İçi Lif Perfüzyon Biyoreaktörlerinde Yüksek Yoğunluklu 3D Hücre Kültürlerinden Büyük Ölçekli Ekstraselüler Vezikül Üretimi

Özet

MSC ve diğer hücre tiplerinden ekstrahücre vezikül üretimi için 3D perfüzyon içi boş fiber biyoreaktörün kurulumu ve kullanımı için talimatlar verilmektedir. Bu protokol, içi boş lifli biyoreaktörlerde hücre yoğunluğunu kontrol ederken, yüksek konsantrasyonlarda sürekli olarak hücre dışı veziküller üretmeyi tanımlar.

Özet

Ekzozom araştırmaları alanındaki ilerleme, geleneksel 2-D hücre kültüründe salgılanan ekzosomların düşük hücre sayısı ve düşük verimliliği nedeniyle engellenmektedir. Boş lifli biyoreaktörlerde (HFBR) yüksek yoğunluklu hücre kültürleri, 3D kültürde yüksek konsantrasyonlarda uzun süre boyunca çok sayıda hücreden salgılanan biyomoleküllerin ve ekstrahücre veziküllerinin (EV) sürekli üretilmesine olanak tanır. Bu protokol, optimal hücre kütlesi ve 3D perfüzyon kültürü koşullarını koruyarak yoğun salgılanmış ekzozomların toplanmasını açıklar; böylece ticari olarak mevcut bir HFBR'de birkaç hafta veya ay boyunca sürekli üretim boyunca yüksek yoğunluklu hücre büyümesini destekler. Sistem kompakt, kapalı, tek kullanımlık, cGMP uyumlu olabilir, kullanımı kolay ve standart bir CO2 kuluçka makinesine sığabilir. Mezenkimal kök hücreler (MSC) ve insan amniyotik sıvı kök hücreleri (HAFSC) gibi bazı hücreler, bu koşullar altında proliferasyonda azalmış olabilir ve zamanla farklılaşma ile fenotipi etkileyebilir. Temsilci sonuçlar, haftalar veya daha uzun süreli sürekli üretim boyunca tipik EV verimlerini ve hücre yaşamlılığını göstermektedir. Bu yöntem, hem araştırma hem de klinik uygulamalar için uygun, tekrarlanabilir, yüksek kaliteli EV hasatları sağlar.

Giriş

Hücre dışı veziküller, hücrelerarası iletişim ve terapötik uygulamalarda, rejeneratif tıp da dahil olmak üzere, rolleri giderek daha fazla tanınmaktadır. Geleneksel 2-B hücre kültürü yöntemleri emek yoğun ve sınırlı verimlidir; bazen deneyler veya hayvan çalışmaları için yeterli EV elde etmek için yüzlerce kültür şişesi gerektirir ^1,2. Klinik çeviri ölçeklendirme genellikle mikrotaşıyıcılar veya diğer destekler kullanan geleneksel karıştırılmış biyoreaktörler kullanır. Bu sistemler doğası gereği fizyolojik değildir, verimsizdir ve değişken sonuçlar doğurabilir. Boş lifli biyoreaktörler, kompakt bir ayak izi içinde ve klinik uygulamalara uygun olabilecek ölçekte yüksek yoğunluklu hücre kültürlerini destekleyen üç boyutlu, perfüzyon tabanlı bir ortam^{sağlar 3,4}.

HFBR'ler, geleneksel 2-B kültüre kıyasla daha az iş, zaman ve alanla yoğun ve yoğun hücre kültürü sistemi sunar^. Kompakt bir alanda yüksek yoğunluklu hücre kültürlerini mümkün kılarak herhangi bir laboratuvarda büyük ölçekli EV üretimini destekler. HFBR'ler, standart bir_CO2 kuluçka makinesinde küçük hacimde (20–60 mL) çok sayıda hücre (1X10⁹ ila 1×10¹⁰) yetiştirir ve özel ekipman gerektirmez. Bu sistemler, haftalar veya aylar boyunca sürekli ve yoğun EV hasadına izin verirken, azaltılmış serum veya kimyasal olarak tanımlanmış ortam kullanımını kolaylaştırır. HFBR'de hücreler, ekstra kapiler alanın (ECS) küçük hacminde, daire ortamından ayırılmış yarı geçirgen, moleküler ağırlık kesimi (MWCO) olan yarı geçirgen, içi boş lif membranıyla ayrılır (Şekil 1). Glikoz ve laktat gibi küçük moleküller lifleri kolayca geçebilirken, antikorlar veya ekstraselüler veziküller gibi daha büyük elementler ECS'de tutulur ve toplanır ve burada toplanabilirler.

