Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeşil Floresan Proteinle İşaretlenmiş Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinin Antikor Aracılı Makrofaj Fagositozunun Zaman Atımlı Görüntülenmesi

219 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, periferik kan mononükleer hücresi kaynaklı makrofajlar ve otomatik bir mikroskop kullanarak, yeşil floresan proteinle işaretlenmiş üçlü negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görüntülemek için kullanılan bir zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Antikor bağımlı hücresel fagositoz, makrofajların antikorla opsonize edilmiş kanser hücrelerini yuttuğu temel bir mekanizmadır. Bu protokol, yeşil floresan protein ile işaretlenmiş, CD24 eksprese eden triple negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için bir zaman ayarlı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır. Makrofajlar, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilmiş, makrofaj koloni uyarıcı faktör ile diferansiye edilmiş ve pro-inflamatuar bir fenotip oluşturmak için interferon gama ve lipopolisakkarit kullanılarak polarize edilmiştir. Kanser hücreleri, belirlenmiş bir efektör-hedef oranında makrofajlarla birlikte kültüre edilmeden önce bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositoz olayları, fizyolojik koşulları korumak için çevresel kontrol sistemine sahip otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 h süresince kaydedilir. Görüntüleme, kanser hücrelerinin tanımlanmasına ve makrofajlar tarafından içselleştirilmelerinin izlenmesine olanak tanıyan parlak alan ve floresan kanalları kullanılarak gerçekleştirilir. Temsili zaman ayarlı görüntüler, floresan kanser hücrelerinin zamanla kademeli olarak yutulduğunu göstermektedir. Kantitatif değerlendirmeyi mümkün kılmak için, aynı ko-kültür koşulları altında paralel bir uç nokta deneyi gerçekleştirilir; burada, fagositoz olaylarının doğru ölçümüne izin vermek için görüntülemeden önce içselleştirilmemiş kanser hücreleri uzaklaştırılır. Bu yöntem, in vitro ortamda antikor kaynaklı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Önemli bir nokta olarak, zaman ayarlı görüntülemenin uç nokta tabanlı kantifikasyon ile entegrasyonu, fagositozun kinetiğinin ve büyüklüğünün tamamlayıcı değerlendirmesine olanak tanır. Bu protokol, kontrollü bir in vitro ortamda terapötik antikorların ve makrofaj hedefli kanser immünoterapilerinin değerlendirilmesini desteklemektedir.

Giriş

Meme kanseri, dünya genelinde kadınlar arasında en sık teşhis edilen malignite olup, yıllık yaklaşık 2,3 milyon yeni vakadan sorumludur1. Hastalık klinik olarak heterojendir ve hormon reseptörlerinin —östrojen reseptörü (ER) ve progesteron reseptörü (PR)— durumuna ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) onkogeninin ekspresyonuna bağlı olarak en az dört ana moleküler alt tipe ayrılır2. Luminal A tümörleri, HER2 aşırı ekspresyonu olmaksızın ER ve/veya PR eksprese eder (ER/PR+ ve HER2−); luminal B tümörleri, ER/PR ve HER2'yi birlikte eksprese eder (ER/PR+ ve HER2+); HER2+ tümörleri, hormon reseptör durumundan bağımsız olarak yüksek HER2 ekspresyonu ile karakterizedir; ve triple-negatif meme kanseri (TNBC), üç belirtecin de ekspresyonundan yoksundur (ER−, PR− ve HER2−)2,3. Bu alt tipler arasında TNBC, klinik olarak en zorlayıcı formu temsil eder ve tüm meme kanserlerinin yaklaşık %15-20'sini oluşturur. Konvansiyonel kemoterapiye verilen zayıf yanıtlar ve etkili hedefli tedavilerin yokluğu nedeniyle, TNBC'li hastalar, en kötü prognoza ve en kısa 5 yıllık genel sağkalıma sahip olarak en agresif hastalık seyri sergilerler3,4. Ayrıca TNBC, özellikle tanıdan sonraki 5 yıl içinde akciğerlere doğru belirgin derecede yüksek bir visseral metastaz eğilimi gösterir ve ileri evre veya metastatik TNBC (mTNBC) hastalarının medyan sağkalım süresi nadiren 2 yılı aşar5,6. Bu istatistikler, TNBC için yeni terapötik stratejilere yönelik kritik ve karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir.

Tümör mikroçevresi (TME), meme kanserinin ilerlemesinde ve bağışıklık sisteminden kaçışta merkezi bir rol oynar. Tümörle ilişkili makrofajlar, TME içindeki en bol bulunan bağışıklık hücreleri arasında yer alır ve son zamanlarda doğal anti-tümör bağışıklığının kritik mediyatörleri olarak kabul edilmiştir7,8,9. TAM'lar tarihsel olarak pro-inflamatuar “M1” ve pro-tümöral “M2” durumlarına ayrılmış olsa da, bu ikili model makrofaj heterojenliğinin gerçek kapsamını yakalamakta yetersiz kalmaktadır. Bunun yerine TAM'lar, TME içindeki çeşitli biyokimyasal sinyallere yanıt olarak gelişen dinamik bir fonksiyonel spektrumu doldururlar. Bu karmaşık ortamda kanser hücreleri, özellikle “beni yeme” sinyallerinin aşırı ekspresyonu gibi çeşitli bağışıklık kaçış stratejileri aracılığıyla makrofaj aktivitesini aktif olarak sabote ederler. CD47/SIRPα aksı, bu bağlamda tanımlanan ilk doğal bağışıklık kontrol noktasıydı6,10 ve daha yakın zamanda CD24, yeni ve güçlü bir antifagositik sinyal olarak ortaya çıkmıştır11,12. CD24, bir glikozilfosfatidilinositol bağı aracılığıyla hücre membranına ankrajlanmış, küçük ve yoğun glikozile edilmiş müsin tipi bir glikoproteindir13. Fizyolojik koşullar altında çeşitli bağışıklık hücresi soyçullarında eksprese edilir, ancak meme, yumurtalık, pankreas ve kolorektal kanserler dahil olmak üzere solid tümörlerde sıklıkla aşırı eksprese edilir14. Tümör hücreleri üzerindeki CD24, makrofajlarda eksprese edilen inhibitör reseptör siyalik asit bağlayan immünoglobulin benzeri lektin 10 (Siglec-10) ile etkileşime girer. Bu etkileşim, Siglec-10'un sitoplazmik kuyruğundaki immünoreseptör tirozin bazlı inhibitör motif bölgelerinin fosforilasyonunu tetikleyerek, aşağı akış fagozitik sinyalini baskılayan SHP-1 ve SHP-2 fosfatazlarını aktive eder11. CD24/Siglec-10 etkileşiminin monoklonal antikorla blokajının, CD24 eksprese eden insan tümörlerinin makrofajlar tarafından fagozitosunu güçlü bir şekilde artırdığı gösterilmiştir. Yakın zamanda yaptığımız çalışma, meme kanseri hücrelerinde CD24a'nın nakavt edilmesinin, bir murine triple-negatif meme kanseri modelinde bu hücrelerin makrofaj fagozitosuna karşı duyarlılığını artırdığını da göstermiştir9.

