Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeşil Floresan Proteinle İşaretlenmiş Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinin Antikor Aracılı Makrofaj Fagositozunun Zaman Atımlı Görüntülenmesi

162 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, periferik kan mononükleer hücresi kaynaklı makrofajlar ve otomatik bir mikroskop kullanarak, yeşil floresan proteinle işaretlenmiş üçlü negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görüntülemek için kullanılan bir zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Antikor bağımlı hücresel fagositoz, makrofajların antikorla opsonize edilmiş kanser hücrelerini yuttuğu temel bir mekanizmadır. Bu protokol, yeşil floresan protein ile işaretlenmiş, CD24 eksprese eden triple negatif meme kanseri hücrelerinin antikor bağımlı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için bir zaman ayarlı canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklamaktadır. Makrofajlar, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilmiş, makrofaj koloni uyarıcı faktör ile diferansiye edilmiş ve pro-inflamatuar bir fenotip oluşturmak için interferon gama ve lipopolisakkarit kullanılarak polarize edilmiştir. Kanser hücreleri, belirlenmiş bir efektör-hedef oranında makrofajlarla birlikte kültüre edilmeden önce bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositoz olayları, fizyolojik koşulları korumak için çevresel kontrol sistemine sahip otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 h süresince kaydedilir. Görüntüleme, kanser hücrelerinin tanımlanmasına ve makrofajlar tarafından içselleştirilmelerinin izlenmesine olanak tanıyan parlak alan ve floresan kanalları kullanılarak gerçekleştirilir. Temsili zaman ayarlı görüntüler, floresan kanser hücrelerinin zamanla kademeli olarak yutulduğunu göstermektedir. Kantitatif değerlendirmeyi mümkün kılmak için, aynı ko-kültür koşulları altında paralel bir uç nokta deneyi gerçekleştirilir; burada, fagositoz olaylarının doğru ölçümüne izin vermek için görüntülemeden önce içselleştirilmemiş kanser hücreleri uzaklaştırılır. Bu yöntem, in vitro ortamda antikor kaynaklı makrofaj fagositozunu görselleştirmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Önemli bir nokta olarak, zaman ayarlı görüntülemenin uç nokta tabanlı kantifikasyon ile entegrasyonu, fagositozun kinetiğinin ve büyüklüğünün tamamlayıcı değerlendirmesine olanak tanır. Bu protokol, kontrollü bir in vitro ortamda terapötik antikorların ve makrofaj hedefli kanser immünoterapilerinin değerlendirilmesini desteklemektedir.

Giriş

Meme kanseri, dünya genelinde kadınlarda en sık teşhis edilen malignitedir ve her yıl yaklaşık 2,3 milyon yeni vaka görülmektedir1. Hastalık klinik olarak heterojendir ve hormon reseptörleri olan östrojen reseptörü (ER) ve progesteron reseptörünün (PR) durumuna ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) onkogeninin ekspresyonuna göre en az dört ana moleküler alt tipe ayrılır2. Luminal A tümörleri, HER2 aşırı ekspresyonu olmaksızın ER ve/veya PR eksprese eder (ER/PR+ ve HER2−); luminal B tümörleri ER/PR ve HER2'yi birlikte eksprese eder (ER/PR+ ve HER2+); HER2+ tümörleri, hormon reseptör durumundan bağımsız olarak yüksek HER2 ekspresyonu ile karakterizedir; üçlü negatif meme kanseri (TNBC) ise her üç markörün de ekspresyonundan yoksundur (ER−, PR− ve HER2−)2,3. Bu alt tipler arasında TNBC, klinik olarak en zorlayıcı formu temsil eder ve tüm meme kanserlerinin yaklaşık %15-20'sini oluşturur. TNBC'li hastalar, konvansiyonel kemoterapiye verilen düşük yanıtlar ve etkili hedefli terapilerin yokluğu nedeniyle, en agresif hastalık seyri, en kötü prognoz ve en kısa 5 yıllık genel sağkalım oranlarını sergilerler3,4. Ayrıca TNBC, özellikle teşhisten sonraki 5 yıl içinde akciğerlere yönelik visceral metastaz eğilimi açısından anlamlı derecede yüksek bir yatkınlık gösterir ve ileri evre veya metastatik TNBC (mTNBC) olan hastaların medyan sağkalımı nadiren 2 yılı aşar5,6. Bu istatistikler, TNBC için yeni terapötik stratejilere yönelik kritik ve karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir.

Tümör mikroçevresi (TME), meme kanseri progresyonu ve immün kaçışta merkezi bir rol oynar. Tümörle ilişkili makrofajlar, TME içindeki en bol bulunan immün hücreler arasında yer alır ve son zamanlarda doğal anti-tümör immünitenin kritik medyatörleri olarak kabul edilmiştir7,8,9. TAM'lar tarihsel olarak pro-inflamatuar “M1” ve pro-tümöral “M2” durumlarına ayrılmış olsa da, bu ikili model makrofaj heterojenliğinin gerçek kapsamını yakalamakta yetersiz kalmaktadır. Bunun yerine TAM'lar, TME içindeki çeşitli biyokimyasal sinyallere yanıt olarak evrilen dinamik bir fonksiyonel spektrum kaplarlar. Bu karmaşık ortamda, kanser hücreleri çeşitli immün kaçış stratejileriyle, özellikle de “beni yeme” sinyallerinin aşırı ekspresyonu yoluyla makrofaj aktivitesini aktif olarak saptırırlar. CD47/SIRPα aksı, bu bağlamda tanımlanan ilk doğal immün kontrol noktasıydı6,10 ve daha yakın zamanda CD24, yeni ve güçlü bir antifagositik sinyal olarak ortaya çıkmıştır11,12. CD24, bir glikozilfosfatidilinozitol bağı aracılığıyla hücre membranına çıpalanmış, küçük ve yoğun şekilde glikozillenmiş müsin tipi bir glikoproteindir13. Fizyolojik koşullar altında çeşitli immün hücre soyyerlerinde eksprese edilir ancak meme, over, pankreas ve kolorektal kanserler dahil olmak üzere solid tümörlerde sıklıkla aşırı eksprese edilir14. Tümör hücrelerinde CD24, makrofajlarda eksprese edilen inhibitör reseptör sialik asit bağlayıcı immünoglobulin benzeri lektin 10 (Siglec-10) ile etkileşime girer. Bu etkileşim, Siglec-10'un sitoplazmik kuyruğundaki immünoreseptör tirozin bazlı inhibitör motif bölgelerinin fosforilasyonunu tetikleyerek, aşağı akış fagositik sinyalizasyonu baskılayan SHP-1 ve SHP-2 fosfatazlarını aktive eder11. Monoklonal antikor ile CD24/Siglec-10 etkileşiminin blokajının, makrofajlar tarafından CD24 eksprese eden insan tümörlerinin fagositozunu güçlü bir şekilde artırdığı gösterilmiştir. Yakın zamanda yaptığımız çalışma, meme kanseri hücrelerinde CD24a nakavtının, murin triple-negatif meme kanseri modelinde hücrelerin makrofaj fagositozuna olan duyarlılığını artırdığını da göstermiştir9.

