Bu çalışma, akupotominin tavşan diz osteoartrit modelinde kıkırdak onarımını teşvik edip etmediğini araştırmıştır. Elli tavşan beş gruba ayrılmıştır. Akupotomi, 4 hafta boyunca haftalık olarak uygulanmıştır. Temel mekanizmayı araştırmak amacıyla eklem şişliği, histopatoloji, inflamatuar sitokinler ve circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK aksı ile ilişkili belirteçler değerlendirilmiştir.
Araştırma makalesi
Acupotomi, Diz Osteoartritinde Kıkırdak Onarımını Teşvik Etmek İçin CircRNA İskele Tabanlı RIC8A/P38 MAPK Aksını Düzenler
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Diz osteoartriti (KOA), progresif kıkırdak dejenerasyonu ve inflamasyon ile karakterizedir. Bu çalışma, bir KOA tavşan modelinde akupotominin terapötik etkilerini ve bunun dairesel RNA fosfodiesteraz 4B (circPDE4B)/kolinesteraz inhibitörlerine direnç 8A (RIC8A)/p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal ekseni ile ilişkisini araştırmıştır. Elli Yeni Zelanda Beyaz tavşanı rastgele beş gruba ayrılmıştır (grup başına n = 10): kontrol, KOA modeli, seleksib, akupotomi ve sham akupotomi. KOA, modifiye Videman yöntemi kullanılarak indüklenmiştir. Modellemeden 6 hafta sonra başlanarak, akupotomi 4 hafta boyunca haftada bir kez uygulanmış, seleksib ise 4 hafta boyunca her gün gavage yoluyla 24 mg/kg dozunda uygulanmıştır. Diz şişliği ve kıkırdak histopatolojisi değerlendirilmiştir. Kıkırdak doku homojenatlarındaki interlökin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve interlökin-6 (IL-6) seviyeleri, enzim bağlı immünosorbent analiz ile ölçülmüştür. Kıkırdak metabolizması ve circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK ekseni ile ilişkili gen ve protein ekspresyonları, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ve Western blotting ile değerlendirilmiştir. KOA model grubuyla karşılaştırıldığında akupotomi; diz şişliğini azaltmış, histopatolojik skorları iyileştirmiş, inflamatuar sitokin seviyelerini düşürmüş, matriks metalloproteinaz-3 (MMP-3), matriks metalloproteinaz-13 (MMP-13), RIC8A ve fosforile p38 MAPK ekspresyonlarını aşağıye düzenlemiş; SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9), aggrekan ve relatif circPDE4B ekspresyonlarını ise yukarıye düzenlemiştir. Akupotominin etkileri seleksib ile kıyaslanabilir düzeydeyken, sham akupotomi anlamlı bir iyileşme sağlamamıştır. Bu bulgular, akupotominin tavşan KOA'sında inflamasyonu ve kıkırdak dejenerasyonunu hafiflettiğini ve bunun circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK ekseninin modülasyonu ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Giriş
Diz osteoartriti (KOA); progresif kıkırdak dejenerasyonu, sinovyal inflamasyon, subkondral kemik sklerozu ve osteofit oluşumu ile karakterize, yaygın bir dejeneratif eklem hastalığıdır1,2,3. Küresel nüfusun yaşlanmasıyla birlikte KOA insidansı artmaya devam etmekte ve bu durum, hastalığı dünya genelinde orta yaşlı ve yaşlı yetişkinler arasında eklem disfonksiyonunun ve kronik ağrının önde gelen nedenlerinden biri haline getirmektedir4,5,6. Mevcut klinik tedaviler temel olarak nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar (NSAİİ) ve intraartiküler kortikosteroid enjeksiyonları gibi farmakolojik ajanlar aracılığıyla semptomatik rahatlamaya odaklanmaktadır. Ancak, hastalığın ilerlemesini durdurabilen veya kıkırdak onarımını teşvik edebilen hastalık modifiye edici tedaviler hala sınırlıdır7,8.
Güncel kanıtlar, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) KOA patogenezi ve ilerlemesindeki önemli düzenleyici rollerini vurgulamıştır9,10,11. Bu ncRNA'lar arasında, dairesel RNA'lar (circRNA'lar), lineer RNA'lara kıyasla daha fazla stabilite sağlayan benzersiz kovalent kapalı döngü yapıları ve çeşitli biyolojik fonksiyonları nedeniyle giderek daha fazla dikkat çekmektedir12,13. Shen ve arkadaşları, circPDE4B'nin, kolinesteraz 8A'ya karşı direnç (RIC8A)/p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal yolu inhibitörlerine karşı direnci düzenleyen bir moleküler iskele görevi gördüğünü, böylece kondrosit hücre dışı matris metabolizmasını ve inflamatuar yanıtları etkilediğini bildirmiştir14. RIC8A/p38 MAPK yolu; kondrositlerde inflamasyon, katabolizma, apoptoz ve senesensin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamakta olup, bunların tamamı osteoartrit patogenezine katkıda bulunmaktadır15.
Akupotomi, geleneksel Çin tıbbı teorisini modern anatomik prensiplerle bütünleştiren minimal invaziv bir terapötik yaklaşımdır ve KOA'nın klinik yönetiminde gelecek vadeden bir etkinlik göstermiştir16,17. Bu teknik, yumuşak doku yapışıklıklarını açmak, lokal dolaşımı iyileştirmek ve etkilenen eklemler çevresinde biyomekanik dengeyi yeniden sağlamak için özelleşmiş bir iğne-bıçak cihazı kullanır; böylece KOA'lı hastalarda ağrıyı hafifletir ve fonksiyonu iyileştirir18. Bildirilen bu klinik faydalarına rağmen, akupotominin terapötik etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmalar, özellikle de kıkırdak onarımında rol oynayan circRNA aracılı sinyal yolaklarını potansiyel düzenlemesi, büyük ölçüde keşfedilmemiş durumdadır.