Antikor bağımlı hücresel fagositoz (ADCP), antikorların makrofajları tümör hücrelerini fagosite etmeleri için yönlendirdiği temel bir mekanizmadır15,16. Tümörde eksprese edilen antijenlere bağlandığında, antikorun Fc bölgesi makrofajlar üzerindeki Fcγ reseptörlerini (FcγRs) etkileyerek, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, fagositik çukur oluşumu ve hedef hücrenin yutulması ile sonuçlanan hücre içi sinyal yolaklarını tetikler17.

Bu çalışmada, meme kanseri hücrelerinin antikor güdümlü makrofaj fagositozunu ölçmek için bir time-lapse canlı hücre görüntüleme protokolü geliştirdik ve valide ettik. Yöntem, sağlıklı insan donörlerden elde edilen, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile farklılaştırılan ve ardından lipopolisakkarit (LPS) ve interferon gama (IFN-γ) ile stimüle edilen periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) kaynaklı makrofajları kullanmaktadır. Akış sitometrisi analizi, stimülasyon sonrası CD11b⁺ popülasyonu içinde CD80'in yukarı regüle olduğunu onaylayarak (Şekil 1) klasik olarak aktive edilmiş fenotipi desteklemiştir. Bu aktivasyon durumu, güçlü bir antikor aracılı fagositik kapasite sağlar ve yöntemi antikor bağımlı hücresel fagositozu (ADCP) değerlendirmek için uygun hale getirir. GFP etiketli CD24-pozitif meme kanseri hücreleri hedef hücreler olarak görev yapar ve ko-kültür öncesinde terapötik bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositik olaylar, kontrollü çevresel koşullar altında otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 saatlik bir süre boyunca kaydedilir. Dinamik görselleştirmeyle paralel olarak kantitatif değerlendirmeye olanak sağlamak için, özdeş ko-kültür koşulları altında ayrı bir uç nokta (endpoint) analizi gerçekleştirilir; bu da internalize olmamış hedef hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından fagositozun titizlikle ölçülmesine imkan tanır. Bu protokol, bir anti-CD24 antikoru tarafından aracılan ADCP'yi değerlendirmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve görsel olarak bilgilendirici bir platform sunmaktadır. Önemli bir nokta olarak, time-lapse görüntülemenin tamamlayıcı bir uç nokta bazlı kantifikasyon stratejisiyle entegrasyonu, fagositik kinetiğin ve büyüklüğün eş zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Yöntem, diğer makrofaj yönelimli immünoterapötik hedeflerin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol, kanser hücrelerindeki yüzey antijenlerine karşı terapötik monoklonal antikorlar tarafından aracılan ADCP'nin değerlendirilmesi için en uygundur. Aday antikorların karşılaştırmalı taraması, doz-yanıt karakterizasyonu ve "beni yeme" sinyal blokajının (örneğin, CD47–SIRPα) etkileri dahil olmak üzere Fc–FcγR etkileşiminin mekanistik çalışmaları için oldukça uygundur. Analiz primer insan makrofajlarını kullandığından, klinik geliştirme öncesinde donörler arası değişkenliğin değerlendirilmesini gerektiren translasyonel çalışmalar için de uygundur.

figure-introduction-1
Şekil 1. Periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilen IFN-γ/LPS stimüle edilmiş makrofajların üretimi ve akış sitometrisi doğrulaması. Üst panel: Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), tüm reaktifler 20°C ± 2°C'ye önceden dengelenmiş şekilde, Ficoll solüsyonu kullanılarak 20°C'de 30 dk boyunca 400 × g'de yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile sağlıklı donörlerden izole edilir. İzole edilen PBMC'ler, makrofaj diferansiyasyonunu sağlamak için 100 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmiş ImmunoCult-SF besiyerinde 7 gün boyunca kültüre edilir (Gün 0–7) ve 5. Günde besiyeri takviyesi yapılır. 8. Günde, diferansiye olmuş makrofajlar 100 ng/mL IFN-γ ve 1 µg/mL LPS ile 48 saat boyunca stimüle edilir (Gün 8–10). Ardından hücreler akış sitometrisi analizine tabi tutulur. Alt panel: Makrofajların akış sitometrisi analizi. Hücreler, CD11b-FITC, CD80-PE ve CD206-PerCP-Cy5.5'ten oluşan bir yüzey paneli ile boyanmış, ardından ölü hücrelerin dışlanması için veri toplama öncesinde DAPI eklenmiştir. Gating stratejisi: Hücreler önce canlı hücreler (DAPI⁻) üzerinden seçilmiş, ardından makrofaj kimliğini doğrulamak için CD11b-FITC'ye karşı FSC-A grafiğinde CD11b⁺ tanımı yapılmıştır. Canlı CD11b⁺ olaylar daha sonra, IFN-γ/LPS stimülasyonu tarafından indüklenen CD80⁺CD206⁻ popülasyonunu doğrulamak için CD80'e karşı CD206 nokta grafiğinde analiz edilmiştir. Sağ: Gated hücrelerin %99,8'inin CD11b⁺ olduğunu gösteren ve makrofaj kimliğini doğrulayan CD11b-FITC'ye karşı FSC-A temsili nokta grafiği. Sol: CD11b⁺ hücrelerin çoğunluğu CD80⁺CD206⁻ kapısı (Q1: %95,2) içinde yer almış olup, bu durum uygulanan stimülasyon koşulları altında beklenen pro-enflamatuar fenotipi göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kullanıcılar, bu tekniği uygularken birkaç kısıtlamayı göz önünde bulundurmalıdır. İlk olarak, PBMC kaynaklı makrofajlardaki donör değişkenliği, fagositoz çıktısında önemli sapmalara yol açabilir; bu nedenle, birleştirilmiş sonuçların yanında bireysel donör verilerinin de raporlandığı çoklu donör (n ≥ 3) kullanımı önerilir. İkinci olarak, 2D ko-kültür formatı tümör mikroçevresini tam olarak yansıtmaz ve bulgular, klinik çıkarımlar yapılmadan önce 3D veya in vivo modellerde doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, 16 saatlik görüntüleme penceresi erken fagositoz olaylarını yakalar ancak antijen sunumu veya sekonder immün aktivasyon gibi daha uzun süreli süreçleri yansıtmaz. Dolayısıyla, gerçek zamanlı görüntüleme ve uç nokta kantifikasyonunun birlikte kullanımı, ADCP ölçümlerinin hem yorumlanabilirliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran tamamlayıcı bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, sağlıklı donörlerden alınan kan örneklerinden türetilen primer makrofajların kullanımını içermektedir. Örneklerin toplanması ve işlenmesi, China Medical University Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. PBMC Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

