Saç derisi akupunkturu egzersizle birleştiğinde, PI3K/AKT aktivasyonunu indükler ve felç sonrası spazmatik sıçanlarda sinaptik plastisiteyi iyileştirir

Özet

Bu çalışma, inme sonrası uzuv spastisitesi bir fare modelinde saç derisi akupunkturunun egzersizle birleşerek motor korteks sinaptik plastisitesi üzerindeki etkilerini araştırmayı ve PI3K/Akt yol aktivitesi ile terapötik etkiler arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

İnme sonrası spaztisite (PSS) için etkili tedaviler sınırlı kalmaktadır ve saç derisi akupunkturunun egzersizle (SAE) birleşerek PSS'yi nasıl hafiflettiği tam olarak anlaşılmamaktadır. Bu çalışma, PSS'li sıçanlarda SAE'nin etkilerini araştırmış ve SAE'nin PI3K/Akt yolu aracılığıyla sinaptik plastisiteyi düzenleyip düzenlemediğini araştırmıştır. Orta beyin arter tıkanması (MCAO) fare modeli oluşturuldu ve fareler rastgele beş gruba ayrıldı: Blank, Sham, MCAO, SAE ve Baclofen. Tüm müdahaleler ardışık 7 gün uygulandı. Nörolojik fonksiyon, beyin infarkt hacmi, histopatoloji, sinaptik ultrayapı ve ilgili protein ekspresyonu değerlendirildi. MCAO grubuna kıyasla SAE, nörolojik eksiklikleri iyileştirdi, kas hipertonisini azalttı, enfarkt hacmini azalttı, nöronal hasarı hafifletti, sinaps sayısını artırdı ve sinaptik morfolojiyi iyileştirdi. SAE ayrıca glial hücre hattından türetilen nörotrofik faktörü (GDNF), fosforile PI3K (p-PI3K), fosforile Akt (p-AKT) ve sinaptofizin (SYN), postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95) ve büyüme ile ilişkili protein 43 (GAP-43) gibi sinaptik proteinleri de yukarı regüle etmiştir. İmmünoflüoresans boyama, SAE tedavisinden sonra motor kortekste SYN ve p-Akt'nin arttığı ifadeyi de göstermiştir. Bu bulgular, SAE'nin GDNF'nin yukarı regulasyonu yoluyla PI3K/Akt sinyalinin aktivasyonu ile korelasyon oluşturabileceğini, böylece sinaptik plastisiteyi iyileştirebileceğini ve PSS semptomlarını hafifletebileceğini göstermektedir. Bu çalışma, PSS'li sıçanlarda SAE'nin etkilerini araştırdı ve SAE müdahalesi, PI3K/Akt yol aktivitesi ile sinaptik plastisite arasındaki potansiyel ilişkiyi araştırdı.

Giriş

Beyin enfarktüsü, dünya çapında ölüm ve engelliliğin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. İskemi ve hipoksi, nöronlara zarar verir, motor devrelerdeki uyarılma-inhibisyon dengesini bozur ve motor disfonksiyona yol^{açar 1}. İnme sonrası spaztisite, kas tonusunun artması ve eklem hareketliliğinin azalması olarak kendini gösterir; bu da günlük yaşam aktivitelerini zorlaştırır ve bakıcı yükünü artırır². Baklofen gibi antispastik ajanlar geçici semptomatik rahatlama sağlayabilir, ancak uzun süreli kullanım ilaç toleransına ve yan etkilere yol açabilir ve sinir fonksiyonunun bozulmasını geri^{getirmez 3}. Geleneksel motor rehabilitasyon da faydanın yavaş başlaması ve tedavi süresinin uzamasıyla sınırlıdır. Bu nedenle, daha güvenli ve etkili terapötik stratejilere acilen ihtiyaç vardır ve altta yatan mekanizmalar daha fazla araştırma gerektirir. Nöroplastisite, felç sonrası fonksiyonel iyileşmenin merkezi bir mekanizmasıdır ve sinaptik yeniden yapılanma, aksonal rejenerasyon ve nöron hayatta kalma⁴. Iskemik inme sonrası infarkt çekirdeği nöronlar hızlı ölürken, lokal inflamatuar yanıtlar iskemik penumbradaki doku hasarını kötüleştirir; Bu süreçler birlikte beyin^{hasarını tetikler 5,6}. Nöroplastisliğin önemli bir bileşeni olan sinaptik plastisite, sinapsla ilişkili proteinler tarafından değerlendirilebilir; bunlar arasında sinaptofizin (SYN) ve büyüme ile ilişkili protein 43 (GAP-43) gibi presinaptik belirteçler ve postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95)^7,8,9 bulunur.