Antikor bağımlı hücresel fagositoz (ADCP), antikorların makrofajları tümör hücrelerini fagosite etmeleri için yönlendirdiği temel bir mekanizmadır15,16. Tümörde eksprese edilen antijenlere bağlandığında, antikorun Fc bölgesi makrofajlar üzerindeki Fcγ reseptörleri (FcγR'ler) ile etkileşime girerek sitoskeletal yeniden düzenleme, fagositik çukur oluşumu ve hedef hücrenin yutulmasıyla sonuçlanan hücre içi sinyal yolaklarını tetikler17.

Bu çalışmada, meme kanseri hücrelerinin antikor güdümlü makrofaj fagositozunu ölçmek için bir zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme protokolü geliştirdik ve doğruladık. Yöntem, sağlıklı insan donörlerden elde edilen, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile farklılaştırılan ve ardından lipopolisakkarit (LPS) ve interferon gama (IFN-γ) ile stimüle edilen periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) kaynaklı makrofajları kullanmaktadır. Akış sitometrisi analizi, stimülasyon sonrası CD11b⁺ popülasyonunda CD80'nin yukarı regülasyonunu onaylayarak (Şekil 1) klasik olarak aktive edilmiş fenotipi desteklemiştir. Bu aktivasyon durumu, güçlü bir antikor aracılı fagositoz kapasitesi sağlayarak yöntemi antikor bağımlı hücresel fagositozun (ADCP) değerlendirilmesi için uygun hale getirmektedir. GFP etiketli CD24-pozitif meme kanseri hücreleri hedef hücreler olarak hizmet eder ve ko-kültür öncesinde terapötik bir anti-CD24 monoklonal antikor ile opsonize edilir. Fagositoz olayları, kontrollü çevresel koşullar altında otomatik bir mikroskop kullanılarak 16 saatlik bir süre boyunca kaydedilir. Dinamik görselleştirme ile paralel olarak kantitatif değerlendirmeye olanak sağlamak için, aynı ko-kültür koşulları altında ayrı bir son nokta analizi gerçekleştirilir; bu da internalize edilmemiş hedef hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından fagositozun titizlikle ölçülmesine imkan tanır. Bu protokol, anti-CD24 antikoru tarafından aracılık edilen ADCP'nin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve görsel olarak bilgilendirici bir platform sunar. Önemli bir nokta olarak, zaman atlamalı görüntülemenin tamamlayıcı bir son nokta tabanlı kantifikasyon stratejisiyle entegrasyonu, fagositoz kinetiğinin ve büyüklüğünün eş zamanlı değerlendirilmesini sağlar. Yöntem, makrofaj hedefli diğer immünoterapötik hedeflerin araştırılması için uyarlanabilir. Bu protokol, kanser hücrelerindeki yüzey antijenlerine karşı terapötik monoklonal antikorlar tarafından aracılık edilen ADCP'nin değerlendirilmesi için en uygundur. Aday antikorların karşılaştırmalı taraması, doz-yanıt karakterizasyonu ve "beni yeme" sinyal blokajının (örneğin, CD47–SIRPα) etkileri dahil olmak üzere Fc–FcγR etkileşiminin mekanistik çalışmaları için oldukça uygundur. Analiz primer insan makrofajları kullandığından, klinik geliştirme öncesinde donörler arası değişkenliğin değerlendirilmesini gerektiren translasyonel çalışmalar için de uygundur.

Makrofaj analizi için akış sitometrisi ile periferal kan mononükleer hücresi izolasyon diyagramı.
Şekil 1. Periferal kan mononükleer hücrelerinden türetilen IFN-γ/LPS stimüle edilmiş makrofajların üretimi ve akış sitometrisi doğrulaması.Üst panel: Periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), tüm reaktifler 20°C ± 2°C'ye önceden dengelenmiş şekilde, Ficoll solüsyonu kullanılarak 20°C'de 30 dk boyunca 400 × g ile yoğunluk gradyanı santrifügasyonu yoluyla sağlıklı donörlerden izole edilir. İzole edilen PBMC'ler, makrofaj diferansiyasyonunu sağlamak için 100 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile takviye edilmiş ImmunoCult-SF medyumunda 7 gün boyunca kültüre edilir (Gün 0–7) ve 5. Gün'de medyum takviyesi yapılır. 8. Gün'de, diferansiye olmuş makrofajlar 100 ng/mL IFN-γ ve 1 µg/mL LPS ile 48 saat boyunca stimüle edilir (Gün 8–10). Hücreler daha sonra akış sitometrisi analizine tabi tutulur. Alt panel: Makrofajların akış sitometrisi analizi. Hücreler, CD11b-FITC, CD80-PE ve CD206-PerCP-Cy5.5'ten oluşan bir yüzey paneli ile boyanmış, ardından ölü hücrelerin dışlanması için veri toplama öncesinde DAPI eklenmiştir. Gating stratejisi: Hücreler önce canlı hücreler (DAPI⁻) üzerinden seçilmiş, ardından makrofaj kimliğini doğrulamak için bir CD11b-FITC karşı FSC-A grafiğinde CD11b⁺ identifikasyonu yapılmıştır. Canlı CD11b⁺ olaylar, daha sonra IFN-γ/LPS stimülasyonu tarafından indüklenen CD80⁺CD206⁻ popülasyonunu doğrulamak için bir CD80 karşı CD206 nokta grafiğinde analiz edilmiştir. Sağ: Seçilen hücrelerin %99,8'inin CD11b⁺ olduğunu ve makrofaj kimliğini doğruladığını gösteren CD11b-FITC karşı FSC-A temsilci nokta grafiği. Sol: CD11b⁺ hücrelerin çoğunluğu CD80⁺CD206⁻ kapısı içinde kalmış (Q1: %95,2), bu da uygulanan stimülasyon koşulları altında beklenen pro-inflamatuar fenotipi göstermiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Kullanıcılar bu tekniği uygularken birkaç kısıtlamayı göz önünde bulundurmalıdır. İlk olarak, PBMC kaynaklı makrofajlardaki donör değişkenliği, fagositik çıktıda önemli varyasyonlara neden olabilir; bu nedenle, havuzlanmış sonuçların yanı sıra bireysel donör verilerinin de raporlandığı çoklu donör (n ≥ 3) kullanımını öneriyoruz. İkinci olarak, 2D ko-kültür formatı tümör mikroçevresini tam olarak yansıtmaz ve klinik çıkarımlarda bulunmadan önce bulgular 3D veya in vivo modellerde doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, 16 saatlik görüntüleme penceresi erken fagositik olayları yakalar ancak antijen sunumu veya sekonder immün aktivasyon gibi daha uzun süreli süreçleri yansıtmaz. Bu nedenle, gerçek zamanlı görüntüleme ve uç nokta nicelleştirmesinin birlikte kullanımı, ADCP ölçümlerinin hem yorumlanabilirliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran tamamlayıcı bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, sağlıklı donörlerin kan örneklerinden türetilen primer makrofajların kullanımını içermektedir. Örneklerin toplanması ve işlenmesi, China Medical University Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. PBMC Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