NOT: İnsan kanı içeren tüm prosedürleri kurumsal IRB onayı (örneğin, CMUH IRB) altında gerçekleştirin. Kan toplama işleminden önce sağlıklı donörlerden bilgilendirilmiş onam alın.

DİKKAT: Tüm insan kan ürünlerini, evrensel önlemler kullanarak Biyogüvenlik Düzeyi 2 koşulları altında işleyin.

  1. Kan toplama
    1. Sağlıklı bir donörden alınan tam kan, 10 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı vacutainer tüplerine toplanır.
  2. Kan dilüsyonu
    1. Tam kan, buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-içermeyen) ile 1:1 oranında dilüe edilir (ör. 10 mL kan + 10 mL PBS).
    2. Üç ila beş kez alt-üst ederek karıştırılır.
      NOT: PBS, kullanımdan önce buz üzerinde tutun. Soğuk sıcaklık, işlem sırasında hücre canlılığının korunmasına yardımcı olur.
  3. Yoğunluk gradyanı katmanlandırması
    1. Dilüe edilmiş kan, konik bir tüpte 2:1 hacim oranında (v/v) dikkatlice Ficoll–Paque PLUS üzerine katmanlandırılır (ör. 15 mL'lik tüpte 4 mL Ficoll üzerine 8 mL kan veya 50 mL'lik tüpte 15 mL üzerine 30 mL).
    2. Katmanlandırma öncesinde hem dilüe edilmiş kan hem de Ficoll–Paque PLUS 20°C ± 2°C'ye kadar dengelenir.
    3. Ficoll–Paque PLUS, kullanımdan en az 30 dk önce 4°C'lik depolama alanından çıkarılır veya 20°C ± 2°C'lik bir su banyosunda kısa süre ısıtılır.
    4. Soğuk reaktifler kullanılmamalıdır; çünkü Ficoll yoğunluğu 20°C ± 2°C için kalibre edilmiştir ve sapmalar ayırma verimliliğini ve PBMC verimini olumsuz etkiler.
      NOT: Keskin bir ara yüz oluşturmak için tüp 45° açıyla eğilir ve kan, tüp duvarı boyunca yavaşça pipetlenir. Ficoll katmanı rahatsız edilmemelidir.
  4. Santrifüjleme
    1. Fren kapatılmış halde, 20°C'de 30 dk boyunca 400 × g'de santrifüjlenir (Şekil 1).
      NOT: Frenleme, yoğunluk gradyanını bozacak ve PBMC verimini azaltacaktır.
  5. PBMC toplama
    1. Bir serolojik pipet kullanılarak, üzerindeki plazma veya altındaki Ficoll katmanını rahatsız etmeden, yalnızca buffy coat katmanı (plazma ve Ficoll katmanları arasındaki beyazımsı ara yüz) dikkatlice aspire edilir.
    2. Toplanan katman yeni bir 50 mL'lik konik tüpe aktarılır.
  6. PBMC yıkama
    1. 50 mL'lik konik tüpte toplam hacmi 25 mL'ye getirmek için PBS eklenir.
    2. Uygun santrifüjleme ve dengeleme sağlamak için 50 mL'lik tüp kullanılır.
    3. 10 dk boyunca 300 × g'de santrifüjlenir.
  7. RBC lizizi
    1. Süpernatan atılır.
    2. Pellet, pellet tamamen dağılana ve görünür topak kalmayana kadar bir serolojik pipetle nazikçe aşağı yukarı pipetlenerek 5 mL kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu içinde yeniden süspande edilir.
    3. Oda sıcaklığında 5 dk inkübe edilir.
      UYARI: Homojen liziz sağlamak için tam dağılım gereklidir; ancak PBMC'lere zarar verebilecek şiddetli pipetlemeden veya vortekslemeden kaçınılmalıdır. RBC liziz tamponu ile inkübasyon süresi 5 dk'yı geçmemelidir, çünkü uzun süreli maruziyet PBMC canlılığını bozabilir.
  8. PBMC çöktürme
    1. PBMC'leri çöktürmek ve lize olmuş RBC döküntülerini uzaklaştırmak için 5 dk boyunca 500 × g'de santrifüjlenir.
  9. Final resüspansiyon
    1. Süpernatan atılır.
    2. Pellet, 5 mL ImmunoCult-SF makrofaj besiyerinde yeniden süspande edilir.
      NOT: Standart koşullar altında, 10 mL tam kan tipik olarak 1,5–2,0 × 107 PBMC verir.

2. Makrofaj Diferansiyasyonu (0–7. Günler)

NOT: Monositlerden türetilen farklılaşmış makrofajları adezyon yoluyla seçmek için doku kültürü (TC) işlemine tabi tutulmamış Petri kapları kullanın. Yapışmayan lenfositler, sonraki kültürleme aşamaları sırasında yıkanarak uzaklaştırılacaktır.