Mekanistik olarak akupotomi, periartiküler yumuşak doku gevşetmesi yoluyla lokal mekanik stimülasyonlar oluşturur. Kondrositler biyomekanik sinyallere yanıt veren mekanosensitif hücrelerdir ve circRNA'ların kondrositlerin mekanotransdüksiyon yanıtlarında rol aldığı gösterilmiştir19,20. Akupotominin eklem kıkırdağına özgü circRNA'ların regülasyonu ile bağlantısını kuran doğrudan kanıtlar olmasa da, akupotomi tarafından oluşturulan mekanik sinyallerin circPDE4B gibi mekanosensitif circRNA'ları modüle edebilmesi biyolojik olarak makuldür. Bu olasılık, mevcut araştırmanın temelini oluşturmuştur.
circPDE4B'nin RIC8A/p38 MAPK sinyal eksenindeki düzenleyici rolüne ilişkin önceki bulgulara dayanarak, bu çalışma, akupotominin circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK sinyal yolunu modüle ederek kıkırdak onarımını desteklediği hipotezini test etmek için modifiye Videman yöntemiyle indüklenmiş bir tavşan KOA modeli kullanmıştır. Akupotomi, diğer KOA müdahaleleri yerine birkaç nedenden dolayı bu çalışma için seçilmiştir. İlk olarak, öncelikle semptomatik rahatlama sağlayan ve sınırlı hastalık modifiye edici etkilerle ve potansiyel uzun vadeli advers olaylarla ilişkilendirilen7,8 nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar (NSAİİ) ve selekoksib gibi farmakolojik ajanlarla karşılaştırıldığında akupotomi, hem lokal mekanik faktörleri hem de biyolojik sinyal yollarını ele alan farmakolojik olmayan bir yaklaşım sunmaktadır. İkinci olarak, tekrarlanan intraartiküler uygulama gerektiren ve enfeksiyon ile eklem hasarı riskleri taşıyan intraartiküler kortikosteroid veya hyaluronik asit enjeksiyonlarının aksine, akupotomi periartiküler yumuşak dokuları hedefler ve sürdürülebilir biyomekanik ve biyokimyasal etkiler gösterebilir21. Üçüncü olarak, klinik kanıtlar, akupotominin KOA hastalarında ağrıyı azaltma ve eklem fonksiyonlarını iyileştirmede konvansiyonel tedavilere kıyasla benzer veya daha üstün sonuçlar verdiğini göstermiş ve deneysel çalışmalar akupotominin inflamatuar yanıtları ve kondrosit metabolizmasını modüle ettiğini öne sürmüştür21,22. Bununla birlikte, akupotominin kondroprotektif etkilerini gerçekleştirdiği spesifik moleküler yollar, özellikle circRNA aracılı sinyalizasyon açısından hala yetersiz şekilde tanımlanmıştır. Bu nedenle, akupotomi ile circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK ekseni arasındaki ilişkinin araştırılması, yeni mekanistik içgörüler sağlayabilir ve akupotominin KOA için hastalık modifiye edici bir müdahale olarak kullanımını destekleyebilir16,18. Birincil sonlanım noktaları; diz eklemi şişliği, histopatolojik kıkırdak dejenerasyonu (Mankin ve Moran skorları), inflamatuar sitokin seviyeleri (interleukin-1β, tümör nekroz faktörü-α ve interleukin-6), kıkırdak metabolizmasıyla ilgili markerların ekspresyonu (matriks metalloproteinaz-3, matriks metalloproteinaz-13, SRY-box transkripsiyon faktörü 9 ve aggrecan) ile circPDE4B ve RIC8A ekspresyonu ve p38 MAPK fosforilasyonu olarak belirlenmiştir. Akupotomi, dört aşamalı teknik (longitudinal release, transvers separasyon ve nodüllerin insizyonu) kullanılarak seçilen periartiküler noktalara 4 hafta boyunca haftada bir kez uygulanmıştır. Akupotominin etkilerini karakterize etmek ve KOA'daki potansiyel moleküler temelini araştırmak için histopatolojik değerlendirme, inflamatuar sitokin ölçümü ile gen ve protein ekspresyon analizleri kullanılmıştır.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Anhui Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay no. AHUCM-rabbits-2023195). Bu protokolde kullanılan reaktifler, kimyasallar, yazılımlar ve araçlar Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Deney hayvanları ve gruplandırma
Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm'dan (Hayvan Üretim Lisans No.: SCXK (Su) 2024-0007) elli sağlıklı yetişkin erkek Yeni Zelanda Beyaz tavşanı (6 aylık, 2,0–2,5 kg ağırlığında) temin edilmiştir. Tüm hayvanlar deneyden önce 1 haftalık bir aklimatizasyon besleme dönemine tabi tutulmuştur. Belirli bir deneysel hipoteze dayanmaksızın, tutarlı bir prosedür geleneği olarak sağ diz şişlik değerlendirmesi için, sol diz ise kıkırdak dokusu toplama işlemi için belirlenmiştir. Aklimatizasyonun ardından tavşanlar rastgele beş gruba ayrılmıştır (her grup için n = 10): herhangi bir modelleme prosedürü veya tedavi uygulanmayan bir kontrol grubu; modifiye Videman yöntemi kullanılarak KOA indüklenen bir KOA model grubu; modellemeden 6 hafta sonra ilaç tedavisine başlanan bir selekoksib grubu; modellemeden 6 hafta sonra akupotomi tedavisine başlanan bir akupotomi grubu ve modellemeden 6 hafta sonra kesme veya gevşetme yapılmadan iğne batırma işleminin uygulandığı bir şam akupotomi grubu.
2. KOA modelinin oluşturulması
Kontrol grubu dışındaki tüm tavşanlara KOA'yı indüklemek için modifiye Videman prosedürü uygulandı. Hayvanlar cerrahi işlemden önce 12 h boyunca aç bırakıldı. Anestezi, marjinal kulak veninden 30 mg/kg dozunda %3 pentobarbital sodyumun intravenöz uygulamasıyla sağlandı. Cerrahi alanın rutin hazırlığı, dezenfeksiyonu ve steril örtme işleminin ardından, diz ekleminin medial yönü boyunca boylamsal bir insizyon yapıldı. Medial kollateral ligament ve anterior krusiyat ligament sırasıyla transekte edildi ve medial menisküs tamamen çıkarıldı. Ardından insizyon katmanlar halinde kapatıldı.
Postoperatif enfeksiyon riskini azaltmak için, 3 ardışık gün boyunca günlük 40,000 U/kg dozunda intramüsküler penisilin uygulanmıştır. Cerrahi işlemden sonra tavşanlar kafeslerine geri döndürülmüş ve eklem immobilizasyonu uygulanmadan serbestçe hareket etmelerine izin verilmiştir.
3. Sham akupotomi tedavisi
KOA modellemesinden 6 hafta sonra, sham akupotomi grubundaki tavşanlara, aktif akupotomi tedavisi için kullanılan palpasyon ve nokta işaretleme prosedürlerinin aynısı uygulandı. İşaretlenen her noktada, deri üzerinden dik olarak, deri altı dokuya ulaşılana kadar 0.35 mm × 25 mm boyutlarında steril tek kullanımlık bir akupotomi iğnesi yerleştirildi. Herhangi bir kesme, gevşetme, transvers manipülasyon veya diğer mekanik serbest bırakma manevrası uygulanmadı. İğne, doku manipülasyonu yapılmadan yerleştirme işleminin hemen ardından geri çekildi. Sham tedavi, ardışık 4 hafta boyunca haftada bir kez uygulandı.