Nörotrofik faktörler, sinaptik plastisite için moleküler bir temel sağlar. Glial hücre hattından türetilen nörotrofik faktör (GDNF) özellikle önemlidir çünkü nöronların hayatta kalmasını ve onarımını destekler, iltihabı baskılar ve sinaptik mikroçevreyi^{iyileştirir.} Ret reseptörüne bağlanarak, GDNF PI3K/Akt sinyal^11'i aktive edebilir. PI3K/Akt zinciri, sinir sisteminde önemli bir hayatta kalma yoludur ve aktivasyonu, sinaptik yeniden yapılandırma için gerekli protein sentezini desteklerken apoptozu^{engeller 12,13}. Saç derisi akupunkturu egzersizle birleşimi (SAE), saç derisi akupunktur uyarlamasını aktif motor antrenmanla birleştiren bütünleşik bir rehabilitasyon stratejisidir. Bu yöntemin genel amacı, aynı anda merkezi sinirsel aktiviteyi modüle etmek ve görevle ilgili motor iyileşmeyi teşvik etmek, böylece kas hipertonisini azaltmak ve felç sonrası fonksiyonel sonuçları iyileştirmektir. SAE, Çin'de inme sonrası spaztisite (PSS) tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu birleşik yaklaşımın gerekçesi, saç derisi akupunkturunun kortikal uyarılmayı ve beyin perfüzyonu modüle edebilmesi, egzersiz terapisinin ise fonksiyonel iyileşme ve sinaptik yeniden şekillendirmeyi destekleyen aktiviteye bağlı motor eğitim sağlamasıdır. Sadece egzersiz terapisiyle karşılaştırıldığında, önceki klinik kanıtlar, kalp derisi akupunkturunun egzersiz tedavisiyle birleştiğinde, inme sonrası uzuv spazmı 14 olan hastalarda uzuv spazmını daha da azalttığını ve motor fonksiyonu ile günlük yaşam aktivitelerini iyileştirdiğini göstermiştir^.

Yakın zamanda yapılan bir sistematik inceleme ve meta-analiz, hareket tarzı saç derisi akupunkturu veya ilgili eşzamanlı saç derisi akupunktur-egzersiz müdahalelerinin, tek bileşenli veya ardışık müdahalelere kıyasla spastisite, motor fonksiyon, denge ve günlük yaşam aktivitelerinde daha fazla iyileşme sağladığını ve eşzamanlı nöromodülasyon ile motor antrenmanın potansiyel avantajını desteklediğini^{öne sürmüştür 15}. Preklinik çalışmalar, SAE veya ilgili hareket tarzı saç derisi akupunktur protokollerinin 5-HT₂A reseptörü aracılı spinal KCC2 reaktivasyonu yoluyla beyin kan akışını iyileştirebileceğini ve spastisiteyi azaltabileceğini^{göstermiştir 16,17}. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, akupunkturun nöroplastisiteyi PI3K/Akt sinyal¹⁸ yoluyla teşvik ettiğini de öne sürmektedir. Bu nedenle, SAE, inme sonrası sinirsel plastisite, motor toparlanma ve spastisite azaltılmasının temel terapötik hedefler olduğu deneysel ve klinik bağlamlar için özellikle uygun olabilir. Ancak, PSS'nin rahatlamasını sağlamada SAE, GDNF/PI3K/Akt sinyal bildirimi ve sinaptik plastisite arasındaki potansiyel ilişki hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Mevcut çalışma, SAE'nin nörolojik eksiklikler ve kas spastisitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve müdahale sonrası GDNF ekspresyonu, PI3K/Akt yol aktivitesi ve sinaptik plastiklikle ilişkili proteinlerdeki değişiklikleri karakterize etmek için PSS'nin bir fare modeli oluşturdu. Bu çalışma, SAE'nin PSS için uygun bir rehabilitasyon stratejisi olup olmadığını belirlemek ve potansiyel etki mekanizmasını netleştirmek için deneysel kanıtlar sağlayabilir.