NOT: İnsan kanı içeren tüm prosedürleri kurumsal IRB onayı (örneğin, CMUH IRB) altında gerçekleştirin. Kan toplama işleminden önce sağlıklı donörlerden bilgilendirilmiş onam alın.

DİKKAT: Tüm insan kan ürünlerini, evrensel önlemler kullanarak Biyogüvenlik Düzeyi 2 koşulları altında işleyin.

  1. Kan toplama
    1. Sağlıklı bir donörden 10 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı vacutainer tüplerine tam kan toplayın.
  2. Kan dilüsyonu
    1. Tam kanı, buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺- içermeyen) ile 1:1 oranında seyreltin (örneğin, 10 mL kan + 10 mL PBS).
    2. Tüpü üç ila beş kez altüst ederek karıştırın.
      NOT: PBS'yi kullanmadan önce buz üzerinde tutun. Soğuk sıcaklık, işlem sırasında hücre canlılığının korunmasına yardımcı olur.
  3. Yoğunluk gradyanı katmanlama
    1. Seyreltilmiş kanı, konik bir tüpte 2:1 hacim oranında (v/v) Ficoll–Paque PLUS üzerine dikkatlice katmanlayın (örneğin, 15 mL'lik bir tüpte 4 mL Ficoll üzerine 8 mL kan veya 50 mL'lik bir tüpte 15 mL üzerine 30 mL).
    2. Katmanlamadan önce hem seyreltilmiş kanı hem de Ficoll–Paque PLUS'ı 20°C ± 2°C'ye dengeleyin.
    3. Ficoll–Paque PLUS'ı kullanımdan en az 30 dk önce 4°C'lik saklama koşullarından çıkarın veya 20°C ± 2°C'lik bir su banyosunda kısa süreli olarak ısıtın.
    4. Soğuk reaktifler kullanmayın; çünkü Ficoll yoğunluğu 20°C ± 2°C için kalibre edilmiştir ve sapmalar ayırma verimliliğini ve PBMC verimini tehlikeye atacaktır.
      NOT: Keskin bir ara yüzey oluşturmak için tüpü 45° açıyla eğin ve kanı duvar boyunca yavaşça pipetleyin. Ficoll katmanını bozmayın.
  4. Santrifügasyon
    1. Fren kapalıyken 20°C'de 30 dk boyunca 400 × g'de santrifüjleyin (Şekil 1).
      NOT: Frenleme, yoğunluk gradyanını bozacak ve PBMC verimini azaltacaktır.
  5. PBMC toplama
    1. Serolojik bir pipet kullanarak, üstteki plazma veya alttaki Ficoll katmanını bozmadan, sadece buffy coat katmanını (plazma ve Ficoll katmanları arasındaki beyazımsı ara yüzey) dikkatlice aspire edin.
    2. Toplanan katmanı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
  6. PBMC yıkama
    1. 50 mL konik tüpte toplam hacmi 25 mL'ye tamamlamak için PBS ekleyin.
    2. Uygun santrifügasyon ve dengeleme sağlamak için 50 mL'lik tüp kullanın.
    3. 10 dk boyunca 300 × g'de santrifüjleyin.
  7. RBC lizisi
    1. Süpernatantı uzaklaştırın.
    2. Pelleti, pellet tamamen dağılana ve görünür topak kalmayana kadar serolojik bir pipetle nazikçe yukarı-aşağı pipetleyerek 5 mL eritrosit (RBC) liziz tamponunda resüspande edin.
    3. Oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
      DİKKAT: Homojen liziz sağlamak için tam dağılım gereklidir; ancak PBMC'lere zarar verebilecek şiddetli pipetlemeden veya vortekslereden kaçının. RBC liziz tamponu ile inkübasyon süresini 5 dk'yı geçirmeyin, çünkü uzun süreli maruziyet PBMC canlılığını tehlikeye atabilir.
  8. PBMC çöktürme
    1. PBMC'leri çöktürmek ve lize olmuş RBC kalıntılarını uzaklaştırmak için 5 dk boyunca 500 × g'de santrifüjleyin.
  9. Final resüspansiyon
    1. Süpernatantı uzaklaştırın.
    2. Pelleti 5 mL ImmunoCult-SF makrofaj medyumunda resüspande edin.
      NOT: Standart koşullar altında, 10 mL tam kan tipik olarak 1,5–2,0 × 107 PBMC verir.

2. Makrofaj Diferansiyasyonu (0–7. Günler)

NOT: Monositlerden yapışma yoluyla türetilen diferansiye makrofajları seçmek için doku kültürü (TC)-işlem görmemiş Petri kapları kullanın. Yapışmayan lenfositler, sonraki kültür aşamalarında yıkanarak uzaklaştırılacaktır.