  1. Gün 0: Hücre ekimi
    1. Hücre sayımı yapın ve 1 × 107 PBMC'yi TC işlem görmemiş 10 cm'lik bir Petri kabına ekin.
    2. Toplam hacmi, 100 ng/mL M-CSF ile desteklenmiş ImmunoCult-SF makrofaj besiyeri kullanarak 10 mL'ye tamamlayın (M-CSF stoğu, kullanımdan hemen önce doğrudan tam besiyerine eklenerek ve nazikçe ters çevirerek karıştırılarak hazırlanır).
      NOT: Protokol, 1 × 106 hücre/mL başlangıç ekim yoğunluğu temel alınarak, donör PBMC verimindeki varyasyonlara uyum sağlamak için orantılı olarak ölçeklendirilebilir.
  2. İnkübasyon ve izleme
    1. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de ve %5 CO₂ altında inkübe edin.
    2. Yüzen monosit kümelerinin oluşumunu ve adherent hücrelerin görünümünü günlük olarak izleyin.
      NOT: Diferansiyasyon ilerledikçe monositler kademeli olarak boyut artıracak ve kümeler oluşturacaktır. Bazı monositler plağa tutunmaya başlayacaktır. Bu aşamada herhangi bir müdahale gerekmemektedir.
  3. Gün 5: Besiyeri takviyesi
    1. Adherent makrofajları rahatsız etmemeye dikkat ederek, kaba 100 ng/mL M-CSF ile desteklenmiş 5 mL taze ImmunoCult-SF makrofaj besiyeri nazikçe ekleyin.
    2. Kültürü 2 gün daha (7. Güne kadar) sürdürün.
      UYARI: Mekanik bozulma diferansiyasyon verimliliğini ve hücre verimini etkileyebileceğinden, adherent makrofajları rahatsız etmemek için taze besiyerini kabın kenarından nazikçe ekleyin.
      NOT: Makrofaj diferansiyasyonunu destekleyen otokrin/parakrin faktörleri korumak için besiyerini tamamen değiştirmekten kaçının.
  4. Gün 7: Morfolojik değerlendirme
    1. Makrofaj diferansiyasyon verimliliğini ters mikroskop altında inceleyin.
    2. Adherent hücreler karakteristik makrofaj morfolojisi sergiler: büyük, yassı, düzensiz şekilli ve görünür pseudopodlara sahip hücreler.
    3. 7. Günde, iyi diferansiye olmuş makrofajlar görünür olmalıdır.
      UYARI: 7. gündeki morfolojik değerlendirme, sonraki akış sitometrisi doğrulaması için kritik bir ön koşuldur. İyi diferansiye olmuş makrofajlar mikroskop altında net bir şekilde görülmeli ve makrofaj morfolojisine sahip adherent hücrelerin oranının yüksek olması daha yüksek diferansiyasyon verimliliğini yansıtır (karakteristik morfolojiye sahip adherent makrofajların yaklaşık %70 konflüensi, başarılı diferansiyasyonun göstergesi kabul edilir). Seyrek tutunma, ağırlıklı olarak yuvarlak hücreler veya yetersiz morfolojik diferansiyasyon gösteren kültürlerin güvenilir akış sitometrisi sonuçları vermesi olası değildir ve bu kültürlerle stimülasyon ile boyama aşamasına geçilmemelidir.

3. Makrofaj Polarizasyonu (8–10. Günler)

  1. Kondisyonlu ortamın toplanması ve berraklaştırılması
    1. 8. Günde, yapışık makrofajları rahatsız etmeden kültür kabındaki 15 mL ortamı dikkatlice aspire edin ve steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    2. Hücre döküntülerini çöktürmek için toplanan ortamı 400 × g'de 5 dk santrifüjleyin.
    3. Berraklaştırılmış süpernatantı bir sonraki adım için saklayın.
  2. İnterferon gama (IFN-γ) ve lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonu
    1. Berraklaştırılmış 15 mL süpernatantı yeni bir steril tüpe aktarın ve 100 ng/mL IFN-γ ve 1 µg/mL LPS ile takviye edin.
    2. Hava kabarcığı oluşturmadan sitokinlerin homojen dağılımını sağlamak için pipetle nazikçe yukarı aşağı (5-10 kez) karıştırın.
    3. Sitokinle takviye edilmiş 15 mL ortamın tamamını, yapışık makrofajları rahatsız etmemek için iç duvar boyunca nazikçe pipetleyerek orijinal kültür kabına geri ekleyin.
    4. 37°C'de %5 CO₂ ile 48 saat boyunca inkübe edin (8. Gün'den 10. Gün'e kadar).
      NOT: Autokrin/parakrin faktörleri korumak için kondisyonlu (eski) ortam kullanın. IFN-γ ve LPS kombinasyonu, makrofajları pro-inflamatuar bir fenotipe polarize etmek için kullanılır. Bu protokolde kullanılan IFN-γ (100 ng/mL) ve LPS (1 µg/mL) stimülasyon koşulları altında makrofajlar, aktive olmuş pro-inflamatuar bir durumla uyumlu uzamış lamellipodia'lar ile CD11b ve CD80 ekspresyonu dahil olmak üzere karakteristik morfolojik değişiklikler gösterirler.
      UYARI: LPS, maruz kalındığında inflamatuar tepkilere neden olabilen biyoaktif bir endotoksin olduğundan, uygun laboratuvar güvenlik prosedürleri ile işlemi gerçekleştirin.