4. Akupotomi tedavisi
KOA modellemesinden 6 hafta sonra, akupotomi grubundaki tavşanlar bir tedavi masasına sabitlendi. Kord benzeri yapılar veya sert nodülleri belirlemek için, etkilenen diz çevresindeki periartiküler dokular, özellikle patella ile medial ve lateral eklem boşluklarının çevresi palpe edildi. Palpasyon bulgularına göre dört ila altı tedavi noktası seçildi ve cilt üzerine işaretlendi.
Tedavi bölgesi tıraş edildi ve rutin steril prosedürler kullanılarak dezenfekte edildi. 0.35 mm × 25 mm ölçülerindeki steril tek kullanımlık bir akupotomi iğnesi, kemik yüzeyine ulaşana kadar işaretlenen her noktadan yavaşça ve dik bir şekilde yerleştirildi. İşlem, dört aşamalı akupotomi tekniğine göre gerçekleştirildi. Önce boylamsal gevşetme, ardından enine ayırma işlemi uygulandı. Sert bir nodül ile karşılaşıldığında, iğne-bıçak aracılığıyla belirgin bir gevşeme hissi algılanana kadar insizyon yapıldı. İşlem sonrası iğne geri çekildi ve her giriş noktası steril gazlı bezle kısa süreliğine sıkıştırılıp yapışkanlı bir pansumanla kapatıldı. Tedavi, ardışık 4 hafta boyunca haftada bir kez uygulandı.
5. İlaç tedavisi
KOA modellemesinden 6 hafta sonra, selekoksib grubundaki tavşanlara 4 hafta boyunca günde bir kez 24 mg/kg oral gavaj yoluyla selekoksib süspansiyonu verildi. Süspansiyon, her gün fizyolojik salin içinde taze olarak hazırlandı. Tedarikçi ve katalog bilgileri Materyaller Tablosunda sunulmuştur.
6. Diz eklemi şişliğinin değerlendirilmesi
KOA modellemesinden 10 hafta sonra, müdahale döneminin sonunda diz eklemi şişliği değerlendirildi. Sağ diz ekleminin, genellikle tibial plato seviyesindeki en şiş bölgesine yumuşak bir ipek iplik sarıldı. İplik çıkarılarak bir cetvel yardımıyla en yakın milimetreye kadar ölçüldü ve kaydedilen uzunluk diz çevresi olarak tanımlandı.
Bağıl şişme oranı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanmıştır:
7. Numune toplama
Müdahale döneminin sonunda tavşanlar, marjinal kulak veni aracılığıyla 30 mg/kg dozunda %3 pentobarbital sodyumun intravenöz uygulanmasıyla anestezi altına alınmıştır. Tibial plato ve femoral kondillerin eklem yüzeylerini açığa çıkarmak için 23 numara bistüri ucu kullanılarak sol diz eklemi açılmıştır. Bu bölgelerden eklem kıkırdak dokusu toplanmıştır.
Her bir kıkırdak örneği iki porsiyona ayrıldı. Bir porsiyon, histopatolojik inceleme için %4 paraformaldehit ile fikse edildi. İkinci porsiyon kriyojenik tüplere yerleştirildi, sıvı azot içerisinde hızla donduruldu ve moleküler analizler yapılana kadar −80 °C'de saklandı. Tüm doku toplama prosedürlerinin tamamlanmasının hemen ardından tavşanlar, marjinal kulak veninden hızlı intravenöz hava enjeksiyonu yoluyla hava embolisi ile ötanize edildi.
Histolojik boyama ile Mankin ve Moran skorlaması, grup başına tüm 10 tavşandan (n = 10) alınan kıkırdak örnekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Grup başına rastgele seçilen üç tavşandan temsilci hematoksilin-eosin ve Safranin O–Fast Green görüntüleri seçilmiştir. İmmünohistokimya ve Western blotting, grup başına rastgele seçilen üç tavşandan (n = 3) alınan örnekler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ve enzim bağlantılı immünosorbent deneyi, grup başına rastgele seçilen altı tavşandan (n = 6) alınan örnekler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm alt küme seçimleri, grup atamaları önceden bilinmeden rastgele olarak yapılmıştır.
8. Hematoksilin ve eozin boyama
%4 paraformaldehit ile fikse edilen kıkırdak dokusu, pH 7.4'te %10 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi içinde 4–6 hafta boyunca dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyon çözeltisi her 3 günde bir yenilendi. İğne penetrasyonu ile dekalsifikasyon doğrulandıktan sonra doku; %70, %80, %90, %95 ve %100'lük artan etanol serisi ile dehydrate edildi, ksilen ile şeffaflaştırıldı ve parafine gömüldü. Gömülen doku, bir mikrotom kullanılarak 5 µm kalınlığında kesildi ve kesitler lam üzerine monte edildi.
Hematoksilin ve eozin boyama için kesitler 60 °C'de 60 dk ısıtılmış, her biri 5 dk süren üç kez ksilen değişimiyle deparafine edilmiş ve ardından sırasıyla %100, %95, %80 ve %70 etanol ile ardından distile su ile yeniden hidrate edilmiştir. Kesitler 5 dk boyunca hematoksilin ile boyanmış, 10 dk boyunca akan musluk suyu altında durulanmış, %70 etanol içinde hazırlanan %1'lik hidroklorik asitte 2–3 sn boyunca diferansiye edilmiş ve distile su ile durulanmıştır. Kesitler daha sonra 2 dk boyunca eozin ile boyanmış, distile su ile durulanmış, %70, %80, %90, %95 ve %100 etanol ileydehidrate edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve nötr reçine ile kapatılmıştır. Kıkırdak morfolojisi incelenmiş ve ışık mikroskobu kullanılarak temsili görüntüler elde edilmiştir.
9. Safranin O–Fast Green boyama
Parafine gömülmüş kıkırdak kesitleri, bölüm 8'de açıklandığı şekilde deparafimize edildi ve yeniden hidrate edildi. Kesitler 5 dk boyunca Weigert demir hematoksilin ile boyandı ve distile su ile durulandı. Ardından kesitler 3 dk boyunca %0,05'lik Fast Green çözeltisi ile boyandı, 10–15 sn boyunca %1'lik asetik asitte kısaca durulandı ve 5 dk boyunca %0,1'lik Safranin O çözeltisi ile boyandı.
Boyama işleminden sonra kesitler, %95 ve %100 etanol ile hızlaycadehidratize edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve nötr reçine ile kapatılmıştır. Boyanan kesitler ışık mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Proteoglikan içeriğini yansıtan Safranin O boyama yoğunluğu, görüntü analiz yazılımı kullanılarak yarı nicel olarak analiz edilmiştir.
10. Histolojik skorlama
Deneysel grup atamalarından habersiz iki patolog, kıkırdak dejenerasyonunun derecesini değerlendirmek için Mankin ve Moran skorlama sistemlerini kullanarak boyanmış kesitleri bağımsız olarak değerlendirdi. Değerlendirme öncesinde, tüm kesitlere rastgele tanımlama kodları verildi. Tedavi atamaları, tüm skorlama tamamlanana kadar patologlara açıklanmadı23.
