak bireysel olarak tanımlanabilir hücrelerde transkript sayımı
   1. Surfaces aracıyla, ilgilenilen nöronu sitoplazmik veya membran belirtici kanalına göre segmentlere ayırın.
   2. Yüzey düzleştirme ve yoğunluk eşik parametrelerini ayarlayarak ortaya çıkan yüzeyin somayı doğru şekilde kapsaymasını sağlarken komşu yapıları hariç tutun.
   3. Spots tespit aracı kullanılarak, FISH kanalındaki transkript noktalarını tespit edin. Tahmini nokta çapı ve yoğunluk eşiğini nokta boyutu ve sinyal yoğunluğuna göre ayarlayın (örneğin, 2x doku genişlemesi için 0,25 μM).
   4. Nokta algılamayı, sadece nöron içindeki noktaların sayıldığından emin olmak için önceden oluşturulan yüzeyle sınırlayın.
   5. İstatistik paneli kullanarak nöron yüzeyindeki toplam tespit edilen nokta sayısını çıkarın.
   6. Aşağı akış analizi için ihracat nokta sayımları ve ilgili ölçümler.
3. FIJI/ImageJ kullanılarak ROI tabanlı floresans niceliklendirmesi
   1. FIJI'de görüntü yığınlarını açın ve Image > Stacks > Z Project > Maximum Intensity Projection kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun. Bir deneydeki tüm örnekler için aynı projeksiyon ayarları kullanın.
   2. İlgi duyduğunuz nöron yapısını anatomik bir belirteç kanalı (örneğin, membran veya sitoplazmik GFP) kullanarak tanımlayın. Freehand veya Polygon Selection aracı kullanılarak, yapıya karşılık gelen ROI'yi manuel olarak belirleyin (örneğin, Dev Fiber dendrit).
   3. Protein kanalına geçin ve tanımlanmış ROI içinde floresans yoğunluğunu Analyze > Measure yöntemiyle ölçün. Aşağıdaki parametreleri kaydedin: Ortalama floresans yoğunluğu; Entegre yoğunluk; Yatırım getirisi alanı.
   4. Benzer büyüklükte, spesifik sinyal içermeyen ve etiketlenmiş nöron yapısının dışında olan yakın bir arka plan ROI'sinde floresans yoğunluğunu ölçün. Deneydeki tüm örnekler için aynı arka plan ROI stratejisini kullanın ve yatırım getirisi ölçümünden arka plan değerini çıkarın.
   5. Genotipler veya deneysel koşullar arasında nicel karşılaştırma için arka plan düzeltilmiş entegre yoğunluk veya ortalama yoğunluk değerleri kullanın. Karşılaştırılan tüm örnekler için aynı görüntüleme ayarlarının kullanıldığından emin olun.

Sonuçlar

Genişleme destekli HCR-smFISH ve immünohistokimya iş akışını biyolojik olarak ilgili bir ortamda doğrulamak için, Drosophila görsel sisteminin yaklaşan kaçış devresine odaklandık. Bu devre, yaklaşan uyaranları algılayan genetik olarak tanımlanmış LC4 görsel projeksiyon^{nöronları 30,31} ve hızlı kalkışları tetikleyen iyi karakterize edilmiş Dev Lif (GF) iniş^{nöronları 32,33} içerir; bu da sağlam beyinlerde hücre tipine özgü moleküler ölçümler için anatomik olarak stereotipli bir sistem sağlar.

Drosophila boşluk birleşim proteini Shaking-B (ShakB)³⁴, aksonal çıkış^{sinapsları 35} ve işitsel^{girişler 35} dahil olmak üzere GF devresinin birçok bileşeninde elektriksel iletimde rol oynadığı öne sürülmüştür. Yaklaşan tespit sırasında GF dendritlerinde elektriksel bağlantıya dair doğrudan kanıtlar sınırlı olsa da, son çalışmalar LC4 nöronlarının yüksek seviyelerde shakB³⁶ ifade ettiğini göstermektedir. Bu gözlemler, protokolün genetik olarak tanımlanmış nöronal tiplerde hem RNA hem de protein seviyelerinde hedeflenen moleküler bozulmaları nicel olarak değerlendirip değerlendiremeyeceğini değerlendirmek için shakB etkisi ve etiketleme stratejilerinin kullanılmasını teşvik etti.