Boş lifli hücre kültürünü diğer yöntemlerden ayıran üç temel özellik: 1) yüksek yüzey alanı/hacim oranı (200^{cm 2}/mL), vivo benzeri hücre yoğunluklarına izin verir, mL'de 1–2 × 108^hücre. 2) Hücreler, gözeneksiz bir plastik kaba değil, gözenekli bir desteğe bağlıdır. Hücre bölmesi zorunlu^{değildir 3}. Lifin moleküler ağırlık kesme (MWCO) kontrolü yapılabilir. Salgılanan ürünler, kartuşun ECS'sindeki 2-D şişe kültürüne kıyasla 10–100 kat tutulur ve yoğunlaştırılır. Ayrıca, fibronektin veya kolajen gibi spesifik protein matrisleri de lif yüzeyine kolayca uygulanabilir ve lifler arasındaki akışı etkilemez.

HFBR, 2-D kültür^6'ya göre daha in vivo benzeri bir 3D perfüzyon temelli kültür ortamı sağlar ve hücrelerin serum desteğine bağımlılığını benzersiz şekilde azaltır ve ortam gereksinimlerini basitleştirir. Bu yüksek yoğunluklu kültür ortamı, 2-B kültüre kıyasla protein işleme farklılıklarını destekleyebilir ve bildirilen gelişmiş EV ^{biyoaktivitesi 7,8,9} ile birlikte olabilir. Boş lifli biyoreaktörler "histosentrik"tir; In vivo hücre fizyolojisinin doku benzeri özelliklerini^{taklit etmeye çalışırlar.} Histosentrik biyoreaktörün iki temel özelliği şunlardır: 1) yüksek hücre yoğunluğu, hücrelerin kendi spesifik mikro ortamlarını üretmesine izin verir ve 2) hücrelerin bölünmesi veya geçişi gerekmez; bu da hücrelerden hücrelere etkileşimler ve sferoidler gibi 3D yapıların zamanla organik olarak gelişmesine olanak tanır. Bu yöntem, geleneksel 2-B kültür sistemleriyle elde edilmesi zor olan hücre yoğunluklarını sağlar ve basitleştirilmiş, proteinsiz ve kimyasal olarak tanımlanmış ortamların kullanımını kolaylaştırabilir.

Şişelerde kültürlenebilecek herhangi bir hücre tipi, boş lifli biyoreaktörde kültürlenebilir. Dönüştürülmüş hücre hatları^{proliferatif 11} olur. İzlenmesi gereken temel parametre glikoz alım oranıdır. Glukoz izleme, metabolik aktivitenin doğrudan ölçümü sağlar; hasat zamanının optimize edilmesini ve hücre^{yoğunluğunun kontrolünü sağlar 12}. Kartuş içindeki hücre kütlesini kontrol etmek önemlidir, böylece glikoz alım oranı sistemin oksijen taşıma ve^CO2 alma kapasitesini aşmaz. Bu, hasat sırasında hücre kütlesinin kolayca çıkarılmasıyla yapılır. MSC'ler ve HAFSC'ler boş lifli biyoreaktörde çoğalmaz ancak hareketsiz kalır. Bu hücreler, biyoreaktörde tohumlanmadan önce genişlemeye ihtiyaç duyar. Ancak kültür kurulduktan sonra, EV'ler haftalar veya aylar boyunca kesintisiz olarak hasat edilebiliyor. MSC fenotipi, kültür boyunca 30 gün boyunca değişmez, belki CD105 ekspresyonu hariç, bu süre içinde azalır. Biyoreaktörden alınan MSC'ler serum içeren ortamda bir şişeye kaplama yapıldığında, CD105 ekspresyonu başlangıç^{seviyesi 13'e} döndü. CD105 ifadesi, 2-D vs. 3D kültürü için bir işaretçi olarak hizmet edebilir. Geçici transfeksiyon teknikleri, yarı-stabil transfektan¹⁴ yapmak için de kullanılabilir.