  1. Gün 0: Hücre ekimi
    1. Hücre sayımı yapın ve 1 × 107 PBMC'yi TC-işlem görmemiş 10 cm'lik bir Petri kabına ekleyin.
    2. Toplam hacmi, 100 ng/mL M-CSF ile desteklenmiş ImmunoCult-SF makrofaj besiyeri kullanarak 10 mL'ye tamamlayın (M-CSF stok çözeltisinin kullanımdan hemen önce doğrudan tam besiyerine eklenmesi ve nazikçe ters çevrilerek karıştırılmasıyla hazırlanır).
      NOT: Protokol, donör PBMC verimindeki varyasyonlara uyum sağlamak için 1 × 106 hücre/mL başlangıç ekim yoğunluğu baz alınarak orantılı olarak ölçeklendirilebilir.
  2. İnkübasyon ve izleme
    1. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de %5 CO₂ ile inkübe edin.
    2. Yüzen monosit kümelerinin oluşumunu ve yapışık hücrelerin ortaya çıkışını günlük olarak izleyin.
      NOT: Diferansiyasyon ilerledikçe monositlerin boyutları kademeli olarak artacak ve kümeler oluşturacaktır. Bazı monositler plağa yapışmaya başlayacaktır. Bu adımda herhangi bir müdahale gerekmez.
  3. Gün 5: Besiyeri takviyesi
    1. Yapışık makrofajları rahatsız etmemeye dikkat ederek, kaba 100 ng/mL M-CSF ile desteklenmiş 5 mL taze ImmunoCult-SF makrofaj besiyeri nazikçe ekleyin.
    2. Kültürü 2 gün daha (7. Güne kadar) sürdürün.
      DİKKAT: Mekanik bozulma diferansiyasyon verimini ve hücre verimini etkileyebileceğinden, taze besiyerini yapışık makrofajları rahatsız etmemek için kabın kenarından nazikçe ekleyin.
      NOT: Makrofaj diferansiyasyonunu destekleyen otokrin/parakrin faktörleri korumak için besiyerini tamamen değiştirmekten kaçının.
  4. Gün 7: Morfolojik değerlendirme
    1. Makrofaj diferansiyasyon verimliliğini ters mikroskop altında inceleyin.
    2. Yapışık hücreler karakteristik makrofaj morfolojisi sergiler: büyük, yassı, düzensiz şekilli ve görünür pseudopodlara sahiptir.
    3. 7. Günde, iyi diferansiye olmuş makrofajlar görünür olmalıdır.
      DİKKAT: 7. gündeki morfolojik değerlendirme, sonraki akış sitometrisi doğrulaması için kritik bir ön koşul görevi görür. İyi diferansiye olmuş makrofajlar mikroskop altında net bir şekilde görülmelidir ve makrofaj morfolojisine sahip yapışık hücrelerin yüksek oranı, daha yüksek diferansiyasyon verimliliğini yansıtır (karakteristik morfolojiye sahip yapışık makrofajların yaklaşık %70 konfluensi, başarılı diferansiyasyonun göstergesi olarak kabul edilir). Seyrek yapışma, ağırlıklı olarak yuvarlak hücreler veya diğer şekilde zayıf morfolojik diferansiyasyon gösteren kültürlerin güvenilir akış sitometrisi sonuçları verme olasılığı düşüktür ve stimülasyon ile boyama aşamalarına geçilmemelidir.

3. Makrofaj Polarizasyonu (8–10. Günler)

  1. Koşullandırılmış besiyerinin toplanması ve berraklaştırılması
    1. 8. Gün'de, yapışık makrofajları rahatsız etmeden kültür kabındaki 15 mL besiyerini dikkatlice aspire edin ve steril bir 50 mL konik tüpe aktarın.
    2. Hücre kalıntılarını çöktürmek için toplanan besiyerini 400 × g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin.
    3. Berraklaştırılmış süpernatantı bir sonraki adım için saklayın.
  2. İnterferon gama (IFN-γ) ve lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonu
    1. Berraklaştırılmış 15 mL süpernatantı yeni steril bir tüpe aktarın ve 100 ng/mL IFN-γ ve 1 µg/mL LPS ile destekleyin.
    2. Hava kabarcığı oluşturmadan sitokinlerin homojen dağılımını sağlamak için pipetle hafifçe yukarı-aşağı çekerek (5–10 kez) iyice karıştırın.
    3. Sitokinle desteklenmiş 15 mL besiyerinin tamamını, yapışık makrofajları rahatsız etmekten kaçınmak için iç duvar boyunca nazikçe pipetleyerek orijinal kültür kabına geri ekleyin.
    4. 37°C'de %5 CO₂ ile 48 sa boyunca inkübe edin (8. Gün'den 10. Gün'e kadar).
      NOT: Otokrin/parakrin faktörleri korumak için koşullandırılmış (eski) besiyeri kullanın. Bu IFN-γ ve LPS kombinasyonu, makrofajları pro-inflamatuar bir fenotipe polarize etmek için kullanılır. Bu protokolde kullanılan IFN-γ (100 ng/mL) ve LPS (1 µg/mL) stimülasyon koşulları altında makrofajlar, aktive edilmiş pro-inflamatuar bir durumla uyumlu uzamış lamellipodyalar dahil olmak üzere karakteristik morfolojik değişikliklerin yanı sıra CD11b ve CD80 ekspresyonu gösterirler.
      DİKKAT: LPS, maruz kaldığında inflamatuar yanıtlara neden olabilen biyoaktif bir endotoksin olduğundan, uygun laboratuvar güvenlik prosedürleri ile uygulayın.