İlk olarak, HCR-smFISH ile ShakB antikor boyama ile birleştirilerek GF ve LC4'te shakB knockdown'un verimliliğini değerlendirdik. GF, her hemibeyin başına tek bir nöron, bir membran belirteciyle etiketlenmişti (Şekil 4A). LC4, her yarımbeyin başına yaklaşık 60 nöronlu bir popülasyon, popülasyon düzeyinde nicelik sağlamak için nükleer bir işaretleyici ile etiketlenmiştir (Şekil 4B). Kontrol beyinlerinde, shakB transkriptleri hem GF hem de LC4 nöronlarında net şekilde tespit edildi. ShakB RNAi'nin ekspresyonu, her iki hücre tipinin hedeflenen nöronlarında shakB mRNA puncta'sında anlamlı bir azalmaya yol açtı (Şekil 4C–D). RNA interferansiyonunun sitoplazmik bölgesiyle uyumlu olarak, transkript tükenmesi en belirgin şekilde sitoplazmik bölmede belirgindi. FlySeg tabanlı niceliklendirme kullanılarak nükleer ve sitoplazmik noktaların ayrılması, LC4 popülasyonu boyunca sitoplazmik shakB transkriptlerinin seçici bir azalmasını ortaya koydu; nükleer noktalar ise önemli ölçüde daha az etkilendi (Şekil 4D, sırasıyla %69 vs %22 azalma).

GF dendritlerinin Dev Kommistüral Internöronların (GCI) aksonlarıyla örtüştüğü bölgelerde ShakB antikor boyama bulduk; bu bölgeler iki Dev Lifi birbirine bağlayan ve karşı taraflı görsel^{yanıtlar sağlayacak 37} (Şekil 4E). Bu gözlemler, GF ile GCI arasında ShakB'ye bağlı elektrik bağlantısını gösteren önceki^{çalışmalarla tutarlıdır.} ShakB antikor boyama, LC4 aksonlarının GF dendritleriyle temas ettiği bölgelerde de gözlemlendi, ancak bu bölgedeki lokalizasyon daha az net çözüldü. Kesin subhücresel lokalizasyon ne olursa olsun, GF dendritik bölgesiyle ilişkili ShakB antikor sinyali RNAi ekspresyonundan sonra belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 4F).

Ancak, antikor tabanlı tespit, ShakB proteininin presinaptik LC4 terminallerine net olarak atamasına izin vermez; temas noktalarındaki postsinaptik GF dendritlerine karşılık. Ayrıca, ShakB'nin görsel sistemde^{yaygın ekspresyonu,} anti-ShakB immünboyama kullanarak LC4 nöronlarında hücre tipine özgü niceliklendirmeyi ^sınırlar. Bu sınırlamaları aşmak ve hücre tipine özgü ShakB lokalizasyonunu doğrudan değerlendirmek için, daha önce ürettiğimiz^36,38 olan endojen etiketli bir shakB alleli kullandık. Bu, özellikle LC4 nöronları içinde ShakB proteininin seçici görselleştirilmesini mümkün kıldı. SmGdP-10×V5 etiketli ShakB, hem dendritlerle (yukarı akış görsel nöronlardan gelen giriş bölgelerine karşılık) hem de GF dendritleriyle temas eden akson terminalleriyle zenginleştirildi (Şekil 4G). ShakB RNAi'nin ifadesi, hem dendritik hem de aksonal bölmelerde V5 sinyalinin neredeyse tamamen ortadan kaybolmasına yol açtı (Şekil 4H). Bu sonuçlar, protokolün yoğun innervasyonlu nöropil içinde endogen protein lokalizasyonunun hücre tipine özgü ve subhücresel çözümlülüğünü sağladığını göstermektedir.

