Murin Beyin Bölgelerinde Morfolojik Gözlem ve Kombine RNA-Protein Ekstraksiyonu için Hemisfer Ayırmalı Bir Protokol

Özet

Bu protokol, fare beyinlerini ikiye ayırır. Yarım kürelerden biri morfolojik boyama için, diğeri ise RNA ve protein ekstraksiyonu için kullanılır. Bu strateji, hayvan tüketimini azaltır, 3R ilkelerine uyar ve hayvanlar arası varyasyonu minimize eder.

Özet

Günlük nörobilim araştırmalarında, morfolojik boyama ve nükleik asit/protein moleküler analizleri tipik olarak ayrı deney hayvanları gerektirir; bu durum hayvan kullanımını artırır ve 3R hayvan refahı ilkesiyle uyumsuzdur. Bu protokol, tek bir hayvandan eşleştirilmiş morfolojik ve moleküler analizlere olanak tanıyan fare beyin dokusu için bir doku tahsis iş akışı oluşturmaktadır. %0,9 saline ile transkardiyal perfüzyondan sonra beyin, iki hemisfer şeklinde ikiye bölünür. Bir hemisfer, immünohistokimya ve immünofloresan için %4 paraformaldehit ile sabitlenir; sükroz-etilen glikol-polivinilpirolidon (PVP) çözeltisinde saklanan kesitler, yedi yıla kadar güvenilir boyama kalitesini korur. Kontralateral hemisfer, kombine RNA ve protein ekstraksiyonu için -80 °C'de kriyoprezerve edilir ve elde edilen verimler downstream qPCR ve Western Blot için yeterlidir. 9–10 mg entorinal korteks punch'ları üzerinde test edilen bu yöntem, RNA veya proteinin ayrı ayrı ekstraksiyonuna göre daha düşük RNA ve protein verimi üretmekle birlikte, geri kazanılan biyomoleküller moleküler tespit için yeterli kalmaktadır. Bu iş akışı, hayvan tüketimini azaltır ve eşleştirilmiş morfolojik ve moleküler analizler arasındaki bireyler arası farklılıkları ortadan kaldırır. Ayrık fare beyin alt bölgelerinin çok boyutlu profillenmesi için uygulanabilir bir doku hazırlama yöntemi sunar.

Giriş

Sinirbilim araştırmaları, son on yıllarda hızla genişleyerek insan beyin fizyolojisini, nörolojik hastalıkların başlangıcını ve terapötik geliştirmeleri yöneten temel mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. Hayvan modelleri; nöral gelişimi, fizyolojik fonksiyonları ve patolojik süreçleri araştırmak için kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir platformlar sağlayarak sinirbilimsel incelemeler için vazgeçilmez olmaya devam etmektedir. Fare deneklerdeki deneysel manipülasyonlar ve histolojik gözlemler, araştırmacıların nöronal sinyallemeyi, nöral devre oluşumunu ve nöral-davranışsal ilişkileri karakterize etmelerine olanak tanır. Teknik ilerlemelere paralel olarak, hayvan deneyleri etiği merkezi bir konu haline gelmiştir. 3R ilkeleri (Replacement - Yerine Koyma, Reduction - Azaltma ve Refinement - İyileştirme), araştırmacıların güvenilir deneysel sonuçları korurken hayvan kullanımını minimize etmelerini gerektiren, tüm hayvan çalışmaları için küresel olarak kabul görmüş standartlardır^1,2.

Koşullu nakavt sistemleri gibi yenilikçi araçlar, fare beyninin belirli alt bölgelerinde hassas genetik manipülasyona olanak tanır³. Bu gelişmeler; öğrenme, hafıza ve ruh halini düzenleyen hipokampal CA1, CA3 ve DG gibi mikro ölçekli beyin kompartmanları üzerine yapılan yoğun araştırmaları teşvik etmiştir⁴. Bu küçük beyin bölgelerinin yüksek düzeyli fonksiyonlarının çözümlenmesi; koordineli morfolojik, transkripsiyonel ve protein düzeyinde ölçümler gerektirir. Ne yazık ki, bu bölgelerin düşük doku hacmi, paralel çoklu indeks saptama işlemleri için önemli teknik engeller oluşturmaktadır.