11. Enzimle ilişkili immunosorbent analiz
Dondurulmuş kıkırdak dokusu tartılmış, pH 7.4'teki fosfat tamponlu salin ile birleştirilmiş ve buz üzerinde iyice homojenize edilmiştir. Homojenat 4 °C'de 20 dk boyunca 3,000 × g'de santrifüj edilmiş ve analiz için süpernatan toplanmıştır. Doku süpernatandaki interleukin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve interleukin-6 (IL-6) konsantrasyonları, üretici talimatlarına uygun olarak tavşan spesifik enzimle ilişkili immunosorbent analiz kitleri kullanılarak ölçülmüştür.
12. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu
Toplam RNA, fenol-kloroform temelli bir yöntem kullanılarak kıkırdak dokusundan ekstrakte edildi. Kısaca, doku RNA ekstraksiyon reaktifinde lize edildi ve sulu ile organik fazları ayırmak için kloroform eklendi. Sulu faz toplandı ve RNA izopropanol ile çöktürüldü, %75 etanol ile yıkandı, havada kurutuldu ve dietil pirokarbonatla işlem görmüş suda çözüldü. RNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldü.
Ters transkripsiyon öncesinde, kalıntı genomik DNA bir genomik DNA eliminasyon reaktifi kullanılarak uzaklaştırıldı. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak komplemanter DNA sentezlendi. Gerçek zamanlı bir polimeraz zincir reaksiyonu sisteminde, SYBR Green tabanlı bir tespit yöntemi kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi. Döngü koşulları şu şekildeydi: 95 °C'de 1 dk başlangıç denatürasyonunu takiben, 95 °C'de 20 sn denatürasyon ile 60 °C'de 1 dk bağlanma ve uzama şeklinde 40 döngü. Amplifikasyon spesifikliğini değerlendirmek için bir dissosiyasyon eğrisi analizi yapıldı.
Matriks metalloproteinaz-3 (MMP-3), matriks metalloproteinaz-13 (MMP-13), SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9), aggrekan, RIC8A ve circPDE4B ekspresyon seviyeleri ölçüldü. β-actin iç referans gen olarak kullanıldı. Göreli ekspresyon, yöntem kullanılarak hesaplandı. Primer dizileri Tablo 1'de verilmiştir.
13. Western blot analizi
Kıkırdak doku, phenylmethylsulfonyl fluoride ile desteklenmiş radioimmunoprecipitation assay tamponunda liz edildi. Lizat 4 °C'de 15 dk boyunca 12,000 × g'de santrifüj edildi ve süpernatan toplam protein fraksiyonu olarak toplandı. Protein konsantrasyonu, bicinchoninic acid analizi kullanılarak belirlendi.
Eşit miktardaki proteinler (hat başına 30 µg), %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılmış ve metanol ile önceden aktive edilmiş poliviniliden florür membranlara aktarılmıştır. Transfer işlemi 4 °C'de 300 mA ile gerçekleştirilmiştir. Transfer süreleri şu şekildedir: aggrecan (250 kDa) için 90 dk; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) ve MMP-13 (52 kDa) için 50 dk; p38 MAPK (41 kDa) ve GAPDH (36 kDa) için 40 dk. Membranlar, Tween 20 içeren Tris-tamponlu salin içindeki %5 yağsız kuru süt ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edilmiştir. Ardından membranlar; MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), aggrecan (1:1.000), RIC8A (1:1.500), fosforile p38 MAPK (1:1.000) ve toplam p38 MAPK (1:2.000) karşıtı primer antikorlar ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Yükleme kontrolü olarak GAPDH (1:2.000) kullanılmıştır. Tween 20 içeren Tris-tamponlu salin ile üç kez yıkama (her biri 10 dk) yapıldıktan sonra, membranlar yaban turpu peroksidaz-konjuge sekonder antikorlar (1:20.000) ile oda sıcaklığında 1,2 saat inkübe edilmiştir. Üç ek yıkamanın ardından, protein bantları geliştirilmiş kemilüminesans substrat kullanılarak görselleştirilmiş ve bir jel dokümantasyon sistemi ile görüntülenmiştir. Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak nicelendirilmiş ve GAPDH'ye göre normalize edilmiştir.
14. İmmünohistokimya
Parafine gömülmüş kıkırdak kesitleri, dereceli bir etanol serisi ile deparafinize edildi ve yeniden hidrate edildi (üç kez 5 dk ksilen; ardından sırasıyla %100, %95 ve %80 etanol ile 3 dk). Antijen geri kazanımı, kesitlerin bir düdüklü tencerede EDTA tamponu (pH 9.0) içinde ısıtılmasıyla gerçekleştirildi. Tampon kaynama noktasına kadar ısıtıldı ve basınçlandırmanın ardından geri kazanım işlemi 2 dk boyunca sürdürüldü, sonrasında oda sıcaklığına kadar soğutuldu. Endojen peroksidaz aktivitesi, oda sıcaklığında 10 dk boyunca %3 hidrojen peroksit ile bloke edildi. Yıkamanın ardından, spesifik olmayan bağlanma, oda sıcaklığında ve karanlıkta 20 dk boyunca keçi serumu ile bloke edildi.
Kesitler, fosforile p38 MAPK (1:800) ve fosforile nükleer faktör kappa B (NF-κB) (1:300) karşıtı primer antikorlar ile 37 °C'de 60 dk boyunca inkübe edildi. Tween 20 içeren fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkandıktan sonra, kesitler uygun horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikorlar ile 37 °C'de 30 dk boyunca inkübe edildi. Üç ek yıkamanın ardından, renk gelişimi için diaminobenzidin kullanıldı (mikroskop altında kontrol edildi), ardından hematoksilin karşıt boyama (2 dk), %70 etanol içindeki %1 hidroklorik asit ile farklılaştırma ve lityum karbonat çözeltisinde mavileştirme (30 s) işlemleri uygulandı. Kesitler daha sonray dehidre edildi, saydamlaştırıldı, lam üzerine monte edildi ve bir ışık mikroskobu kullanılarak incelendi. Boyama ImageJ yazılımı kullanılarak değerlendirildi ve yarı nicel analiz için entegre optik yoğunluk hesaplandı.
15. İstatistiksel analiz
Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlar
Akupotomi eklem kıkırdağındaki histolojik değişiklikleri hafifletir
Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, KOA model grubunda diz çevresi ve bağıl şişlik oranı kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde artmıştır. Her iki ölçüm de akupotomi veya selekoksib tedavisi sonrası anlamlı derecede azalırken, şam akupotomi KOA model grubuna kıyasla anlamlı bir iyileşme sağlamamıştır.