Ek nitel kontrol olarak, tanımlanmış nöronal popülasyonlarda genişletilmemiş FISH'i immünohistokimya ile birleştirerek test ettik (Ek Şekil 1). grd'den gelen FISH sinyali, optik lob scRNA-seq verilerinden tahmin edilen ifadeyle tutarlı olan LC22 somatalarıyla örtüştü (Ek Şekil 1A–C)¹³. tdTomato ifade eden Tm3 nöronlarında, tdTomato mRNA'sı tdTomato proteini ile örtüşürken, VGlut1 mRNA'sı Tm3 somatalarıyla örtüşmemiştir; bu da Tm3 nöronların kolinergik kimliğiyle uyumludur (Ek Şekil 1⁾¹³. Bu örnekler, genişletilmemiş FISH + IHC'nin nitel varlık/yokluk değerlendirmesi için yeterli olduğunu, güvenilir tek noktalı nicelik için ise genişlemenin gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu protokolün başarılı uygulanması, net hücre tipine özgü etiketleme, düşük arka plana sahip ayrık smFISH noktaları, bireysel çekirdeklerin veya manuel olarak tanımlanmış hücre hacimlerinin güvenilir segmentasyonu ve perturbasyondan sonra hedef RNA veya protein sinyalinin tutarlı azalmasıyla gösterilir. Negatif veya düşük sinyal sonuçları da yorumlanabilir olmalıdır: örneğin, shakB RNAi, azalmış shakB mRNA ve ShakB protein sinyali üretirken, genişlememiş FISH, net tdTomato mRNA tespitine rağmen Tm3 somatalarında VGlut1 sinyali eksikliği gösterdi. Optimal olmayan sonuçlar arasında zayıf antikor veya smFISH sinyali, yüksek arka plan noktası, eksik segmentasyon, nokta yanlış ataması veya görüntüleme sırasında örnek kayması yer alır; bunların hepsi aşağı akım nicelemesini etkileyebilir.

Şekil 2. Monte ve görüntüleme, ışık tabakası ve konfokal mikroskopi platformları kullanılarak genişletilmiş örneklerdir. (A) Tüm görüntüleme platformlarında ortak olan genişletilmiş hidrojellerin görselleştirmesi ve kırpılması (1–2), ardından ışık tabakası mikroskopisi için montaj (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Ters lazer taramalı konfokal mikroskopa (Nikon Ti2-E AXR) monte edilmiş genişletilmiş bir örnek fotoğrafı. (C) Genişletilmiş Drosophila görsel sistem örneğinin (floresan nükleer işaretleyici ile işaretlenmiş LC4 nöronları) temsil eden tek optik kesitleri (tek Z düzlemleri), shakB mRNA için incelenmiştir ( bkz. Şekil 4), üç görüntüleme platformunda elde edilmiştir. Ölçek çubukları, 10 μm (genleşme sonrası doku). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. FlySeg kullanılarak smFISH puncta'nın nicel analizi. (A) Belirlenen hücreler içinde otomatik segmentasyon ve nokta nicelleştirme için FlySeg analiz iş akışının şematik genel bakışı. (B) FlySeg'in çekirdek segmentasyon mantığını gösteren üç boyutlu Voronoi tessellasyonu. Görüntüleme hacmi mekânsal alanlara bölünür (her biri farklı bir renkte gösterilir), her bölüm en fazla bir çekirdek içerecek şekilde sınırlandırılır ve böylece tek hücre ataması sağlanır. Her Voronoi bölgesinde, çekirdek fonksiyonel optimizasyon prosedürü kullanılarak hem nükleer hem de çevresindeki sitoplazmik yoğunluk değerlerine dayanarak optimal nükleer yüzeyi belirler. (C) Nükleer ve sitoplazmik transkriptleri ayırt etmek için --nuclei_dilation seçeneğinin gösterilmesi. SmFISH noktalarıyla çevrili GFP etiketli bir çekirdeği gösteren tek optik kesit, DNaz tedavisinden sonra sitoplazmik bölmeyi belirten diffüz DAPI sinyaliyle birlikte. Çizgiler, sırasıyla çekirdek ve sitoplazmik hacimlere karşılık gelen 0 ve 0.5 genişleme faktörlerini gösterir. (D) (C)'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu, puncta'nın hem nükleer hem de sitoplazmik bölmeleri lokalize ettiğini gösterir. Ölçek çubukları, 10 μm (genleşme sonrası doku). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. RNAi aracılı moleküler pertürbasyon kullanılarak nicel iş akışının doğrulanması (A) Dev Lif (GF) somasının ışık tabakası projeksiyonları (10 μm kalınlığı, tam hücre hacmini kaplamayan) membran işaretçisi ile işaretlenmiş ve shakB mRNA'sı için kontrol (üst) ve shakB RNAi (alt) koşullarında incelenmiştir. Kesik yeşil çizgiler, sitoplazmik ancak nükleer mRNA havuzunun azalmadığını vurgulamak için soma sınırlarını gösterir. n, beyin (her hayvanın bir tarafı). (B) ( A) ile aynı şekilde, nükleer işaretleyici ile işaretlenmiş LC4 nöronları için. (C) GF nöronlarında (birleşik nükleer ve sitoplazmik havuzlarda) shakB FISH punkttalarının kontrol ve shakB RNAi koşullarında nicelendirilmesi. Noktalar bireysel nöronları temsil eder (her beyin için bir nöron, her hayvan için bir taraf). (D) LC4 nöronları için (C) ile aynı. Noktalar bireysel beyinleri temsil eder (hayvan başına bir taraf; hücre başına puan sayısı beyin başına ortalanır). (E) GF dendritlerinin konfokal projeksiyonları, zar işaretleyici ile etiketlenmiş ve kontrol (üst) ve shakB RNAi (alt) koşullarında ShakB için boyanmış konfokal projeksiyonlar. (F) GF dendritlerindeki ShakB protein seviyelerinin kontrol altında ve GF>shakB RNAi koşullarında ortalama floresans yoğunluğu olarak ölçülmesiyle nicelendirilmesi. n, beyin (her hayvanın bir tarafı). (G) Zar belirteciyle işaretlenmiş ve kontrol (üstte) ve shakB RNAi koşullarında smGdP-10xV5 etiketli ShakB'yi eksprese eden LC4 nöronlarının konfokal projeksiyonları. Kesik yeşil konturlar, ShakB-V5 yoğunluğunun değerlendirildiği LC4 dendritleri ve akson terminalleri alanlarını gösterir: (H) LC4 dendritleri ve akson terminallerindeki ShakB-smGdP-V5 protein seviyelerinin ölçülmesi; kontrol altında ortalama floresans yoğunluğu ve LC4 > shakB RNAi koşulları olarak ölçülür. n, beyin (her hayvanın bir tarafı). Hata çubukları ortalama ± SEM gösterir. Tüm istatistiksel karşılaştırmalar iki taraflı Welch t-testleri kullanılarak yapıldı. Ölçek çubukları, tüm görüntülerde 10 μm (genleşme sonrası doku). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, genişleme destekli HCR-smFISH, genleşme öncesi immünohistokimya ve segmentasyon tabanlı transkript nicelemesini birleştirerek aynı genetik olarak tanımlanmış nöronlarla eşleşen RNA ve protein ölçümlerini mümkün kılar. Bu bileşenleri tek bir iş akışına entegre ederek, bu yöntem sağlam Drosophila beyninde niceliksel, hücre tipine özgü moleküler analizi kolaylaştıracaktır.

Burada getirilen birkaç pratik modifikasyon, Drosophila beyninde immünohistokimya ile genleşme destekli HCR-smFISH ile birleştirilmesi için kritik^{adımları temsil etmektedir 24}. İlk olarak, doku genişlemesinden önce immünohistokimya yapılmalıdır ve smFISH. Protokol bir Proteinaz K sindirim aşamasını içerdiğinden, genleşmeden sonra immünohistokimya yapmak epitopun bütünlüğünü azaltabilir. Önemli olarak, pre-genleşme antikor kuluçkası (24 saat birincil + 24 saat ikincil), RNase-clean tekniği ve kovalent RNA sabitleme kullanıldığında RNA sinyal yoğunluğunu belirgin şekilde azaltmaz. İkinci olarak, birincil ve ikincil antikor konsantrasyonları, standart tam montaj IHC'ye göre genellikle 2–3× olarak artırılmalıdır; bu, Proteinaz K sindirimi ve doku genişlemesiyle ilişkili sinyal kaybını telafi etmek için. Üçüncüsü, fiksasyon koşulları hem protein hem de RNA sinyalinin korunması için önemlidir. Asitsiz glioksal fiksasyon, nokta sinaptik protein lokalizasyonunun korunmasını artırır, nöronal süreçlerin yapısal bütünlüğünü korur ve mRNA noktalarının nicel tespitini bozmaz. Ayrıca, RNA ve proteinin eşzamanlı sabitlenmesinin hem aşağı akış HCR-smFISH hem de immünoflüoresans tespitiyle uyumlu olduğunu gözlemledik. Bu ayarlamalar birlikte, immünohistokimya ile genişleme destekli transkript tespiti arasındaki uyumluluğu artırır.