Protokol

Tüm prosedürler, Changchun Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. 20251038) ve Hayvan Araştırmaları: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE 2.0) yönergeleri ile NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda gösterilmiştir.

Deneysel prosedürler
Deneysel hayvanlar ve gruplaşma
Hongda Hayvan Yetiştirme Çiftliği'nden (Kuancheng Bölgesi, Changchun, Çin) seksen spesifik patojensiz (SPF) yetişkin Sprague–Dawley faresi (220–250 g) satın alındı. Hayvanlar, Çin Tıp Üniversitesi Changchun Deneysel Hayvan Merkezi'nde 22–25 °C, %50–60 göreceli nem ve 12 saatlik ışık/karanlık döngü koşullarında, ücretsiz yiyecek ve suya erişim sağlandı. 1 haftalık aklimatizasyonun ardından, fareler rastgele bir boş grup (n = 12), bir Sham grubu (n = 12) ve bir model-rezerv grubuna (n = 56) atandı. Boş grup, sağlıklı farelerde davranışsal performans, histopatolojik özellikler ve moleküler belirteç ekspresyonu için temel değerler sağlamak amacıyla normal, tedavi edilmemiş bir kontrol olarak dahil edilmiştir. Sham grubu, MCAO grubuyla aynı anestezi ve cerrahi maruziyete maruz kaldı, ancak arteriyel tıkanma yapılmadı; Bu nedenle, bu grup anestezi ve cerrahi manipülasyonun potansiyel etkileri için bir kontrol görevi gördü. Hem Blank hem de Sham gruplarının dahil edilmesi, iskemik yaralanmanın etkilerini cerrahi işlemle ilgili etkilerden ayırt etmesini sağladı.

Model rezerv grubu MCAO modellemesi geçirdi. Ameliyattan sonraki ilk 3 gün model-indüksiyon dönemi olarak tanımlandı. Bu dönemde, 56 sıçandan 8'i öldü, bu da %14,29 ölüm oranına karşılık geldi ve modellemenin başarısız olması nedeniyle 12 fare hariç tutuldu. Başarılı model kurulumu olan kalan 36 sıçan, rastgele sayı tablosu kullanılarak MCAO, SAE ve Baclofen gruplarına rastgele dağıtıldı; her grupta 12 fare bulundu. Grup müdahaleleri şöyleydi: (I) Boş grup: sadece rutin beslenme, müdahale yok. (II) Sahte grup: ortak karotis arterin, iç ve dış karotis arterlerin ve vagus sinirinin cerrahi maruziyeti, ligasyon veya filament yerleştirilmeden. (III) MCAO grubu: MCAO, intraperitoneal anestezi altında %3 sodyum pentobarbital ile belirlendi ve sonraki tedavi yapılmadı. (IV) SAE grubu: başarılı MCAO modellemesi ve doğrulamasından sonra, farelere saç derisi akupunkturu egzersizle birleştirildi. %1,5–%2,0 oranlarında izofloran inhalasyon anestezisi yalnızca kısa iğne yerleştirme aşamasında kullanıldı. Koşu bandı eğitimi ancak bilinç tam iyileşme ve kendiliğinden yürüme yeteneğinin geri kazanılmasından sonra başlatıldı. Akupunktur GV20 ve bilateral EX-HN1'de yapıldı. İğneler 1 mm derinliğe yerleştirilir ve koşu bandı eğitim döneminde tutulurdu. Standartlaştırılmış 30 dakikalık iğne tutma/eğitim dönemi, koşu bandı antrenmanı dönemi olarak tanımlandı ve 10 dakika boyunca 6 m/dak ve ardından 0° eğimde 20 dakika boyunca 12 m/dakikadan oluşuyordu. Müdahale, 7 gün ardışık olarak günde bir kez uygulandı. (V) Baklofen grubu: başarılı MCAO modellemesi ve doğrulamasından sonra, fareler 7 gün ardışık olarak günde bir kez intragastrik garaj ile 0,4 mg/kg oranında baklofen aldılar.