Morfolojik boyama, RNA kantifikasyonu ve protein immünodeteksiyonu, nörobilimdeki üç rutin temel okumadır. Geleneksel araştırma tasarımları, bu üç test türünü tamamlamak için üç ayrı fare kohortu gerektirir. Bu uygulama, hayvan harcamalarını önemli ölçüde artırmakta ve histolojik ile moleküler veri setleri arasındaki karşılaştırılabilirliği zayıflatan ciddi hayvanlar arası biyolojik varyasyonlara yol açmaktadır. Tek bir hayvandan eşleşmiş morfolojik ve moleküler sinyallerin elde edildiği birleşik bir iş akışı, bu iki kritik kısıtlamayı büyük ölçüde giderecek ve 3R'nin Azaltma (Reduction) ilkesine daha iyi uyum sağlayacaktır.

Burada, fare beyin dokusu için tekrarlanabilir bir hemisferik ayırma protokolü sunmaktayız. Sistemik salin perfüzyonun ardından tüm beyin iki hemisfer olarak ayrılır: bir hemisfer morfolojik incelemeler için fikse edilir, kontralateral hemisfer ise eş zamanlı RNA ve protein ko-ekstraksiyonu için kriyoprezerve edilir. Sükroz-etilen glikol-polivinilpirolidon (PVP) koruyucu tamponu ile fikse edilen ve saklanan dokular, immünohistokimya ve immünofloresans için yedi yıla kadar stabil ve yüksek kaliteli boyama sinyallerini korumaktadır. Bu yöntemi, hipokampus ve prefrontal korteks gibi yaygın olarak araştırılan bölgelerden daha hafif olan, entorinal korteksten alınan küçük 9–10 mg'lık punch örnekleri kullanarak valide ettik. Bu kadar küçük bir doku örneğinin başarıyla tespit edilmesi, hipotalamus ve amigdala gibi daha küçük beyin alt bölgelerinin de bu iş akışıyla uyumlu olduğunu göstermektedir. Protokol, özel tek amaçlı ekstraksiyon kitlerinden daha düşük RNA ve protein konsantrasyonları üretse de, izole edilen biyomoleküller standart alt akış qPCR ve Western blot analizlerini destekleyecek yeterli kaliteye sahiptir. Bu iş akışı, hayvan kullanımını azaltmakta ve eşleştirilmiş morfolojik ve moleküler analizler arasındaki bireyler arası farkları ortadan kaldırmaktadır. Bu yöntem, ayrık fare beyin alt bölgelerinin çok boyutlu profillemesi için uygulanabilir bir doku hazırlama yöntemi sunar.

Protokol

Etik beyanı

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, Çin Halk Cumhuriyeti'ndeki Dalian Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (sıçan deneyleri için Onay No. AEE18026 ve fare deneyleri için No. AEE24261). Tüm deneysel protokoller, laboratuvar hayvanlarına yönelik etik kılavuzlar uyarınca uygulanmış ve hayvan deneyleri için 3R ilkelerine (Azaltma, Yerine Koyma ve İyileştirme) tam olarak uyulmuştur. Tüm deneysel süreç boyunca, hayvanların acı ve sıkıntılarını etkili bir şekilde hafifletmek için titiz önlemler alınmıştır. Aynı zamanda, deneysel hayvan sayısı, istatistiksel analiz sonuçlarının güvenilirliğini ve geçerliliğini sağlamak için gerekli olan minimum miktarla sınırlandırılmıştır. Bu protokolde kullanılan reaktiflerin, sarf malzemelerinin ve ekipmanların tam listesi için Malzemeler Tablosuna bakınız.