Genişleme tek bir gece aşaması ekliyor ve teknik olarak karmaşık değil, ancak kullanımı deneysel hedefe bağlı. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, genin belirli bir hücre tipinde ifade edilip edilmediğini değerlendirmek için genişletilmemiş FISH, immünohistokimya ile birleştiğinde, genin belirli bir hücre tipinde ifade edilip edilmediğini değerlendirmek için yeterlidir; iken, bireysel smFISH noktalarının güvenilir şekilde çözülmesi, bireysel somatalara atanması ve etkili mekansal çözünürlükte önemli artış nedeniyle nicel olarak analiz edilmesi gerektiğinde genleşme gereklidir. Benzer şekilde, Terasaki tarzı çoklu kuyu plakaları kesinlikle zorunlu değildir, ancak reaktif kullanımını azaltır, birden fazla koşulun paralel işlenmesine izin verir ve küçük partiler arasında örnek kimliğinin korunmasına yardımcı olur; Standart mikrosantrifüj tüpleri de reaktif hacmi daha az sınırlayıcı olduğunda kullanılabilir. Işık tabakası mikroskobisi, genişlemiş dokunun hızlı hacimsel görüntülemesini mümkün kılsa da, standart ters lazer tarama ve dönen disk konfokal sistemlerinin, genişletilmiş Drosophila beynindeki seçilmiş nöronal popülasyonların tam görüntülenmesi için yeterli olduğunu gösteriyoruz. Konfokal mikroskopinin yaygın bir sınırlaması kısa çalışma mesafesidir. Ancak, sinek beyni küçük olduğu ve örnekler PBS'de yaklaşık 2×% genişlediği için, uzun çalışma mesafesi suya batma hedefleri yeterli penetrasyon derinliği sağlar. Nicel karşılaştırmalar için, alım ayarları örnekler arasında aynı tutulmalı, doygun piksellerden kaçınmalı ve voxel boyutu bireysel smFISH noktalarını çözmek için yeterli olmalıdır. Bu, protokolün özel ışık levhası enstrümantasyonu olmayan laboratuvarlara erişimini genişletir.

Güncellenmiş FlySeg uygulaması, daha önce yayımlanmış FlySeg çerçevesinin üzerine inşa edilir ve bu protokol için iki ana ekleme getirir. İlk olarak, yapılandırılabilir bir nükleer genişleme parametresi, smFISH noktalarının segmentli çekirdeklerle mekansal ilişkilerine dayanarak nükleer veya sitoplazmik olarak sınıflandırılmasını sağlar. DNaz tedavisinden sonra sitoplazmik DAPI boyama bu aşama için önemlidir; çünkü hücre vücudunu belirleyen dağınık bir sinyal sağlar ve güvenilir nükleer segmentasyonu destekler, böylece nükleer ve sitoplazmik transkript havuzlarının ayrılmasını destekler. İkinci olarak, otomatik outlier algılama, zayıf segmentlenmiş çekirdekleri belirler ve bunlar aşağı akış niceliklerinden dışlanabilir. Hücre tipine özgü gen knockdown'ın moleküler etkilerini değerlendirmenin ötesinde, nükleer ve sitoplazmik transkriptlerin ayrılması, transkript lokalizasyonu devam eden transkripsiyon aktivitesini yansıttığında bilgilendirici olabilir. Memeli beyinlerinde, aktivite kaynaklı hemen erken gen transkripsiyonları önce çekirdekte görülür ve ardından mRNA'lar işlenip dışa aktarılırken sitoplazmada^{birikir 39}; bu prensip nöronal aktivasyon sürelerinin^{catFISH 40} analizinde kullanılır. Drosophila beyninde benzer transkripsiyonel dinamiklerin olup olmadığı şu anda bilinmemektedir, ancak bu prensipte mevcut iş akışı kullanılarak araştırılabilir. Diğer tüm darbe komacası deneylerinde, nükleeri sitoplazmik noktadan ayırt etmek, toplam transkript sayısının ötesinde zamansal bilgi sağlayabilir. Aynı zamanda, iş akışı sadece nükleer segmentasyonla sınırlı değildir ve tüm soma (yani zar tanımlı) hücre segmentasyonuna uyarlanabilir. Mevcut nicel iş akışı nöronal somatalar için optimize edilmiştir; Nöropil bölgeleri görüntülenebilse de, mRNA puncta'larının bireysel aksonlara veya dendritlere nicel olarak atanması ek bölme-spesifik segmentasyon stratejileri gerektirir. FlySeg, nüfus düzeyinde istatistiklerin gerektirdiği yoğun nöronal popülasyonlarda otomatik, yüksek verimli niceliklendirme için en faydalıdır. Bireysel olarak tanımlanabilir nöronlar veya manuel olarak tanımlanan bölmeler için Imaris veya FIJI/ImageJ gibi diğer araçlar daha uygun olabilir. Bu nicelik stratejilerinin özeti, ana uygulamaları, avantajları ve sınırlamaları dahil olmak üzere Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