Şekil 1C,D'de gösterildiği gibi, Mankin skoru KOA model grubunda kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuş ve akupotomi veya selekoksib tedavisi sonrası anlamlı derecede azalmıştır. Sham akupotomi grubunda anlamlı bir azalma gözlemlenmemiştir. Moran skoru ise tersi bir örüntü göstermiştir.
Hematoksilin-eosin ve Safranin O–Fast Green boyamaları, KOA model grubunda kontrol grubuna kıyasla eklem kıkırdağı yüzeyinde incelme, süreksizlik ve lokalize erozyon olduğunu göstermiştir (Şekil 1E,F). Akupotomi ve selekoksib, daha belirgin kıkırdak konturları ve azalmış yapısal hasarla belirtildiği üzere bu patolojik değişiklikleri iyileştirmiştir. Buna karşılık, sham akupotomi grubu KOA model grubuna benzer patolojik özellikler sergilemiştir. Bu bulgular, akupotominin KOA modelinde eklem şişliğini ve kıkırdak dejenerasyonunu azaltmada ve histolojik skorları iyileştirmede selekoksib ile karşılaştırılabilir etkiler ürettiğini göstermektedir.
Akupotomi inflamatuar sitokin seviyelerini düşürür
Şekil 2A–C'de gösterildiği üzere, kıkırdak doku homojenatlarındaki interleukin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktör-α (TNF-α) ve interleukin-6 (IL-6) konsantrasyonları, KOA model grubunda kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha yüksekti. Akupotomi veya selekoksib tedavisi, her üç inflamatuar sitokinin seviyelerini anlamlı şekilde düşürmüştür. Buna karşın, sham akupotomi grubu, KOA model grubuna kıyasla anlamlı bir azalma göstermemiştir.
Akupotomi, RIC8A/p38 MAPK sinyal yolunu protein düzeyinde modüle eder
İmmünohistokimyasal analiz, fosforile p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (p-p38 MAPK) ve fosforile nükleer faktör kappa B (NF-κB) ekspresyonunun akupotomi ve selekoksib gruplarında, KOA model grubuna göre anlamlı düzeyde daha düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). Sham akupotomi ve KOA model grupları arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir.
Western blot analizi, matris metalloproteinaz-3 (MMP-3), matris metalloproteinaz-13 (MMP-13), kolinesteraz inhibitörlerine direnç 8A (RIC8A) ve p-p38 MAPK protein seviyelerinin KOA model grubunda kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha yüksek olduğunu, buna karşın kıkırdak sentezi ile ilişkili proteinler olan SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9) ve agrekan seviyelerinin anlamlı derecede daha düşük olduğunu göstermiştir. KOA model grubu ile karşılaştırıldığında, akupotomi ve selekoksib grupları MMP-3, MMP-13, RIC8A ve p-p38 MAPK ekspresyonunda azalma, SOX9 ve agrekan ekspresyonunda ise artış göstermiştir. Sham akupotomi grubu, ölçülen proteinlerde anlamlı bir değişiklik olmaksızın KOA model grubuna benzer protein ekspresyon modelleri sergilemiştir (Şekil 3B–I). Bu bulgular, akupotomi ve selekoksibin KOA üzerindeki etkilerinin RIC8A/p38 MAPK sinyal yolunun modülasyonu ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Akupotomi, RIC8A/p38 MAPK sinyal yolunu transkript düzeyinde modüle eder
Şekil 4A–G'de gösterildiği gibi, MMP-3, MMP-13 ve RIC8A ekspresyon seviyeleri KOA model grubunda kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekken, SOX9 ve aggrecan ekspresyonu anlamlı derecede düşük bulunmuştur. KOA model grubu ile karşılaştırıldığında, akupotomi ve selekoksib; MMP-3, MMP-13 ve RIC8A ekspresyonunu azaltmış, SOX9 ve aggrecan ekspresyonunu ise artırmıştır. Sham akupotomi grubu, ölçülen transkript seviyeleri açısından KOA model grubundan anlamlı bir fark göstermemiştir.
Akupotomi ayrıca göreli circPDE4B ekspresyonunu artırmış olup, bu durum terapötik etkilerinin circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK sinyal ekseninin modülasyonu ve azalmış inflamatuar ve katabolik sinyalizasyon ile ilişkili olduğunu göstermiştir.
VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ :
ELISA, H&E boyama, immünohistokimya, RT‑qPCR, Safranin O–Fast Green boyama ve western blot verileri dahil olmak üzere, bu çalışmanın bulgularını destekleyen ham veriler, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935 adresindeki Figshare deposunda açıkça erişime sunulmuştur.
Şekil 1. Akupotomi, diz osteoartritli tavşanlarda diz şişliğini ve eklem kıkırdağı dejenerasyonunu azaltır. (A) Diz çevresi. (B) Göreceli diz şişlik oranı. (C) Mankin histolojik skoru. (D) Moran histolojik skoru. (E) Kontrol, KOA modeli, selekoksib, akupotomi ve şam akupotomi gruplarından alınan eklem kıkırdağının temsili hematoksilin ve eozin boyalı kesitleri. (F) Beş deneysel gruptan alınan temsili Safranin O–Fast Green boyalı kesitler. Histolojik skorlama (Mankin ve Moran), grup başına tüm 10 tavşandan (n = 10) alınan örnekler kullanılarak gerçekleştirilmiş, H&E ve Safranin O–Fast Green boyama için temsili görüntüler ise grup başına rastgele seçilen 3 tavşandan elde edilmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'nin post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. Yatay çubuklar karşılaştırılan grupları belirtmektedir. P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001. Ölçek çubukları, 100 µm. Kısaltmalar: KOA = diz osteoartriti; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Akupotomi, diz osteoartriti olan tavşanlarda inflamatuar sitokin seviyelerini düşürür. (A) İnterlökin-1β konsantrasyonu. (B) İnterlökin-6 konsantrasyonu. (C) Tümör nekroz faktörü-α konsantrasyonu. Sitokin konsantrasyonları, grup başına altı tavşandan alınan örneklerde (n = 6) enzimle bağlantılı immünosorbent assay ile ölçülmüştür. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yatay çubuklar karşılaştırılan grupları göstermektedir. P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001. Kısaltmalar: IL-1β = interlökin-1β; IL-6 = interlökin-6; KOA = diz osteoartriti; SEM = ortalamanın standart hatası; TNF-α = tümör nekroz faktörü-α. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Akupotomi, diz osteoartritli tavşanlarda inflamatuar ve kıkırdak metabolizmasıyla ilişkili proteinleri modüle eder. (A) Kontrol, KOA modeli, seleksib, akupotomi ve şam akupotomi gruplarının eklem kıkırdaklarındaki fosforile nükleer faktör kappa B ve fosforile p38 mitojenle aktive olan protein kinaz ekspresyonunu gösteren temsili immünohistokimyasal görüntüler. Ölçek çubukları, 100 µm. (B) SOX9, RIC8A, MMP-13, fosforile p38 MAPK, toplam p38 MAPK, MMP-3, aggrecan ve GAPDH ekspresyonunu gösteren temsili Western blot analizleri. (C) GAPDH'ye normalize edilmiş aggrecan miktarının densitometrik kantifikasyonu. (D) GAPDH'ye normalize edilmiş MMP-13 kantifikasyonu. (E) GAPDH'ye normalize edilmiş MMP-3 kantifikasyonu. (F) GAPDH'ye normalize edilmiş toplam p38 MAPK kantifikasyonu. (G) GAPDH'ye normalize edilmiş fosforile p38 MAPK kantifikasyonu. (H) GAPDH'ye normalize edilmiş SOX9 kantifikasyonu. (I) GAPDH'ye normalize edilmiş RIC8A kantifikasyonu. Western blot analizleri, grup başına üç tavşandan alınan örnekler kullanılarak gerçekleştirilmiştir (n = 3). Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. Yatay çubuklar karşılaştırılan grupları belirtir. P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001. Kısaltmalar: GAPDH = gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz; KOA = diz osteoartriti; MAPK = mitojenle aktive olan protein kinaz; MMP-3 = matriks metalloproteinaz-3; MMP-13 = matriks metalloproteinaz-13; NF-κB = nükleer faktör kappa B; p-NF-κB = fosforile nükleer faktör kappa B; p-p38 MAPK = fosforile p38 MAPK; RIC8A = kolinesteraz inhibitörlerine direnç 8A; SEM = ortalamanın standart hatası; SOX9 = SRY-box transkripsiyon faktörü 9. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Akupotomi, diz osteoartriti olan tavşanlarda kıkırdak metabolizmasıyla ilişkili transkriptleri ve circPDE4B ekspresyonunu modüle eder. (A) Relatif aggrecan ekspresyonu. (B) Relatif MMP-3 ekspresyonu. (C) Relatif MMP-13 ekspresyonu. (D) Relatif p38 MAPK ekspresyonu. (E) Relatif SOX9 ekspresyonu. (F) Relatif circPDE4B ekspresyonu. (G) Relatif RIC8A ekspresyonu. Ekspresyon, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile ölçülmüş ve referans gene göre normalize edilmiştir. Analizler, grup başına altı tavşandan alınan örnekler kullanılarak gerçekleştirilmiştir (n = 6). Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. Yatay çubuklar karşılaştırılan grupları belirtmektedir. P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001. Kısaltmalar: circPDE4B = circular RNA phosphodiesterase 4B; KOA = diz osteoartriti; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = ortalamanın standart hatası; SOX9 = SRY-box transcription factor 9. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
| Gen | Amplikon Boyutu | İleri primer | Geri primer |
| （bp） | （5'→3'） | （5'→3'） | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Aggrecan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tablo 1: Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılan primer dizileri. Tablo; hedef genleri, beklenen amplikon boyutlarını ve 5′ ile 3′ yönündeki ileri ve geri primer dizilerini listelemektedir. Kısaltmalar: bp = baz çifti; circPDE4B = dairesel RNA fosfodiesteraz 4B; MAPK = mitojenle aktive olan protein kinaz; MMP-3 = matriks metalloproteinaz-3; MMP-13 = matriks metalloproteinaz-13; RIC8A = kolinesteraz inhibitörlerine direnç 8A; SOX9 = SRY-box transkripsiyon faktörü 9.
Tartışma
Bu çalışma, tavşan diz osteoartrit (KOA) modelinde akupotominin terapötik etkilerini değerlendirmiş ve circPDE4B ekspresyonu ile RIC8A/p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal ekseni arasında bir ilişki belirlemiştir. Akupotomi, eklem şişliğini ve histopatolojik değişiklikleri iyileştirmiş; hem transkript hem de protein seviyelerinde inflamatuar ve kıkırdak metabolizmasıyla ilgili belirteçleri değiştirmiştir.
Akupotomi tedavisi sonrası interleukin-1β, tümör nekroz faktörü-α ve interleukin-6 düzeylerindeki azalma, akupotominin daha önce rapor edilen immünomodülatör etkileriyle uyumludur21. Bu sitokinler, matriks bozucu enzimleri teşvik ederek ve hücre dışı matriks sentezini baskılayarak kıkırdak dejenerasyonuna katkıda bulunurlar22,24,25. Transkript ve protein düzeylerinde matriks metalloproteinaz-3 (MMP-3) ve matriks metalloproteinaz-13 (MMP-13) seviyelerindeki eş zamanlı azalmalar, akupotominin KOA ile ilişkili katabolik aktiviteyi baskıladığını daha güçlü bir şekilde göstermektedir.
Dikkat çekici bir bulgu, akupotomi kaynaklı circPDE4B ekspresyonundaki değişiklikler ile RIC8A/p38 MAPK yolağının modülasyonu arasındaki ilişkidir. Bu yolağın anormal aktivasyonu; enflamasyon, oksidatif stres ve hücre dışı matris degradasyonu ile ilişkilidir. Akupotomi sonrası RIC8A ekspresyonunda ve p38 MAPK fosforilasyonunda görülen azalmalar, tedavinin bu yolak içindeki sinyal dengesinin yeniden kurulmasına yardımcı olabileceğini düşündürmektedir. Relatif circPDE4B ve RIC8A/p38 MAPK ile ilişkili belirteçlerdeki koordineli değişiklikler, daha önce öne sürüldüğü üzere26,27 circPDE4B'nin bir moleküler iskele olarak işlev görebileceği hipoteziyle uyumludur. Bununla birlikte, mevcut bulgular korelasyoneldir ve circPDE4B'nin akupotominin terapötik etkilerine aracılık ettiğini kanıtlamamaktadır. Nedenselliği belirlemek için fonksiyon kaybı ve fonksiyon kazanımı çalışmaları gereklidir.
Akupotomi ile circRNA düzenlemesi arasındaki potansiyel ilişki, bu çalışmanın önemli bir yönüdür. Mekanik stimülasyonun çeşitli dokularda circRNA ekspresyonunu etkilediği gösterilmiştir28,29,30,31. Ancak, akupotominin tetiklediği mekanik stimülasyonu eklem kıkırdağına özgü circRNA'ların düzenlenmesine bağlayan doğrudan kanıtlar hala sınırlıdır. Tedavi sonrası relatif circPDE4B ekspresyonunda gözlenen değişim, mekanik stimülasyona verilen doğrudan bir yanıtı veya azalmış inflamasyona verilen dolaylı bir yanıtı yansıtıyor olabilir. Kontrollü mekanik stimülasyonu, kondrositeye özgü circPDE4B manipülasyonu ile birleştiren gelecek çalışmalar, bu olasılıkların ayırt edilmesine yardımcı olacaktır.