1. Deneysel hayvan hazırlığı ve transkardiyal perfüzyon cerrahisi

1. Anestezi ve ameliyat öncesi hazırlık
   1. Bu protokol için spesifik patojenden arındırılmış (SPF) derece yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları veya C57BL/6 fareleri kullanın. Hayvanları, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsüne sahip, sıcaklık kontrollü (22 ± 2 °C) bir ortamda barındırın. Hayvanların steril gıda ve suya ad libitum erişimini sağlayın.
   2. Anesteziyi başlatmak için hayvanlara intraperitonal enjeksiyon yoluyla sıçanlar için 80 mg/kg veya fareler için 50 mg/kg dozunda sodyum pentobarbital uygulayın (bkz. Şekil 1).
2. Transkardiyal perfüzyon prosedürü
   1. Anestezize edilmiş hayvanları cerrahi tabla üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
   2. Düz makas kullanarak karın duvarını kılıç çıkıntısından pubik simfize kadar orta hat boyunca kesin. Kalbi tamamen açığa çıkarmak için yan toraks duvarını bilateral olarak kesin.
   3. Hayvanı sabit bir akış hızında buz gibi 0.9% normal salin ile perfüze edin: sıçanlar için 10–15 dk boyunca 100–150 mL ve fareler için 5–8 dk boyunca 20–30 mL.
3. Beyin hasadı ve hemisfer ayırma
   1. Perfüzyon tamamlandıktan sonra hayvanları büyük cerrahi makasla dekapite edin. Kafatasını açığa çıkarmak için kafa derisini orta hat boyunca kesin.
   2. Beyni kranial boşluktan nazikçe kaldırmak için steril bir spatula kullanın. Tüm beyni hızla buz üzerine yerleştirilmiş steril bir Petri kabına aktarın.
   3. Beyni sagital sütür boyunca simetrik olarak sol ve sağ hemisferlere ayırmak için steril, RNaz-free bir jilet kullanın.
   4. Sol hemisferi fiksasyon için 10 mL buz gibi 4% paraformaldehit çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne derhal aktarın. Sağ hemisferi etiketlenmiş, RNaz-free bir kriyokoruma tüpüne aktarın, sıvı azot içerisinde şok dondurun ve RNA ve protein ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın.

2. Beyin dokusu fiksasyonu, kesit alma ve uzun süreli saklama

1. Fiksasyon ve dehidrasyon
   1. Sol hemisferi %4'lük paraformaldehit çözeltisine tamamen daldırın ve dokuyu 4 °C'de 24 sa boyunca fikse edin. Fiksasyon işlemi tamamlandıktan sonra beyin hemisferini, %30'luk sükroz çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu 4 °C'de dehidre edin.
   2. Beyin dokusu tüpün dibine çökene kadar %30'luk sükroz çözeltisini her 24 saatte bir yenileyin.
2. Kriyoseksiyon hazırlama
   1. Dehidre edilmiş beyin hemisferini sükroz çözeltisinden çıkarın ve fazla sıvıyı steril filtre kağıdı ile nazikçe kurulayın.
   2. Beyin hemisferini, optimal kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamı kullanarak kriyostat numune tablasına monte edin.
   3. Bir kriyostat kullanarak 30 µm kalınlığında seri koronal beyin kesitleri alın. Ardışık kesitleri steril 0.01 M PBS içeren 24 kuyucuklu bir plakada toplayın.
3. Beyin kesitlerinin uzun süreli saklanması
   1. Beyin dilimi kriyoprotektan koruma çözeltisini önceden hazırlayın: 100 mL 0.01 M PBS'ye 2 g PVP400, 60 g sükroz ve 60 mL etilen glikol ekleyin. Tüm bileşenler tamamen çözülene kadar çözeltiyi oda sıcaklığında karıştırın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.

3. TRIzol ile RNA ekstraksiyonu

1. Doku homojenizasyonu ve faz ayrımı
   1. Entorinal kortikal dokuyu, ultra ince bir homojenizatör kullanarak 1 mL TRIzol reaktifi içinde homojenize edin ve homojenatı 15 dk boyunca buz üzerinde inkübe edin. 4 °C'de 5 dk boyunca 8,000 × g hızda santrifüjleyin.
   2. 200 µL kloroform ekleyin ve 10 sn boyunca vorteksleyin. 4 °C'de 15 dk boyunca 5,600 × g hızda santrifüjleyin. Ardından üstteki sulu fazı RNase-free bir tüpe aktarın. RNA'yı çöktürmek için 500 µL izopropanol ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de inkübe edin. Tekrar santrifüjleyin.
2. RNA çöktürme, yıkama ve kalite değerlendirmesi
   1. Süpernatantı atın ve RNA peletini 1 mL %75 etanol ile yıkayın. 4 °C'de 5 dk boyunca 5,600 × g hızda santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, peleti 10 dk boyunca havada kurutun ve RNA'yı 20 µL DEPC işlem görmüş su içinde 10 dk boyunca çözün.
   2. Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ve saflığını (A₂₆₀/A₂₈₀) ölçün. RNA'yı daha sonraki analizlere kadar -80 °C'de saklayın.