4. IFN-γ ve LPS ile Stimüle Edilmiş Makrofajların İnflamatuar Fenotip Markerlarının Akış Sitometrisi ile Doğrulanması

  1. Hücre hasadı
    1. Fenotipleme için 10. Gündeki polarize makrofajların bir kısmını hasat edin.
    2. PBS içinde 10 mM EDTA ekleyin ve 37°C'de 10–15 dk inkübe edin.
    3. Hücreleri nazikçe pipetleyerek ayırın.
      NOT: Hücreler yapışık kalmaya devam ederse EDTA inkübasyonunu 37°C'de 30 dk daha uzatın, ardından nazik pipetleme işlemini tekrarlayın. Hücre canlılığını ve yüzey belirteç bütünlüğünü korumak için şiddetli pipetlemeden veya mekanik kazımadan kaçının.
  2. Antikor boyama kurulumu
    1. Hücreleri CD11b (pan-makrofaj soy hattı belirteci), CD80 (inflamatuar belirteç) ve CD206'ya (inflamatuar fenotip tanımlaması için negatif dışlama belirteci olarak kullanılan anti-inflamatuar belirteç) karşı florokrom konjuge antikorlarla boyayın.
  3. Boyama prosedürü
    1. Ayırılan 5 × 105 makrofajı, 100 µL soğuk PBS içeren bir akış sitometrisi tüpüne aktarın.
    2. CD11b-FITC, CD80-PE ve CD206-PerCP-Cy5.5 antikorlarını her biri 1 µg/mL final konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin.
    3. Hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyerek karıştırın.
    4. Numuneleri ışıktan koruyarak buz üzerinde 1 sa boyunca inkübe edin.
    5. Numuneleri 4°C'de 1 dk boyunca 300 × g'de santrifüj edin.
    6. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    7. Hücre peletini yıkamak için 0.5 mL soğuk PBS ekleyin.
    8. Numuneleri 4°C'de 1 dk boyunca 300 × g'de santrifüj edin.
    9. Süpernatantı dökün.
    10. Hücre peletini 200 µL soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.
    11. 1 µg/mL final konsantrasyona ulaşacak şekilde DAPI ekleyin.
      NOT: Uygun izotip kontrollerini ve bir canlılık boyasını (örneğin DAPI veya Viobility 405/452 Fixable Dye) dahil edin.
  4. Akış sitometrisi analizi
    1. Boyanmış numuneleri bir akış sitometrisi kullanarak analiz edin.
    2. Makrofaj popülasyonunda CD11b ve CD80 ekspresyonunu onaylayın.
    3. Fagositoz analizine ancak inflamatuar fenotip ile uyumlu belirteç ekspresyonu onaylandıktan sonra geçin.
  5. Akış sitometrisi veri toplama ve kurulumu
    1. Cihaz kurulumu
      1. Akış sitometresini şu kanalları kullanarak konfigüre edin: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) ve PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Veri toplama parametresini, tanımlanan ana kapı (parent gate) içinde numune başına 10.000 olay toplayacak şekilde ayarlayın.
    2. Eşik ve kazanç (gain) kalibrasyonu
      1. X-ekseninde FSC ve Y-ekseninde bir florofor kanalı gösteren dört nokta grafiği (dot plot) açın.
      2. Her bir florofora uygun izotip kontrol antikorları ile boyanmış hücreler hazırlayın.
      3. İzotip kontrol numunelerini analiz edin.
      4. Her kanal için kazancı, izotip kontrol popülasyonunu logaritmik ölçekte 101 değerinin altına konumlandıracak şekilde ayarlayın.
      5. Arka plan sinyal seviyelerini tanımlamak için bu eşiği kullanın.
        NOT: Arka plan ile spesifik sinyal arasında güvenilir bir ayrım oluşturmak için 101 ile 101·5 arası bir logaritmik ölçek aralığı kullanın.
    3. Kompansasyon
      1. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne bir damla kompansasyon boncuğu ekleyin.
      2. Karşılık gelen florokrom konjuge antikoru 1 µg/mL final konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin.
      3. Işıktan koruyarak buz üzerinde 30 dk inkübe edin.
      4. 1 dk boyunca 400 × g'de santrifüj edin.
      5. Süpernatantı dökün.
      6. Boncukları 200 µL soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.
      7. Tek renkli kontrolleri analiz edin.
      8. Florofor taşımasını (spillover) düzeltmek için spektral kompansasyon uygulayın.
    4. Kapılama (Gating) stratejisi
      1. Canlı hücre seçimi
        1. Y-ekseninde Pacific Blue/V450 (DAPI) ve X-ekseninde FSC görüntüleyin.
        2. Canlı hücreleri seçmek için DAPI-negatif olayları (101 altı) kapılayın.
      2. Makrofaj tanımlama
        1. Canlı hücre popülasyonunu ana kapı olarak ayarlayın.
        2. Y-ekseninde FITC (CD11b) ve X-ekseninde FSC görüntüleyin.
        3. CD11b⁺ olayları (101 üzeri) kapılayın.
      3. İnflamatuar fenotip tanımlama
        1. CD11b⁺ popülasyonunu ana kapı olarak ayarlayın.
        2. Y-ekseninde PE (CD80) ve X-ekseninde PerCP-Cy5.5 (CD206) görüntüleyin.
        3. Her iki eksende 101.5 değerinde kuadrant kapılama uygulayın.
        4. Sol üst kuadrandaki (Q1) CD80⁺CD206⁻ hücreleri tanımlayın.
  6. Kabul kriterleri
    1. CD11b⁺ ana kapısı içindeki hücrelerin ≥%90'ının CD80⁺CD206⁻ olduğunu doğrulayın.
    2. Fagositoz analizine ancak bu eşik değere ulaşıldığında geçin.
    3. Numuneler bu kriteri karşılamazsa PBMC izolasyonunu, M-CSF diferansiyasyonunu ve IFN-γ/LPS stimülasyonunu tekrarlayın.

5. Antikor Bağımlı Fagositoz Analizi

NOT: Deney kurulumundan önce kanser hücrelerindeki stabil GFP ekspresyonunu doğrulayın. Deney öncesinde hedef hücrelerdeki CD24 ekspresyonunu konfirme edin. Optimal performans için %50–100 oranında CD24 pozitifliği gösteren kanser hücreleri kullanın. Bu protokolde kullanılan MDA-MB-468 hücreleri %100 CD24 pozitifliği sergilemektedir.

  1. Makrofaj ekimi
    1. Adım 4'te doğrulandığı üzere, IFN-γ ve LPS ile stimüle edilmiş makrofajları 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağına kuyucuk başına 2 × 105 hücre olacak şekilde ekin.
    2. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için plağı 37°C'de, statik koşullarda ve %5 CO₂ altında 12–16 saat inkübe edin (Şekil 2A).
      NOT: Devam etmeden önce makrofajların sıkıca yapıştığından emin olun. Kötü yapışmış makrofajlar görüntüleme sırasında ayrılabilir ve sonuçları yanıltabilir.
  2. Kanser hücrelerinin hazırlanması
    1. CD24-pozitif GFP-etiketli meme kanseri hücrelerini (MDA-MB-468) %70–%80 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.
    2. Kültür ortamını aspire edin.
    3. Hücre monokatmanını bir kez PBS ile yıkayın.
  3. Kanser hücrelerinin ayrılması
    1. Kültür kabına PBS içinde 10 mM EDTA ekleyin.
    2. Hücreleri 37°C'de 5–10 dakika inkübe edin.
    3. Hücrelerin tamamen salınmasını sağlamak için nazik pipetleme ile hücreleri ayırın.
      NOT: Hücre ayırma işlemi için tripsin kullanmaktan kaçının. Enzimatik sindirim, CD24'ü hücre yüzeyinden koparabilir ve antikor bağlanmasını bozabilir.
  4. Kanser hücrelerinin toplanması ve sayılması
    1. Ayrılan hücreleri bir santrifüj tüpüne toplayın.
    2. Hücreleri 300 × g'de 5 dakika santrifüj edin.
    3. Süpernatantı uzaklaştırın.
    4. Hücre peletini komple RPMI ortamında yeniden süspande edin.
    5. Canlı hücreleri sayın.
  5. Kanser hücrelerinin antikor ile opsonizasyonu
    1. Kanser hücrelerini 0,5 mL komple RPMI ortamında 2 × 105 hücre/mL yoğunlukta yeniden süspande edin.
    2. Anti-CD24 monoklonal antikoru 1 µg/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin.
    3. Antikora homojen dağılım sağlamak için hücre süspansiyonunu nazik pipetleme ile karıştırın.
    4. Hücreleri 37°C'de statik koşullar altında 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Antikora bağımlı fagositoz için negatif kontrol olarak, aynı konsantrasyonda izotip-eşleşmiş bir IgG kontrolü ekleyin.
  6. Ko-kültür hazırlığı
    1. Opsonizasyondan sonra hücreleri yıkamayın.
    2. Hücre yüzeyindeki antikor kaplamasını korumak için doğrudan ko-kültüre geçin.
  7. Ko-kültür kurulumu
    1. Makrofaj içeren her bir kuyucuğa 1 × 105 antikor-opsonize GFP-etiketli meme kanseri hücresi ekleyin.
    2. 2:1 efektör-hedef oranını koruyun.
      NOT: Efektör-hedef oranını deneysel tasarıma göre ayarlayın. Hücre-hücre temas sıklığını artırmak ve fagositik olayların tespitini geliştirmek için belirtilen 2:1 oranından daha yüksek makrofaj-kanser hücresi oranları (örneğin 3:1 veya 5:1) kullanın.