MCAO modelinin kurulması
Fare MCAO modeli, modifiye bir intraluminal filament^{yöntemi kullanılarak oluşturuldu 19}. 12 saat oruç ve su yoksunluğundan sonra, fareler intraperitoneal %3 sodyum pentobarbital enjeksiyonuyla anestezi edilip sırtüstü pozisyona getirildi. Deri dezenfeksiyonundan sonra, sağ ortak karotis arteri (CCA) ve bitişik sinir ile kasları ortaya çıkarmak için orta çizgi servikal kesi yapıldı. Dış karotis arter (ECA) tanımlandı ve bağlandı, iç karotis arter (ICA) izole edildi. Ligatürler proksimal ICA ve CCA'ya yerleştirildi ve distal CCA geçici olarak kelepçelendi. Daha sonra kelepçeye yakın CCA'da küçük bir arteriotomi yapıldı. 0,26 mm bir naylon filament yerleştirildi ve ICA boyunca 18–20 mm ileriye taşınarak orta beyin arterinin başlangıcını kapattı. ICA ve CCA daha sonra bağlandı ve kesi dikildi. Ameliyattan sonra, iyileşme sırasında fareler sıcak tutuldu ve enfeksiyonu önlemek için intraperitoneal penisilin (40.000 U) enjeksiyonu yapıldı. Sham grubunda, filament yerleştirilmeden sadece damar maruziyeti yapıldı; yara kapanması ve ameliyat sonrası bakım, MCAO grubundakilerle aynıydı. Başarılı model oluşturma, ameliyattan 3 gün sonra^Zea Longa skoru 19 ≥ 2 ve Grade 1 20 ≥ modifiye edilmiş Ashworth Scale (MAS) kas tonusu puanı^olarak tanımlandı.

Müdahale yöntemleri
Saç derisi akupunkturu egzersiz müdahalesiyle birleşir
Önceki çalışmalar, MCAO sıçanlarında nörolojik bozuklukların 3. günde zirveye ulaştığını ve ameliyattan sonraki 10 gün içinde yüksek kaldığını, periferik kas direncinin ise 6. günden⁹²¹. güne kadar kademeli olarak arttığını göstermiştir. Bu nedenle, tedavi ameliyat sonrası 3. günde başlatıldı ve spontan iyileşmenin etkisini en aza indirmek için 7 gün ardışık günde bir kez devam etti. Modellemeden önce, SAE grubuna atanan fareler 3 gün boyunca 5 m/dakika hızla, günde 10 dakika²² dakika uyarlanabilir koşu bandı eğitimi aldılar. Bu uyarlanabilir eğitim, sıçanları koşu bandında koşmaya alıştırmak ve resmi müdahale döneminde mücadele, düşme, koşmayı reddetme veya durma olasılıklarını azaltmak için kullanıldı. Uyarlanabilir eğitim ve resmi müdahale sırasında, anormal koşu bandı ile ilgili durumlar sürekli mücadele, koşu yolundan düşme, 1 dakikadan fazla koşmayı reddetme veya koşu bandı antrenmanı sırasında 1 dakikadan fazla durma olarak tanımlandı. Bu olaylar gözlemlendiğinde deneysel kayıtlara kaydedilmiştir. Kısa bir tereddüt veya geçici durma, hafif bir uyarı sonrası koşu bandında koşmaya devam edilebiliyorsa dışlanmaya yol açmazdı. Veriler, yalnızca bir hayvanın tekrar tekrar düşme, sürekli koşmayı reddetme veya şiddetli sıkıntı nedeniyle atanan günlük koşu bandı seansını tamamlayamaması durumunda hariç tutuldu. 3. günde başarılı model doğrulamasının ardından, SAE müdahalesi 7 gün ardışık olarak günde bir kez uygulandı.