3D boş lifli hücre kültürünün daha canlı hücre kültürü koşulları ve avantajlarına örnekler arasında zaman içinde tam ve uniform post-translasyonel^{modifikasyonlar 15,16}, kriptosporidium kültürü için mide epiteliyle villilerin^{oluşumu 17}, 3D karaciğer¹⁸, 3D kan-beyin bariyeri^{modeli 19}, plazmodium sporozoit^{oluşumu 20} ve kemik iliği/kök hücre birlikte yetiştirilmesi²¹ yer alır.

HFBR'de EV'ler yüksek yoğundur ve hücre lizisi sınırlı olduğu için hücre içi proteinler ve membran parçalarından kaynaklanan kontaminasyon azalır. Boş lifli biyoreaktörler, lifleri kesmeyen yüksek moleküler ağırlıklı bileşenler olmadığı sürece, herhangi bir ortamla uyumludur. Gerekirse, bu büyük moleküller doğrudan biyoreaktörün ECS'sine eklenebilir. DMEM gibi yüksek glukozlu ortamlar tercih edilir. Daha az karmaşık, proteinsiz hücre kültürü ortamları, protein yükünü azaltarak arındırmayı basitleştirebilir. Mezenkimal kök hücreler ve insan amniyotik sıvı kök hücreleri, standart bazal ortam ve FBS'de, ayrıca ticari olarak mevcut olan çeşitli MSC ortam formülasyonlarında kültürlenmiştir. HFBR, hazır kartuşlarla gram miktarda ekzosom üretebilir. Boş lifli biyoreaktör, potansiyel cGMP koşullarında büyük ölçekli ekzosom üretimi için faydalı bir yöntemdir ve hem ekzozom araştırmalarını hem de klinik çeviriyi ilerletmede bir paradigma değişimini temsil eder.

Hücre dışı vezikül üretimi için içi boş lifli bir biyoreaktörün başarılı kullanımı oldukça protokol özeldir. Biyoreaktörün manipülasyonu, hücre tohumlama yoğunluğu, hasat sıklığı ve kullanılan ortamın hepsi başarılı bir biyoreaktör çalışmasına katkıda bulunabilir. Bu protokol, yüksek yoğunluklu hücre kültürlerinden ekstrasellüler vezikülleri üretmek ve toplamak için içi boş lifli bir biyoreaktör kullanımı için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar. Amaç, sistem kurulumu, hücre aşılama, kültür bakımı ve hasat prosedürleri gibi rehberlikleri içeren EV hasadı için tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlamaktır. Bu yöntem, araştırma uygulamaları için tutarlı EV üretimini desteklemeyi ve farklı hücre tipleri ile deneysel hedeflere uyarlanabilecek bir çerçeve sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler, standart İyi Laboratuvar Uygulaması (GLP) ve İyi Hücre ve Doku Kültürü Uygulaması yönergelerine uygundur.

NOT: Kartuş önceden monte edilmiş ve gamma sterilize edilmiştir. Çift torbalıdır ve her bağlantıda luer kapakları bulunur, bu yüzden tamamen kapalıdır ve poşetlerin dışında steril kalır. Kartuş portu tanımlaması için Şekil 2'ye bakınız. Tüm adımlar oda sıcaklığında, laminar akışlı bir başlıkta gerçekleştirildi.

1. Rezervuar Kapağının hazırlanması ve sterilizasyonu.

1. Çift torbalı kartuştan iki kısa boru parçasını çıkarın.
2. Boruyu, rezervuar kapağının paslanmaz çelik borusundaki hortum dikenlerine takın.
3. Kısa boru ve paslanmaz çelik boruların açıkta kalan uçlarını alüminyum folyo ile sararak otoklavlama sonrası sterilliği koruyun. Monte edilen parçaları bir otoklav torbasına yerleştirin.
4. 121 °C'de 15–30 dakika boyunca kuru bir döngü kullanarak otoklav yapılır. Kullanmadan önce kapağı oda sıcaklığına kadar soğutun.