4. IFN-γ ve LPS ile Stimüle Edilmiş Makrofajların İnflamatuar Fenotip Markerlarının Akış Sitometrisi ile Doğrulanması

  1. Hücre hasadı
    1. Fenotipleme için 10. günde polarize makrofajların bir kısmını hasat edin.
    2. PBS içinde 10 mM EDTA ekleyin ve 37°C'de 10–15 dk inkübe edin.
    3. Hücreleri hafif pipetleme yaparak ayırın.
      NOT: Hücreler yapışık kalırsa, 37°C'de EDTA inkübasyonunu 30 dk daha uzatın, ardından hafif pipetlemeyi tekrarlayın. Hücre canlılığını ve yüzey markör bütünlüğünü korumak için şiddetli pipetlemeden veya mekanik kazımadan kaçının.
  2. Antikor boyama kurulumu
    1. Hücreleri CD11b (pan-makrofaj soy markörü), CD80 (inflamatuar markör) ve CD206'ya (inflamatuar fenotip tanımlaması için negatif dışlama markörü olarak kullanılan anti-inflamatuar markör) karşı florokrom konjuge antikorlarla boyayın.
  3. Boyama prosedürü
    1. Ayrılmış 5 × 105 makrofajı, 100 µL soğuk PBS içeren bir akış sitometrisi tüpüne aktarın.
    2. CD11b-FITC, CD80-PE ve CD206-PerCP-Cy5.5 antikorlarını her biri 1 µg/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin.
    3. Hücre süspansiyonunu hafif pipetleme ile karıştırın.
    4. Numuneleri ışıktan koruyarak buz üzerinde 1 sa boyunca inkübe edin.
    5. Numuneleri 4°C'de 1 dk boyunca 300 × g'de santrifüjleyin.
    6. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    7. Hücre peletini yıkamak için 0.5 mL soğuk PBS ekleyin.
    8. Numuneleri 4°C'de 1 dk boyunca 300 × g'de santrifüjleyin.
    9. Süpernatantı atın.
    10. Hücre peletini 200 µL soğuk PBS içinde yeniden süspanse edin.
    11. 1 µg/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde DAPI ekleyin.
      NOT: Uygun izotip kontrollerini ve bir canlılık boyasını (örneğin, DAPI veya Viobility 405/452 Fixable Dye) dahil edin.
  4. Akış sitometrisi analizi
    1. Boyanmış numuneleri bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
    2. Makrofaj popülasyonunda CD11b ve CD80 ekspresyonunu doğrulayın.
    3. Fagositoz assay'ine yalnızca inflamatuar fenotip ile uyumlu markör ekspresyonu doğrulandıktan sonra geçin.
  5. Akış sitometrisi veri toplama ve kurulumu
    1. Cihaz kurulumu
      1. Akış sitometresini şu kanalları kullanarak konfigüre edin: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) ve PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Veri toplama parametresini, tanımlanan ana kapı (parent gate) içinde numune başına 10.000 olay toplayacak şekilde ayarlayın.
    2. Eşik ve kazanç (gain) kalibrasyonu
      1. X ekseninde FSC ve Y ekseninde bir florofor kanalını gösteren dört nokta grafiği (dot plot) açın.
      2. Her bir floroforla eşleşen ilgili izotip kontrol antikorlarıyla boyanmış hücreler hazırlayın.
      3. İzotip kontrol numunelerini analiz edin.
      4. İzotip kontrol popülasyonunu logaritmik ölçekte 101 değerinin altına konumlandırmak için her kanalın kazancını ayarlayın.
      5. Arka plan sinyal seviyelerini tanımlamak için bu eşiği kullanın.
        NOT: Arka plan ile spesifik sinyal arasında güvenilir bir ayrım oluşturmak için 101 ile 101·5 arasında bir logaritmik ölçek aralığı kullanın.
    3. Kompansasyon
      1. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne bir damla kompansasyon boncuğu ekleyin.
      2. İlgili florokrom konjuge antikoru 1 µg/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin.
      3. Işıktan koruyarak buz üzerinde 30 dk inkübe edin.
      4. 1 dk boyunca 400 × g'de santrifüjleyin.
      5. Süpernatantı atın.
      6. Boncukları 200 µL soğuk PBS içinde yeniden süspanse edin.
      7. Tek renkli kontrolleri analiz edin.
      8. Florofor sızıntısını (spillover) düzeltmek için spektral kompansasyon uygulayın.
    4. Kapılama (Gating) stratejisi
      1. Canlı hücre seçimi
        1. Y ekseninde Pacific Blue/V450 (DAPI) ve X ekseninde FSC gösterin.
        2. Canlı hücreleri seçmek için DAPI-negatif olaylar (101 altı) üzerinde kapılama yapın.
      2. Makrofaj tanımlama
        1. Canlı hücre popülasyonunu ana kapı olarak ayarlayın.
        2. Y ekseninde FITC (CD11b) ve X ekseninde FSC gösterin.
        3. CD11b⁺ olaylar (101 üstü) üzerinde kapılama yapın.
      3. İnflamatuar fenotip tanımlama
        1. CD11b⁺ popülasyonunu ana kapı olarak ayarlayın.
        2. Y ekseninde PE (CD80) ve X ekseninde PerCP-Cy5.5 (CD206) gösterin.
        3. Her iki eksende 101.5 değerinde kuadrant kapılama uygulayın.
        4. Sol üst kuadrandaki (Q1) CD80⁺CD206⁻ hücreleri tanımlayın.
  6. Kabul kriterleri
    1. CD11b⁺ ana kapısı içindeki hücrelerin ≥%90'ının CD80⁺CD206⁻ olduğunu doğrulayın.
    2. Fagositoz assay'ine yalnızca bu eşik değerine ulaşıldığında geçin.
    3. Numuneler bu kriteri karşılamazsa, PBMC izolasyonunu, M-CSF diferansiyasyonunu ve IFN-γ/LPS stimülasyonunu tekrarlayın.

5. Antikor Bağımlı Fagositoz Analizi

NOT: Deney kurulumundan önce kanser hücrelerinde stabil GFP ekspresyonunu doğrulayın. Deney öncesinde hedef hücrelerde CD24 ekspresyonunu teyit edin. Optimal performans için %50–100 oranında CD24 pozitifliği gösteren kanser hücreleri kullanın. Bu protokolde kullanılan MDA-MB-468 hücreleri %100 CD24 pozitifliği sergilemektedir.

  1. Makrofaj ekimi
    1. Adım 4'te doğrulandığı şekilde, IFN-γ ve LPS ile stimüle edilmiş makrofajları, 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına kuyucuk başına 2 × 105 hücre olacak şekilde ekiniz.
    2. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için plağı 37°C'de, statik koşullarda %5 CO₂ ile 12–16 sa boyunca inkübe ediniz (Şekil 2A).
      NOT: Devam etmeden önce makrofajların sıkıca yapıştığından emin olun. Yetersiz yapışmış makrofajlar görüntüleme sırasında ayrılabilir ve sonuçları bozabilir.
  2. Kanser hücrelerinin hazırlanması
    1. CD24-pozitif GFP etiketli meme kanseri hücrelerini (MDA-MB-468), %70–80 konfluens düzeyine kadar kültüre ediniz.
    2. Kültür ortamını aspire ederek çekiniz.
    3. Hücre monokatmanını bir kez PBS ile yıkayınız.
  3. Kanser hücrelerinin ayrılması
    1. Kültür kabına PBS içinde 10 mM EDTA ekleyiniz.
    2. Hücreleri 37°C'de 5–10 dk inkübe ediniz.
    3. Hücrelerin tamamen salınmasını sağlamak için nazikçe pipetleyerek hücreleri ayırınız.
      NOT: Hücre ayırma işlemi için tripsin kullanmaktan kaçının. Enzimatik sindirim, CD24'ü hücre yüzeyinden koparabilir ve antikor bağlanmasını tehlikeye atabilir.
  4. Kanser hücrelerinin toplanması ve sayımı
    1. Ayrılan hücreleri bir santrifüj tüpüne toplayınız.
    2. Hücreleri 300 × g'de 5 dk santrifüjleyiniz.
    3. Süpernatantı uzaklaştırınız.
    4. Hücre peletini komple RPMI ortamında yeniden süspanse ediniz.
    5. Canlı hücreleri sayınız.
  5. Kanser hücrelerinin antikor opsonizasyonu
    1. Kanser hücrelerini 0,5 mL komple RPMI ortamında 2 × 105 hücre/mL yoğunlukta yeniden süspanse ediniz.
    2. Anti-CD24 monoklonal antikoru 1 µg/mL son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyiniz.
    3. Antikorun homojen dağılımını sağlamak için hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyerek karıştırınız.
    4. Hücreleri 37°C'de, statik koşullar altında 30 dk inkübe ediniz.
      NOT: Antikora bağımlı fagositoz için negatif kontrol olarak, aynı konsantrasyonda izotip-eşleşmiş bir IgG kontrolü ekleyiniz.
  6. Ko-kültür hazırlığı
    1. Opsonizasyondan sonra hücreleri yıkamayınız.
    2. Hücre yüzeyindeki antikor kaplamasını korumak için doğrudan ko-kültür işlemine geçiniz.
  7. Ko-kültür kurulumu
    1. Makrofaj içeren her bir kuyucuğa 1 × 105 antikor-opsonize GFP etiketli meme kanseri hücresi ekleyiniz.
    2. Efektör-hedef oranını 2:1 olarak koruyunuz.
      NOT: Efektör-hedef oranını deneysel tasarıma göre ayarlayınız. Hücre-hücre temas sıklığını artırmak ve fagositik olayların tespitini geliştirmek için belirtilen 2:1 oranından daha yüksek makrofaj-kanser hücresi oranları (örneğin 3:1 veya 5:1) kullanınız.