Yaygın sorun giderme noktaları arasında zayıf antikor sinyali, yüksek smFISH arka planı, jel hasarı veya örnek kaybı, görüntüleme sırasında örnek kayması ve zayıf segmentasyon bulunur. Zayıf antikor sinyali genellikle antikor konsantrasyonunu daha da artırarak veya birincil ve/veya ikincil antikor kuluçkalarını 24 saatten 48 saate uzatarak iyileştirilebilir. Yüksek smFISH arka planı genellikle hibridizasyon sonrası yıkamaların uzatılması ve doygun alım ayarlarından kaçınarak azaltılabilir. Jel hasarı ve örnek kaybı, geniş delikli uçlar, düz kesimli jeller kullanılarak ve kabarcıkların oluşmasını önlemek için vent kanallarının kesilmesiyle en aza indirilir. Görüntüleme sırasında örnek kayması, montaj edilen jellerin en az 1 saat dengelenmesiyle azaltılır; Kayma devam ederse, denge 2 saat veya daha uzun süreye kadar uzatılabilir. Zayıf segmentasyon, zayıf sitoplazmik DAPI boyama veya eksik örnek dengelenmesinden kaynaklanabilir; bu da hücre sınırı sinyalini azaltabilir veya alım sırasında X-Y-Z kaymalarına neden olabilir; bunlar FlySeg parametrelerini ayarlamadan önce kontrol edilmelidir. Bu protokolde jeller 1× PBS içinde tutulur ve yaklaşık 2× izotropik genişleme sağlanır. Daha yüksek mekansal çözünürlük gerekirse, seyreltilmiş PBS veya deiyonize suda daha büyük genleşme sağlanabilir. Buna karşılık, amaç yalnızca tanımlanmış bir hücre tipinde ekspresyonun varlığını veya yokluğunu değerlendirmek ise, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, genişletilmemiş FISH ve immünohistokimya kombinasyonu yeterli olabilir. Protokol, yinelemeli FISH iş akışlarıyla uyumludur. Problar ve HCR saç toknaları DNaz tedavisiyle çıkarılabilir, böylece aynı örnekte ek hibritleşme ve amplifikasyon turları yapılabilir. Gelecekteki teknik uzantılar arasında daha yüksek pleksli yinelemeli HCR-smFISH, görüntüleme turları arasında otomatik kayıt, geliştirilmiş tüm hücre veya nörit segmentasyonu ve deneyler arasında RNA ve protein sinyallerini karşılaştırmak için daha standart analiz boru hatları yer alabilir. Bölme-spesifik segmentasyon stratejilerinin geliştirilmesi, nicel analizi nöronal somataların ötesine aksonlar ve dendritlere de genişletebilir. Birleşik RNA–protein okuması, bölme-çözümlü transkript niceliği ve standart görüntüleme platformlarıyla uyumluluk, bu iş akışını sağlam Drosophila beyninin genetik olarak tanımlanmış nöronlarında hedefli moleküler doğrulama deneyleri için uygun kılar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10N Sodyum Hidroksit Çözeltisi	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
1N Sodyum Hidroksit Çözeltisi	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Salin-Sodyum Sitrat Tamponu & nbsp;	Invitrogen	Cat# AM9763
4-hidroksi-TEMPO	Sigma-Aldrich	Cat# 176141
5M Sodyum Klorür Çözeltisi	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Akrilamid	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Akrilik asit	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Akriloyl-X, SE	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	Yok
Alexa Fluor 488 Keçi Tavuk Karşıtı (1:200)	Jackson ImmunoResearch Laboratuvarları	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Keçi Fare Karşıtı IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Tavşan IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Amonyum persülfat	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