2. Boş fiber kartuşu rezervuar şişesine takın

1. 1 L'lik bir şişeden 50 mL PBS'yi 50 mL konik bir tüpe aktarın ve daha sonra kullanın.
2. Depo kapağını otoklav torbasından çıkarın ve uzun çelik borulardan koruyucu folyoyu çıkarın.
3. PBS şişesinden kapağı çıkarın ve rezervuar kapağını yerine vidalın. Fişiği iç steril poşetten çıkarın.
4. Rezervuar kapağının üstündeki boru parçalarından birinden alüminyum folyoyu çıkarın.
5. Uzun kartuş boru parçalarından birinden luer kapağını çıkarın ve rezervuar kapağındaki rezervuar borusuna takın. Biraz geri dönüş yapın, ki burkulmayı önlesin.
6. İkinci boru bağlantısı için de tekrarlayın.
7. PBS'nin sistemden geçmesi için kahverengi pompa borusunu nazikçe sıkarak tüm hava kabarcıkları giderilmesini sağlayın.

3. Ekstra kapiller boşluğun doldurulması (ECS)

1. 20 mL PBS'yi steril bir şırıngaya en az 1,5" uzunluğunda büyük bir iğne ile çekin; Güvenlik için kör iğne tercih edilir.
2. Her iki yan port luer bağlantısını alkolle dezenfekte edin ve kurumasına izin verin.
3. PBS dolu şırıngayı bir yan porta, boş steril şırıngayı ise karşı porta takın. Her iki uç portunu kapatın ve her iki yan portu açın.
4. PBS'yi ECS'ye yavaşça enjekte ederek kartuşu hafif bir açıyla tutarak hava kabarcıklarını en aza indirin. Karşı taraftaki boş şırınga hava ile dolur.
5. ECS'de hava varsa, sağ uç portunu açın ve sıvıyı boş şırıngaya çekin, ta ki ECS sıvıyla dolana kadar (bu, PBS'yi rezervuar şişesinden, liflerden ve ECS'ye çeker).
6. Her iki yan port sürgü kelepçesini kapatın, her iki uç port sürgü kelepçesini açın ve pompa borusunu parmaklarınızla nazikçe sıkıştırarak akışı kontrol edin.
7. Boş şırıngaları yan portlara bağlı bırakın, böylece kapak olarak hizmet eder. Laminar akış kapüşonundan çıktıklarında şırıngaları her yeni olanla değiştirin.

4. Kaplama lifleri ve hücre aşısı

NOT: Liflerin belirli bir matris proteiniyle kaplama ve hücrelerin aşılanması prosedürleri esasen aynıdır. Fazla sıvı liflerden geçip rezervuara akarken, hücreler veya kaplama malzemesi ECS'deki liflerin dışında kalacaktır. Tohumlama için 1 × 10⁸ hücre önerilir. 4.000 cm² HFBR için 20 mL PBS içinde 100–500 μg matriks proteini önerilir. Lif yüzeylerine bağlanan matris proteinleri MWCO'yu etkilemez

1. Kaplama çözeltisi veya hücre süspansiyonunu steril 50 mL konik bir tüpte hazırlayın. 1 X 108 hücre, şişe genişlemesinden koşullanmış ortamda veya PBS'de 100–500 ug matris proteini. Cilt 20 ml.
2. 20 mL hücre veya kaplama çözeltisi büyük ölçülü bir iğne kullanarak steril bir şırıngaya çekilin.
3. Çözeltiyi içeren şırıngayı bir yan porta, boş steril şırıngayı diğer yan porta takın.
4. Her iki uç portunu kapatın ve her iki yan portu açın.
5. Sıvıyı iki şırınga arasında geçirerek çözeltiyi nazikçe karıştırın. Her şırıngada çözeltinin yarısını bırakın. Her iki yan portu kapatın.
6. Sağ uç portunu açın ve rezervuar kapağını dörtte tur gevşedin.
7. Bir şırıngadan alınan çözeltiyi ECS'ye enjekte edin. Bağlı yan portu kapatın.
8. Diğer şırıngadan çözeltiyi enjekte edin. Bağlı yan portu kapatın. Her iki uç portunu da açın.
9. Aşılanan hücreler varsa, kartuşu oda sıcaklığında 30 dakika yatay pozisyonda bırakın, ardından uzun eksen boyunca 180° döndürün ve ek 30 dakika bekletin.
   1. Lifleri matriks proteiniyle kaplıyorsanız, gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
10. Kartuşu Duet pompa sistemine yerleştirin ve 25 numaradan akışı başlatın.