Görüntüleme deneyinde makrofaj ve GFP-etiketli hücre etkileşiminin zaman atlamalı diyagramı.
Şekil 2. Antikor bağımlı hücresel fagositozun zaman atlamalı görüntülemesi. (A) Ko-kültür sisteminin ve zaman atlamalı görüntüleme düzeneğinin şematik genel görünümü. Görüntüleme parametreleri, faz kontrastı ve GFP kanalları ile 10× objektif kullanılarak, toplam 16 saatin (97 kare) üzerinden 10 dakikalık aralıkları içermekteydi. (B) 1 saatten 16 saate kadar olan, GFP-pozitif kanser hücrelerinin makrofajlar tarafından zamanla içselleştirilmesi ile karakterize edilen fagositik olayları gösteren temsili zaman atlamalı görüntüler. Sarı kesikli daireler temsili fagositik olayları vurgulamaktadır. Faz kontrastı kanalında, yutulan kanser hücreleri makrofaj sitoplazması içinde faz-parlak hücre içi yapılar olarak görünür (beyaz oklar). GFP kanalında, makrofajlar içinde lokalize olan floresans, içselleştirmeyi doğrular. (C) GFP-etiketli kanser hücrelerinin makrofaj aracılı yutulmasının ardışık sürecini gösteren, 0, 1, 4 ve 16. saatlerdeki temsili fagositik olayların büyütülmüş görünümleri. Görüntü dizisi, makrofaj aracılı fagositik olayların net görselleştirilmesine dayanarak temsili olarak seçilmiştir. Beyaz oklar, hedef hücrelerle etkileşime giren ve onları içselleştiren makrofajları göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Zaman Atlamalı Görüntüleme (Otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi)

NOT: Deneye başlamadan önce, Lionheart otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi ve Gen5 otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımını kullanarak görüntüleme protokolünü yapılandırın. Doğru kurulum, optimal performans ve güvenli kullanım sağlamak için görüntüleme sistemini çalıştırmadan önce uygun eğitimi alın.

  1. Cihaz hazırlığı
    1. Görüntüleme sistemini, çevresel kontrol modülünü ve CO₂ gaz kaynağını görüntülemeden en az 1 saat önce açın.
    2. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımındaki Çevresel Kontrol (Environment Control) panelini açın.
    3. Sıcaklığı 37°C ve CO₂ değerini %5 olarak ayarlayın.
    4. Plakayı yüklemeden önce oda sıcaklığının ± 0.2°C ve CO₂ değerinin %5.0 ± 0.1% aralığında stabilize olduğunu doğrulayın.
  2. Plaka kurulumu
    1. 24 kuyucuklu plakayı görüntüleme sisteminin görüntüleme odasına yerleştirin.
  3. İlk yapılandırma
    1. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımının Görev Yöneticisini (Task Manager) açın.
    2. [Imager manual mode] seçeneğini belirleyin.
    3. Görüntüleme parametrelerini başlatmak için [Capture now] düğmesine tıklayın.
    4. 10× objektif seçin.
    5. Filtre ayarı olarak mikroplakayı (microplate) seçin.
    6. Otomatik canlı hücre görüntüleme yazılımının plaka kütüphanesinden 24 kuyucuklu bir plaka seçin.
  4. Odaklama ve görüntü kurulumu
    1. Faz Kontrast (Phase Contrast) kanalını seçin.
    2. Temsili bir kuyucuk (örneğin A1) seçin.
    3. Zaman atlamalı (time-lapse) görüntüleme öncesinde otomatik odaklamayı (autofocus) etkinleştirin.
    4. Kamera simgesini kullanarak bir görüntü yakalayın.
    5. Hücre morfolojisini ve odak kalitesini doğrulayın.
    6. [Process/Analyze] sekmesine gidin.
    7. Deneyi yapılandırmak için [Create experiment from an image set] seçeneğini belirleyin.
  5. Zaman atlamalı görüntüleme parametreleri
    1. [Procedure] ayarlar panelini açın.
    2. Sıcaklığı 37°C ve CO₂ değerini %5 olarak ayarlayın.
    3. [Start Kinetic] kısmında, çalışma süresini 16:00:00 olarak ayarlayın.
    4. Görüntüleme aralığını 0:10:00 olarak ayarlayın.
    5. Toplam okuma sayısını 97 olarak ayarlayın.
    6. Erken fagositoz olaylarını yakalarken zamansal çözünürlük ve fototoksisiteyi dengelemek için 10–15 dk görüntüleme aralığı kullanın.
  6. Görüntüleme kanalı yapılandırması
    1. Kanal 1'i Faz Kontrast olarak ayarlayın.
    2. Kanal 2'yi GFP (Ex 469/35, Em 525/39) olarak ayarlayın.
    3. Optimal görüş alanı ve çözünürlük için 10× objektif seçin.
    4. Aydınlatmayı, entegrasyon süresini ve kazancı (gain) [Auto] olarak ayarlayın veya manuel olarak düzenleyin.
    5. Sinyal doygunluğunu önlemek için tipik 100–300 ms GFP pozlama süresi kullanın.
    6. Tüm kuyucuklarda aynı görüntüleme ayarlarını uygulayın.
  7. Görüntüleme pozisyonu kurulumu
    1. [Define beacons] menüsünü açın.
    2. Z-stack görüntülemeyi devre dışı bırakın.
    3. Montaj (montage) görüntülemeyi devre dışı bırakın.
    4. Görüntülemeyi tek bir odak düzleminde gerçekleştirin.
    5. Mikroskop simgesini kullanarak her kuyucuk içinde temsili, örtüşmeyen bölgeler seçerek görüntüleme pozisyonlarını manuel olarak belirleyin.
    6. Tüm zaman noktalarında aynı görüntüleme pozisyonlarını koruyun.
    7. Kuyucuk başına en az 4–6 görüş alanı seçin.
  8. Zaman atlamalı görüntüleme
    1. Otomatik zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmak için [Play] düğmesine tıklayın.
  9. Veri dışa aktarma ve görselleştirme
    1. Görüntüleme sonrası kaydedilen deney dosyasını açın.
    2. Görüntüleme pozisyonlarını seçin.
    3. Zaman atlamalı verileri MP4 formatında dışa aktarın.
    4. [Process Tool] aracını açın.
    5. Görselleştirmeyi artırmak ve temsili fagositoz olaylarını tanımlamak için gerekirse [Image Deconvolution] uygulayın.
      NOT: Zaman atlamalı görüntülemeyi yalnızca kalitatif görselleştirme için kullanın. Yutulmamış GFP-pozitif kanser hücreleri makrofajlarla örtüşebilir veya geçici olarak ilişkilendirilebilir, bu da yanlış pozitif sinyallere yol açabilir. Kantitatif analiz için ayrı bir son nokta (endpoint) deneyi gerçekleştirin.