Ansusuz DMSO	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Bondik UV ile kürlenen yapıştırıcı	Bondic	Bondic başlangıç kiti
cellSens görüntüleme yazılımı v4.4.1	Obvious Scientific	Yok
Tavuk Poliklonal Anti-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (çevre yöneticisi)	Anaconda, Inc	Yok
Corning™ Frosted Microscope Slides	Corning	Cat# 2948-75X25
Özel Tasarlanmış LS7 Numune Tutucu	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Tek Kullanımlık Paslanmaz Steril Skalpel	MedPride	MPR-47101
Etilen diamintetraasetik asit	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Fiji (ImageJ) görüntü analiz yazılımı v2.14.0	ImageJ Konsorsiyumu	Yok
FlySeg (özel pipeline)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	Yok
GAF fiksatif çözüm	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® 24 Kuyu hücre kültür plakası, işlememiş	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Bloomington Stok Merkezi	#41315
Keçi Serumu Donör Sürüsü	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Amplifikatör Tamponu	Moleküler Aletler	Yok
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Amplifikatörler: AF546, JF669	Moleküler Aletler	Yok
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Prob Hibridizasyon Tamponu	Moleküler Aletler	Yok
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Prob Yıkama Tamponu	Moleküler Aletler	Yok
HCR™ RNA-FISH(v3.0) ShakB Prob	Moleküler Aletler	Yok
Imaris 10.1	Oxford Instruments	Yok
IXPlore IX85 SpinSR Dönen Disk Konfokal Mikroskopu	Obvious Scientific	Yok
LS7 Işık Levha Mikroskobu	Carl Zeiss	Yok
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Fare Monoklonal Anti-V5 (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'-Tetrametiletilenediamin & nbsp;	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N'-Metilenbeniza krilamid & nbsp;	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Napari	Açık kaynak topluluğu	Yok
NIS-Elements İleri Araştırma görüntüleme yazılımı	Nikon Şirketi	Yok
Nükleazsız Su	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ Nunclon&trade ile MiniTrays; Delta yüzeyi	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	Cat# 70011044
Photo-Flo deterjan	Elektron Mikroskopi Bilimleri	Cat# 74257
Poli-L-Lizin Çözeltisi	Ted Pella	Cat# 18026
Hassas Kapaklı Gözlükler, #1.5H Kalınlık	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal&Trade; Yapıştırıcılı silikon izolatörü, bir kuyu, çapı 20 mm, derinliği 0,5 mm	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinaz K	New England  Biolabs	Cat# P8107S
Tavşan Anti-ShakB (1:400)	Geord Ammer'den Hediye	Yok
RNase AWAY™ Yüzey Dezinantı	Invitrogen	Cat# 7002
RNaz-Free DNase Set	Qiagen	Cat# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto ve ark., 2025	PMID: 41278920
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Stemi 508 Stereo Mikroskop	Carl Zeiss	Yok
SYTO™ 41 Mavi Floresan Nükleik Asit Boyama	Invitrogen	Cat# S11352
Ti2E AXR NSPARC Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop	Nikon Şirketi	Yok
Tris Base	Fisher Scientific	Cat# BP152-500
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo ve ark. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski ve ark., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Bloomington Stok Merkezi	#35785
UAS-myr::GFP;	Bloomington Stok Merkezi	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer ve ark., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8.0	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (Dev Lif)	Dombrovski ve ark., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	Yok