Her tedavi seansında, fareler %1,5–%2,0 isofluran ile anestezi edildi. Anestezi, iğne yerleştirildikten hemen sonra sona erdirildi. Deneysel uygulamada, sıçanlar genellikle izofluran çekilmesinden yaklaşık 1–2 dakika içinde tam bilinç kazanırlar. Koşu bandı eğitimi, fareler anestezi altındayken başlamadı. Akupunktur noktaları, Çin Akupunktur-Moksibustion Derneği tarafından 2020 yılında yayımlanan Deneysel Hayvanlarda Yaygın Akupunktur Noktalarının Isimlendirmesi ve Lokalizasyonu'na göre deneyimli hayvan akupunktur uzmanları tarafından tespit edilmiştir. GV20, kranial orta çizgideki ön ve arka fontanelleri birbirine bağlayan çizginin orta noktası olarak tanımlanmıştır. İki taraflı EX-HN1 noktaları GV20'ye 2 mm yan çapta konumlandırıldı. 0,25 mm × 13 mm ölçüsünde tek kullanımlık iğneler dikey olarak 1 mm derinliğe yerleştirildi ve standart 30 dakikalık koşu bandı eğitim süresi boyunca korundu. İğneler, yer değiştirmeyi önlemek için nefes alabilir tıbbi bantla sabitlendi ve prosedür tutarlılığını sağlamak için palpasyon ile kafatası penetrasyonu dışlandı. İğne pozisyonu ve bant sabitleme, koşu bandı eğitiminden önce, anormal koşu davranışı varsa kısa duraklamalarda ve antrenmanın hemen ardından kontrol edildi. Ayrıca, koşu bandı eğitimi sırasında hayvan davranışına bakılmaksızın her 5 dakikada bir iğne pozisyonu görsel olarak kontrol edildi. İğne yer değiştirme, koşu bandı koşusu sırasında görünür gevşeme, iğne açısının değişmesi, kısmi çekilme veya tamamen yerinden çıkma olarak tanımlanmıştır. İğne pozisyonu kaybedilmeden hafif gevşeme gerçekleşirse, bant nazikçe güçlendirilir ve koşu bandı kısa bir süre duraklatılırdı. Bir iğne kısmen çekilmiş veya tamamen yerinden çıkarılmışsa, o seans sırasında iğne tekrar yerleştirilmezdi; Fare, kalan koşu bandı eğitimini ek iğne manipülasyonu olmadan tamamladı ve olay deneysel günlükte belgelendi. Hayvanlar, yalnızca tek bir iğne yer değiştirme olayı nedeniyle dışlanmazdı; ancak bu olay koşu bandı eğitimini tamamlayamaması veya şiddetli sıkıntı belirtileriyle eşlik edilirse.

Standartlaştırılmış 30 dakikalık iğne tutma/eğitim dönemi, sıçanların izofluran anestezisinden tam iyileşmeden sonra koşu bandı koşmaya başlamasıyla başlar ve koşu bandı eğitimi tamamlandıktan hemen sonra, iğneler çıkarıldığında sona ererdi. İzofloran üretiminin kesilmesinden sonraki kısa iyileşme intervalı, standartlaştırılmış 30 dakikalık eğitim süresine dahil edilmemiştir. İğneler iyileşmeden önce yerleştirildiği için, fiziksel yaşam süresi 30 dakikalık koşu bandı antrenman süresinden yaklaşık 1–2 dakika daha uzundu. Bu tanım, SAE grubundaki tüm farelerde tutarlı şekilde uygulanmıştır. Bir fare, şu kriterler karşılandığında koşu bandı eğitimine başlayacak kadar iyileşmiş sayıldı: bilincin tam iyileşmesi, bağımsız durabilme yeteneği, düz bir yüzeyde istikrarlı yürüme yeteneği ve hafif dış uyarıma normal yanıt. Bu kriterler koşu bandına yerleştirilmeden önce kontrol edildi.