Acupotomi ve seleksoksib, farklı etki mekanizmalarına rağmen ölçülen birçok sonuçta benzer eğilimler ortaya çıkarmıştır. Bu yakınlaşma birkaç şekilde açıklanabilir. İlk olarak, her iki tedavi de RIC8A/p38 MAPK ekseni ve nükleer faktör kappa B sinyal yolu dahil olmak üzere ortak alt yollar üzerinde etkili olabilir. İkinci olarak, gözlemlenen benzerlikler, yola özgü etkilerden ziyade kıkırdak korumasının ortak özelliklerini yansıtıyor olabilir. Üçüncü olarak, seçilen belirteçler inflamasyon ve kıkırdak metabolizmasının ortak uç noktalarını temsil ediyor olabilir ve bu nedenle farklı üst mekanizmaları ayırt etmek için yetersiz kalabilir. Benzer etkinlik, özdeş mekanizmalar olduğu anlamına gelmez; aksine, her iki müdahalenin de osteoartrit patolojik ağının ortak bileşenlerini etkileyebileceğini göstermektedir26,32,33. Transkriptomik veya proteomik profilleme gibi tarafsız yaklaşımlar, tedaviye özgü moleküler imzaların tanımlanmasına yardımcı olabilir.
Akupotomi ve selekoksibin etkilerinin benzer olması klinik açıdan da önem taşıyabilir. Akupotomi, uzun süreli ilaç kullanımına bağlı bazı yan etkilerden kaçınırken periartiküler mekanik faktörleri ele alan farmakolojik olmayan bir tedavi seçeneği sunabilir. Ancak, tavşan modeli insan KOA'sının karmaşıklığını tam olarak yansıtmadığı için bu yorum ihtiyatla değerlendirilmelidir. Bu preklinik bulguların daha geniş klinik uygulamaları destekleyebilmesi için daha fazla translasyonel ve klinik çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bazı kısıtlamalar kabul edilmelidir. İlk olarak, circPDE4B ile RIC8A/p38 MAPK ekseni arasındaki ilişki, fonksiyon kaybı veya kazanımı deneyleri kullanılarak test edilmemiştir. İkinci olarak, tavşan modeli ve 4 haftalık tedavi süresi, insan hastalığı ve uzun vadeli sonuçlara ilişkin çıkarımları sınırlamaktadır. Üçüncü olarak, moleküler analizlerde nispeten küçük hayvan alt grupları kullanılmıştır ve bu durum gruplar arasındaki ince farkların tespit edilmesini kısıtlamış olabilir. Dördüncü olarak, seçilen belirteç paneli tedaviye özgü üst akış mekanizmalarını ayırt edemeyebilir. Son olarak, akupotomi ve selekoksibe verilen benzer yanıtlar, bu iki müdahalenin yakınsak veya bağımsız yollar üzerinden hareket edip etmediğinin belirlenmesi için daha fazla araştırma gerektirmektedir.
Sonuç
Akupotomi, KOA tavşan modelinde eklem şişliğini, enflamatuar sitokin seviyelerini, kıkırdak dejenerasyonunu ve katabolik belirteç ekspresyonunu azaltmıştır. Bu etkiler, relatif circPDE4B ekspresyonundaki değişiklikler ve RIC8A/p38 MAPK sinyal ekseninin modülasyonu ile ilişkilendirilmiştir. Mevcut bulgular korelasyonel olduğu için, circPDE4B'nin akupotominin terapötik etkilerine doğrudan aracılık edip etmediğini belirlemek için daha fazla mekanistik çalışmaya ihtiyaç vardır.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek herhangi bir rakip finansal çıkarı veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 81774436), Anhui Eyaleti Klinik Tıbbi Araştırma Dönüşüm Projesi (hibe no. 202427b10020136), Anhui Eyalet Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Projesi (hibe no. 2023AH050824), Anhui Sağlık Araştırma Programı (hibe no. AHWJ2023A30123) ve Anhui Geleneksel Çin Tıbbı Derneği Miras ve İnovasyon Araştırma Projesi (hibe no. 2024ZYYXH153) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3% hidrojen peroksit | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | İmmünohistokimya sırasında endojen peroksidaz aktivitesini bloke eder. |
| 4% paraformaldehit | Biosharp | BL539A | Dekalsifikasyon ve histolojik işlemden önce kıkırdak dokusunu fikse eder. |
| Asetik asit | Merck | A6283 | %70 içinde %1'lik hidroklorik asit hazırlamak için kullanılır |
| Yapışkan bandajlar | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Akupotomi sonrası kullanılır. |
| Aggrecan antikoru | Proteintech | 13880-1-AP | Kıkırdak protein ekstraktlarında aggrecan'ı tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| Susuz etanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Histolojik işlem sırasında dokudehidrasyonu ve kesit rehidrasyonu için kullanılır. |
| BCA protein analiz kiti | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. |
| Celecoxib | Biochempartner | BCP02156 | Oral gavage yoluyla uygulanan referans farmakolojik tedavi. |
| Santrifüj | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Santrifügal ayırma yoluyla doku lizatlarını ve homojenatlarını berraklaştırmak için kullanılır. |
| Kloroform | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Toplam RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayırımı için kullanılır. |
| Sitrati tampon, pH 6.0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | İmmünohistokimya öncesinde ısı ile tetiklenen antijen geri kazanımı için kullanılır. |
| Kriyotüpler | NEST Biotechnology | 607001 | Dondurulmuş numune saklama için kullanılır |
| DAB substratı | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | HRP etiketli immünohistokimyasal sinyallerin görselleştirilmesi için kullanılan kromojenik substrat. |
| DEPC ile işlem görmüş su | Generay Biotech | D1007 | RNA çözünürlüğü ve moleküler biyoloji prosedürleri için kullanılan RNaz-free su. |
| Tek kullanımlık akupotomi iğnesi, 0.35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Akupotomi ve sham akupotomi prosedürleri için kullanılan steril iğne-bıçak. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Kıkırdak içeren doku için dekalsifikasyon solüsyonunu hazırlamak için kullanılır. |
| Geliştirilmiş kemilüminesans substratı | Thermo 340958 | 340958 | Western blot bantlarını görselleştirmek için kullanılır. |
| Eozin solüsyonu | Zhuhai Beso | BA4022 | Hematoksilin ve eozin boyamasında kullanılan karşı boya. |
| Fast Green solüsyonu | Solarbio | G1371 | Safranin O–Fast Green boyamasında kullanılan karşı boya. |
| GAPDH antikoru | Zsbio | TA-08 | Western blot yükleme kontrolü olarak kullanılır ancak şu an listelenmemiştir. |
| Jel görüntüleme sistemi | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Kemilüminesans Western blot görüntülerini yakalar. |
| Cam mikroskop lamları | CITOTEST | 188105 | Kesitleri monte etmek için kullanılır |
| Keçi anti-fare IgG, HRP-konjuge | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Fare primer antikorları için HRP-konjuge sekonder antikor. |
| Keçi anti-tavşan IgG, HRP-konjuge | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Tavşan primer antikorları için HRP-konjuge sekonder antikor. |
| Keçi serumu | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | İmmünohistokimya sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke eder. |
| GraphPad Prism, versiyon 10 | GraphPad Software | Uygulanamaz | İstatistiksel analiz ve grafik hazırlama için kullanılır. |
| Hematoksilin solüsyonu | Zhuhai Beso | BA4041 | Hematoksilin ve eozin boyaması ile immünohistokimyasal karşı boyama için kullanılan nükleer boya. |
| Homojenizatör | Witeg | SGCR-5-553-722 | ELISA ve moleküler analizler için kıkırdak dokusunu homojenize eder. |