figure-protocol-1
Şekil 2Antikor bağımlı hücresel fagositozun zaman serili görüntülemesi. (A) Ko-kültür sisteminin ve zaman ayarlı görüntüleme düzeneğinin şematik genel görünümü. Görüntüleme parametreleri, 10x objektif kullanılarak, toplam 16 saatlik (97 kare) bir kazanım süresi boyunca 10 dakikalık aralıkları içermekteydi.× faz kontrast ve GFP kanallarına sahip objektif. (B) 1. saatten 16. saate kadar olan, makrofajların GFP-pozitif kanser hücrelerini zaman içinde içselleştirmesiyle karakterize edilen fagositoz olaylarını gösteren temsili zaman serisi görüntüleri. Sarı kesikli daireler temsili fagositoz olaylarını vurgulamaktadır. Faz kontrast kanalında, yutulmuş kanser hücreleri makrofaj sitoplazması içinde faz-parlak hücre içi yapılar olarak görünmektedir (beyaz oklar). GFP kanalında, makrofajlar içinde lokalize olan floresans, içselleştirmeyi doğrulamaktadır. (C) 0, 1, 4 ve 16. saatlerdeki temsili fagositoz olaylarının büyütülmüş görünümleri; makrofaj aracılı GFP etiketli kanser hücrelerinin yutulmasının ardışık sürecini göstermektedir. Görüntü dizisi, makrofaj aracılı fagositoz olaylarının net şekilde görselleştirilmesine dayanarak temsili olarak seçilmiştir. Beyaz oklar, hedef hücrelerle etkileşime giren ve onları içselleştiren makrofajları belirtmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Zaman Atlamalı Görüntüleme (Otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi)

NOT: Deneyden önce Lionheart otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi ve Gen5 otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımını kullanarak görüntüleme protokolünü yapılandırın. Doğru kurulum, optimal performans ve güvenli kullanım sağlamak için görüntüleme sistemini çalıştırmadan önce uygun eğitimi alın.

  1. Cihaz hazırlığı
    1. Görüntüleme işleminden en az 1 s önce görüntüleme sistemini, çevresel kontrol modülünü ve CO₂ gaz kaynağını açın.
    2. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımındaki Çevresel Kontrol (Environment Control) panelini açın.
    3. Sıcaklığı 37°C ve CO₂ değerini %5 olarak ayarlayın.
    4. Plakayı yerleştirmeden önce hazne sıcaklığının ± 0.2°C aralığında stabilize olduğunu ve CO₂ değerinin %5.0 ± 0.1% olduğunu doğrulayın.
  2. Plaka kurulumu
    1. 24 kuyucuklu plakayı görüntüleme sisteminin görüntüleme haznesine yerleştirin.
  3. İlk yapılandırma
    1. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımının Görev Yöneticisini (Task Manager) açın.
    2. [Imager manual mode] seçeneğini seçin.
    3. Görüntüleme parametrelerini başlatmak için [Capture now] düğmesine tıklayın.
    4. 10× objektif seçin.
    5. Filtre ayarı olarak mikroplaka (microplate) seçeneğini belirleyin.
    6. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımının plaka kitaplığından 24 kuyucuklu bir plaka seçin.
  4. Odaklama ve görüntü kurulumu
    1. Faz Kontrast (Phase Contrast) kanalını seçin.
    2. Temsili bir kuyucuk seçin (örneğin, A1).
    3. Time-lapse görüntüleme öncesinde otofokusu etkinleştirin.
    4. Kamera simgesini kullanarak bir görüntü yakalayın.
    5. Hücre morfolojisini ve odak kalitesini doğrulayın.
    6. [Process/Analyze] sekmesine gidin.
    7. Deneyi yapılandırmak için [Create experiment from an image set] seçeneğini seçin.
  5. Time-lapse görüntüleme parametreleri
    1. [Procedure] ayarları panelini açın.
    2. Sıcaklığı 37°C ve CO₂ değerini %5 olarak ayarlayın.
    3. [Start Kinetic] altında, çalışma süresini 16:00:00 olarak ayarlayın.
    4. Görüntüleme aralığını 0:10:00 olarak belirleyin.
    5. Toplam okuma sayısını 97 olarak ayarlayın.
    6. Erken fagositoz olaylarını yakalarken temporal çözünürlük ve fototoksisite arasında denge kurmak için 10–15 dakikalık bir görüntüleme aralığı kullanın.
  6. Görüntüleme kanalı yapılandırması
    1. Kanal 1'i Faz Kontrast olarak ayarlayın.
    2. Kanal 2'yi GFP (Ex 469/35, Em 525/39) olarak ayarlayın.
    3. Optimal görüş alanı ve çözünürlük için 10× objektif seçin.
    4. Aydınlatma, entegrasyon süresi ve kazancı (gain) [Auto] olarak ayarlayın veya manuel olarak düzenleyin.
    5. Sinyal doygunluğunu önlemek için tipik olarak 100–300 ms'lik bir GFP pozlama süresi kullanın.
    6. Tüm kuyucuklarda aynı görüntüleme ayarlarını uygulayın.
  7. Görüntüleme pozisyonu kurulumu
    1. [Define beacons] menüsünü açın.
    2. Z-stack görüntülemeyi devre dışı bırakın.
    3. Montaj (montage) görüntülemeyi devre dışı bırakın.
    4. Görüntülemeyi tek bir odak düzleminde gerçekleştirin.
    5. Mikroskop simgesini kullanarak her kuyucuk içinde temsili ve örtüşmeyen bölgeler seçerek görüntüleme pozisyonlarını manuel olarak tanımlayın.
    6. Tüm zaman noktaları boyunca aynı görüntüleme pozisyonlarını koruyun.
    7. Kuyucuk başına en az 4–6 görüş alanı seçin.
  8. Time-lapse görüntüleme
    1. Otomatik time-lapse görüntülemeyi başlatmak için [Play] düğmesine tıklayın.
  9. Veri dışa aktarma ve görselleştirme
    1. Görüntüleme işleminden sonra kaydedilen deney dosyasını açın.
    2. Görüntüleme pozisyonlarını seçin.
    3. Time-lapse verilerini MP4 formatında dışa aktarın.
    4. [Process Tool] aracını açın.
    5. Görselleştirmeyi geliştirmek ve temsili fagositoz olaylarını tanımlamak için gerekiyorsa [Image Deconvolution] işlemini uygulayın.
      NOT: Time-lapse görüntülemeyi yalnızca kalitatif görselleştirme için kullanın. Yutulmamış GFP-pozitif kanser hücreleri, makrofajlarla örtüşebilir veya geçici olarak ilişkilenebilir, bu da yalancı pozitif sinyallere yol açabilir. Kantitatif analiz için ayrı bir uç nokta (endpoint) testi gerçekleştirin.

7. Uç Nokta Fagositoz Kantifikasyonu

  1. Internalize edilmemiş hücrelerin uzaklaştırılması
    1. Analizi özdeş ko-kültür koşulları altında gerçekleştirin.
    2. Deneyi 4 h süresinde sonlandırın.
    3. Kültür ortamını uzaklaştırın.
    4. PBS içinde 10 mM EDTA ekleyin.
    5. 37°C'de 5 min boyunca inkübe edin.
    6. Internalize edilmemiş GFP-pozitif hücreleri uzaklaştırmak için PBS ile nazikçe yıkayın.
    7. Taze makrofaj ortamı ekleyin.
  2. Kantifikasyon için görüntüleme
    1. Faz kontrast ve GFP kanallarını kullanarak görüntüleri elde edin.
    2. Kuyu başına en az 4–6 görüş alanı yakalayın.
    3. Koşul başına minimum üç kuyuyu analiz edin.
  3. Fagositoz olaylarının tanımlanması
    1. Hücre sınırları içerisinde tamamen çevrelenmiş GFP-pozitif sinyaller içeren makrofajları belirleyin.
  4. Görüntü analizi
    1. Görüntüleri ImageJ yazılımında açın.
    2. Cell Counter eklentisini kullanın.
    3. Toplam makrofaj sayısını belirleyin.
    4. Internalize edilmiş GFP-pozitif hücreler içeren makrofajları sayın.
  5. Fagositoz indeksinin hesaplanması
    1. Şu işlemi hesaplayın: figure-protocol-2
    2. Analizi körleme yöntemle gerçekleştirin.
    3. En az üç bağımsız deneyde tekrarlayın.
  6. Veri sunumu
    1. Temsili time-lapse görüntülerini kronolojik olarak sunun (Şekil 2B ve Şekil 2C).
    2. Temsili uç nokta görüntülerini sunun (Şekil 3A ve Şekil 3B).

figure-protocol-3
Şekil 3. Son nokta analizi ile antikor bağımlı makrofaj fagositozunun nicelleştirilmesi. (A) GFP etiketli meme kanseri hücreleri ile 4 sa boyunca ko-kültüre edilen makrofajların, ardından EDTA uygulamasıyla yutulmamış hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından alınan temsilci faz-kontrast ve GFP floresan görüntüleri. Makrofajları ve internalize olmuş GFP-pozitif hedefleri belirlemek için faz kontrast ve GFP kanalları birleştirilmiştir. Makrofajlar (sayaç 0) ve GFP-pozitif yutucu makrofajlar (sayaç 1), ImageJ'deki Cell Counter eklentisi kullanılarak sayılmıştır. IgG kontrol koşulunda hiçbir fagositik olay gözlemlenmezken, anti-CD24 monoklonal antikor uygulaması, makrofajlar içinde aktif fagositozu gösteren belirgin hücre içi GFP-pozitif sinyallerle sonuçlanmıştır. Ölçek çubuğu = 200 µm. (B) Toplam makrofaj popülasyonuna oranla internalize GFP-pozitif hücreler içeren makrofajların yüzdesi olarak tanımlanan fagositoz indeksinin nicelleştirilmesi. Anti-CD24 monoklonal antikor, IgG kontrolüne kıyasla fagositoz indeksini önemli ölçüde artırmıştır (0.00 ± 0.00%'ye karşı 18.76 ± 4.01%, ortalama ± SD; grup başına n = 6 alan; ***p < 0.001, Welch eşleştirilmemiş t-testi). Veriler en az üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PBMC'lerden makrofajların başarılı bir şekilde üretildiği ve polarize olduğu, morfolojik değerlendirme ve akış sitometrisi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 1). Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilen PBMC'ler, M-CSF takviyeli ortamda kültüre edilmiş ve 7. güne gelindiğinde karakteristik makrofaj morfolojisine sahip adherent hücreler elde edilmiştir. IFN-γ ve LPS ile stimülasyonun ardından hücreler, uygulanan koşullar altında aktivasyonla uyumlu bir fenotip sergilemiştir. Akış sit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokoldeki birkaç adım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, PBMC izolasyonunun kalitesi ve saflığı, makrofaj verimini ve diferansiyasyon verimliliğini doğrudan etkiler. Seyreltilmiş kanın Ficoll gradyanı üzerine dikkatlice katmanlanması ve fren kapatılarak santrifüjleme yapılması, buffy coat arayüzünün korunması için gereklidir. RBC lizininin yetersiz olması veya liz tamponu ile aşırı inkübasyon, PBMC canlılığını tehlikeye atacaktır. İkinci olarak, proinflamatuar ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Tayvan Eğitim Bakanlığı'nın (MOE) Yüksek Eğitim Filiz Projesi (Higher Education Sprout Project) kapsamındaki Öne Çıkan Alanlar Araştırma Merkezi Programı aracılığıyla, Çin Tıp Üniversitesi Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapi Merkezi tarafından desteklenmiştir (CBPTC-PROJ-5-2).