İğne tutma sırasında, fareler 0° eğimli koşu bandı egzersizi yaptılar: 10 dakika boyunca 6 m/dakika, ardından 20 dakika boyunca 12 m/dakika hızla. Çalışma sırasında hiçbir zaman elektrik şoku kullanılmadı. Bir fare resmi eğitim sırasında koşmayı bıraktıysa veya 1 dakikadan fazla koşmayı reddederse, hareketi teşvik etmek için koşu bandı duvarına hafifçe vurmak gibi nazik, olumsuz olmayan işitsel uyarım kullanıldı. Böyle bir yönlendirmenin kullanımı, mücadele, düşme, durma, koşmayı reddetme veya iğne yerinden kayma gözlemlendiğinde deneysel günlükte belgelenmiştir. Bu olaylar betimleyici olarak izlendi ve gözlemlendiğinde deneysel günlükte belgelendi. Egzersiz yoğunluğu, daha önce bildirilen protokollere dayanarak deri akupunkturu ile koşu bandağı antrenmanının birleştirildiği kapsamlı şekilde^{ayarlandı 16,23}. SAE müdahalesi 7 gün ardışık olarak günde bir kez uygulandı (Şekil 1A).

Baklofen müdahalesi
Başarılı model doğrulamasının ardından, Baclofen grubundaki farelere intragastrik gavaj ile 0,4 mg/kg dozda baklofen çözeltisi verildi. İlaç, 7 gün ardışık olarak günde bir kez saat 9:00'da uygulandı.

Sonuç kesin
Genel gözlem
Genel durum tüm gruplarda günlük olarak izlendi; vücut ağırlığı, ruh durumu, yiyecek ve su alımı, spontan aktivite dahil.

Nörolojik fonksiyon ve kas tonusu değerlendirmesi
Model doğrulama sonrası 1., 3., 5. ve 7. günlerde nörolojik eksiklikler ve uzuv spastisitesi, model doğrulamasından sonra Zea Longa skoru, değiştirilmiş nörolojik şiddet puanı (mNSS) ve modifiye edilmiş Ashworth Ölçeği kullanılarak değerlendirildi. Tüm zaman noktalarındaki tüm davranışsal değerlendirmeler, gözlem süresi boyunca grup dağılımı kör edilmiş iki araştırmacı tarafından bağımsız olarak gerçekleştirildi. Ayrıntılı puanlama kriterleri gösterilmiştir (Tablolar 1–3).

Beyin infarkt hacminin belirlenmesi
Beyin enfarkt hacmi 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama ile değerlendirildi. 7 günlük müdahalenin ardından, her gruptan üç fare rastgele seçildi ve intraperitoneal sodyum pentobarbital aşırı dozuyla ötanazi, ardından hızlı kafa kesilerek tüm beyin toplanması yapıldı. Beyinler önce −20 °C'de donduruldu ve ardından 2 mm kalınlığında koronal kesitlere bölündü. Bölümler, karanlıkta 37 °C'de %2 TTC çözeltisinde 30 dakika kuluçka edildi, ardından gece boyunca %4 paraformaldehit ile 4 °C'de sabitlendi. Ertesi gün, tüm bölümler dijital kamerayla fotoğraflandı. Normal beyin dokusu koyu kırmızıya boyanmışken, enfarkt dokusu soluk beyaz görünüyordu. İnfarkt alanları ImageJ ile nicelendirildi ve infarkt hacmi şu formülle yüzde olarak ifade edildi:

İnfarkt hacmi (%) = enfarkt alanı / toplam beyin kesiti alanı X %100.   (1)

Beyin dokusunun histopatolojik muayenesi
Hematoksilin–eozin (HE) boyama
Peri-enfarkt korteksindeki histopatolojik değişiklikleri değerlendirmek için hematoksilin ve eozin boyama kullanıldı. 7 günlük müdahaleden sonra, fareler intraperitoneal sodyum pentobarbital aşırı dozuyla ötenazi edildi. Daha sonra kanı almak için 0,01 M fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile hızlı transkardiyal perfüzyon uygulandı, ardından fiksasyon için 250 mL soğuk 4% paraformaldehit (4 °C) uygulandı. Tüm beyin toplandı ve peri-enfarkt kortikal doku izole edilip %4 paraformaldehit ile 4 °C'de 24 saat boyunca sabitlendi. Dokular parafinle gömülüp 5 μm koronal olarak kesitlenmiştir. Bölümler kaydıraklara monte edildi, 60 °C'de 30 dakika pişirildi ve ksilen I–III ile (her biri 10 dakika) deparafinize edildi. Daha sonra HE boyama işlemi yapıldı, ardından dehidrasyon ve temizlik yapıldı. Son olarak, bölümler nötr balsamla örtüldü ve görüntüler Nikon ışık mikroskobu kullanılarak alındı.