| Hidroklorik asit | Merck | 7607 | %70 içinde %1'lik hidroklorik asit hazırlamak için kullanılır |
| Image Lab yazılımı | Bio-Rad | Uygulanamaz | Western blot bantlarının densitometrik analizi için kullanılır. |
| Image-Pro Plus, versiyon 6.0 | Media Cybernetics | Uygulanamaz | Safranin O boyama yoğunluğunun yarı-kantitatif analizi için kullanılır. |
| İzopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Toplam RNA ekstraksiyonu sırasında RNA'yı çöktürmek için kullanılır. |
| Işık mikroskobu | Olympus | CX41 | Boyanmış kıkırdak kesitlerini incelemek ve görüntülemek için kullanılır. |
| Tıbbi markör | edding | 497985 | Tedavi noktalarını işaretlemek için kullanılır |
| Metanol | Shanghai Suyi | 20180427 | PVDF membranı aktive etmek için kullanılır |
| Mikrotom | Leica | RM2016 | Parafinle gömülmüş dokuları 5 µm kesitlere ayırır. |
| MMP-13 antikoru | Bioss | bs-0575R | Matriks metalloproteinaz-13'ü tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| MMP-3 antikoru | Bioss | bs-43017R | Matriks metalloproteinaz-3'ü tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| Nötr reçine | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Boyanmış doku kesitlerinin kalıcı hazırlığı için kullanılan montaj medyumu. |
| Yeni Zelanda Beyaz tavşanları (erkek, 6 aylık, 2.0–2.5 kg ağırlığında) | Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm | SCXK (Su) 2024-0007 | Diz osteoartrit modellemesi ve tedavi değerlendirmesi için kullanılan deneysel hayvanlar. |
| No. 23 bistüri ucu | Caisson | SCX08-100PC | Numune toplama sırasında kullanılır. |
| Yağsız kuru süt | Gene | 9999S | Bloklama reaktifi olarak kullanılır. |
| p38 MAPK antikoru | Bioss | bs-0637R | Toplam p38 MAPK'yı tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| Parafin mumu | Thermo | 8330 | Doku gömmek için kullanılır |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Doku homojenizasyonu, yıkama ve reaktif hazırlama için kullanılır. |
| Penisilin | Jilin Huamu Animal Health Products | Uygulanamaz | Ameliyat sonrası günde 40,000 U/kg olarak kullanılır |
| Pentobarbital sodyum | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Anestezi için %3, 30 mg/kg olarak kullanılır. |
| fosfat tamponlu salin | beyotime | ST448 | İmmünohistokimya sırasında doku homojenizasyonu ve yıkama için kullanılır. |
| Fizyolojik salin | servicevio | G4702 | Celecoxib süspansiyonunu hazırlamak için kullanılır |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Protein ekstraksiyonu sırasında lizis tamponuna eklenen proteaz inhibitörü. |
| p-NF-κB antikoru | Santa | sc-136548 | İmmünohistokimyasal analizde p- NF-κB'yi tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| p-p38 MAPK antikoru | Bioss | bs-5476R | Fosforile p38 MAPK'yı tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| gDNA Eraser içeren PrimeScript RT Reaktif Kiti | TaKaRa | RR047A | Genomik DNA giderme ve RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu için kullanılır. |
| PVDF membran | Millipore | IPVH00010 | Western blotting sırasında protein transferi için kullanılan membran. |
| Tavşan IL-1β ELISA kiti | Jiyinmei | JYM0011Rb | Analiz edilen numunedeki tavşan interlökin-1β'yı nicelleştirir. |
| Tavşan IL-6 ELISA kiti | Jiyinmei | JYM0006Rb | Analiz edilen numunedeki tavşan interlökin-6'yı nicelleştirir. |
| Tavşan TNF-α ELISA kiti | Jiyinmei | JYM0003Rb | Analiz edilen numunedeki tavşan tümör nekroz faktörü-α'yı nicelleştirir. |
| Real-time PCR sistemi | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Floresans tabanlı kantitatif PCR amplifikasyonu gerçekleştirir. |
| RIC8A antikoru | Bioss | bs-11355R | RIC8A'yı tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| RIPA lizis tamponu | Beyotime | P0013B | Kıkırdak dokusundan toplam proteini ekstrakte eder. |
| Safranin O solüsyonu | Solarbio | G1371 | Safranin O–Fast Green histolojisinde kıkırdak proteoglikanlarını boyar. |
| SDS-PAGE reaktifleri veya hazır jeller | Solarbio | S8010 | Jel yüzdesini veya ürünü içerir. |
| SOX9 antikoru | Bioss | bs-4177R | SOX9'u tespit etmek için kullanılan primer antikor. |
| Spektrofotometre | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | RNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçer. |
| Steril gazlı bez | Zhende | V505463 | İğne çekildikten sonra kompresyon için kullanılır. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Kantitatif PCR için kullanılan floresan reaktif. |
| Tris-tamponlu salin | Solarbio | T8060 | Western blotting için yıkama ve bloklama tamponunu hazırlamak için kullanılır. |
| TRIzol reaktifi | Life Technologies | 15596018 | Toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılan fenol–guanidinyum reaktifi. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Tris-tamponlu salin ve fosfat tamponlu salin yıkama solüsyonlarına eklenen noniyonik deterjan. |
| Weigert demir hematoksilin solüsyonu | Merck | 1.15973 | Safranin O–Fast Green boyamasında kullanılır. |
| Ksilen | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Deparafinizasyon ve doku berraklaştırma için kullanılır. |
Kaynaklar
- Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
- Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
- Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
- Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
- Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
- Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
- Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
- Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
- Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
- Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
- Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
- Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
- Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
- Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
- Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
- Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
- Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
- Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
- Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
- Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
- Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
- Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
- Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
- Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
- Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
- Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
- Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
- Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
- Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
- Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
- Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
- Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
- 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.