5. Hasat Hazırlıkları ( bkz. Şekil 2)

1. Sağ taraf portuna 3 yollu bir stop muslu ve steril filtreli boş steril bir şırınga takın.
2. 3 yönlü stop musunu steril filtreden havalandırma için ayarlayın. Sol taraf portuna ikinci boş steril şırıngayı takın.

6. Koşullu ortamın toplanması (Hasat)

1. Sağ taraf portunu açın ve filtreden steril havalandırmayı sürdürün.
2. Kartuşun sağ ucunu yukarı doğru eğin ve koşullu ortamı (ürünü) sol enjeksiyona çekin. ECS içeriğini tamamen sol şırıngaya boşaltın.
3. Sağ taraftaki portu kapat. Sol taraf portunu kapatın, şırıngayı çıkarın ve hasadı 50 mL'lik konik bir tüpe içine toplayın.
4. Sol taraftaki porttaki şırıngayı değiştirin. Sol taraf portunu açın. Sağ uç portunu açın.
   Rezervuar kapağını 1/4 tur sök.
5. Kartuşun sol ucunu yukarı doğru eğin ve sol yan porta bağlı şırıngadan çekerek ECS'yi doldurun. ECS'yi tamamen sıvı menisküs yan port borusunun ortasına kadar doldurun.
6. Sağ uç portunu kapat. Sağ taraftaki portu açın ve 3 yollu stop musunu filtreden havalandırmak için ayarlayın.
7. Sol taraf portunu açın. Kartuşu sağa doğru eğin ve ECS'yi tamamen sol şırıngaya boşaltın.
8. Sol taraf portunu kapat. Şırıngayı çıkarın ve toplanan ECS'yi 50 mL'lik konik tüpe içine toplayın.
9. Şırıngayı sol taraf portuna takın. Sağ taraftaki portu kapat. Sağ uç portunu aç
10. Kartuşun sol tarafını yukarı doğru eğin ve ECS'yi sol şırıngadan çekerek doldurun. ECS'yi tamamen sıvı menisküs yan port borusunun ortasına kadar doldurun.
11. Sol taraf portunu kapat. Sol uç portunu açın. Rezervuar kapağını sık.
12. Kartuşu Duet pompasına geri göndermeden önce pompa borusunu manuel olarak sıkıştırarak sistem akışını onaylayın.

7. Biyoreaktörü pompa sistemine takın.

1. Pompa akış hızını kontrol kutusunda 25'e ayarlayın. Pompa çalışırken kartuş daha kolay takılır.
2. Akış yolu standının sağ kenarını tutun. Pompa borusunu pompa borusuna kaydırın.
3. Akış yolunun tabanını pompa tabanındaki yuvaya kaydırın. Dikdörtgen kayıt cihazının akış yolu standındaki kesik noktaya takıldığından emin olun.
4. Rezervuar şişesini pompa tabanının yanındaki girintiye yerleştirin.
5. İnce güç kablosu, kuluçka makinesindeki contaların arasına sığacak. Kontrol kutusunda, kuluçka makinesinin yanına takmak için bir mıknatıs bulunur.

8. Glikoz seviyelerini izleyin

1. 1 mL pipet kullanarak, rezervuar şişesinden 1 mL'lik bir ortam örneği alın.
2. Uyumlu bir glukoz ölçer kullanarak küçük bir damla örneklenmiş ortamı sayaç test şeridine koyarak glikoz konsantrasyonunu ölçün.

9. Glikoz Alım Oranının Hesaplanması

NOT: Glikoz alım oranı, ilk glukoz ölçümünden 24 saat sonra alınarak hesaplanır. Oran rezervuar hacmine bağlı olduğundan, glikoz konsantrasyonundaki düşüşü rezervuar hacmi ile litrede çarpın. Örneğin, rezervuar şişesinde 250 mL varsa, 0,25 (%25) ile çarpın. (Glukoz1-Glukoz2) X (rezervuar şişesi, litrede). 250 mL 0.25 L. Birden fazla gün geçmişse, bunu gün sayısına böl. Örneğin: Başlangıç glikozu 4.5 g/L; 24 saat sonra glikoz ölçüm: 2.7 g/L; rezervuar şişesi: 250 mL. 4.5-2.7=1.8 g. 1.8X.25 (rezervuar şişesi 0.25 L), 0.45 g glikoz tüketilir. Glikoz alım oranı günde 450 mg'dır.

10. Geçerlilik Kontrolü

1. Hasat protokolünü kullanarak küçük bir hücre örneği toplayın.
2. Plaka hücrelerini taze %10 serum içeren bir T 25 kültür şişesine yerleştirin. Bağlanma ve yaşama yeteneğini görsel olarak değerlendirin.

11. Kartuşun günlük bakımı ve kültürün ilk haftası.

NOT: Kültürün ilk haftasında, proliferatif hücreler günde tüketilen 1–2 gram glukoz hedef oranına ulaşacak.

1. 0. Gün: Hücreleri aşılayın, medya formülasyonundan glukoz başlangıç konsantrasyonunu belirleyin. Başlangıç rezervuar hacmi: 125 mL.
2. 1-2. Gün: Her gün glikozu ölçün. Başlangıç glikozu %50 tükendiğinde, 125 mL rezervuarı 250 mL taze ortam ile değiştirin ve serumu %7,5'e indirin.
3. 3-4. Gün: Glikozu ölçün. Başlangıç glikozu %50 azaldığında, 250 mL rezervuarı 500 mL taze ortamla değiştirin ve serumu %5'e indirin.
4. 4-5. Gün: Glikozu ölç. Başlangıç glukozu %50 azaldığında, 500 mL yerine 1L taze ortam verin. Serumu %2,5'e indirin ve isterseniz kimyasal olarak tanımlanmış medyaya geçin.
5. 6+ Gün: Glikozu ölç, ECS alın. Hücre yoğunluğunu hasat ederek günde 1 ila 2 gram arasında glikoz alımını tutmak için kontrol edin.
6. Çoğaltıcı olmayan hücreler için, rezervuar şişesinde 125 mL ile başlayın ve ortamı her 3 günde bir değiştirin.
7. Eğer önemli miktarda glukoz tüketimi varsa, rezervuar 250 mL'ye çıkarılır. Serumu 3-4. günlerde ECS'den çıkarın ve yerine bazal ortamla değiştirin.

Sonuçlar

Bu protokole göre, çoğalan hücre hatlarıyla tohumlanmış 4.000 cm² kartuş genellikle günde 1–2 g glikoz tüketir. Bu, DMEM gibi yüksek glikozlu bir ortam kullanıldığında her 2–3 günde 1 L ortam anlamına gelir. Hücreler, tohumlandıktan sonraki bir hafta içinde maksimum yoğunluğa ulaşır. Hasat, 5–7 gün sonra veya glikoz alım oranı günde 1 g'a ulaştığında başlamalı ve mümkünse her gün yapılmalıdır. Kültürün bu ilk haftasında, ECS'deki serum içeren ortam, gerekirse serum dolaşımdaki ortamda korunurken serumsuz bazal ortamla değiştirilebilir. Glikoz alım oranı günde 1 g'a ulaştığında, kolayca azaltılmış serum ortamına veya kimyasal olarak tanımlanmış diğer ortamlara geçebilirsiniz. MSC ve HAFSC'ler, CHO, 293 veya hibritoma gibi dönüştürülmüş hücre hatlarına göre çok daha düşük oranda glikoz tüketir. Sferoidlerin oluşumu, MSC ve HAFSC ile diğer hücre tiplerinde tipiktir (Şekil 3). Günlük glikoz izleme, kültür sağlığı ve metabolik aktivitenin güvenilir bir ölçütü sağlar. Standart, ticari olarak mevcut kseno-serbest medyalar MSC ve HAFSC ile başarıyla kullanılmıştır. Hasat hacmi yaklaşık 20 mL'dir. Hasat aralarında 24 saatlik aralıklar optimal olur çünkü EV konsantrasyonları 24 saat sonra maksimuma ulaşır (Şekil 4). Hasat edilen ortamda tipik ekzozom konsantrasyonları, hücre tipine, hücre tohumlama sayılarına ve diğer faktörlere bağlı olarak 1–5 ×ile 10¹² parçacık/mL arasında değişir ve santrifüjlemeden sonra görünür peletler oluşabilir (Şekil 5). Çok sayıda hücre tohumlanabilir ve kültür alanına değil, hücre sayısına göre yapılmalıdır (Şekil 6).