4. Minute kiti ile toplam protein ekstraksiyonu

1. Doku lizizi ve homojenizasyonu
   1. Sütun ve toplama tüpünü buz üzerinde önceden soğutun. Dokuyu, ultra ince bir homojenizatör kullanarak 100 µL hücre liziz tamponu içinde homojenize edin. Homojenizatörü ek 100 µL hücre liziz tamponu ile durulayın ve lizatları birleştirin.
2. Protein geri kazanımı ve miktar tayini
   1. Homojenatı sütuna aktarın ve oda sıcaklığında 2 dk inkübe edin.
   2. 11,000–14,300 × g hızda 2 dk santrifüjleyin.
   3. Santrifüjden hemen sonra toplama tüpünü buz üzerine yerleştirin ve sütunu atın. Protein konsantrasyonunu BCA analizi kullanarak belirleyin.

5. Entorinal korteksten eş zamanlı RNA ve protein ekstraksiyonu (9–10 mg)

1. Deney öncesi hazırlık ve reaktif hazırlığı
   1. Tüm ekstraksiyon adımları için DNA/RNA/protein kitini kullanın. Yalnızca sertifikalı RNaz-free ve DNaz-free sarf malzemeleri kullanın (bkz. Şekil 2).
   2. Lizis tamponunu kullanmadan hemen önce hazırlayın: Kit ile birlikte verilen lizis tamponuna 1:100 dilüsyonunda proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.
2. Doku lizizi ve faz ayrımı
   1. Dondurulmuş sağ beyin hemisferini -80 °C depolama alanından çıkarın ve buza yerleştirin. Hedef beyin bölgesinden 9–10 mg doku toplamak için steril RNaz-free bir punch kullanın.
   2. Görünür doku parçası kalmayana kadar elektrikli bir doku homojenizatörü kullanarak dokuyu buz üzerinde tamamen homojenize edin. Tam lizis sağlamak için homojenatı buz üzerinde 10 dk inkübe edin.
   3. Homojenata kit ile birlikte verilen ayırma reaktifinden 200 µL ekleyin. Tüpü 30 sn boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve oda sıcaklığında 3 dk inkübe edin. Tam faz ayrımı elde etmek için tüpü 4 °C'de 8,000 × g hızda 15 dk santrifüjleyin.
3. RNA saflaştırma ve elüsyon
   1. Üstteki sulu fazı RNaz-free bir pipet ucu kullanarak dikkatlice toplayın. Toplanan sulu fazı yeni bir 1,5 mL RNaz-free tüpe aktarın. Toplanan sulu faza eşit hacimde %100 etanol ekleyin ve karıştırın.
   2. Karışımdan 700 µL'yi kit ile birlikte verilen RNA saflaştırma kolonuna aktarın. Kolonu oda sıcaklığında 5,600 × g hızda 1 dk santrifüjleyin.
   3. Kolona kit ile birlikte verilen 500 µL RNA yıkama tamponu 1 ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında 5,600 × g hızda 1 dk santrifüjleyin.
   4. Ardından kolona kit ile birlikte verilen 500 µL RNA yıkama tamponu 2 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Kolon membranındaki kalıntı etanolü tamamen uzaklaştırmak için boş kolonu oda sıcaklığında 8,000 × g hızda 2 dk santrifüjleyin.
   5. Kolonu yeni bir RNaz-free 1,5 mL mikrocentrifüj tüpüne aktarın. Kolon membranının merkezine doğrudan 30–50 µL RNaz-free su (60 °C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında 2 dk inkübe edin. RNA'yı elüye etmek için kolonu oda sıcaklığında 8,000 × g hızda 1 dk santrifüjleyin.
4. Protein presipitasyonu ve çözünürlük
   1. RNA ekstraksiyonu için sulu faz alındıktan sonra, orijinal tüpte kalan organik faza ve ara faza 750 µL isopropanol ekleyin. Proteinleri presipite etmek için karışımı -20 °C'de 30 dk inkübe edin.
   2. Tüpü 4 °C'de 8,000 × g hızda 10 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve protein peletini tüpün dibinde bütün halde tutun.
   3. Protein peletine 1 mL %95 etanol ekleyin. Peleti yıkamak için tüpü kısa süre vorteksleyin. Tüpü 4 °C'de 8,000 × g hızda 5 dk santrifüjleyin ve süpernatantı dökün. Bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
   4. Protein peletini, pelet yarı saydam hale gelene ve görünür kalıntı etanol kalmayana kadar oda sıcaklığında 5–10 dk boyunca havada kurutun.
   5. Kurutulmuş pelete 50–100 µL %5–10 SDS çözeltisi ekleyin. Proteini tamamen çözmek için tüpü 1 dk boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve buz üzerinde 10 dk inkübe edin. Tüpü 4 °C'de 8,000 × g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı final protein ekstraktı olarak toplayın.