Fon sağladıkları ve akademik destek verdikleri için Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapötikler Merkezi'ne teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) stok çözeltisiSigma-Aldrich (veya eşdeğeri)E7889 (veya eşdeğeri)Hücre ayırma işlemi için PBS içerisinde 10 mM EDTA çalışma çözeltisi hazırlamak amacıyla kullanılır
24 kuyucuklu doku kültürü plakaları (TC-işlemli)Corning (veya eşdeğeri)3524Fagositoz testi sırasında makrofajların ve kanser hücrelerinin ko-kültürü için kullanılır
Anti-insan CD206 antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)321122 (veya eşdeğeri)Alternatif makrofaj fenotipi belirteci
Anti-insan CD24 monoklonal antikoruThermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)MA1-91384 (veya eşdeğeri)Antikor bağımlı fagositoz için kanser hücrelerini opsonize etmek amacıyla kullanılır
Çevresel kontrol odacıklı otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi (örneğin, Lionheart FX)Agilent Technologies (veya dengi)BioTek Lionheart FX Otomatik MikroskopKontrollü sıcaklık ve [eksik metin] altında uzun süreli zaman atlamalı görüntülemeye olanak tanır 2 koşullar
Otomatik canlı hücre görüntüleme için görüntüleme yazılımı (örneğin, Gen5)Agilent Technologies (veya eşdeğeri)Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Time-lapse görüntüleme verilerinin elde edilmesi ve analizi için kullanılır
Santrifüj (salıncak kovalı rotor)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)TX-1000 rotorlu (veya eşdeğeri) Multifuge X4R ProPBMC izolasyonu ve hücre yıkama basamakları için kullanılır
2 inkübatör (37°C, %5 2)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)Forma Doğrudan Isıtma 2 İnkübatör (veya eşdeğeri)Hücre kültürü için fizyolojik koşulları korur
2 regülatörlü gaz kaynağıAgilent Technologies (veya eşdeğeri)Giriş yok.Malzemeler 2 inkübatör ve görüntüleme sistemi çevresel kontrolü için
Konik tüpler (15 mL ve 50 mL)Corning (veya eşdeğeri)352070 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu, yıkama ve santrifüjleme adımları için kullanılır
EDTA kaplı kan toplama tüpleri (vakutaynerler)BD Biosciences (veya eşdeğeri)367863 (veya eşdeğeri)Donörlerden tam kan örnekleri toplamak için kullanılır
Ficoll-Paque PLUSCytiva (veya eşdeğeri)17144003 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu için yoğunluk gradyanı medyumu
Akış sitometresi (örn. FACSCanto II)BD Biosciences (veya eşdeğeri)BD FACSCanto II Makrofajların fenotipik analizi için kullanılır
Kompanzasyon boncukları (akış sitometrisi)Biolegend (veya eşdeğeri)424602Tek renkli kompanzasyon kontrolleri için kullanılır
FITC anti-human CD11b antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)101205 (veya eşdeğeri)Makrofajları tanımlamak için kullanılan belirteç
PE anti-insan CD80 antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)375410 (veya eşdeğeri)Aktive makrofaj fenotipi ile ilişkili marker
GFP eksprese eden meme kanseri hücre hattı (MDA-MB-468)ATCC (veya eşdeğeri)HTB-132 (veya eşdeğeri)Fagositoz analizinde kullanılan hedef hücreler; GFP görselleştirmeyi sağlar
ImmunoCult-SF makrofaj besiyeriSTEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)10961 (veya eşdeğeri)Makrofaj farklılaşması için kullanılan serumsuz ortam
Dulbecco’Dulbecco Modifiyeli Eagle Ortamı (DMEM)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)12100046Kanser hücrelerinin kültürü ve resüspansiyonu için kullanılır
İzotip kontrol antikoru (IgG)Bio X Cell (veya eşdeğeri)BE0297 (veya eşdeğeri)Antikor bağımlı fagositoz testi için negatif kontrol
Lipopolisakkarit (LPS)Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri)L2630 (veya eşdeğeri)IFN- ile kombinasyon halinde makrofajları aktive etmek için kullanılan stimülüsγ
Rekombinant insan interferon gama (IFN-γ)STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)78020 (veya eşdeğeri)Makrofaj aktivasyonu için kullanılan sitokin
Rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF)STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)78057 (veya eşdeğeri)Makrofaj farklılaşması için kullanılan büyüme faktörü
Pasteur pipetleri veya serolojik pipetlerJetbiofil (veya eşdeğeri)GSP010010 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu ve hücre kültürü sırasında sıvı aktarımı için kullanılır
PBS (Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen)2+-/Mg2+-içermeyen)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)BP399-500 (veya eşdeğeri)Hücrelerin yıkanması ve dilüsyon basamakları için kullanılan tampon çözelti
Petri kapları (100 mm, non–doku kültürü işleminden geçmiş)Corning (veya eşdeğeri)430591Adherans seçimi yoluyla makrofaj farklılaşması için kullanılır
Kırmızı kan hücresi (eritrosit) liziz tamponuBioLegend (veya eşdeğeri)420301 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu sırasında kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için kullanılır
Viability 405/452 Sabitleyici BoyaMiltenyi Biotec (veya eşdeğeri)130-130-404 (veya eşdeğeri)Akış sitometrisi analizi sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılır
DAPISigma-Aldrich (veya eşdeğeri)D9542 (veya eşdeğeri)Akış sitometrisinde ölü hücrelerin dışlanması için kullanılır

Kaynaklar

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  3. Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).
  4. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).
  5. Lin, N. U., et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).
  6. Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).
  7. Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).
  8. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  9. Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).
  10. Majeti, R., et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 138 (2), 286-299 (2009).
  11. Barkal, A. A., et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).
  12. Wang, X., et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).
  13. Chan, S. H., et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).
  14. Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 15, 1367959 (2024).
  15. Weiskopf, K., Weissman, I. L. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).
  16. Cao, X., et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).
  17. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).
  18. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  19. Denardo, D. G., Ruffell, B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).
  20. Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. (140), e57566 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Antikor Bağımlı FagositozYeşil Floresan ProteinCD24 Eksprese Eden HücrelerCanlı Hücre GörüntülemeMonoklonal Antikor OpsonizasyonuUç Nokta AnaliziKanser İmmünoterapisi
Yeşil Floresan Proteinle İşaretlenmiş Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinin Antikor Aracılı Makrofaj Fagositozunun Zaman Atımlı Görüntülenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.