Sonuçlar, EV üretiminin glikoz tüketimiyle ölçülen metabolik aktiviteyle korelasyon oluşturduğunu göstermekte, kültür performansını izlemek ve optimize etmek için pratik bir parametre sağlamaktadır. Günlük hasat 24 saat aralıklarla EV konsantrasyonunu maksimize eder ve kültür stabilitesini korur. Bu bulgular, içi boş lifli biyoreaktörlerde tekrarlanabilir EV üretimi için glikoz izleme ve kontrollü hasat sıklığının temel parametreler olarak kullanılmasını desteklemektedir.

Şekil 1: Boş fiber biyoreaktörün kesiti. Malzeme, liflerin iç kısmından akar ve hücreler dış yüzeylerine tutunur. Glikoz ve laktat gibi küçük moleküler ağırlıklı bileşenler lifleri kolayca kesebilir. EV'ler gibi salgılanan ürünler lifleri geçemez ve liflerin dışındaki alanda, yani ECS (ekstrakapiller alan) yoğun şekilde yoğunlaşır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Portlar ve kelepçelerle kartuşun fotoğrafı. Akış yolunda tek yönlü çek valfler, ortamın yeniden sirkülasyon akışını oluşturur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mezenkimal kök hücreler, İnsan Amniyotik Sıvı Kök Hücreleri, Kardiyak öncüler ve bazı diğer hücre tipleri, kartuşa yeterince sayıda tohumlandığında sferoidler oluşturur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı zaman aralığı hasatlarından sonra EV konsantrasyonlarının ölçümü. 24 saat sonra, EV konsantrasyonu maksimum konsantrasyona ulaşır. Optimum hasat 24 saat sonrasıdır. (Veriler Paolo Neviani, EV çekirdeği, Los Angeles Çocuk Hastanesi'nden sağlanmıştır). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: C2011 içi boş lifli biyoreaktörde kültürlenen DIFI hücrelerinden bir haftalık EV'lerin hasadı. Diferansiyel santrifüjle izole edilmiş elektrikli araçlar. (veri Jeff Franklin, Vanderbilt Üniversitesi izniyle)^18,19. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Şaşırtıcı derecede çok sayıda hücre boş lifli biyoreaktöre tohumlanabilmektedir. Yüksek lisanslar, 2-D kültürde büyük bir alanı kaplar; 3D kültürde küre olarak yetiştirildiğinde, daha az yer kaplarlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Boş lifli biyoreaktörler, gerçek ticari miktarlarda protein veya antikor üretemezler. Ancak, yüksek yoğunlukta nispeten çok sayıda hücre kültürü yapma ve klinik olarak ilgili ölçekte yoğun bir EV ürünü salgılamada benzersiz bir yeteneklere sahiptirler. Histosantrik bir biyoreaktörün gerçek avantajları ancak son birkaç yılda fark edilmiştir. Yüksek yoğunluklu perfüzyon kültürü koşulları, cGMP uyumlu ortam kullanılarak araştırma ve potansiyel klinik uygulamalar için uygun miktarlarda yoğunlaştırılmış EV'ler ortaya çıkarır. 4.000^{cm 2'den} tek bir hasad, 10–20 mL hacimde 5 ×¹² ila 1 × 10¹⁴ EV içerebilir. Bu verimler, EV^{dozu 22'yi} değerlendiren çalışmalarda bildirilen aralık içindedir.

Günlük glikoz alım oranının izlenmesi, kültür performansını değerlendirmek için önemli bir parametredir ve hücre metabolizması, hücre sayısı ve sağlığın doğrudan göstergesidir. Genel olarak, başlangıç glikoz konsantrasyonu 4.5 g/L olan DMEM gibi yüksek glikoz ortamları tercih edilir. Glikoz %50 tüketildiğinde ortam taze seviyeye değiştirilmelidir. MSC'ler gibi bazı hücreler, 3 g/L'nin üzerindeki glukoz konsantrasyonlarında glikoz tüketip laktat üretiyor, ardından 3 g/L'nin altında glutamin tüketip amonyak üretmeye geçiyor. MSC'lerin 3D kültürde tam metabolik profillenmesi henüz yapılmamıştır.