Nissl boyama
Nissl boyama, peri-enfarkt bölgesinde nöron sağlıklarını ve Nissl vücut yoğunluğunu değerlendirmek için kullanıldı. 7 günlük müdahaleden sonra, fareler ötenaziye edilip 0,01 M PBS (37 °C) ile transkardiyal perfüze edildi, ardından %4 paraformaldehit (4 °C) 250 mL alındı. Tüm beyin çıkarıldı, peri-enfarkt ve kontralateral kortikal dokular gece boyunca %4 paraformaldehit ile 4 °C sıcaklıkta diseksiye edilip sabitlendi. Parafin gömülmesinden sonra 5 μm kesitler hazırlandı. Kesitler 10 dakika boyunca ksilenle deparaffinleştirildi, bir dizi derecelendirilmiş etanol çözeltisi (%95, 90%, %80, %70 ve %50; her konsantrasyon için 5 dakika) ile yeniden nemlendirildi ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Nissl çalışma çözeltisi ile boyandı. Kısa bir damıtılmış su ile durulama yaptıktan sonra, bölümler derecelendirilmiş etanolden kurtuldu, 2 dakika ksilen içinde temizlendi ve sonunda örtü kapaklarıyla monte edildi. Görüntüler ışık mikroskobu altında çekilip analiz edildi.

Protein yayılımının Western blot analizi
Western blotting, PI3K/Akt sinyalizasyonu ve sinaptik plastisitede yer alan proteinleri değerlendirmek için gerçekleştirildi. 7 günlük müdahalenin ardından, fareler sodyum pentobarbital aşırı dozuyla ötanazi edildi ve peri-enfarkt motor korteks dokusu toplandı. Dokular buz üzerinde Radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) liz tamponunda tamamen homojenize edildi ve toplam protein çıkarılması için 4 °C'de 1610 × g. sıcaklıkta 30 dakika boyunca santrifüj edildi. Protein konsantrasyonu, ticari bir bicinchoninic acid (BCA) protein test kiti kullanılarak nicel olarak belirlendi. Eşit miktarda protein (her şerit başına 50 μg) sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve elektriksel olarak poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarıldı. Membranlar, spesifik olmayan bağlanmayı ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında %5 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile 1 saat boyunca bloklandı, ardından 4 °C'de gece boyunca primer antikorlarla inkübe edildi. Üç tur yıkamadan sonra, Tween-20 (TBST) tamponu ile Tris tamponlu tuzlu suyla üç tur yıkamadan sonra, zarlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorla (seyreltme oranı 1:1000) inkübe edildi. Protein bantları geliştirilmiş kemilyüminesans (ECL) kullanılarak görselleştirildi ve bant yoğunluğu ImageJ ile nicelendirildi. Göreceli protein ekspresyonu hedef proteinin iç kontrol oranı olarak hesaplandı. Birincil antikorlar şunlardı: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), fosfo-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), fosfo-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) ve GDNF (1:1000).

Sinaptik ultrayapı gözlemi
Geçirimli elektron mikroskopisi (TEM) sinaps sayısı ve yapısal bütünlüğü değerlendirmek için kullanılmıştır. 7 günlük müdahalenin ardından sıçanlar anestezi edilip %4 paraformaldehit ve %2,5 glutaraldehit içeren karışık fiksasyon ile transkardiyal perfuze edildi. Peri-enfarkt kortikal doku blokları (1 mm × 1 mm × 1 mm) toplanıp %2,5 glutaraldehit ile 2 saat boyunca sabitlendi, ardından %1 osmiyum tetroksit ile 1 saat sonradan fiksasyon yapıldı. Örnekler daha sonra derecelendirilmiş etanol dehidrasyonu, epoksi reçine gömülmesi, ultra ince kesitleme (50 nm kalınlığında) ve uranil asetat ile kurşun sitrat ile çift boyama ile işlendi. Sinaptik ultrayapı, bir geçirim elektron mikroskobu kullanılarak incelendi. Yapısal değerlendirme için görüntüler 8.000× olarak alındı ve sinapslar 5.000× olarak sayıldı. Her grup için üç rastgele nöropil alanı analiz edilip ortalama sinaps sayısı hesaplandı ve veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırıldı.

