Yöntem makalesi

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

130 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

31 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Özet

Nukleazlar, baz editörler ve prime editörler dahil olmak üzere CRISPR editörleri, hastalık yaratan genetik varyantları verimli bir şekilde düzeltebilir veya hedef genleri bozabilir. Düzenleme sonuçları genellikle kültürlenmiş birincil hücrelerde, hasta kaynaklı hücrelerde veya mühendislik yapımı hücre hatlarında genetik varyasyonun etkisini incelemek veya hayvan çalışmalarına veya klinik çeviriye başlamadan önce ilk adım olarak değerlendirilir. Düzenleyicilerin mRNA olarak sentetik rehber RNA'larla birlikte memeli hücrelerine ulaşılması, plazmid tabanlı yaklaşımlara göre düzenleme verimliliğini artırabilir ve DNA entegrasyonu veya hedef dışı düzenleme gibi sorunların sürekli ipresyonunu önleyebilir. Bu makale, in vitro transkripsiyon (IVT) ile genom editörü mRNA'sını hazırlamak için bir iş akışını sunmaktadır; bu süreçte birlikte transkripsiyonel kap ve kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleotitler, elektroporat editörü mRNA ve yönlendirici RNA'ları birincil insan fibroblastlarına, indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) veya lenfoblastoid hücre hatlarına (LCL) dahil olmak üzere ve Illumina platformunda hedefli amplikon dizileme ile düzenleme sonuçlarını niceleyerek ve ardından CRISPResso2 kullanılarak analiz yapmayı içermektedir. Bu iş akışı, rehber RNA'lar, elektroporasyon parametreleri ve editör varyantlarının nicel kıyaslamasını mümkün kılar ve tek hücreli klonlama, fenotipik testler, preklinik hayvan çalışmaları ve terapötik geliştirme gibi sonraki uygulamaları destekler.

Giriş

Birincil memeli hücrelerinde verimli genom düzenlemesi, genetik modellerin oluşturulmasını ve aday tedavi stratejilerinin preklinik değerlendirmesini destekler. CRISPR tabanlı teknolojilerdeki son gelişmeler, baz düzenleme ve asal düzenleme gibi, çift zincirli DNA kırıntıları oluşturmadan hassas nükleotid modifikasyonlarını mümkün kılarak düzenleme sonuçlarının saflığınıartırır 1,2. Bu teknolojiler, orak hücre hastalığı3 ve kistikfibroz 4'e yol açan varyantları düzeltme stratejileri dahil olmak üzere, hastalık modellemesi ve terapötik genom düzenleme çalışmalarında başarıyla uygulanmıştır.

Memeli hücrelerine genom düzenleme bileşenlerini iletmek için özellikle etkili bir strateji, editleyici enzimi kodlayan in vitro transkripsiyonlu (IVT) mRNA'nın sentetik rehber RNA'larla (gRNA) birleşmesiyle elektroporasyonudur. mRNA iletimi, genom editörlerinin geçici ekspresyonunu sağlar, böylece uzun süreli nükleaz aktivitesi en aza indirilir ve hedef dışı düzenleme olaylarının olasılığını azaltır. IVT teknolojisindeki gelişmeler, mRNA sentezinin verimliliğini, verimini ve kalitesiniartırmıştır 4,5,6. Plazmid DNA şablonları ve PCR kaynaklı DNA şablonları, in vitro transkripsiyonda yaygın olarak kullanılır ve her biri kendine özgü avantajlar ve sınırlamalar sunar. Bu protokolde, plazmidlerde uzun poli(A) traktlarının yayılmasıyla ilgili sorunları önlemek için PCR ile oluşturulan şablonlar tercih edilir; çünkü plazmidler rekombinasyon ve uzunluk değişkenliğine yatkındır. Ancak, bu protokolte tarif edilen PCR şablonlarını kullanmak, 120-nükleotid poli(A) kuyruğunu barındıran pahalı bir ters primer gerektirir ve PCR, primerlerde kodlanmayan diziler için plazmidlerin bakteriyel yayılmasına göre daha fazla hata yapabilir. Alternatif olarak, Elegen ve 4basebio gibi ticari sağlayıcılar yüksek isabetli DNA şablonları sunabilir; bu da transkripsiyon şablonları oluşturmak için güvenilir ancak daha pahalı bir seçenek sunar.

Dikkatli rehber RNA tasarımı, başarılı genom düzenleme deneylerinin bir diğer kritik bileşenidir. Tahmin edilen hedefte verimlilik ve minimum hedef dışı aktivite temelinde araştırmacıların optimal gRNA dizilerini belirlemelerine yardımcı olmak için çeşitli hesaplama araçları geliştirilmiştir. Yaygın kullanılan platformlar arasında, Cas enzimlerinin protospacer komşu motif (PAM) gereksinimleriyle uyumlu rehber dizilerinin tanımlanmasını sağlayan ve yüksek tahmin edilen aktivite ve özgüllük 7,8 ile aday rehberleri önceliklendirmek için puanlama metrikleri sağlayan CHOPCHOP ve CRISPOR bulunur. Rehber RNA tasarımı için temel ilkeler ve en iyi uygulamalar, CRISPRliteratürü 9,10,11,12,13'te kapsamlı şekilde açıklanmıştır.

Elektroporasyon, genellikle lipid tabanlı transfeksiyon yaklaşımlarına dirençli hücre tiplerinde yüksek teslimat verimliliği elde edebildiği için genom düzenleme reaktiflerini memeli hücrelerine iletmek için yaygın olarak kullanılır. Elektroporasyon, hücre zarını geçici olarak geçirimlileştirir ve mRNA ve gRNA'lar gibi dışdışı nüklein asitlerin sitoplazmaya girmesine izin verir. Birincil hücreler, fibroblastlar, lenfoblastoid hücre hatları ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler dahil olmak üzere birden fazla memeli hücre tipi için optimize edilmiş elektroporasyonprotokolleri geliştirilmiştir 14. Lonza 4D ve Amaxa sistemleri gibi ticari elektroporasyon platformları, hücre tipine özgü programlar ve reaktifler sunarken, hücre yaşamlılığını koruyarak teslimat verimliliğini artıracak şekilde tasarlanmıştır. Amaxa 96 kuyu Mekik platformu gibi yüksek verimli elektroporasyon sistemleri, çoklu deneysel koşullarda ölçeklenebilir genom düzenleme deneylerini daha da mümkün kılar. Neon elektroporasyon sistemi de yaygın olarak kullanılır ancak bu protokolün odağı değildir.