7. Bitiş Noktası Fagositoz Quantifikasyonu

  1. İçselleştirilmemiş hücrelerin uzaklaştırılması
    1. Analizi özdeş ko-kültür koşulları altında gerçekleştirin.
    2. Deneyi 4 h süresinde sonlandırın.
    3. Kültür ortamını uzaklaştırın.
    4. PBS içinde 10 mM EDTA ekleyin.
    5. 37°C'de 5 min inkübe edin.
    6. İçselleştirilmemiş GFP-pozitif hücreleri uzaklaştırmak için PBS ile nazikçe yıkayın.
    7. Taze makrofaj ortamı ekleyin.
  2. Kantifikasyon için görüntüleme
    1. Faz kontrast ve GFP kanallarını kullanarak görüntüler elde edin.
    2. Kuyu başına en az 4–6 görüş alanı yakalayın.
    3. Koşul başına en az üç kuyuyu analiz edin.
  3. Fagositoz olaylarının tanımlanması
    1. Hücresel sınır içinde tamamen kapalı GFP-pozitif sinyaller içeren makrofajları tanımlayın.
  4. Görüntü analizi
    1. Görüntüleri ImageJ yazılımında açın.
    2. Cell Counter eklentisini kullanın.
    3. Toplam makrofaj sayısını belirleyin.
    4. İçselleştirilmiş GFP-pozitif hücreler içeren makrofaj sayısını belirleyin.
  5. Fagositoz indeksinin hesaplanması
    1. Hesaplayın: Fagositoz indeksi formülü; yutulan GFP-pozitif hücrelerin toplam makrofajlara oranı; denklem.
    2. Analizi körleme yöntemiyle gerçekleştirin.
    3. En az üç bağımsız deneyde tekrarlayın.
  6. Verilerin sunumu
    1. Temsili zaman ayarlı görüntüleri kronolojik olarak sunun (Şekil 2B ve Şekil 2C).
    2. Temsili bitiş noktası görüntülerini sunun (Şekil 3A ve Şekil 3B).

Fagositoz analizi: makrofaj ko-kültürü, anti-CD24 mAb; mikroskopi görüntüleri, veri grafiği karşılaştırması.
Şekil 3. Uç nokta analizi ile antikor bağımlı makrofaj fagositozunun nicelleştirilmesi. (A) GFP etiketli meme kanseri hücreleri ile 4 saat boyunca ko-kültür edilen makrofajların, ardından EDTA uygulaması kullanılarak yutulmamış hücrelerin uzaklaştırılmasından sonraki temsilci faz-kontrast ve GFP floresan görüntüleri. Makrofajları ve internalize edilmiş GFP-pozitif hedefleri belirlemek için faz kontrast ve GFP kanalları birleştirilmiştir. Makrofajlar (sayaç 0) ve GFP-pozitif yutucu makrofajlar (sayaç 1), ImageJ'deki Cell Counter eklentisi kullanılarak sayılmıştır. IgG kontrol koşulunda hiçbir fagositik olay gözlemlenmezken, anti-CD24 monoklonal antikor tedavisi, makrofajlar içinde aktif fagositozu belirten net hücre içi GFP-pozitif sinyallerle sonuçlanmıştır. Ölçek çubuğu = 200 µm. (B) Toplam makrofaj popülasyonuna oranla internalize GFP-pozitif hücreler içeren makrofajların yüzdesi olarak tanımlanan fagositoz indeksinin nicelleştirilmesi. Anti-CD24 monoklonal antikor, IgG kontrolüne kıyasla fagositoz indeksini anlamlı şekilde artırmıştır (0.00 ± 0.00%'ye karşı 18.76 ± 4.01%, ortalama ± SD; grup başına n = 6 alan; ***p < 0.001, Welch'in eşleştirilmemiş t-testi). Veriler en az üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PBMC'lerden makrofajların başarılı bir şekilde üretildiği ve polarize olduğu, morfolojik değerlendirme ve akış sitometrisi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 1). Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilen PBMC'ler, M-CSF takviyeli ortamda kültüre edilmiş ve 7. güne gelindiğinde karakteristik makrofaj morfolojisine sahip adherent hücreler elde edilmiştir. IFN-γ ve LPS ile stimülasyonun ardından hücreler, uygulanan koşullar altında aktivasyonla uyumlu bir fenotip sergilemiştir. Akış sit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokoldeki birkaç adım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, PBMC izolasyonunun kalitesi ve saflığı, makrofaj verimini ve diferansiyasyon verimliliğini doğrudan etkiler. Seyreltilmiş kanın Ficoll gradyanı üzerine dikkatlice katmanlanması ve fren kapatılarak santrifüjleme yapılması, buffy coat arayüzünün korunması için gereklidir. RBC lizininin yetersiz olması veya liz tamponu ile aşırı inkübasyon, PBMC canlılığını tehlikeye atacaktır. İkinci olarak, proinflamatuar ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Tayvan Eğitim Bakanlığı'nın (MOE) Yüksek Eğitim Filiz Projesi (Higher Education Sprout Project) kapsamındaki Öne Çıkan Alanlar Araştırma Merkezi Programı aracılığıyla, Çin Tıp Üniversitesi Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapi Merkezi tarafından desteklenmiştir (CBPTC-PROJ-5-2).