Başarılı bir biyoreaktör kültürü için en kritik parametre hücre aşılama sayısıdır. 4.000 cm²C2011 biyoreaktörü için minimum aşılama hücresi sayısı 1 × 10⁸ hücredir. MSC veya HAFSC gibi çoğaltmayan hücreler için daha fazla sayıda tercih edilir; toplamda 1×^10.9 hücreye kadar. Rezervuar hacmi, kartuştaki hücre sayısıyla orantılı olmalıdır. 1 × 10⁸ hücre, 125 ml'den büyük olmayan bir rezervuar kullanmalıdır. 1 × 10⁹ hücrede rezervuar 1 L'den büyük olmamalıdır. Çok büyük bir rezervuar hücreleri gecikme fazına gönderebilir. Bu, hücrelerin Trypan Blue boyama ile uygulanabilir olmasına rağmen hiç glukoz tüketmemesiyle karakterizedir. Bu durumda, rezervuar hacmini azaltın veya daha fazla hücre tohumlayın. Etkili bir biyoreaktör kültürü için yeterli hücre sayısı elde etmek için birden fazla hücre aşısı gerekebilir. Kartuşta zaten bulunan hücrelerin üzerine daha fazla hücre ekmek yeterli. Biyoreaktör performansını değerlendirirken, hücre aşısı boyutuna dikkat edin. Hücre tohumlamasında 10 kat artış, EV üretiminin 10 kat artmasına yol açabilir.

Protokoldeki değişiklikler, hücre tipine ve istenen verime bağlı olarak ortam formülasyonları, yüzey kaplamaları, hücre sayıları, hasat hacmi, hasat sıklığı veya şırınga boyutu değişikliklerini içerebilir. Sürekli kültür, kültür sırasında değişiklikler yapılabilir ve gerçek zamanlı sonuçlar elde edilebildiği için kolay, gerçek zamanlı koşul optimizasyonu^{sağlar 21}. Sorun giderme çalışmaları, sterilliği korumaya ve metabolik aktiviteyi izlemeye odaklanmalıdır. Borularda, özellikle sürgü kelepçelerinin etrafında, tıkanıklık veya bükülme olmadığından emin olun. Bakteriyel kontaminasyon, rezervuar şişesinde hızlı glikoz tüketimi ve bulanıklığa yol açar. Mantar kontaminasyonu, kartuşun sol uç kapağında kabarık beyaz birikimi ile belirtilir ve bu da akışı engeller. Boş lifli biyoreaktör sisteminin kullanımı, becerikli bir kullanım ve protokollere sıkı uyum gerektirir. Kritik adımlar arasında doğru sayıda hücre tohumu ekmek, hasat sırasında sterilliği korumak ve aşırı büyüme veya besin tükenmesini önlemek için glikoz tüketimini dikkatlice izlemek yer alır. Çoğu hücre, bazen fibronektin kaplı protein matriksine bağlı olarak liflere bağlanır; bu da hücrelerin hızlı bağlanmasını sağlar. MSC, HAFSC ve kalp öncülleri gibi bazı hücreler liflere bağlı kalır ve 3D sferoidler oluşturur.

HFBR sistemi, çoğu hücre tipinin yüksek yoğunluklu, kimyasal olarak tanımlanmış ve kseno-serbest kültürlerini destekler ve büyük ölçekli EV^{üretimini kolaylaştırır 23}. Günlük glikoz izleme, biyoreaktör performansı için güvenilir bir ölçüt sağlar. Kapalı, perfüzyon tabanlı sistem, cGMP standartlarıyla uyumludur ve daha büyük kartuşlar veya hatta birden fazla kartuş kullanılarak ölçeklendirme mümkündür. Gram ölçekli elektrikli araç üretimi optimize edilmiş koşullarda mümkün olabilir. Boş lifli biyoreaktör, kontrollü koşullar altında sürekli EV üretimi ve toplama için tekrarlanabilir bir platform sağlar. Burada özetlenen protokol, tutarlı çalışma ve güvenilir sonuçları desteklemek için sistem kurulumu, aseptik işlem ve metabolik izleme gibi pratik hususları vurgular. Farklı kültür koşullarında EV özelliklerini ve işlevsel özelliklerini değerlendirmek ve performansı alternatif üretim sistemleriyle karşılaştırmak için daha fazla çalışma gerekebilir.

Bu yöntem, rejeneratif tıp ve terapötik uygulamalar dahil olmak üzere araştırma ve klinik EV üretimi için geniş çapta uygulanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008