Genom düzenleme bileşenlerinin teslim edilmesinin ardından, düzenleme sonuçları genellikle düzenleme alanının çevresindeki genomik bölgenin hedefli yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak değerlendirilir. Dizileme kütüphaneleri, hedef lokusun PCR amplifikasyonu ile oluşturulur, ardından indeksleme ve yüksek verimli dizileme yapılır. Ortaya çıkan dizileme okumaları, genom düzenleme deneyleri için tasarlanmış özel biyoinformatik boru hatları kullanılarak analiz edilir. Bu protokolde, düzenleme sonuçları CRISPResso2 kullanılarak nicel olarak ölçülür; bu, genom düzenleme sonuçlarının dizileme verilerinden ayrıntılı analizini mümkün kılan yaygın kullanılan bir hesaplamaplatformudur 15. CRISPResso2, dizileme okumalarını bir referans dizisiyle hizalatır ve genel düzenleme verimliliği, yerleştirme-silme (indel) sıklıkları, hassas nükleotid ikameleri ve hedef bölge boyunca düzenleme dağılımları gibi düzenleme sonuçlarını nicelikle ölçür. Yazılım ayrıca, deneysel koşullar karşılaştırmasını ve düzenleme parametrelerinin optimizasyonunu kolaylaştıran grafiksel görselleştirmeler ve istatistiksel özetler de sağlar.

Yüksek kaliteli IVT mRNA üretimi, elektroporasyon ile optimize edilmiş teslimat ve yüksek çözünürlüklü dizileme analizinin entegrasyonu, kültürlenmiş hücrelerde genom düzenleme stratejilerini değerlendirmek için sağlam bir iş akışı sağlar (Şekil 1). Bu yaklaşım, genom düzenleme stratejilerini in vivo çalışmalara ve potansiyel terapötik uygulamalara ilerletmeden önce düzenleme verimliliği, özgüllük ve deneysel parametrelerin yinelemeli optimizasyonunu sağlar.

Protokol

Etik beyan:
İnsan kaynaklı hücre hatlarını içeren tüm işlemler, kurumsal yönergeler ve onaylı protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. PCR kullanarak doğrusal DNA şablonu oluşturun

Dikkat: Tüm RNA adımlarını RNase içermeyen tüketim malzemeleri ve çalışma yüzeyleri kullanarak gerçekleştirin. Uygun genomik modifikasyon için uygun editörü seçerken listelenen mRNA editörlerini ve farklı varyantlarını göz önünde bulundurun (Tablo 1).

  1. PCR reaksiyonunu, bakterilerden ekstraksiyon edilen plazmid DNA'sında miniprep veya midiprep kit kullanılarak birleştirin. NEBNext Ultra II Q5 Master Mix enzimiyle 50 μL PCR reaksiyonunda 20 ng plazmid DNA kullanın ve PCR'yi Tablo 2'de açıklandığı gibi birleştirin.
    1. Plazmiddeki aktif olmayan T7 promotorunu düzelten ileri bir primer kullanın; bu da dairesel transkripsiyonu engeller.
    2. Verimli transkripsiyon ve mRNA stabilitesini desteklemek için 120-nt poly(A)₁₂₀ kuyruğu sağlayan ters primer kullanın.
    3. Urasil yerine N1-metil-pseudouridin kullanın ve mRNA translasyonunu iyileştirmek ve doğuştan bağışıklıkaktivasyonunu azaltmak için CleanCap AG ekleyin (Şekil 1).
      NOT: Diğer nukleotid analogları ve kaplayıcı reaktifler mevcuttur, ancak bunlar genom düzenleme mRNA'larında tutarlı bir şekilde yüksek aktivite göstermiştir. Nanopartikül tabanlı teslimat uygun bir alternatiftir ancak bu protokolde tartışılmaz.
  2. Kodlama bölgesinin yukarısında fonksiyonel bir T7 promotoru ve aşağısında bir poli(A) dizisi tanıtan primerler kullanarak editör kodlama dizisini PCR ile 30 döngü boyunca güçlendirin (Tablo 2 ve Tablo 3).
    NOT: IVT şablonunun nükleotid dizisi tablo 4'te altını çizmiştir.
  3. PCR ürünü doğrulayın ve arındırın
    1. PCR ürününden 5 μL'yi %1 agaroz jel üzerinde 180 V tamponda 180 V boyunca 30 dakika boyunca çalıştırın. PCR ürün arıtmasına geçmeden önce yaklaşık 4000-6500 bp arasında (yazı alınan editörü doğrultusuna göre) tek bir bandın varlığını doğrulayın.
    2. PCR ürününü bir PCR temizleme kiti (Malzemeler Tablosu) ile arındırın.
      NOT: Birden fazla bant veya düşük PCR ürün kalitesi gözlemlenirse, termodöngü koşullarını optimize edin (Tablo 5 – Sorun Giderme Tablosu).
    3. Arındırılmış DNA'yı florometrik dsDNA testi ile nicelikle ölçün. Qubit dsDNA analizi için, yüksek duyarlılıklı Qubit çalışma çözeltisi 796 μL ile 4 μL boya karışımını birleştirerek buffer-boya ana karışımını hazırlayın; her ikisi de kitte sağlanmıştır.
    4. Ayrı tüplerde, 198 μL tampon boya master karışımı, 2 μL düşük konsantrasyon standardı S1, yüksek konsantrasyon standardı S2 ve numune ile karıştırın. Stok konsantrasyonunu ölçmek için Qubit florometre cihazında belirtildiği gibi her bir standart ve örneği ekleyin.
      NOT: Eğer örnekler analiz aralığının üzerindeyse, seyreltme yapılması gerekebilir.

2. mRNA'yı transkribe edin

  1. IVT reaksiyonunu buz üzerinde T7 RNA polimeraz, NTP'ler, ko-transkripsiyonel kap için kap analogu ve uridin yerine N1-metil-pseudouridin trifosfatı kullanarak doğuştan bağışıklıkaktivasyonunu 1˒5˒6 azaltarak hazırlayın.
  2. IVT reaksiyon karışımını Tablo 4'e göre hazırlayın. Tablo 4'te verilen açıklamalı şablon dizisini kullanın. Her transkripsiyon reaksiyonunu 40 μL'lik nihai hacimde birleştirin.
  3. Birden fazla deney için yeterli mRNA üretmek amacıyla 5–10 reaksiyon tüpü hazırlayın. Her 40 μL reaksiyonu yaklaşık 100 μg mRNA üretir. Asal düzenleme elektroporasyonu için 1 μg mRNA ve baz düzenleme elektroporasyonu için 3 μg mRNA kullanılırken, ~33–100 elektroporasyon için bu yeterlidir.
  4. RNA'yı transkribe edin
    1. IVT reaksiyonunu pipetle iyice karıştırın. Reaksiyonu 37 °C'de 2 saat kuluçka edin.
  5. RNA'yı arındırın
    1. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarılır ve IVT reaksiyonuna toplam reaksiyon hacminin yarısına eşit bir hacimde 7,5 M lityum klorür (LiCl) çözeltisi ekleyerek nihai LiCl konsantrasyonu 2,5 M elde edilir. 40 μL IVT reaksiyonu için, 20 μL 7,5 M LiCl ekleyin. Nazik pipetle iyice karıştırın.
    2. Reaksiyonu -20 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Örneği 16.000 × g sıcaklıkta , 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. Süpernatantı pipetle çıkarın ve atın. Pelleti 1mL %70 etanol ile 4 °C'de yıkayın. Peleti rahatsız etmek gerekmez. 16.000 × gr sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Etanolü tamamen çıkarın ve peleti RNase içermeyen bir biyogüvenlik dolabında 1-2 dakika hava kurumasına izin verin. Pelleti aşırı kurutmayın, yoksa yeniden süzülmesi zor olabilir.
  6. RNA'yı yeniden askıya alın ve nicelikle alın
    1. RNA'yı nükleazsız suya yeniden süsleyebilirin. Her reaksiyonu başlangıçta 50 μL nukleazsız suya yeniden askıya alın ve RNA konsantrasyonu ölçüldükten sonra daha da seyreltin. RNA'yı, nanodrop gibi florometrik RNA testi kullanarak nicelikleştirin.
      Duraklama noktası: RNA niceliklendirme ve alikotlamadan sonra, mRNA aliquotlarını elektroporasyona kadar -80 °C'de saklayın. Tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının; Her aliquotu kullanmadan önce sadece bir kez eritin.
    2. Arıtılmış mRNA veriminin yaklaşık 100-400 μg olarak 40 μL IVT reaksiyonu olduğunu doğrulayın. mRNA'yı nükleazsız suyla 2 μg·μL-1'e seyreltin ve ardından aliquote yapın. Alikotları −80 °C'de sakla.
      NOT: Tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının. Tek kullanımlık aliquotlar hazırlayın ve kullanılmayan çözülmüş malzemeleri atın. Her aliquot başına 8–20 elektroporasyon için PCR şeritlerinde 12,5 μL aliquot hazırlayın.
  7. RNA bütünlüğünü değerlendirin
    1. RNA boyutu ve bütünlüğünü agaroz jel elektroforezi veya otomatik elektroforez ile değerlendirin (Şekil 2)
    2. 10.000x seyreltilmiş SYBR Gold içeren %0,8 agaroz jeli hazırlayın. NEB ssRNA Marker gibi tek zincirli bir RNA merdiveni kullanın.
    3. mRNA'yı 2x RNA Jel Yükleme Boya ile denatüre edin ve örnekleri 10 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtarak jel üzerine yükleyin.
    4. Yazılan editörü yaklaşık 4000-6500 nt oranında mRNA'nın baskın bir bant olarak göründüğünü, minimum bulaşma veya düşük moleküler ağırlıklı ürünlerle doğrulayın. Önemli bozulma, bulaşma veya birden fazla beklenmedik bant gösteren RNA örneklerini atın.

3. Kılavuz RNA'ların tasarımı ve hazırlanması

NOT: Hedef genomik lokus içindeki protospacer komşu motif (PAM) dizilerini belirleyin ve seçilen editör ile planlanan genomik modifikasyonla uyumlu rehber RNA'ları seçin. CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling ve VectorBuilder gibi rehber RNA tasarım platformları, olumlu tahmin edilen aktivite veözgüllüklere sahip rehber RNA'ları önceliklendirmek için kullanılabilir 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Hedef genomik lokus içinde, seçilen nükleaz varyantıyla uyumlu PAM sitelerini, NGN uyumlu varyantlar dahil, rehber RNA tasarım araçları kullanarak tanımlayın.
  2. Yüksek tahmin edilen hedefe uygun aktiviteye ve düşük tahmin edilen hedef dışı aktiviteye sahip rehber RNA'ları seçin. Kılavuz RNA için düzenleme penceresini onaylayın.
  3. Temel düzenleme veya prime düzenleme uygulamaları için, seçilmiş editörün optimal etkinlik penceresi içinde hedef edilen düzenlemeyi konumlandıran rehber RNA'ları seçin.
  4. İlk 3 ve son 3 nükleotid için 2'-O-Metil baz analogları içeren sgRNA veya pegRNA sırası ile rehberlerin ilk 3 ve son 2 bazı arasında 3' fosforotiyoat bağlantısı içerir.
  5. Kılavuz RNA'ları nükleazsız suda veya TE tamponunda (100μM) yeniden askıya alın. 5 μL aliquot hazırlayın ve aliquotları −80 °C'de saklayın. Kullanım anında, elektroporasyondan önce elektroporasyon tamponunda eritip seyreltir.

4. Hücre kültürü hazırlığı

NOT: Elektroporasyondan önce mikroskopi ve canlılık testleriyle hücre bütünlüğünü değerlendirin.

  1. Primer fibroblastlar veya HEK293T hücreler DMEM'de %10 FBS, 4,5 g· takviye edilmiş şekilde kültürlenin L-1 glikoz, GlutaMAX ve 110 mg· L-1 sodyum piruvat. Hücreleri, steril T75 şişelerine (TC yüzeyi) termo başına %20 birleşme oranında kaplama yapın. 1-20 geçişler arasındaki hücreleri koruyun. Hücreleri %80 birleşimde ayırın ve elektroporasyon için hücreleri %70-80 birleşimde kullanın.
  2. mTeSR Plus ortamında pluripotent kök hücreler kültürleniyor. Hücreleri, Geltrex ile kaplanmış steril T75 şişelerine kaplayın ve her şişe başına %20 birleşimle alın. Günlük olarak madde değiştirin ve 1-20 pasajlar arasındaki hücreleri koruyun. Her pasajdan sonraki 24 saat boyunca medyaya CEPT kokteyli ekleyin. Hücreleri %80 birleşimde ayırın ve elektroporasyon için hücreleri %70-80 birleşimde kullanın.
  3. Hücreler, elektroporasyon için uygun yoğunluğa, genellikle %70–%80 birleşime ulaşana kadar %5 CO₂ içinde 37 °C sıcaklıkta tutulur.
  4. Hücreler elektroporasyon için uygun sayıda ve birleşimde olduğunda ortamı çıkarın.
  5. Hücrelere TrypLE Ekspres Enzimi ekleyin (T75 şişesi için 1mL) ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Hücreleri nazikçe termosa bozulayarak tek hücreli bir süspansiyon elde edin. Dissosiyasyonu 3 mL hücre kültürü ortamı ekleyerek durdurun ve saymadan önce büyük hücre kümelerinin yokluğunu doğrulayın.
  6. Hücreleri 1.000 × g ile 5 dakika boyunca pellet edin, hücreleri 15 mL Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu (DPBS) ile bir kez yıkayın ve hücreleri tekrar santrifüj edin.
  7. Çözüm 13 ile Nükleocounter NC-3000 gibi otomatik bir canlılık testi kullanarak hücre konsantrasyonu ve yaşamlılığını değerlendirin. Nükleosayacı üzerinde ölçümden önce 11,4 μL hücre ile 0,6 μL Çözelti 13 birleştirin. Elektroporasyona yalnızca hücre canlılığı en az %85 olduğunda devam edin ve bu eşik altında örnekleri atın veya yeniden hazırlayın.
  8. Hücreleri yaklaşık 0,5 × 106–2 × 106 hücre·mL-1 DPBS yoğunluğunda yeniden süzülür. Hücreleri sayın ve canlılığı hemositometre veya hücre sayacı kullanarak değerlendirin.
  9. Sadece hücre yaşamlılığı %85 ≥ ise devam edin.
  10. Hücreleri elektroporasyon tamponunda yeniden askıya alın. Her reaksiyonda 2 × 10-5 hücreyi 5 μL soğuk elektroporasyon tamponunda yeniden askıya alın.
  11. Elektroporasyon tamponunu üreticinin talimatlarına uygun olarak takviye çözeltisiyle hazırlayın ve tamponu buz üzerinde tutun.
  12. Hücreleri soğuk tutun ve hızlıca ilerleyin. Hücreleri buzda tutun ve hemen elektroporasyon kurulumuna geçin.

5. Elektroporasyon

NOT: Çok kanallı pipetleme kolaylaştırmak için PCR şerit tüplerinde düzenleme kargosu hazırlayın. Elektroporasyondan sonra, hücreler CEPT kokteyli ile takviye edilmiş ortamda yeniden süspansiyona getirilerek hücre hayattakalmasını artırın.

  1. RNA yükünü hazırlayın.
    1. Düzenleyici mRNA ve yönlendirici RNA(lar)ı elektroporasyon tamponunda birleştirerek buz üzerindeki RNA kargosunu hazırlayın.
    2. Baz editörleri ve nükleazlar için, örnek başına 1,5 μL (3 μg) mRNA, 0,5 μL (50 pmol) kılavuz RNA ve 15 μL elektroporasyon tamponu içeren nihai elektroporasyon çözeltisi hazırlanın.
    3. Asal editörler için, her örnek başına 0,5 μL (1 μg) mRNA, 1,5 μL (150 pmol) kılavuz RNA ve 15 μL elektroporasyon tamponu içeren nihai elektroporasyon çözeltisi hazırlanın.
    4. RNA kargo çözeltilerini, transfer ve örnek işleme sırasında hacim kaybını telafi etmek için 1.2× master karışımı olarak hazırlayın. Her hedef site ve editör varyantı için reaktiv hacimlerini ve oranlarını gerektiğinde optimize edin.
  2. Hücreleri, yükü ve elektroporatı dağıtın.
    1. Her elektroporasyon kuyusuna 5 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
    2. 5 μL hücreye elektroporasyon tamponu içinde 17 μL RNA kargosu eklenin. Süspansiyonu pipetle iki kez karıştırın.
      Dikkat: Hücreler ve RNA kargosunu birleştirdikten sonra hızlı ilerleyin çünkü hücreler tarafından salgılanan RNazlar editör mRNA'yı hızla bozabilir. Hücreler ve RNA kargosunu karıştırdıktan sonra elektroporasyonu 2 dakika içinde tamamlayın.
    3. Seçilen hücre tipine göre optimize edilmiş elektroporasyon programını çalıştırın (Tablo 6; Şekil 2; Şekil 3).
      1. Birincil insan derisi fibroblastları veya HEK293T hücreleri için, tampon SF özellikli Lonza 4D elektroporasyon sistemini kullanın. Her reaksiyonda 200.000 hücre 200 μL elektroporasyon küvetine ekleyin. CM-130 programını çalıştırın. Hemen 80 μL önceden ısıtılmış DMEM + %10 FBS, 4.5 g· L-1 glikoz, 4 mM L-glutamin ve 110 mg· L-1 sodyum piruvat. Hücreleri 10 dakika boyunca geri alın, ardından 96 veya 24 kuyu plakalarına seyreltirin.
      2. Pluripotent kök hücreler için, tampon P3 ile Lonza 4D elektroporasyon sistemini kullanın. Her reaksiyonda 200.000 hücre 20 μL elektroporasyon küvetine ekleyin. DN-100 programını çalıştır. Hemen 80 μL önceden ısıtılmış mTeSR Plus ortamı ekleyin. Hücreleri 10 dakika boyunca geri kazandıktan sonra 24 kuyulu plakalara seyreldin.
    4. Hücreleri kaplamadan sonra her gün inceleyerek hücre sağlığı ve iyileşmesini takip edin.

6. Genomik DNA çıkarımı

NOT: PCR amplifikasyonundan önce genomik DNA'nın yeterli kalitede olduğundan ve inhibitörlerden arınmış olduğundan emin olun; çünkü DNA kalitesi, dizileme kütüphanesi hazırlığını ve genom düzenleme sonuçlarının doğru nicelenmesinietkileyebilir 9,10,11.

  1. Hücreleri yıkayıp hasat edin.
    1. Hücreleri elektroporasyondan 2-3 gün sonra toplayın. Hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın ve hemen genomik DNA çıkarımına geçin.
    2. 10 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 mL %10 (wt/vol) sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi ve nükleazsız suyu birleştirerek 1 L nihai hacmde eksik liz tamponu hazırlayın. Eksik liz tamponunu oda sıcaklığında 6 aya kadar saklayın.
    3. Tam lizis tamponu için 1:1.000 (vol/hacim) seyreltme ile proteinaz K eklenerek tam lizis tamponu hazırlanır. Lizis başlatmak için hücrelere tam lizis tamponu ekleyin. 96 kuyu plakasında yaklaşık 80.000 hücre içeren her kuyuya 40 μL tam lizis tamponu ekleyin. Numune kaybına yol açabileceği için yukarı aşağı pipo yapmayın.
  2. Örnekleri sindirin.
    1. Örnekleri 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe ederek hücre lizisi ve proteinaz K sindirimi tamamlanır.
  3. Proteinaz K'yı inaktive edin.
    1. Lizatları PCR tüplerine veya 96 kuyruklu bir PCR plakasına aktarın. Örnekleri 80 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka altına alın ve proteinaz K'yı inaktive edin.
  4. Lizatları sakla.

Duraklama Noktası: Lizatları PCR amplifikasyonuna kadar −20 °C'de sakla.

7. Düzenleme analizi için hedefli amplikon dizileme

NOT: PCR ürünlerini dizilemeden önce ekvimolyar miktarlarda biriktirin. Toplu genom düzenleme sonuçlarının nicelendirilmesi için genellikle örnek başına yaklaşık 10.000 dizileme okuması yeterlidir.

  1. Düzenleme alanının en az 25 bp yukarısında ve 25 bp aşağıda yaklaşık 300 bp amplikon üretecek locus-spesifik primerler tasarlayın (Tablo 7).
  2. Hedef genomik lokusu, Tablo 8, Tablo 9'da verilen koşullara göre PCR1 uygulayarak güçlendirin.
  3. PCR1 ürünü şablon olarak kullanarak, örneğin Tablo 7'deki "Örnek PCR indeksleme primerleri" sekmesinde gösterilen primerlerle PCR ile benzersiz örnek indeksleri ekleyin. Tablo 8 ve Tablo 9'un 2. sekmesinde gösterildiği gibi PCR koşullarını kullanın.
  4. PCR1 ve PCR2 ürünlerini %1,5 agaroz jel üzerinde çalıştırarak beklenen boyutlarda tek bantların varlığını doğrulayın.
  5. PCR2 ürünlerini ekvimolyar miktarlarda birleştirin. Havuzlu PCR2 kütüphanesini üreticinin talimatlarına göre 0.65:1 AMPure XP boncuk-örnek oranı ile temizleyin. Arındırılmış kütüphaneyi 30 μL nukleazsız suda elüasyon edin ve dizilemeden önce jel elektroforezi ile adaptör dimerlerin çıkarıldığını doğrulayın.
  6. Nihai havuzlanmış kütüphaneyi florometrik dsDNA testi kullanarak nicelikleştirin. Kapiller elektroforezi ile parça boyut dağılımını değerlendirin.
  7. Kütüphaneleri tek uçlu 300 döngülü okumalarla Illumina MiSeq enstrümanı üzerinde sıralayın. Son havuzlanmış kütüphaneyi 4 nM'e kadar seyrelt. 5 μL, havuzlanmış 4 nM kütüphanesini, 5 μL 0.1 M NaOH ve pipetle birleştirerek karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın, ardından MiSeq kitiyle birlikte verilen 990 μL soğuttulan HT tamponu ekleyerek çözeltiyi nötralize edin ve 20 pm'ye kadar seyreltin. %15 PhiX kontrolünde artış. Kütüphaneyi bir Illumina MiSeq kartuşuna yükleyin ve üreticinin standart çalışma ayarlarını kullanarak tek uçlu 300 döngülü dizileme çalıştırın. Her örnek başına yaklaşık 30.000 okuma üretmeyi hedefleyin, ancak örnek başına 10.000 okuma düzenlemeanalizi için yeterlidir 12. MiSeq dizilemesi Genewiz veya Quintara gibi bazı şirketlerde örnek başına yapılabilir.

8. Genom düzenleme sonuçlarının analizi

Not: CRISPResso2 analizi, genel düzenleme verimliliğinin, nükleotit dönüşüm sıklıklarının ve yerleştirme/silinme (indel) frekanslarının nicelendirilmesini sağlar ve deneysel koşullarda düzenleme sonuçlarını karakterize etmek için kullanılabilir15.

  1. Dizileme verilerini çoklu ayrıştırılın ve FASTQ dosyalarını genomik lokus ve deneysel koşullara göre düzenleyin.
  2. CRISPResso2'yi Github deposunda verilen talimatlara göre kurun (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. CRISPResso2 toplu analizini, giriş FASTQ dosyalarını ve analiz parametrelerini belirten batch.txt dosyaları kullanılarak çalıştırın (örnekler Tablo 7'de verilmiştir). Minimum okuma kalitesi puanını 30'a ayarlayın. "W" pencere genişliğini 20'ye ayarlayın. Sitozin baz editörleri kullanılırsa, bazı indeller nick noktasına ek olarak bazla düzenlenmiş nukleotidler etrafında merkezlenebilir. Bu durumda, bu indelleri en iyi yakalamak için "wc" pencere merkezini nick sitesindeki varsayılan merkez yerine -10'a ayarlayın.
  4. Uygun özet çıktı dosyalarından nükleotit dönüşüm frekansları, ekleme/silme (indel) frekansları ve (varsa) HDR veya asal düzenleme frekansları gibi nicel çıktıları çıkarın. Bunlar genellikle Microsoft Excel veya diğer tablo düzenleme yazılımlarında açılabilen "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" ve "Nucleotide_percentage_summary.txt" adlı dosyalarda bulunur.
  5. Aşağı akış grafiki ve veri yorumu için nicel düzenleme değerlerini, Şekil 3-4'te olduğu gibi dışa aktarın. Allik düzenleme sonuçlarını değerlendirmek için "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" dosyalarını ( Şekil 5'te gösterildiği gibi) kullanın.

Sonuçlar

HEK3 kontrol sitesine sahip ABE8e temel editörü gibi, kolayca erişilebilen test sitesine sahip verimli bir düzenleyici kullanmak, teslimat sistemi deneyde kullanılan hücreler için uygunsa genellikle %90'ın üzerinde düzenleme verimliliği elde edebilir. Düzenleyici mRNA, rehber RNA, hedef site veya teslimat koşullarında düzenlemeye daha az uygun hale getiren sorunlar durumunda daha düşük düzenleme verimliliği ortaya çıkabilir. Daha çok yönlü PAM dizilerine erişen ama onları daha az sıkı bağlayan Cas9 varyantları veya düzenleyicileri ideal düzenleme pencerelerinin dışındaki nukleotidlere hedeflemek düzenleme verimliliğini azaltabilir. Başarılı IVT tarafından oluşturulan editör mRNA'lar genellikle minimal bulaşma veya düşük moleküler ağırlıklı bozunma ürünleriyle tek bir baskın bant olarak görülür; bu da aşağı akış elektroporasyonu için uygun yüksek transkript bütünlüğünü gösterir (Şekil 2).

Editör mRNA ve sentetik rehber RNA'ların elektroporasyonundan sonra, çoğu hücre 24–48 saat içinde toparlanır ve uygun elektroporasyon programlarıyla tipik morfolojilerini korur (Şekil 3–4). Elektroporasyon koşulları, farklı tamponlar belirgin şekilde farklı sonuçlar verebileceği için belirli hücre tipine göre uyarlanmalıdır. Çevrimiçi Lonza Bilgi Merkezi, yaygın hücre tipleri için tampon ve elektroporasyon kodları önerilerinde bulunur ve Lonza hücre hatları ile birincil hücreler için ayrı optimizasyon kitleri sunar. Tamponların ampirik karşılaştırması, verimli teslimat için optimal koşulları belirlemeye yardımcı olabilir. Uygun olmayan programlar ise hiçbir teslimata yol açabilir veya hücreler için son derece toksik olabilir (%50'den fazla kaybı veya hücre döngüsünün devamını engelleme). Temsilli optimizasyon deneyleri, elektroporasyon koşulları genelinde düzenleme sonuçlarında önemli farklılıklar göstermiştir; bazı programlar yüksek düzenleme verimliliği sağlarken, diğerleri minimum düzenleme üretmiştir ve her hücre tipi için ampirik optimizasyonun önemini vurgulamaktadır (Şekil 3–4).

iPSC'ler, fibroblastlar ve LCL'ler boyunca, hedef alınmış amplikon dizileme ve ardından CRISPResso2 analizi kullanılarak düzenleme verimliliği ve yan ürünler nicelendirilir (Şekil 4). HEK3 test lokusunun adenin baz düzenlemesi burada gösterilmiştir (Şekil 4), bu da analiz edilen örneklerde düşük indel frekanslı amaçlanan nukleotid dönüşümlerine yol açmıştır. CRISPResso2 analizi, hedef lokustaki düzenlenmiş ve düzenlenmemiş allellerin görselleştirilmesini sağlar ve amaçlanan nükleotid dönüşümlerinin, indel frekanslarının ve diğer düzenleme yan ürünlerinin nicelendirilmesini kolaylaştırır; böylece düzenleme sonuçlarının kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar (Şekil 5). Düzenleme verimliliği, hedef bölgedeki bu kesin tek nükleotit yerine geçme sıklığının ölçülmesiyle nicelendirilir. HEK3 lokusu, iyi karakterize edilmiş düzenleme profili ve deneysel sistemler arasında tekrarlanabilirliği nedeniyle model lokusu olarak kullanılır ve farklı koşullarda temel düzenleme performansının sağlam bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Yeni düzenleme prosedürlerini optimize ederken bu rehberi insan hücrelerinde olumlu bir kontrol olarak test etmenizi öneriyoruz. Baz düzenleme genellikle düşük indel frekanslı niyetlenen nukleotid dönüşümleri için zenginleştirilirken, asal düzenleme hassas düzenlemeler ve düşük frekanslı yan ürünlerin karışımınısağlar 3,12. Düzenleme verimlilikleri koşullara göre değişmekte olup, hücre tipleri ile elektroporasyon programları arasında açık farklar gözlemlenmiştir (Şekil 3-4). Bu varyasyonlar muhtemelen hücre alımı, canlılık ve DNA onarım aktivitesindeki farklılıkları ile elektroporasyon parametrelerinin teslimat verimliliği üzerindeki etkisini yansıtır. Bu bulgular, elektroporasyon ayarlarının hücre tipine özgü optimizasyonunun, tutarlı ve maksimum düzenleme sonuçları elde etmek için önemini vurgulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1. Editör mRNA'nın in vitro transkripsiyonla hazırlanması.
Düzenleyici mRNA üretiminin şematik genel bakışı. (Adım 1) Düzenleyici kodlama dizisini ve T7 promotorunu içeren plazmid şablonunun hazırlanması. (Adım 2) PCR amplifikasyonu ile lineer bir DNA şablonu oluşturuldu. (Adım 3) T7 RNA polimerazı kullanılarak kaplı mRNA sentezi için in vitro transkripsiyon. (Adım 4) Şablon DNA, enzimler ve serbest nükleotitlerin çıkarılması için mRNA'nın saflaştırılması. Ortaya çıkan kapalı mRNA, memeli hücrelerine elektroporasyon veya lipid nanopartikül ile aşağı akış yoluyla ulaşım için uygundur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. mRNA jel elektroforezi örnek görüntüsü 
Üç genom editörü mRNA'sının elektroforez görüntüsü, SYBR altın lekesi kullanılarak %1 agaroz jel üzerinde çalışır. NEB'den alınan ssRNA merdiveni solda gösterilmiştir ve boyut işaretleri uzunluklarıyla gösterilmiştir. Belirgin bir lekelenme veya küçük bantların olmaması, bu mRNA'ların uygun kalitede olduğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerde (iPSC) genom düzenlemesi için elektroporasyon koşullarının optimizasyonu. 
iPSC'lerde farklı elektroporasyon koşullarında elde edilen düzenleme verimlilikleri gösterilmiştir. Hücreler, CB-150 tampon P4, CD-118 tampon P3, DN-100 tampon P3, DC-100 tampon P3, DC-100 tampon P3 gibi birçok tampon ve program kombinasyonları kullanılarak elektroporlanmıştı; bunların hepsi Lonza 4D Nükleofeksiyon cihazında. Düzenleme, parametrelerle (1600 V, 20 ms, 1 darbe) Neon elektroporasyon cihazı kullanılarak değerlendirildi. Düzenleme verimliliği, düzenlenen lokusun hedefli dizilme analiziyle nicelleştirildi. N=1 örnek başına olur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Fibroblastlarda genom düzenleme için elektroporasyon koşullarının optimizasyonu.
Farklı nükleofeksiyon programları kullanılarak elektroporasyon sonrası verimlilik düzenleme. Fibroblastlar, birden fazla Lonza Nükleofektörü programı (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 ve FF-113) kullanılarak elektroporlantı ve düzenleme sonuçları hedefli dizileme ile nicelendirildi. İki replika (P2, P3) için sonuçlar gösterilmiştir. Editör teslimatı olmadan negatif kontrol de dahildir. Elektroporasyon kodlarının karşılaştırılması, elektroporasyon ayarlarında düzenleme verimliliğindeki farklılıkları ortaya koyarak fibroblast genom düzenlemesi için optimal parametrelerin belirlenmesini sağlar. N=1 örnek başına olur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Hedeflenen lokusta genom düzenleme sonuçlarının karakterizasyonu. 
CRISPResso2'den alınan allel frekans tablosu çıktısı; bu tabel, sgRNA hedef bölgesinin çevresindeki düzenlenmiş ve düzenlenmemiş allellerin göreceli bolluğunu yüksek verimlilikli dizileme analiziyle belirlenmiş olarak gösterir. Kırmızı açıklamalar, taban düzenleme penceresini ve kullanılan hücre hattında mevcut olan heterozigot polimorfizmi gösterir. Kılavuz RNA aralayıcı dizisi gri ile altı çizilmiştir. "Tahmin edilen bölünme pozisyonu", noktalı çizgiyle gösterilen, analiz Batch Dosyamızdaki pencere merkezi "wc"nin değişmesi nedeniyle SpCas9 için tipik "PAM eksi 3" konumuna göre kaydırılmış (örnek Tablo 8'de). Bu aslında tahmin edilen kesinti konumunu kaydırmaz, ancak çıktı, noktalı çizgiyi çevreleyen indellerin 20 nükleotit penceresi içinde değerlendirileceğini, hem gerçek nik noktasında merkezlenen indellerin hem de deaminlenmiş nükleotitlerde merkezlenenlerin yakalanacağını göstermek için gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan editörler ve diziler 
Sütun 1: AddGene'de in vitro transkripsiyon için genom editörleri mevcuttur. Bu protokolde tanımlandığı gibi in vitro transkripsiyona uygun plazmidler için isimler ve Addgene kimlikleri mevcuttur. Sütun 2: Bu çalışmada kullanılan rehber RNA aralayıcılarının dizileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2. mRNA plazmid şablonunun amplifikasyonu için PCR reaktifleri.
Plazmid şablonunun PCR amplifikasyonu ve sonraki uygulamalar için lineer DNA üretmek amacıyla kullanılan reaktifler ve reaksiyon bileşenleri listesi, ayrıca ileri ve ters transkripsiyon primerlerinin dizisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3. mRNA şablonunun amplifikasyonu için PCR döngüsü koşulları. 
Bu tablo, plazmid DNA'sından mRNA şablonunun PCR amplifikasyonu için kullanılan termosikl koşullarını listeler; sonraki uygulamalardan önce. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4. In vitro. transkripsiyon (IVT) reaksiyonları için kullanılan reaktifler. 
Bu tablo, doğrusal DNA şablonundan editör mRNA'yı sentezlemek için in vitro transkripsiyonda kullanılan reaktifler ve reaksiyon bileşenlerini listeler. Renk kodlu öğelerle örnek bir şablon dizisi (ABE8e) gösterilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5. Genom düzenleme iş akışındaki temel adımlar için sorun giderme rehberi. 
Bu tablo, in vitro transkripsiyon (IVT) ile düzenleyici mRNA hazırlığı sırasında ortaya çıkabilecek yaygın teknik sorunları ve MiSeq dizileme analizini özetler. İş akışının her adımı için, düzenleme verimliliğinin optimize edilmesine ve düzenleme sonuçlarının doğru algılanmasına yardımcı olmak için potansiyel sorunlar, olası nedenler ve önerilen çözümler sunulur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6. Farklı memeli hücre tipleri için optimal elektroporasyon programları. 
Bu tablo, editör mRNA'nın verimli teslimatı için kullanılan elektroporasyon program kodları ve tampon koşullarını listeler; yönlendirme RNA'ları farklı memeli hücre tiplerine yönlendirir. Listelenen elektroporasyon parametreleri, genom düzenleme verimliliğini maksimize eden ve hücre canlılığını koruyan koşulları belirlemek için test edildi. Aynı program, her hücre hattı veya birincil hücre kaynağı için çalışmayabilir, bu nedenle düzenleme başlangıçta başarısız olursa bu listeden alternatiflerin test edilmesi önerilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 7. Genom düzenleme sonuçlarının nicelendirilmesi için CRISPResso2 analiz parametreleri. 
İlk sekme, hedef lokusunun güçlendirilmesi için kullanılan HTS1 primer tasarımına bir örnek verilmiştir. İkinci sekme, kütüphane hazırlığı sırasında kullanılan indeksleme primerlerine bir örnek sunar. Üçüncü sekme, sıralama sırasında her numuneye benzersiz indeksler atamak için kullanılan indeksleme düzenlemesine bir örnek göstermektedir. Dördüncü sekme, CRISPResso2 analizi için örnek bir giriş parti dosyası içerirken, beşinci sekme ise ek bir CRISPResso2 analiz giriş Parti Dosyası örneği sunar. Pencere merkezi "wc"nin, temel editörler için ayarlandığını, böylece deaminlenmiş bazlara ve nükleaz kesiği veya kesik noktasına odaklanmış indellerin tespit edilmesini kolaylaştırmak için ayarlandığını unutmayın. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 8. MiSeq kütüphanesi hazırlığı için PCR1 (Tabma 1) ve PCR2 (Tabma 2) reaktifleri.
Bu tablo, hedef genomik lokusları amplifikasyon için Tabb 1 (PCR1) ve örnek spesifik indeks dizilerini ve Illumina dizileme adaptörlerini içeren Tabma 2'de (PCR2) kullanılan reaktifler ve reaksiyon bileşenlerini listeler; böylece MiSeq analizi için dizileme hazır kütüphaneler oluşturulur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 9. PCR1 (Tab 1) ve PCR2 (Tab 2) MiSeq kütüphanesi hazırlığı için döngü koşulları.

Bu tablo, hedef genomik bölgeleri amplifikasyon için Tabma 1'de (PCR1) ve örnekle ilgili indeks dizilerini ve Illumina dizileme adaptörlerini içeren Tabma 1'de (PCR2) kullanılan termodöngü koşullarını listeler; böylece MiSeq analizi için dizileme hazır kütüphaneler oluşturulur. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, editör mRNA ve sentetik rehber RNA'ların elektroporasyonu kullanılarak birincil memeli hücrelerinde genom düzenleme için bir iş akışı sağlar. mRNA olarak teslimat, plazmid teslimatına kıyasla daha verimli düzenleme sağlar ve mRNA, editör protein veya ribonükleoproteine göre partiler arasında daha basit ve tutarlı olur. baz editörlerinin mRNA ve ribonükleoprotein formları önceki çalışmalarda başbaşa karşılaştırıldığında, mRNA daha iyi düzenlemeverimliliği sağlamıştır 3. Plazmid veya viral dağıtım yöntemlerine kıskında, mRNA tabanlı teslimat geçici ekspresyonu ve genomik entegrasyon riskini azaltır, ancak farklı hücre tipleri için optimizasyon gerektirebilir. Düşük düzenleme verimliliğinin yanı sıra, genom düzenlemesinde plazmid DNA'sının kullanılması, hedef hücrelerin genomuna rastgele entegre edilme riskini taşır ve editörün uzun süreli ekspresyonu nedeniyle hedef dışı düzenleme riskini artırabilir. Hedefli amplikon dizileme ve CRISPResso2'nin birleşimi, düzenleme verimliliğinin standartlaştırılmış nicelenmesini ve herhangi bir allel sonucun karakterizasyonunusağlar 3.

Başarı için birkaç faktör hayati öneme sahiptir. Bu protokolteki kritik adımlar arasında RNA bütünlüğünü sıkı RNazsız işlem yoluyla korumak, optimal rehber RNA'ların seçilmesi ve her hücre tipi için elektroporasyon koşullarının dikkatlice optimize edilmesi yer alır. RNA bütünlüğü ve dikkatli RNaz kontrolü sonuçları güçlü şekilde etkiler ve yönlendirici RNA seçimi verimlilik ve yan ürün profillerinin birincil belirleyicisi olarak kalır. Elektroporasyon ayarları hücre tipine göre ampirik optimizasyon gerektirir ve yüksek düzenleme sağlayan bazı programlar da toksisiteye neden olabilir. Düşük düzenleme verimliliği gözlemlenirse, elektroporasyon parametreleri, RNA kalitesi veya rehber RNA tasarımının optimizasyonu düşünülmelidir. Aşırı toksisite oluşursa, elektroporasyon gücünü veya RNA girdisini azaltarak hücre yaşamlılığını artırabilir. Ek optimizasyon stratejileri arasında, hedef hücre tipine göre uyarlanmış alternatif elektroporasyon tamponları ve programlarının test edilmesi veya düzenleyici veya rehber RNA konsantrasyonlarının değiştirilmesi yer alır. Bu iş akışı, editörleri kıyaslamak ve değiştirilmiş hücreler üretmek için pratik bir platform sağlar; ardından tek hücre klonlama, fenotipleme, in vivo çalışmalar veya translasyonel geliştirme yapılabilir. Bu iş akışı, birincil hücrelerde genom düzenleme stratejilerini değerlendirmek için geniş çapta uygulanabilir ve genomik bağlamlar ve hücre tipleri arasında düzenleme modalitelerinin sistematik karşılaştırılmasını mümkün kılar. Klinik olarak ilgili varyantların tanıtılması veya düzeltilmesi ile kodlayan ve kodlamayan düzenleyici unsurların fonksiyonel sorgulanması yoluyla hastalık modellemesini destekler. Ayrıca, hedefe uygun verimlilik, hedef dışı aktivite ve düzenleme dayanıklılığının değerlendirilmesi gibi terapötik düzenleme yaklaşımlarını optimize etmek için bir platform sağlar. İş akışı ayrıca rehber RNA'ları ve düzenleme sistemlerini taramak ve önceliklendirmek, teslimat stratejilerini değerlendirmek ve hastaya özgü varyantları hassas tıp çerçevesinde test etmek için de kullanılabilir. Toplu olarak, temel genom biyolojisi, translasyonel araştırma ve preklinik gelişim arasında çok yönlü bir köprü görevi görür. Bu yöntemin sınırlamalarından biri, elektroporasyon verimliliği ve hücre sürdürülebilirliğinin hücre türleri arasında önemli ölçüde değişebileceği ve bunun ampirik optimizasyon gerektirmesidir. Ayrıca, düzenleme sonuçları rehber RNA tasarımı ve saflığına ile hedef lokusun erişilebilirliğine bağlı olabilir; bu da farklı deneysel sistemlerde tekrarlanabilirliği sınırlayabilir. Bu kısıtlamalara rağmen, deneysel parametrelerin ve rehber tasarımının dikkatli optimizasyonu değişkenliği azaltabilir ve bu yaklaşımın çeşitli hücresel sistemlerde güvenilir ve tekrarlanabilir uygulanmasını mümkün kılar.

Açıklamalar

N.W. ve E.V.B., Johns Hopkins Üniversitesi aracılığıyla genom düzenleme teknolojileri için patent başvurularında bulundu. G.A.N., Broad Institute ve Johns Hopkins Üniversitesi aracılığıyla genom düzenleme teknolojileriyle ilgili patent başvurularında bulunmuştur.

Yazarın katkısı:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. ve G.A.N. her biri metnin ayrı bölümlerini hazırlaydı. M.V. son metni derleyip düzenledi, ardından tüm yazarlar düzenlemeleri yaptı.

Teşekkürler

Bu protokolle ilgili faydalı tartışmalar için Beatriz Olalla Sastre'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, British Heart Foundation'ın CureHeart'a verdiği Big Beat Challenge ödülü ile desteklendi (ödül referans no. BBC/F/21/220106), Kistik Fibroz Vakfı (NEWBY23XX0 ödülü) ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (G.A.N.'a R00HL163805 ve DP2OD038783). J.N.W., NIH T32 No. T32 desteğini GM148383.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaksiyon
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul hücre çözeltisi ve 0.4167 μL DAPI çözeltisi 
Çözelti 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Çözeltisi
Phusion High-Fidelity DNA Polimeraz Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Miktar: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polimeraz New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TüpleriThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaksiyon
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, %10 çözeltiThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nükleik Asit Jel BoyasıThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Jel Boyası Thermo Fisher Scientific S33102 
Sentetik sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reaksiyonNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzim Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE tamponu (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (%0,25) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penisilin/Streptomisin Karışımı 10.000 ug/mL,

Kaynaklar

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

BiyolojiSay 233Say 233Bo De erSaymRNAnukleofeksiyonIVTiPSC lerfibroblastlarbaz edit rprime edit r
Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.