Fon sağladıkları ve akademik destek verdikleri için Kanser Biyolojisi ve Hassas Terapötikler Merkezi'ne teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) stok çözeltisiSigma-Aldrich (veya eşdeğeri)E7889 (veya eşdeğeri)Hücre ayırma işlemi için PBS içerisinde 10 mM EDTA çalışma çözeltisi hazırlamak amacıyla kullanılır
24 kuyucuklu doku kültürü plakaları (TC-işlemli)Corning (veya eşdeğeri)3524Fagositoz testi sırasında makrofajların ve kanser hücrelerinin ko-kültürü için kullanılır
Anti-insan CD206 antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)321122 (veya eşdeğeri)Alternatif makrofaj fenotipi belirteci
Anti-insan CD24 monoklonal antikoruThermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)MA1-91384 (veya eşdeğeri)Antikor bağımlı fagositoz için kanser hücrelerini opsonize etmek amacıyla kullanılır
Çevresel kontrol odacıklı otomatik canlı hücre görüntüleme sistemi (örneğin, Lionheart FX)Agilent Technologies (veya dengi)BioTek Lionheart FX Otomatik MikroskopKontrollü sıcaklık ve [eksik metin] altında uzun süreli zaman atlamalı görüntülemeye olanak tanır 2 koşullar
Otomatik canlı hücre görüntüleme için görüntüleme yazılımı (örneğin, Gen5)Agilent Technologies (veya eşdeğeri)Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Time-lapse görüntüleme verilerinin elde edilmesi ve analizi için kullanılır
Santrifüj (salıncak kovalı rotor)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)TX-1000 rotorlu (veya eşdeğeri) Multifuge X4R ProPBMC izolasyonu ve hücre yıkama basamakları için kullanılır
2 inkübatör (37°C, %5 2)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)Forma Doğrudan Isıtma 2 İnkübatör (veya eşdeğeri)Hücre kültürü için fizyolojik koşulları korur
2 regülatörlü gaz kaynağıAgilent Technologies (veya eşdeğeri)Giriş yok.Malzemeler 2 inkübatör ve görüntüleme sistemi çevresel kontrolü için
Konik tüpler (15 mL ve 50 mL)Corning (veya eşdeğeri)352070 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu, yıkama ve santrifüjleme adımları için kullanılır
EDTA kaplı kan toplama tüpleri (vakutaynerler)BD Biosciences (veya eşdeğeri)367863 (veya eşdeğeri)Donörlerden tam kan örnekleri toplamak için kullanılır
Ficoll-Paque PLUSCytiva (veya eşdeğeri)17144003 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu için yoğunluk gradyanı medyumu
Akış sitometresi (örn. FACSCanto II)BD Biosciences (veya eşdeğeri)BD FACSCanto II Makrofajların fenotipik analizi için kullanılır
Kompanzasyon boncukları (akış sitometrisi)Biolegend (veya eşdeğeri)424602Tek renkli kompanzasyon kontrolleri için kullanılır
FITC anti-human CD11b antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)101205 (veya eşdeğeri)Makrofajları tanımlamak için kullanılan belirteç
PE anti-insan CD80 antikoru (akış sitometrisi)BioLegend (veya eşdeğeri)375410 (veya eşdeğeri)Aktive makrofaj fenotipi ile ilişkili marker
GFP eksprese eden meme kanseri hücre hattı (MDA-MB-468)ATCC (veya eşdeğeri)HTB-132 (veya eşdeğeri)Fagositoz analizinde kullanılan hedef hücreler; GFP görselleştirmeyi sağlar
ImmunoCult-SF makrofaj besiyeriSTEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)10961 (veya eşdeğeri)Makrofaj farklılaşması için kullanılan serumsuz ortam
Dulbecco’Dulbecco Modifiyeli Eagle Ortamı (DMEM)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)12100046Kanser hücrelerinin kültürü ve resüspansiyonu için kullanılır
İzotip kontrol antikoru (IgG)Bio X Cell (veya eşdeğeri)BE0297 (veya eşdeğeri)Antikor bağımlı fagositoz testi için negatif kontrol
Lipopolisakkarit (LPS)Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri)L2630 (veya eşdeğeri)IFN- ile kombinasyon halinde makrofajları aktive etmek için kullanılan stimülüsγ
Rekombinant insan interferon gama (IFN-γ)STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)78020 (veya eşdeğeri)Makrofaj aktivasyonu için kullanılan sitokin
Rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF)STEMCELL Technologies (veya eşdeğeri)78057 (veya eşdeğeri)Makrofaj farklılaşması için kullanılan büyüme faktörü
Pasteur pipetleri veya serolojik pipetlerJetbiofil (veya eşdeğeri)GSP010010 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu ve hücre kültürü sırasında sıvı aktarımı için kullanılır
PBS (Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen)2+-/Mg2+-içermeyen)Thermo Fisher Scientific (veya eşdeğeri)BP399-500 (veya eşdeğeri)Hücrelerin yıkanması ve dilüsyon basamakları için kullanılan tampon çözelti
Petri kapları (100 mm, non–doku kültürü işleminden geçmiş)Corning (veya eşdeğeri)430591Adherans seçimi yoluyla makrofaj farklılaşması için kullanılır
Kırmızı kan hücresi (eritrosit) liziz tamponuBioLegend (veya eşdeğeri)420301 (veya eşdeğeri)PBMC izolasyonu sırasında kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için kullanılır
Viability 405/452 Sabitleyici BoyaMiltenyi Biotec (veya eşdeğeri)130-130-404 (veya eşdeğeri)Akış sitometrisi analizi sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılır
DAPISigma-Aldrich (veya eşdeğeri)D9542 (veya eşdeğeri)Akış sitometrisinde ölü hücrelerin dışlanması için kullanılır

Kaynaklar

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Antikor Ba ml FagositozYe il Floresan ProteinCD24 Eksprese Eden H crelerCanl H cre G r nt lemeMonoklonal Antikor OpsonizasyonuU Nokta AnaliziKanser mm noterapisi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.