İmmünoflüoresans çift etiketleme testi
İmmünofluoresans çift etiketleme boyama, peri-enfarkt kortekste SYN ve p-Akt'in ekspresyonunu ve dağılımını değerlendirmek için gerçekleştirildi. 7 günlük müdahalenin ardından, sıçanlar intraperitoneal sodyum pentobarbital aşırı dozuyla ötenazi edildi ve peri-infarkt kortikal dokusu hızla disseksiye edildi. Örnekler %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitlendi, optimal kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömüldü ve 10 μm kalınlığında kesimlere kesildi. Bölümler oda sıcaklığında 1 saat hava kurutuldu ve kalan OCT bileşiği gidermek için TBST tamponu ile üç kez yıkandı. Bölümler, oda sıcaklığında %0,3 Triton X-100 ile 20 dakika geçirimli hale getirildi, PBS ile durulandı ve oda sıcaklığında %5 BSA çözeltisi ile 1 saat boyunca bloklandı. Karanlık koşullarda, bölümler gece boyunca 4 °C'de tavşan anti-SYN (seyrelme 1:200) ve tavşan anti-p-Akt (seyrelme 1:200) birincil antikorlarıyla kuluçka edildi. Ertesi gün, bölümler PBS ile üç kez yıkanmış ve oda sıcaklığında ikincil antikorla (1:400 seyreltme 1:400) karanlıkta kuluçka altına alınmıştır. TBST tamponu ile altı yıkamadan sonra, hücre çekirdekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çalışma çözeltisi ile karşı boyandı. Görüntüler, floresans mikroskobu kullanılarak aynı pozlama ve arka plan ayarlarında alındı. Motor kortekste SYN ve p-Akt ekspresyon desenlerini gruplar arasında değerlendirmek için temsilci görüntüler kullanıldı.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler GraphPad Prism 10.1.2 ve IBM SPSS Statistics 25 kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Zea Longa puanı, değiştirilmiş Nörolojik Şiddet Skoru ve değiştirilmiş Ashworth Ölçeği dahil olmak üzere birden fazla zaman noktasında toplanan davranışsal veriler, iki yönlü tekrarlanan ölçümlü ANOVA kullanılarak analiz edildi; grup denek arasında faktör olarak ve zaman dahili faktör olarak kullanıldı. Önemli ana etkiler veya etkileşimler tespit edildiğinde, Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi sonradan analiz için kullanıldı. Diğer veriler tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi sonradan karşılaştırmalar yapıldı. İki kuyruklu p. < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bar grafiklerde, istatistiksel anlamlılık, ilgili şekil yazılarında tanımlanan yıldızlarla belirtilir.

Sonuçlar

SAE, PSS sıçanlarında nörolojik fonksiyonu iyileştirir ve kas spastisitesini azaltır
İnme sonrası spaztisite olan sıçanlarda SAE'nin davranışsal işlev bozukluğu üzerindeki terapötik etkileri, model doğrulamasından sonra 1, 3, 5 ve 7. günlerde Zea Longa puanı, değiştirilmiş Nörolojik Şiddet Skoru ve değiştirilmiş Ashworth Ölçeği kullanılarak değerlendirildi (n = grup başına 12). Zea Longa skoru ve mNSS nörolojik eksiklikleri değerlendirmek için kullanılırken, kas tonus...

Tartışma

Önceki klinik çalışmalar, saç derisi akupunkturunun egzersizle birleştiğinde, inme sonrası spaztisite hastalarda spastik semptomları hafifletebileceğini, motor fonksiyon ve günlük yaşam aktivitelerini (ADL) iyileştirdiğini ^{göstermiştir14,24}. Bu bulgular klinik değerini desteklemektedir. Mevcut çalışma, Zea Longa skoru, mNSS ve MAS dahil olmak üzere üç davranışsal ölçütle bir fare modelinde SAE'nin terapötik faydasını daha da doğr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor