Yöntem makalesi

Yenidoğan Sepsis İçin Translasyonel Preterm Domuz Modeli

124 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71456

⸱

10 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Erken doğulanlarda bakteriyel sepsis modelleri gereklidir, ancak mevcut kemirgen modelleri klinik önemden yoksundur. Canlı Staphylococcus epidermidis ile enfekte olan erken domuz yavruları kullanılarak yüksek translasyonel bir yenidoğan sepsis modeli geliştirilmiştir.

Özet

Erken doğuran bebekler, aşırı iltihaplanma ve organ işlev bozukluğu durumu olan hızla hayatı tehdit eden sepsise ilerleyebilen bakteriyel enfeksiyonlara karşı özellikle savunmasızdır. Hastalık mekanizmalarını araştırmak ve terapötik gelişimi ilerletmek için, neonatal sepsisin karmaşık patofizyolojisini ve klinik sunumunu kopyalayan sağlam translasyonel hayvan modellerine kritik önem vardır. Bu protokol, doğumdan kısa bir süre sonra veya doğum sonrası üçüncü günde canlı Staphylococcus epidermidis'in intraarterial infüzyonuyla indüklenen klinik olarak önemli bir preterm domuz sepsisini sunmaktadır. Domuz yavrusu, gebeliğin %90'ında sezaryen ile doğulur ve yenidoğan yoğun bakım koşullarında bakım alır. Bunlar arasında sıcaklık ve oksijen kontrollü kuluçka makineleri ile parenteral beslenme ile seri kan örnekleme sağlanmasını sağlayan yerleşik göbek arterial kateteri bulunur. S. epidermidis enfeksiyonunun ardından domuz yavruları 24–48 saat boyunca izlenir. Sepsisin insidansı ve şiddeti, bakteri dozu ve parenteral glukoz tedarikiyle ayarlanabilir. Parenteral glikozun daha yüksek tedarı, pro-inflamatuar bağışıklık yanıtlarını hızlandırır ve bu da klinik bozulmaya yol açar. Ölümcül sepsis ve insani son noktalar, arteriyal kan gazı parametreleri (pH ≤ 7.1) ile uyuşukluk, cilt renk değişikliği ve takipne gibi hemodinamik bozulmanın klinik belirtileriyle tanımlanır. Bu model, enerji metabolizması ve immünomodülatör müdahalelerin yeni doğumlu enfeksiyon sırasında bakteriyel klirens, sistemik iltihap ve doku hasarını nasıl etkilediğini keşfetmek için benzersiz bir platform sunar. Yenidoğan sepsisinin önlenmesi ve tedavisi için klinik stratejiler konusunda önemli bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Yenidoğan enfeksiyonu, özellikle erken doğurmuş bebekler arasında, ancak düşük doğum ağırlığı veya perinatal komplikasyonlara sahip bebekler arasında da ölüm ve uzun süreli hastalıkların başlıcanedenlerinden biridir 1,2. Erken teşhis, spesifik olmayan klinik belirtiler, olgunlaşmamış ve oldukça değişken bağışıklık yanıtları ile enfeksiyonu enfeksiyon dışı iltihabı ayırt edebilen hassas ve spesifik biyobelirteçlerin eksikliği nedeniyle hâlâzordur 3,4. Sonuç olarak, klinisyenler genellikle mikrobiyolojik doğrulamadan önce ampirik geniş spektrumlu antibiyotik tedavisi başlatır; bu da aşırı antibiyotik kullanımına, erken yaşamda mikrobiyal kolonizasyonun bozulmasına ve antimikrobiyal direncin gelişimine katkıdabulunur.

Yenidoğan sepsis, enfeksiyona karşı düzensiz bir konak yanıtı nedeniyle organ işlev bozukluğuna yol açan hayati tehlike doğuran birdurumdur 4. Enfeksiyon ve sepsis ayrı biyolojik ve klinik varlıkları temsil etse de, bu terimler neonatoloji literatürlerinde sıklıkla birbirinin yerine kullanılır. Klinik olarak, yenidoğan sepsis genellikle erken veya geç başlangıçlı sepsis (EOS, LOS) olarak sınıflandırılır; sırasıyla 72 saat öncesinde veya sonra meydana gelir1. EOS genellikle doğum sırasında bulaşan patojenler, örneğin Escherichia coli veya Grup B Streptococcus tarafından neden olur. Buna karşılık, LOS sıklıkla spesifik olmayan semptomlarla ortaya çıkar, kültür negatif olabilir ve invaziv işlemler, parenteral beslenme ve uzun süreli hastanede yatma gibi risk faktörleriyle ilişkilidir. En yaygın neden organizmalar arasında koagulaz negatif stafilokokklar, özellikle Staphylococcus epidermidis ve Gram-negatif bakteriler bulunur; ancak mantar ve polimikrobiyal enfeksiyonlar dagörülür 1,2,6. Etiyolojik olarak bağımsız olarak, yenidoğan enfeksiyonlar yaygın bir sepsisfenotipi 1,2 üzerinde birleşebilir. Önemli olarak, erken doğuştan doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık gelişimsel olgunlaşmamışlığı ve sınırlı metabolik rezervler sergiler; bu da enfeksiyona yanıt vermeyi etkileyebilir7.

Tanı ve tedavideki ilerleme, mevcut deneysel sistemlerin sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. In vitro yaklaşımlar, bağışıklık yollarının mekanik çalışmalarına olanak tanır ancak karmaşık bağışıklık yanıtlarının entegre fizyolojisini yakalayamıyor. Kemirgen modelleri, yenidoğan bağışıklık yanıtlarının genetik ve moleküler çalışmaları için değerli olsa da, bağışıklık ontojezi, metabolizma ve 8,9 boyutlarında insanlardan önemli ölçüde farklıdır. Bu modellerde sepsisin klinik yönetimi, yoğun izleme, tekrarlayan kan örnekleme ve klinik olarak gerçekçi destekleyici veya terapötik bakım testleri için sınırlı fırsatlar nedeniyle incelenmesi zordur.

Büyük hayvan modelleri, özellikle erken doğan yeni doğan domuz yavruları, güçlü bir tamamlayıcı yaklaşım sunar. Domuzlar, benzer bağışıklık hücresi popülasyonları, desen tanıma reseptör sinyalleri ve metabolikdüzenleme 10,11,12,13,14 dahil olmak üzere insanlarla yakın anatomik, fizyolojik ve immünolojik benzerliklere sahiptir. Önemli olarak, domuzlar yetişkin sepsis13,15 için yaygın olarak model olarak kullanılmaktadır. Domuzların fiziksel ölçeği, klinik olarak uygun enstrümantasyon, sürekli fizyolojik izleme, tekrarlanan biyo-örnekleme ve parenteral beslenme, sıvı tedavisi, antibiyotikler ve solunum desteği gibi standart yoğun bakım müdahalelerinin kullanılmasına olanak tanır. Deneysel enfeksiyon, gelişimsel olgunlaşma bağlamında da incelenebilir; bu da hastalık yörüngelerini, konak yanıtlarını ve tedavi etkilerini klinik uygulamaya çok yakın koşullarda incelemeyi mümkün kılar.

Bu makale, esnek bir translasyon platformu olarak tasarlanmış erken doğumlu domuz balalarında standartlaştırılmış bir yenidoğan sepsis modelini tanımlar. Model, sistemik bakteriyel enfeksiyonun kontrollü indüksiyonuna ve klinik, immünolojik ve metabolik yanıtların uzunlamasına değerlendirmesine olanak tanır; bu da yenidoğan sepsisinin patofizyolojisini incelemek ve yeni önleyici ve terapötik müdahalelerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Protokol

Tüm detaylandırılan prosedürler, hayvan deneyleri için AB direktifi 2010/63/EU'ye uygun olarak yürütülmüş ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği (lisans numarası: 2020-15-0201-00520) tarafından onaylanmıştır.

1. Doğumla ilgili prosedürler

  1. Gebeliğin %90'ında (gebelik günleri 106–107) erken doğurmak için seçmeli sezaryen yapılabilir.
    1. Ticari Özel Patojensiz bir çiftlikten hamile bir domuz (Landrace × Large White, üçüncü veya dördüncü parity) edinin.
      NOT: Domuz, tam doğum gününün bilinmesini sağlamak için yapay tohumlama (× Duroc) ile hamile kalmalıdır.
    2. Dişi dişi bir gece boyunca (en az 12 saat) oruç tutun ve ameliyattan önce improvizet suya erişiminiz olsun. Atropin (domuz başına 2 mL), butorfanol (2 mL/100 kg vücut ağırlığı; 10 mg/mL) ve Zoletil 50 Vet (3.3 mL/100 kg vücut ağırlığı; tiletamin 25/mL ve 25 mg/mL) içeren bir kokteylin intrakas enjeksiyonu ile sedasyonu indük edin.
    3. Sedasyon edildikten sonra, kulak veni kateteri takılır ve propofol (10 mg/mL) ile genel anestezi uygulanır ve palpebral refleks ile çene tonunun kaybı sağlanana kadar titrlenir.
    4. Hava yolunu güvence altına almak için doğrudan laringoskopi altında endotrakeal entübasyon yapın. Sezaryen boyunca %100 oksijen (1–2 L/dakika) içinde kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı ile buharlaştırılmış izofluran kullanarak cerrahi bir anestezi düzlemi tutulur.
    5. %5'te başlayın ve %1,5–2,5 oranında kalın; konsantrasyonu kalp atış hızı ve çevresel oksijen doygunluğuna göre en düşük etkili doza kadar titre.
      NOT: Apne oluşursa, yeterli oksijenlenme sağlamak için mekanik ventilasyon başlatın.
    6. Dişi otu sağ yan yatmaya yerleştirin. Cerrahi bölgeye aseptik bir hazırlık yapın. Sol yan kesi hattı boyunca subkutan ve intramusküler infiltrasyon yoluyla toplam 120 mL lidokain (10 mg/mL) uygulanır.
    7. Rahim boynuzlarını açığa çıkarmak ve dışa çıkarmak için bir skalpel kullanarak sol yan laparotomi yapın. Rahim boynuzlarını daha büyük kıvrım boyunca keserek bireysel domuz yavruları doğurabilirsiniz.
    8. Göbek bağını kesmeden önce, kordonu domuzcuya doğru 2–3 kez sağarak hemoglobin konsantrasyonu ve demir depoları artırılır. Göbek kordonun, kanamayı önlemek için gazlı bezle birlikte A–Z işaretli göbek kelepçesi yerleştirin ve kordonu kesin.
    9. Teslimattan hemen sonra, her domuz yavrusunu polietilen torbaya koyarak başını açıkta bırakın. Torba, ısı kaybını en aza indirerek hipotermi riskini azaltır.
    10. Boynun içine kas içi olarak sabit hacimde 0.1 mL doksapram (20 mg/mL) ve 0.1 mL flumazenil (0.1 mg/mL) uygulanır. Doxapram spontan solumu uyarırken, benzodiazepinli bir antagonist olan flumazenil, sezaryen sırasında dişi domuzdan aktarılan anesteziyi kısmen tersine çevirir.
    11. Domuzcukları yenidoğan yoğun bakım ünitesine nakledin.
  2. Yeniden canlandırma, rastgeleleştirme ve kateterizasyon
    1. Her domuz yavrusunun cinsiyeti yenidoğan yoğun bakım ünitesine nakledildiğinde tartın ve belirleyin.
    2. Kendiliğinden nefes alamayan domuz yavruları için bireysel olarak canlandırma yapılsın. Doxapram ve/veya flumazenil dozlarını tekrarlayın ve solunumu stabilize etmek için gerektiğinde pozitif basınçlı ventilasyon sağlanın.
    3. Domuzcuklar fizyolojik olarak stabil hale geldikten ve hâlâ anne yoluyla aktarılan anestezi nedeniyle anestezi halindeyken aseptik teknikle göbek bağının bir arterial kateteri (4 Fr PVC besleme tüpü) yerleştirilir. Kateter ucunu dorsal aortaya doğru ilerlet. Kateteri dikişlerle cilde sabitleyin ve parenteral beslenme sağlamak için infüzyon hattına bağlayın.
      NOT: Preterm domuzda, kateter ucu kötü konumlanma riski nedeniyle bağırsak ven üzerinde intraarteriyal uygulama, ductusvenosus 21 yerine karaciğer parenkima içinde potansiyel karaciğer nekrozunu önlemek için yerleşik standarttır.
    4. Domuzcukları doğum ağırlığı ve cinsiyete göre katmanlaştırın ve onları tedavi gruplarına rastgele atayın.
  3. Konut koşulları
    1. Her domuz yavrusunu tek tek ısıtmalı, yumuşatılmış bir kuluçka makinesine ve kontrollü havalandırmaya yerleştirin.
    2. Hipoksiyi önlemek için doğumdan sonra 12 saate kadar ek oksijen (1–2 L/dakika) verin.
    3. Doğumdan sonraki ilk 12 saat boyunca rektal sıcaklığı izleyin. Isınma koşullarını 38–39 °C (hedef: 38,5 °C) olarak korumak için ayarlayın.
      NOT: Doğumdan hemen sonra ve kateter yerleştirilmesi sırasında kısa bir hipotermi dönemi beklenmektedir.

2. Plazma infüzyonuyla pasif aşılama

NOT: Domuzlar immünoglobulinleri transplasental olarak aktarmadığından, 24 saatten uzun süren deneylerde spontan enfeksiyonları önlemek için kısmi pasif aşılama sağlamaktır.

  1. Sezaryen sonrası domuzdan anne kanı alın, steril heparin kaplı bir kapta alın. Kanı steril Falcon tüplerinde 4 °C, 2500 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjle edin ve bir kez tekrarlayın. Ayrıldıktan sonra, plazmayı dikkatlice yeni steril Falcon tüplerine toplayın ve kullanılana kadar 4 °C'de saklanın.
  2. Doğumdan sonraki 12 saat içinde, plazmayı 8 mL/kg dozda infüzyon pompası kullanılarak 30 dakika boyunca sürekli bir intraarterial infüzyon olarak verin.

3. Deneysel enfeksiyonun indüklenmesi

NOT: Deneysel enfeksiyon doğumdan 3–4 saat sonra veya doğum sonrası 3. günde tetiklenebilir.

  1. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması
    1. Donmuş S. epidermidis stok şişesini (WT-1457, %15–25 gliserol) oda sıcaklığında eritin. Homojen bir süspansiyon elde etmek için kısa süreliğine (2–3 saniye) girdap kullanılır.
      NOT: Enfeksîyonel ajanlar için risk grubu sınıflandırmasına göre, S. epidermidis DSÖ Risk Grubu 1 mikroorganizması olarak sınıflandırılmıştır. DSÖ Risk Grubu 1 mikroorganizmalarının insan hastalığına neden olma olasılığı düşük ve özel bir dikkat gerektirmez.
    2. 20 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu ile 5 μL eritilmiş S. epidermidis stokunu steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde aşılayarak gece kültürü hazırlayın. 37 °C'de inkübe yapın ve yörüngesel sallanma ile 180 rpm'de ~16 saat boyunca kultura ulaşın, böylece kültür durağan aşamaya ulaşabilir. Aynı koşullarda aşılanmamış BHI suyu kontrolünü dahil ederek orta sterilliği doğrulayın.
    3. 20 mL BHI suyu ile 200 μL gece kültürü (1:100 seyreltme) steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde aşılayarak yeni bir kültür hazırlayın. Tüm domuz yavrularını enfekte edecek kadar kültür hazırlayın (bkz. 3.1.4 – 3.1.6. adımlardaki hesaplamalar). 37 °C'de inkubasyon yapın, 180 rpm'de yörünge sallanmasıyla 2,5 saat boyunca, bakteriler erken logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar (Ek Şekil 1A).
    4. Tüm domuz yavrularını enfekte etmek için gereken toplam kültür hacmini titrlenen hedef doz, ortalama vücut ağırlığı, domuz yavrusu sayısı ve kültür yoğunluğu temelinde tahmin edin.
    5. Kültürün 2,5 saatlik kuluçkadan sonra 600 nm (OD) ≥1 optik yoğunluğuna ulaşacağını varsayın ve OD olarak 1 = 3 × 108 koloni oluşum birimi (CFU)/mL olarak belirlenmiş dönüşüm oranı kullanılır.
    6. Kayıpları karşılamak için %15 ekstra hacim ekleyin. Tahmini kültür hacmini şu formülle hesaplayın:
      VTahmini = [Hedef doz (CFU/kg BW) × BW) × BW × N × 1.15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      burada:
      VTahmini = Tahmini toplam kültür hacmi (mL)
      BW = domuz yavrusunun ortalama vücut ağırlığı (kg)
      N = toplam domuz yavrusu sayısı
    7. Kuluçka sonrası kültürün OD değerini belirler. Ölçümleri spektrofotometrenin doğrusal aralığında tutmak için numuneyi gerektiği kadar seyreltin.
    8. Hedef CFU konsantrasyonuna ulaşmak için gereken nihai kültür hacmini şu formülle hesaplayın:
      VFinal = OD1 · VTahmini / Ölçülen OD (2)
      burada:
      VFinal = gerekli nihai kültür hacmi (mL)
    9. Hesaplanan VFinal'i 50 mL Falcon tüplerine aktarın ve oda sıcaklığında 3.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. Süpernatantı dikkatlice at.
    11. Bakteriyel pelleti 3 x VFinal steril %0,9 salin içinde yeniden askıya alın ve arteriyadan uygulanmaya hazırlanın (3 mL/kg vücut ağırlığı 3 dakika sürede). Çözümün agregalardan arınmış olduğundan emin olun.
    12. Bakteriyel süspansiyon ile 50 mL infüzyon şırıngaları hazırlayın.
    13. Enfeksiyonsuz kontroller için steril %0,9 salinli ayrı bir 50 mL infüzyon şırıngası hazırlayın.
  2. Enfeksiyon prosedürü
    1. Hedef dozu 3 dakika boyunca vermek için bir infüzyon pompası seti kullanılarak her domuzcuya göbek arterial kateteri üzerinden bakteriyel süspansiyon veya steril salin verin. Ardışık domuzcuklar arasında 5 dakikalık bir aralık kalın.
    2. Enfeksiyondan hemen sonra, kateteri yıkamak ve tüm dozun teslim edilmesini sağlamak için sürekli parenteral beslenme infüzyonuna başlayın.
    3. Dozu bakteriyel süspansiyonu 4 °C'de saklayarak doğrulayın. Daha sonra, bakteri yoğunluğu belirlenmek için kan agar plakalarında seyreltilip yayılabilir (bkz. adım 8)

4. Parenteral beslenme

  1. Deney boyunca domuzcuklara tam parenteral beslenme (TPN) sağlamak. Örneğin, yeni doğan domuz yavrularının makro besin gereksinimlerini karşılamak üzere modifiye edilmiş Kabiven 1900 kcal gibi üç odalı insan TPN torbası kullanın.
  2. Parenteral beslenme çözeltisini steril koşullarda hazırlayın.
    1. Glikoz odasından 300 mL çıkarın.
    2. Lipid odasından 70 mL al.
    3. Glikoz odasına 155 mL %50 glikoz ekleyin.
    4. Glikoz odasına 214 mL Vamin ekleyin.
    5. Glikoz odasına 150 mL steril su ekleyin.
    6. Glikoz odasına 0.1 mL heparin (5000 IE/mL) ekleyin.
    7. Üç odanın içeriğini iyice karıştırın.
      NOT: Bu, Tablo 1'de gösterilen makro besin bileşimiyle parenteral beslenme çözeltisi ortaya çıkarır. Alternatif beslenme rejimlerinin enfeksiyon yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirirken bu formülasyonu standart kontrol diyeti olarak kullanın.
    8. Parenteral besinleri 4 °C'de kullanana kadar sakla. Çözeltiyi partiler halinde hazırlayın ve hazırlıktan sonra 48 saatten fazla kullanmayın.
      NOT: Model, domuz yavrularına oroqastrik besleme tüpleri takarak enteral beslenme ve bağırsak uyarısının etkilerini değerlendirmek üzere değiştirilebilir.
  3. Parenteral beslenmenin verilişi
    1. 50 mL steril infüzyon şırıngalarını parenteral beslenmeyle doldurun ve infüzyon pompası ile intraarterial kateter üzerinden sürekli infüzyon pompası ile infüzyon yapın.
    2. İnfuzyon hızını 6 mL/kg/h olarak ayarlayın. Domuz yavrularını günlük tartın ve güncel vücut ağırlığına göre dozu ayarlayın.
      NOT: Uzun vadeli çalışmalar için, periferik ödem (aşırı hidrasyon) gözlemlenirse, infüzyon oranını 4 mL/kg/s'e düşürün.
    3. Enjeksiyon pompalarını düzenli olarak izleyin, böylece şırıngaların boş çalışmadığından emin olun. Gerekirse şırıngaları doldurun.

5. Klinik izleme

  1. Çalışma boyunca domuz yavrularını düzenli olarak değerlendirerek harekete geçilmeyeceğini belirleyin. Bakteriyel infüzyondan sonra, hayvanlar planlı ötenazi yapılana kadar deneyimli personel tarafından her 1–2 saatte bir izlenmelidir.
    NOT: Klinik bozulma, yani hiç belirti kalmadan insancıl son noktalara ilerlemek, 30–60 dakika içinde hızla gerçekleşebilir.
    1. Solunumla ilgili belirtileri gözlemleyin; taşipin, solunum sıkıntısı, siyanoz ve agonal nefes alma gibi sorunlar var.
      NOT: Hipoksi (oksijen doygunluğu %80< durumlarda oksijen tedariki başlatılmalı/artırılmalıdır.
    2. Dolaşımla ilgili belirtileri gözlemleyin; renk değişimi, soğuk uçlar, uzun kapiller dolum süresi, taşikardi ve bradikardi.
    3. Aktiviteyle ilgili belirtileri gözlemleyin; yorgunluk, ayakta duramamak veya yürüyememek (doğum sonrası 3. günden itibaren geçerlidir) ve ağrı uyarılarına tepki.
    4. Ekşimoz veya ciltte peteşial kanama gibi pıhtılaşmaya ilişkin belirtileri gözlemleyin. Renk değiştirmiş bölgelere hafif baskı uygulayın; Kızarıklık ağarmazsa, bulguyu cilt kanaması olarak sınıflandırın.
  2. Klinik belirtiler gözlemlenirse, kan gazı ölçümleri yapılarak pH, laktat, oksijen doygunluğu ve karbondioksitin kısmi basıncı temel değerlere göre karşılaştırılabilir (bkz. adım 6.3).
    NOT: Sürekli klinik izleme (örneğin, kan basıncı, kalp atışı ve solunum hızı) kullanılabilir ancak bu deneylerde rutin olarak kullanılmaz.

6. Kan örneklemesi

NOT: Domuz yavrularında uzunlamasına kan örneklemesi, intra-arterial kateter veya jugulyar venipunktur ile yapılabilir. Örneklenen toplam kan hacmi tahmini toplam kan hacminin %7,5'ini (vücut ağırlığının ~%7'si) geçmemelidir. Tüm kan örnekleme prosedürleri yerel etik kurallara uymalıdır.

  1. İntra-arteriyel kateter kan örnekleme
    1. Temiz, eldivenli ellerle kateter portuna dikkatlice erişin. Erişim noktasını açmadan önce etanol ile dezenfekte edin. İnfuzyon hattının kontaminasyonundan kaçının.
    2. En az 2 mL kan çekilip bir kenara alın, çünkü bu hacim infüzyon hattındaki parenteral beslenmeyle kontamine olabilir. Çekilen numunenin sterilliğini koruyun.
    3. Analiz için gerekli kan hacmini toplayın. Örneğin, hematoloji analizleri için kan EDTA kaplı tüplerde toplanmalı, kan gazı analizleri için ise heparin kaplı şırıngalarla alınmalıdır.
    4. Örnekleme tamamlandıktan sonra, başlangıçta çekilen 2 mL kanı domuz yavrusuna yeniden enfuze edin ve kateteri dikkatlice parenteral beslenme infüzyon hattına yeniden bağlayın.
  2. Juguler ponksiyon kan örneklemesi
    1. Domuz yavrusunu kuluçka makinesinden çıkarın ve boyun bölgesini açığa çıkarmak için sırt yatağı pozisyonuna yerleştirin. Domuz yavrusunu hareketi önlemek ve juguler damara güvenli erişim sağlamak için güvenli şekilde tutun.
      NOT: Juguler venipunktur, kanama, hematom oluşumu ve hava yolu bozulması gibi potansiyel risklerle ilişkilidir. Bu prosedürün yapılması kararı, sonuçların bilimsel önemiyle dikkatlice değerlendirilmelidir.
    2. Juguler venin yaklaşık anatomik konumunu belirleyin ve delin bölgesini etanol ile dezenfekte edin.
    3. Juguler venipunktur Vacutainer sistemiyle yapın ve gerekli kan hacmini toplayın. Örneğin, 0,2 mL kan toplayın ve örneği bakteriyel plakaya kadar 4 °C'de saklayın.
    4. Hemostaz sağlanana kadar venipturistik bölgesine baskı uygulayın. Sonra domuz yavrusunu kuluçka makinesine geri götürün.
    5. Domuz yavrusunu yenilenmiş kanama belirtileri için izlemeye devam edin. Eğer ciddi bir kanama olursa, domuz yavrusunu ötenazi yapın. Ayrıca, hava yolunu tehlikeye atabilecek deri altı hematom oluşumu veya iç kanamayı takip edin.
  3. Kan gazı ölçümleri
    1. Heparinli şırıngadaki kan örneğini hava kabarcıkları için inceleyin. Eğer baloncuklar varsa, gaz ölçümlerini değiştirmemek için şırıngaya dokunarak onları nazikçe dışarı çıkarın veya çıkarın.
    2. Örneği kan gazı analizörüne taşıyın ve üreticinin talimatlarını takip edin. Doğruluğu korumak için numunenin zamanında işlendiğinden emin olun.

7. Sepsis kriterleri ve insancıl son noktalar

  1. Domuz yavrularını, sepsis işareti olan önceden tanımlanmış insani son noktalara ulaştıklarında ötenazi.
    NOT: Diğer patolojiler veya iatrojenik yaralanmalar için, insancıl son noktalar için yerel etik yönergelere bakınız.
    1. Sepsis için ana gösterge ve birincil insani son nokta olarak kan pH'ını kullanın. Hemen kan pH≤ı 7.1 olan domuz balalarını ötenazi yapın. Kan pH ≤ 7.2 olan domuz yavruları için her 15–30 dakikada bir kan gazı ölçümleri tekrarlanacak ve ikinci insancıl son noktaları izleyin.
    2. İkincil insancıl son nokta olarak, yayılmış intravasküler pıhtılaşma ortaya çıktığında, ekkimoz veya peteşial kanama, solunum durması, derin halsizlik ve/veya ağrı uyaranlarına yanıt vermeme (anatomik forsepsle nazikçe sıkıldığında yoksunluk refleksinin olmaması ile doğrulanmıştır) gibi yayılan intravasküler pıhtılaşma belirtileri ortaya çıktığında domuz yavrularını ötenazi edin.
  2. Domuz yavrusunu Zoletil bazlı bir karışımın (0.1 mL/kg) kas içi enjeksiyonuyla anestezi edin.
    NOT: Bir şişe Zoletil 50 Vet (tiletamin, 125 mg, zolazepam 125 mg) 6,25 mL ksilazin (20 mg/mL), 1,25 mL ketamin (100 mg/mL) ve 2,5 mL butorfanol (10 mg/mL) kullanılarak 10 mL'ye yeniden oluşturulur. Son konsantrasyonlar her biri 12,5 mg/mL tiletamin, zolazepam, ksilazin, ketamin ve 2,5 mg/mL butorfanoldür.
  3. Ağrılı bir uyarana yanıt olarak yoksunluk refleksinin olmaması nedeniyle anestezi derinliğinin yeterli olduğunu doğrulayın (bkz. adım 7.1.2).
  4. Sodyum pentobarbital aşırı dozunun intrakardiyak enjeksiyonu ile ötenazi yapılması (3 mL/kg; 400 mg/mL).
    NOT: Ötenazi öncesinde Vacutainer sistemi kullanılarak intrakardiyak kan örneklemesi yapılabilir.

8. Bakteriyel kaplama ve nicelik

  1. Deney sırasında toplanan juguler venipunktur örnekleri ve ötenazi sırasında toplanan kardiyak ponksiyon numuneleriyle kan bakteri yoğunluğunu nicelikle ölçin.
    NOT: Arterial kateterden alınan kan kullanılmaz, çünkü bu kateterde ilk deneysel enfeksiyondan kalan bakteriler bulunabilir ve bu da nicelikleri karıştırabilir.
    1. Her kan örneği için bir koyun kanı agar plakası hazırlayın, altına 0, -1, -2 ve -3 kuyrektlerini işaretleyin ve plakayı hayvan kimliği ile zaman noktasıyla etiketleyin.
    2. Her örnekten 50 μL kan kullanarak, 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 450 μL steril PBS içinde 10-1, 10-2 ve 10-3 katı sulandırılması hazırlanır.
    3. Her plakayı atanan dörtlükte üç adet 20 μL seyreltme damlası ile tespit edin; temas veya bulaşmayı önlemek için aralık damlaları belirleyin ve aerosolleşmeyi önleyin.
    4. Plakaları gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın, ardından 4 °C'de saklayın ve saymaya başlayın.
    5. Sulandırmadaki tüm bakteri kolonilerini sayın, her noktada yaklaşık 10 koloni içerir. Sadece genellikle beyaz, dairesel ve düzgün kenarlı olan S. epidermidis kolonilerini dahil edin. Morfolojisi değişmiş kolonileri dikkatlice inceleyin ve kaydedin; çünkü bunlar örneğin örnekleme yoluyla yapılan kontaminasyonu gösterebilir. Aşağıdaki denklemi kullanarak CFU/mL hesaplayın:
      (CFU/mL) = [(koloni sayısı · seyrelme faktörü)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

Sonuçlar

Doğum sonrası 5. güne kadar erken yetiştirilen domuzcuklarda doz-yanıt deneyi yapıldı (Şekil 1). Doğum sonrası 3. günde, domuz yavrularına düşük dozda S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), yüksek dozda S. epidermidis (5 ×10 9 CFU/kg, n = 9) veya kontrol olarak salin (n = 3) infüzyonu verildi ve 44 saat boyunca izlendi.

S. epidermidis infüzyonunun ardından, yüksek dozu alan domuz yavrularında 44 saatlik takip süresi boyunca kan bakteri yükü düşük dozlu gruplara kıyasla daha yüksek kaldı (Şekil 2A, P < 0.05). Yüksek dozlu gruptaki (3/9) sadece domuz yavrusu sepsis geliştirdi ve enfeksiyondan yaklaşık 12–15 saat sonra başlangıç gerçekleşti (Şekil 2B). Bununla uyumlu olarak, yüksek S. epidermidis dozu alan domuz yavrularında 12 saat içinde daha düşük kan pH (Şekil 2C, P < 0.001) ve karbondioksit (pCO₂) kısmi basıncında belirgin bir artış görülmüştür (Şekil 2D, P < 0.01), düşük dozlu gruplara kıyasla.

Enfeksiyonun akut evresinde (6 saat), her iki enfekte grup da tuzlu kontrollere kıyasla daha düşük baz fazlalığı ve daha yüksek laktat seviyeleri gösterdi; yüksek dozlu S. epidermidis grubunda ise 12 saat ile 12 saate kadar devam eden daha belirgin değişiklikler var (Şekil 2E, F, P < 0.01 – 0.05). Kan şekeri seviyeleri gruplar arasında farklılık göstermedi (Şekil 2G).

6 saat sonra, her iki enfekte grup da enfekte olmayan kontrollere kıyasla güçlü kan nötrofil azalması gösterdi (Şekil 3A, her ikisi P< 0.001). Enfeksiyonun ilerleyen dönemlerinde, her iki enfekte grupta da nötrofil yenilenmesi gözlemlenmiş, ancak düşük dozlu S. epidermidis grubunda daha yüksekti (Şekil 3A, P < 0.05). Her iki enfekte grup da deney sırasında trombositopeni geliştirdi; ancak, trombosit sayıları yüksek dozlu S. epidermidis grubunda, düşük dozlu grup ve enfekte olmayan kontrol gruplarına kıyasla daha erken ve belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 3B, P < 0.01–0.05). TNF-α, IL-6 ve IL-10 plazma seviyeleri, enfeksiyondan 6 ve 12 saat sonra her iki enfekte grupta kontrol gruplarına kıyasla yüksekti (Şekil 3C, P < 0.001–0.05). 24 saatte, plazma TNF-α ve IL-10 seviyeleri yalnızca yüksek dozlu S. epidermidis grubunda, enfekte olmayan kontrollerle karşılaştırıldığında (P < 0.05) yüksek kaldı; 44 saat sonra ise sadece TNF-α seviyeleri yüksek kaldı (P < 0.05).

Ötenazi zamanı, domuzcuklar insani son noktalara ulaştığında veya enfeksiyondan 44 saat sonra planlanan zamanda ötenazi edildiklerinde, negatif akut faz reaktantları ve organ hasarı belirteçleri plazma seviyeleri ölçüldü (Şekil 4A–G). Bunlar arasında, yüksek dozda S. epidermidis ile enfekte olan domuz yavrularında düşük dozlu gruplara kıyasla yalnızca kolesterol (negatif akut faz reaktanı) anlamlı şekilde daha düşüktü (Şekil 4B, P < 0.05). Karaciğer hasarı belirteçlerinin ortalama seviyeleri, alanin aminotransferaz ve aspartat aminotransferaz dahil, ayrıca kreatinin ve kan üre azotu gibi böbrek hasarı belirteçleri, yüksek dozlu S. epidermidis grubunda, enfekte olmayan kontrollere göre sayısal olarak daha yüksekti (Şekil 4D–G).

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel tasarım. Erken doğumlu domuzcuklar gebeliğin %90'ında sezaryen ile doğurdu. Doğum sonrası 3. günde, domuz yavrularına 10:9 veya 5 × 10:9 CFU/kg veya kontrol olarak salin içeren canlı S. epidermidis intra-arterial infüzyon verildi. Enfeksiyondan sonra, domuz yavruları 44 saat boyunca izlendi ve belirlenmiş zaman noktalarında uzunlamasına kan örneği alındı. Biorender.com ile oluşturulan figür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Erken doğumlu domuzlarda kan bakteriyel yükü, hayatta kalma ve kan gazı parametreleri, arter infuzyonu (CON) veya canlı S. epidermidis enfeksiyonu sonrası. (A) Enfeksiyondan 6, 24 ve 44 saat sonra toplanan kan örneklerinde S. epidermidis yoğunluğu. (B) Enfeksiyondan 44 saat sonra insani son noktaya veya planlı ötenazi süresini gösteren hayatta kalma eğrileri. (C–G) Enfeksiyondan sonraki 0, 6, 12, 24 ve 44 saat içinde arteriyal kan gazı parametreleri. Veriler ortalama SD ± (A), hayatta kalma eğrileri (B) veya median (düz çizgi) ve IQR (noktalı çizgiler) (C–G) dahil keman nokta grafikleri olarak sunulur. n = 9 her enfekte grup için; n = 3 enfekte olmamış kontrol için. Veriler, grup × zaman etkileşimlerini (A, C–G) içeren doğrusal karışık etkiler modeli veya Cox orantılı tehlike modeli (B) kullanılarak analiz edildi. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Kısaltmalar; CON = kontrol; pCO2 = CO2'nin kısmi basıncı; SE = S. epidermidis. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Erken doğan domuz yavrularında, tuzlu (CON) arteriyel infüzyon veya canlı S. epidermidis enfeksiyonu sonrası dolaşımdaki inflamatuar belirteçler. (A, B) Enfeksiyondan 6, 12, 24 ve 44 saat sonra dolaşımdaki nötrofil ve trombosit sayıları. (C) Enfeksiyondan sonra 6, 12, 24 ve 44 saat içinde TNF-α, IL-6 ve IL-10 plazma seviyeleri. Veriler, median (düz çizgi) ve IQR (noktalı çizgiler) (A–C) dahil olmak üzere keman nokta grafikleri olarak sunulur. n = 9 her enfekte grup için; n = 3 enfekte olmamış kontrol için. Veriler, grup × zaman etkileşimlerini (A–C) içeren doğrusal karışık etkiler modeli kullanılarak analiz edildi. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Kısaltmalar; CON = kontrol; IL = interleukin; SE = S. epidermidis; TNF = tümör nekroz faktörü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Erken doğan domuz yavrularında plazma biyokimyasal parametreleri, arterial salin (CON) infüzyonu veya canlı S. epidermidis enfeksiyonu (109 veya 5 × 109 CFU/kg). (A–G) Plazma albümin, kolesterol, ALP, ALAT, ASAT, kreatinin ve BUN seviyeleri, insani son noktada veya planlı ötenazi zamanında, enfeksiyondan 44 saat sonra. Veriler, tam aralığı (minimumdan maksimuma) (A–G) gösteren bıyık grafikleri olarak sunulur. Koyu mor renkte bireysel veri noktaları, sepsis geliştirmiş domuz yavrularını gösterir. n = 9 her enfekte grup için; n = 3 enfekte olmamış kontrol için. Veriler, çoklu doğrusal regresyon modeli (A–G) kullanılarak analiz edildi. *P < 0.05. Kısaltmalar; ALAT = alanin aminotransferaz; ALP = alkali fosfataz; ASAT = aspartat aminotransferaz; BUN = kan üre azotu; CON = kontrol; SE = S. epidermidis. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Toplam MiktarYoğunlaşma
Enerji7762kJ3525kJ/L
Makro besinler
Amino Asitler92g42g/L
Şişman66g30g/L
Glikoz221g100g/L
Mikrobesinler
Na64mmol29mmol/L
K48mmol22mmol/L
Mg8mmol4mmol/L
Ca4mmol2mmol/L
PO418mmol8mmol/L
SO48mmol4mmol/L
Cl93mmol42mmol/L
Asetat78mmol35mmol/L

Tablo 1: Değiştirilmiş toplam parenteral beslenmenin bileşimi. Parenteral beslenme çözeltisinde toplam enerji, makro besinler (amino asitler, yağ ve glikoz) ve mikrobesinler.

Ek Şekil 1: S. epidermidis WT-1457'nin büyüme kinetiği Bakteriler, 37 °C'de beyin kalp infüzyon çorbasında kültürlendi ve 180 rpm'de orbital sallanma yapıldı. Optik yoğunluk zamanla 600 nm olarak ölçüldü. Veriler logaritmik (A) ve doğrusal ölçekli (B) (n = 3 bağımsız deney) üzerinde gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Erken doğumlu domuz yavruklarında standart bir yenidoğan sepsis modeli, klinik olarak önemli yenidoğan olgunluk koşulları altında sistemik bakteriyel enfeksiyonu incelemek için tasarlandı. Model, gebelik yaşının kontrolü, resüsitasyon ve yoğun bakım desteği, enfeksiyonun zamanlaması ve uzunlamasına kan örneklemesini birleştirir. Bu yaklaşım, kemirgen ve in vitro deneysel sistemler ile enfekte yeni doğan bebeklerde karşılaşılan karmaşık fizyoloji arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlamaktadır. Önemli olarak, bu model cinsiyet, düşük doğum kilosu ve gebelik yaşı arasındaki bilinen ilişkiyi ve sepsis hassasiyeti ile insan erken doğumlubebeklerde gözlemlendiğini doğrulamak için kullanılmıştır (16,17,18).

Domuzlar, bağışıklık fonksiyonu ve fizyolojisi açısından insanlarla önemli benzerlikleri nedeniyle enfeksiyon araştırmaları için son derece önemli bir büyük hayvan modelidir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel bileşenleri, lökosit alt kümeleri, desen tanıma reseptör sinyalleri ve sitokin yanıtları gibi unsurlar, domuzlar ile insanlar arasında yakın bir ilişki gösterir. Yeni doğan domuzcuklar ile insanlar arasındaki temel immünolojik farklılıklar, adaptif bağışıklık yanıtlarında yatmaktadır. Domuz gebeliği sırasında immünoglobulin G (IgG) transplasental transferi olmadığından, yeni doğan domuz yavruları bu konuda saf olarakdoğurlar 19. Benzer şekilde, bebeklerin B hücreleri 3–6 aylıktan önce IgM'den IgG'ye izoform kayması geçirmezken, domuz B hücreleri doğumdan kısa bir süre sonra IgG yanıtlarıoluşturabilir.

Bu model sisteminde, bu farklılıklar, doğumdan kısa bir süre sonra, adaptif bağışıklık yanıtları oluşmadan önce enfeksiyon indükleyerek ve anne immünoglobulinlerinin plazma transfüzyonu yoluyla sağlanmasıyla azaltılır. Bu yaklaşım, erken doğumdan kaynaklanan kesintili transplasental IgG transferine maruz kalan çok erken doğulan bebeklere benzer dolaşımda IgG seviyeleriile sonuçlanır 17. Ayrıca, doğumda nispeten büyük vücut boyutu (~800 g) modeli yeni doğan farelere (~3 g) kıyasla daha da güçlendirir. Sonuç olarak, sıcaklık, nem ve oksijen gerilimi gibi çevresel etkiler, insan yenidoğan çocuklarının deneyimlediklerine daha çok benziyor. Bu ölçek ayrıca klinik kalitede ekipmanların, invaziv izlemenin ve damar erişimi, solunum desteği ve sürekli fizyolojik izleme gibi destekleyici bakım yöntemlerinin kullanılmasını sağlar; bunlar yenidoğan kemirgen modellerinde uygulanabilir değildir. Özellikle, preterm domuz modelinde parenteral beslenme gibi infüzyonlar için damarlardan erişim umbilikal arterial kateter ile sağlanır. Bu, klinik neonatolojide kullanılan standart intravenöz yoldan tezat oluştursa da, erken doğumlu domuzcukların anatomik kısıtlamaları nedeniyle gereklidir; burada göbek ven kateterleri nadiren ductus venosus'tan kendiliğinden geçer ve karaciğerparenkima 21 içindeki malpozisyon olur. Arteriyal içi doğum, göbek ven yanlış yerleşmesiyle ilişkili yüksek karaciğer nekrozu riski olmadan sürekli infüzyon için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Aynı şekilde, arterial kan numunesi alınarak kan gazı analizi yapılabilir.

Bu modelde sistemik enfeksiyon, neonatal yoğun bakım ünitelerinde geç başlangıçlı sepsisin başlıca nedeni olan canlı S. epidermidis'in intra-arterial infüzyonuyla indüksiyona sahiptir 1,2. Ancak, çeşitli patojenler seti yenidoğan sepsisine neden olur ve S. epidermidis gibi koagulaz negatif stafilokokların da E. coli 1,2 gibi daha az şiddetli enfeksiyonlara ve daha virülent patojenlere göre daha düşük sepsis riskine yol açtığı bilinmektedir. Model düşük virülanslı bir patojen kullansa da, gözlemlenen klinik bozulma, inflamatuar aktivasyon ve fizyolojik istikrarsızlık yenidoğan sepsisinin temel özelliklerini yansıtmaktadır. Bu çalışmadaki enfekte olmamış kontrol grubu (n = 3), aynı yoğun bakım koşullarında "sağlıklı" erken domuz yavrularının fizyolojik durumunu göstermek için bir temel referans olarak hizmet vermektedir. Bu bir tasarım dengesizliğine yol açsa da, bu karşılaştırmalar enfeksiyona konak yanıtını temsil etmek için tasarlanmıştır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, S. epidermidis dozlarının artmasıyla net bir doz-yanıt ilişkisi vardı ve bu,22 yaşamın 1. gününde enfekte edilen domuz yavrusu yavrularında önceki bulgularla tutarlıdır. Sadece en yüksek S. epidermidis dozunu alan domuz yavruları, ötenazi gerektiren insani son noktalara kadar bozuldu. Ancak, her iki enfekte grupta metabolik asidoz gelişirken, yüksek dozlu S. epidermidis grubunda yalnızca önemli bir solunum bileşeni (yüksek pCO₂) gözlemlendi. Benzer şekilde, her iki grup da enfeksiyondan 6 saat sonra belirgin nötropeni gösterdi, ardından 24 saatte nötrofil yenilenmesi gerçekleşti ki bu düşük dozlu grupta daha fazlaydı. Her iki grupta da trombositopeni bulundu; plazma sitokinlerinde ve organ hasarı belirteçlerinde artışlar vardı; en yüksek S. epidermidis dozunu alan domuz yavrularında daha belirgin yanıtlar görüldü.

Erken doğumlu domuz yavrularında, doğum sonrası 1. günde S. epidermidis enfeksiyonu, yenidoğan sepsisin paraklinik belirtilerini (metabolik asidoz, lökopeni, trombositopeni, iltihaplanma) ile birlikte utanıklık, koagulopati ve komplementtüketimini 17,22,23 tetikler. Enfeksiyon ayrıca enerji metabolizmasında sistemik bozulmalara yol açıyor; özellikle mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun azalması, plazma proteom ve metabolomda yeni doğunan sepsis hastalarında bildirilendeğişikliklere benzer değişiklikler 24,25,26. Ayrıca, erken domuz yavrusu (%90 gebelik), tamdönemde doğulan domuz yavrularına göre sepsis geliştirme olasılığı çok daha yüksektir. Besin bileşimi klinik ve immünolojik yanıtları da etkiler. Glikoz bazlı TPN, pro-inflamatuar bağışıklık yanıtlarını güçlendiren glikolitik metabolizmayı tetikler ve periferik dokularda hastalık toleransınızayıflatır 24,26. Bu yanıtların birleşimi, organ hasarı ve sepsisfenotipi 27'ye doğru ilerleme ile ilişkilidir. TPN bileşiminin modülasyonu, glikoz içeriğini azaltarak veya glikozun galaktoz, glükojenik amino asitler veya β-hidroksibutirat28,29 gibi alternatif makrobesinlerle değiştirilmesi, inflamatuar yanıtı azaltır ve hastalıklara karşı doku toleransını korur. TPN ile yüksek glukoz takviyesi de hiperglisemiye (≈10–20 mM) yol açar. Ancak, gözlemlenen glikolize bağlı inflamatuar yanıtların ne ölçüde doğrudan yükselen kan şekeri seviyeleriyle yönlendirildiği belirsizdir.

Deneysel gözlemler, enfeksiyonun doğum sonrası gününe bağlı olarak klinik yanıtlarda açık farklılıklar göstermektedir. Hem sepsis gelişimi riski hem de klinik semptomların şiddeti, enfeksiyon doğumdan kısa süre sonra indüklendiğinde en yüksektir. Doğum sonrası 3. günde enfeksiyon indüksiyonu, indüksiyondan sonraki ilk 24 saat boyunca hastalık davranışları, solunum ve metabolik asidoz ile daha hafif bir sepsis fenotipine yol açar, ardından organ yaralanmalarının belirteçleri yükselmiş olmasına rağmen klinik iyileşme devam eder. Erken ve geç indüksiyon arasındaki bu farkların altında yatan mekanizmalar şu anda bilinmemektedir ve devam eden bir araştırma alanını temsil etmektedir. Ancak, parenteral beslenmenin başlanmasından sonra glukoz homeostazı, erken doğurma yavrularında, erken doğuş yavrularında ilk üç gün boyunca iyileşir ve benzer glikoz alımına rağmen hiperglisemi azalır. Genel olarak, enfeksiyonun doğum sonrası gününü ve glukoz sağlama süresini değiştirmek, modelin hem akut, hem de hayati tehlike oluşturan sepsis veya daha hafif bir fenotipin özelliklerini yakalamasına olanak tanır. Bu düzenlemeler birlikte, belirli hastalık fenotiplerine uyarlanmış hedefli müdahalelerin test edilmesini mümkün kılar. Bu modelin klinik uygulanabilirliği, sepsis ile ilişkili yeni doğumlu puanlama sistemleriyle, örneğin neonatal Ardışık Organ Yetmezliği Değerlendirmesi (nSOFA) gibi yerleşik bir şekilde hizalanarak daha da güçlendirilebilir. Kardiyovasküler ve hematolojik puanlama için sürekli arteriyel kan basıncı ve anında trombosit sayılarının uygulanamazlığı nedeniyle mevcut çalışmada gerçek zamanlı nSOFA tabanlı puanlama sistemi uygulanmadı. Protokolün gelecekteki iyileştirmeleri, hastalık şiddetini daha iyi kategorize etmek için uyarlanmış bir nSOFA çerçevesini içerebilir.

Çeviri güçlerine rağmen, bu modelin birkaç önemli sınırlaması vardır. Bu deneyler kaynak yoğun olup, sezaryen doğumu, yenidoğan canlandırma, doğum sonrası barınma ve erken domuz yavrusu bakımı için özel tesisler ve yüksek eğitimli personel gerektirir. Enfeksiyon deneyleri, hayvan refahı ve güvenilir veri toplama sağlamak için iki ila üç deneyimli personel tarafından sürekli ve uygulamalı izleme gerektirir ve uzun vadeli takip maliyetleri artırır. Kemirgen modelleriyle karşılaştırıldığında, türe özgü reaktiflerin erişimi daha sınırlıdır, özellikle immünohistokimya ve akış sitometrisi için, ancak uygun doğrulamadan sonra birçok insan antikoru başarıyla kullanılabilir. Ayrıca, domuzların dışlanmış doğası, yavru içi ve arasında önemli biyolojik çeşitlilik yaratır ve enfeksiyon yanıtlarında mütevazı farklılıkları tespit etmek için daha büyük grup büyüklüklerini gerektirir. Bu değişkenlik deneysel karmaşıklığı artırsa da, aynı zamanda klinik yenidoğan popülasyonlarında gözlemlenen heterojenliği daha yakından yansıtır ve böylece modelin translasyonel önemini artırır. Sonuç olarak, bu doğrulanmış neonatal sepsis protokolü neonatolojide gelecekteki araştırmalar ve yeni önleyici ve terapötik müdahalelerin test edilmesi için faydalı bir araç olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kopenhag Üniversitesi Karşılaştırmalı Pediatri grubu personeli tarafından desteklenmiş ve Novo Nordisk Vakfı (NNF23OC0085457 ve NNF22OC0078747) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

Kaynaklar

  1. Shane, A. L., Sánchez, P. J., Stoll, B. J. Neonatal sepsis. The Lancet. 390 (10104), 1770-1780 (2017).
  2. Strunk, T., Molloy, E. J., Mishra, A., Bhutta, Z. A. Neonatal bacterial sepsis. The Lancet. 404 (10449), 277-293 (2024).
  3. Wynn, J. L., et al. Time for a neonatal-specific consensus definition for sepsis. Pediatric critical care medicine : a journal of the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. 15 (6), 523-528 (2014).
  4. Schlapbach, L. J., et al. International Consensus Criteria for Pediatric Sepsis and Septic Shock. JAMA. 331 (8), 665-674 (2024).
  5. Fleiss, N., Hooven, T. A., Polin, R. A. Can we back off using antibiotics in the NICU?. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 26 (3), 101217 (2021).
  6. Strunk, T., et al. Impaired Cytokine Responses to Live Staphylococcus epidermidis in Preterm Infants Precede Gram-positive, Late-onset Sepsis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 72 (2), 271-278 (2021).
  7. Collins, A., Weitkamp, J. H., Wynn, J. L. Why are preterm newborns at increased risk of infection?. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 103 (4), F391-F394 (2018).
  8. Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
  9. Bailey, M., Christoforidou, Z., Lewis, M. C. The evolutionary basis for differences between the immune systems of man, mouse, pig, and ruminants. Veterinary Immunology and Immunopathology. 152 (1-2), 13-19 (2013).
  10. Mair, K. H., et al. The porcine innate immune system: An update. Developmental & Comparative Immunology. 45 (2), 321-343 (2014).
  11. Ezquerra, A., et al. Porcine myelomonocytic markers and cell populations. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 284-298 (2009).
  12. Gerner, W., Käser, T., Saalmüller, A. Porcine T lymphocytes and NK cells – An update. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 310-320 (2009).
  13. Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
  14. Pabst, R. The pig as a model for immunology research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 287-304 (2020).
  15. Goldfarb, R. D., Dellinger, R. P., Parrillo, J. E. Porcine models of severe sepsis: emphasis on porcine peritonitis. Shock (Augusta, Ga). 24 Suppl 1 (SUPPL. 1), 75-81 (2005).
  16. Bæk, O., Ren, S., Brunse, A., Sangild, P. T., Nguyen, D. N. Impaired neonatal immunity and infection resistance following fetal growth restriction in preterm pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1808 (2020).
  17. Bæk, O., et al. Diet Modulates the High Sensitivity to Systemic Infection in Newborn Preterm Pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1019 (2020).
  18. Bæk, O., et al. Sex-Specific Survival, Growth, Immunity, and Organ Development in Preterm Pigs as Models for Immature Newborns. Frontiers in Pediatrics. 9, (2021).
  19. Porter, P. Transfer of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM to lacteal secretions in the parturient sow and their absorption by the neonatal piglet. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 181 (2), 381-392 (1969).
  20. Butler, J. E., et al. The piglet as a model for B-cell and immune system development. Veterinary immunology and immunopathology. 128 (1-3), 147-170 (2009).
  21. Sangild, P. T., et al. The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91, 4713-6359 (2013).
  22. Brunse, A., Worsøe, P., Pors, S. E., Skovgaard, K., Sangild, P. T. Oral Supplementation with Bovine Colostrum Prevents Septic Shock and Brain Barrier Disruption During Bloodstream Infection in Preterm Newborn Pigs. SHOCK. , 1 (2018).
  23. Krogh, A. K. H., Brunse, A., Thymann, T., Bochsen, L., Kristensen, A. T. Staphylococcus epidermidis sepsis induces hypercoagulability in preterm pigs. Research in veterinary science. 127, 122-129 (2019).
  24. Bæk, O., et al. Altered hepatic metabolism mediates sepsis preventive effects of reduced glucose supply in infected preterm newborns. eLife. 13, (2024).
  25. Wu, Z., et al. Regulation of host metabolism and defense strategies to survive neonatal infection. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1870 (8), (2024).
  26. Muk, T., Brunse, A., Henriksen, N. L., Aasmul-Olsen, K., Nguyen, D. N. Glucose supply and glycolysis inhibition shape the clinical fate of Staphylococcus epidermidis–infected preterm newborns. JCI Insight. 7 (11), (2022).
  27. Zhong, J., et al. Reduced parenteral glucose supply during neonatal infection attenuates neurological and renal pathology associated with modulation of innate and Th1 immunity. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1871 (4), (2025).
  28. Wu, Z., et al. Harnessing systemic glycolysis-TCA cycle axis to boost host defense against neonatal infection. EMBO Molecular Medicine. , (2026).
  29. Bæk, O., et al. Rethinking parenteral nutrition as supportive therapy for neonatal sepsis. Med. , (2026).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm noloji ve EnfeksiyonSay 233Say 233Bo De erSayenfeksiyonbakterihayvandomuzporsinneonatneonatolojibebek
Video yakında

İlgili makaleler