6. İmmünohistokimya (IHC) boyama

1. Kesit ön işlemi ve endojen enzim inaktivasyonu
   1. Beyin kesitlerini -20 °C kriyoprotektan saklama ünitesinden çıkarın. Kesitleri 0.01 M PBS (pH 7.4) içeren 24 kuyucuklu bir plakaya aktarmak için cam iğne kullanın.
   2. Kesitleri oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde, her yıkama 5 dk olacak şekilde üç kez 0.01 M PBS ile yıkayın.
   3. Endojen peroksidaz aktivitesini inaktive etmek için kesitleri oda sıcaklığında 10 dk boyunca %3 hidrojen peroksit peroksidaz bloklayıcı ile inkübe edin. Bloklamadan sonra yıkama adımlarını tekrarlayın.
2. Permeabilizasyon ve spesifik olmayan bloklama
   1. Hücre membranı permeabilizasyonu için kesitleri oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 30 dk boyunca %0.5 Triton X-100 içinde inkübe edin. Yıkama adımlarını tekrarlayın.
   2. Kesitleri oda sıcaklığında 30 dk boyunca %4 sığır serum albümini içinde inkübe edin, ardından oda sıcaklığında 30 dk daha spesifik olmayan boyama inhibitörü ile inkübe edin.
3. Primer ve sekonder antikor inkübasyonu
   1. Primer antikorları %1 BSA solüsyonunda şu optimize edilmiş dilüsyonlarda seyreltin: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000) ve glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
   2. Her kuyucuğa, kesitlerin tamamen daldığından emin olarak 200 µL seyreltilmiş primer antikor solüsyonu ekleyin.
   3. Her kuyucuğa 200 µL biotin-işaretli sekonder antikor ekleyin. Kesitleri oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
   4. Kesitleri her yıkama 5 dk olacak şekilde üç kez 0.01 M PBS ile yıkayın. Her kuyucuğa 300 µL streptavidin-peroksidaz konjugatı ekleyin. Kesitleri oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin. İnkübasyondan sonra yıkama adımlarını tekrarlayın.
4. 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) kromojenik geliştirme ve lam kapatma
   1. Her kuyucuğa 200 µL DAB çalışma solüsyonu ekleyin. Kromojenik reaksiyonu ışık mikroskobu altında izleyin.
   2. Kesitleri cam iğne kullanarak jelatin kaplı cam lamların üzerine monte edin. Lamları oda sıcaklığında tamamen havada kurutun.
   3. Lamları dereceli bir etanol serisi (%50, %70, %90, %95, %100, %100 etanol, her biri 5 dk) ileyerekydehidre edin, ardından iki kez 5'er dk ksilen ile şeffaflaştırma işlemi uygulayın.

7. İmmünofloresan (IF) boyama

1. Kesit ön işlemi ve permeabilizasyon
   1. -20 °C kriyoprotektan saklama alanından beyin kesitlerini çıkarın. Kesitleri, 0.01 M PBS (pH 7.4) içeren 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın.
   2. Kesitleri oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde, her yıkama 5 dk olacak şekilde 0.01 M PBS ile üç kez yıkayın.
   3. Kesitleri oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde %0.5 Triton X-100 içerisinde 30 dk inkübe edin.
   4. Permebilizasyondan sonra kesitleri 0.01 M PBS ile, her yıkama 10 dk olacak şekilde üç kez yıkayın.
2. Bloklama ve primer antikor inkübasyonu
   1. Kesitleri %4 BSA ve spesifik olmayan boyama inhibitörü içeren bir bloklama solüsyonunda, oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir hazne içerisinde 1 sa boyunca inkübe edin.
   2. Bloklama solüsyonunu aspire edin. Primer antikorları optimize edilmiş konsantrasyonlarda %1 BSA solüsyonunda seyreltin ve her kuyucuğa 300 µL seyreltilmiş primer antikor solüsyonu ekleyin. Kesitleri 4 °C'de, nemlendirilmiş ve ışık geçirmeyen bir hazne içerisinde gece boyunca inkübe edin.
3. Sekonder antikor inkübasyonu
   1. Ertesi gün kesitleri karanlıkta, oda sıcaklığında 1 sa boyunca ısıtın. Primer antikor solüsyonunu geri alın ve kesitleri karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde, her yıkama 10 dk olacak şekilde 0.01 M PBS ile üç kez yıkayın.
   2. Florofor konjuge sekonder antikorları, üreticinin önerdiği seyreltme oranında %1 BSA solüsyonunda seyreltin. Her kuyucuğa 300 µL sekonder antikor solüsyonu ekleyin. Kesitleri karanlıkta, oda sıcaklığında 1–2 sa inkübe edin.
   3. Kesitleri karanlıkta, her yıkama 5 dk olacak şekilde 0.01 M PBS ile beş kez yıkayın.

8. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizi

1. RNA gDNA temizleme ve ters transkripsiyon
   1. Bir ters transkripsiyon kiti kullanarak, 20 µL'lik reaksiyon sistemi başına 1 µg toplam RNA ile cDNA sentezlemek için ters transkripsiyon gerçekleştirin. Üreticinin önerdiği termal döngü programını uygulayın: 25 °C'de 5 dk, 50 °C'de 15 dk, 85 °C'de 5 dk ve 4 °C'de bekletme.
   2. Sentezlenen cDNA'yı RNase-free su ile 1:5 oranında seyreltin. cDNA'yı qPCR amplifikasyonuna kadar -20 °C'de saklayın.
2. qPCR sistem hazırlığı ve amplifikasyon
   1. qPCR reaksiyon sistemini, özel bir RNase-free PCR kabininde buz üzerinde hazırlayın. 20 µL'lik reaksiyon sistemi şunları içerir: 10 µL qPCR Master Mix, 0,4 µL ileri primer (10 µM), 0,4 µL geri primer (10 µM), 2 µL seyreltilmiş cDNA kalıbı, 7,2 µL RNase-free su.
   2. Aşağıdaki programı kullanarak qPCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 30 saniye 95 °C'de başlangıç denatürasyonu; 95 °C'de 10 saniye ve 60 °C'de 30 saniye şeklinde 40 döngü; ardından 60 °C'den 95 °C'ye kadar, her 5 saniyede 0,5 °C artışlarla disosiyasyon eğrisi analizi.

9. Western blot

1. Protein kantifikasyonu ve numune hazırlama
   1. BCA analiz sonuçlarına dayanarak, protein ekstraktlarını %5–10'luk SDS çözeltisi kullanarak eşit konsantrasyonlara seyreltin.
2. SDS-PAGE elektroforezi ve protein transferi
   1. Standart moleküler biyoloji protokollerine uygun olarak %10'luk bir SDS-PAGE ayırma jeli ve %5'lik bir toplama jeli hazırlayın.
   2. Jeldeki her kuyuya 20 µg toplam protein yükleyin. Gradyan yükleme deneyleri için her kuyuya 15 µg, 30 µg ve 45 µg protein yükleyin.
   3. Protein markörü ayırma jeline girene kadar 30 dk boyunca 80 V'da elektroforez gerçekleştirin, ardından bromofenol mavisi boya jelin altına ulaşana kadar voltajı 60–90 dk boyunca 120 V'a yükseltin.
   4. Transfer sandviçini şu sırayla (katottan anoda doğru) oluşturun: sünger, filtre kağıdı, jel, PVDF membran, filtre kağıdı ve sünger. Jel ile membran arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
   5. Buz banyosunda 90 dk boyunca 300 mA sabit akımda ıslak transfer gerçekleştirin.
3. Membran bloklama ve antikor inkübasyonu
   1. Transfer tamamlandıktan sonra PVDF membranı kısa bir süre TBST tamponu ile durulayın. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloklamak için membranı, oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca %5'lik BSA içinde inkübe edin.
   2. Primer antikorları optimize edilmiş konsantrasyonlarda %5'lik BSA çözeltisi ile seyreltin. Membranı, primer antikor çözeltisi ile birlikte 4 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin.
   3. Ertesi gün membranı, bir çalkalayıcı üzerinde her yıkama 10 dk olacak şekilde üç kez TBST tamponu ile yıkayın.
   4. Yaban turbu peroksidaz (HRP)-konjuge sekonder antikoru, üreticinin önerdiği seyreltme oranında %5'lik yağsız süt çözeltisi ile seyreltin. Membranı, sekonder antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca inkübe edin.
   5. Sekonder antikor inkübasyonundan sonra membranı, her yıkama 10 dk olacak şekilde üç kez TBST tamponu ile yıkayın. Membranı, karanlıkta 1–2 dk boyunca ECL substrat çözeltisi ile inkübe edin.

Sonuçlar

RNA konsantrasyonunun belirlenmesi, agaroz jel elektroforezi ve qPCR

Gösterildiği gibi, toplam RNA ve protein, DNA/RNA/protein kiti kullanılarak entorinal korteks (9–10 mg) punchlarından birlikte ekstrakte edilmiştir. TRIzol (RNA) veya protein ekstraksiyon kiti ile işlenen paralel örnekler kontrol olarak kullanılmıştır. Protokol sonucunda, TRIzol'den % 36 daha az olan (p < 0.05) 235 ± 12 ng µL⁻¹ RNA elde edilmiştir (Şekil 3A). Buna rağmen, agaroz jeller net 28S ve 18S rRNA bantları ile 5S sinyalleri ortaya koyarak RNA'nın bütün olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). CD86, IL-1β, TNF-α ve IL-6 için yapılan qPCR, tek ve simetrik disosiyasyon eğrileri üretmiş (Şekil 3C) ve grupta daha düşük Ct değerleri gözlemlenmiştir (Şekil 3D); ancak bu farklılıkların geliştirilmiş RNA kalitesini mi yoksa ekstraksiyon verimliliğini mi yansıttığını belirlemek için RNA bütünlük analizlerini içeren ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. RNA verimi TRIzol ekstraksiyonu ile elde edilenden daha düşük olsa da, belirgin 28S ve 18S rRNA bantları ile spesifik qPCR amplifikasyon eğrileri, ekstrakte edilen RNA'nın sonraki qPCR analizleri için yeterli kalitede olduğunu göstermiştir.

Protein konsantrasyonunun değerlendirilmesi, SDS-PAGE ve Western blot analizi

RNA verileriyle tutarlı olarak, çift ekstraksiyon protokolü, protein kitiyle karşılaştırıldığında daha düşük toplam protein konsantrasyonları sağlamıştır (p < 0.05). Buna rağmen, Western blot analizleri incelenen her hedef için belirgin şekilde daha güçlü immünoreaktif bantlar ortaya çıkarmıştır (Şekil 4A). RNA nicelik belirleme sonuçlarıyla tutarlı olarak, RNA–protein ko-ekstraksiyon protokolü, CBB tüm protein boyamasıyla gözlemlenebileceği üzere, tek amaçlı protein kitinden daha az toplam protein geri kazanımı sağlar (Şekil 4B–C). Housekeeping protein β-Tubulin, her iki ekstraksiyon yönteminde de benzer sinyal yoğunluğuna sahip, net ve stabil bantlar göstermiştir. Düşük bolluktaki ULK proteini de ko-ekstraksiyonla elde edilen örneklerde başarıyla tespit edilmiştir. Özellikle PSD-95, p-ERK ve p-NFκB p65 bant sinyalleri, tekli protein ekstraksiyon kitine kıyasla ko-ekstraksiyon grubunda belirgin şekilde daha güçlüydü. 15 µg'dan 45 µg'a kadar yapılan seri protein yüklemesi, her iki gruptaki tespit edilen tüm hedefler için doza bağımlı bant gradyanları oluşturmuştur. Toplu olarak değerlendirildiğinde, çift ekstraksiyon iş akışının toplam protein verimi daha düşük olsa da, protein kalitesi standart Western blot analizi için yeterlidir ve genel tespit performansı geleneksel tekli protein ekstraksiyon kitlerinden daha düşük değildir.

İmmünohistokimya ve immünofloresan

0,5–7 yıl boyunca saklanan beyin kesitleri üzerinde yapılan immünohistokimya; sağlam morfolojiye ve liflere sahip DCX⁺ yeni doğmuş nöronların, AVP⁺ salgılayıcı hücrelerin ve MAP2/NeuN⁺ nöronların güçlü şekilde etiketlendiğini ortaya koymuştur (Şekil 5A). 5–7 yıllık kesitlerin immünofloresansı; belirgin GFAP⁺ astrositler, Iba-1⁺ mikroglialar ve FosB⁺ aktive nöronlar göstermiştir (Şekil 5B). 0,5–yedi yıl boyunca saklanan temsilci kesitler, test edilen koşullar altında tespit edilebilir immünohistokimyasal ve immünofloresan sinyallerini korumuştur. Böylece, koruma solüsyonu doku bütünlüğünü ve antijenisitesini koruyarak güvenilir uzun süreli saklamayı mümkün kılmaktadır.

Şekil 1: Beyin morfolojik ve moleküler tespiti için entegre hemisfer ayırma iş akışı. Bu şema; kemirgen transkardiyal salin perfüzyonu, izole edilmiş tüm beynin orta hattan ikiye bölünmesi, sol hemisferin IHC/IF boyaması için fiksasyonu ve kriyoseksiyon hazırlığı ile karşıt hemisferin sonraki eş zamanlı RNA-protein ko-ekstraksiyonu, qPCR ve Western blot analizi için kriyoprezervasyonu dahil olmak üzere tüm deneysel süreci göstermektedir. Tüm fare çizimleri orijinal olarak Jimeng AI tarafından oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dondurulmuş kemirgen beyin dokusundan eş zamanlı RNA ve protein ko-ekstraksiyon iş akışı. Diyagram; dondurulmuş hemisferlerden hedef doku punchlanmasını, doku lizisini ve üç fazlı ayırmayı, qPCR için RNA saflaştırma ve elüsyonunu, ayrıca Western blot tespiti için örnekleri hazırlamak üzere protein presipitasyonunu, yıkamasını ve çözündürülmesini kapsayan ardışık adımları göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mikro ölçekli sıçan entorinal korteks örnekleri kullanılarak RNA veriminin, RNA bütünlüğünün ve qPCR uyumluluğunun değerlendirilmesi. (A) Ko-ekstraksiyon kiti ile TRIzol yöntemi aracılığıyla elde edilen RNA konsantrasyonlarının miktarları (ortalama ± SEM). (B) Her iki ekstraksiyon grubundan elde edilen sağlam 28S ve 18S rRNA bantlarını gösteren agaroz jel elektroforezi. (C) Tekil erime eğrileri, hedef inflamatuar genlerin ve referans gen olarak GAPDH'nin spesifik amplifikasyonunu doğrulamaktadır. (D) İki farklı ekstraksiyon yöntemi boyunca aynı RNA girdisi altında tespit edilen inflamatuar genlerin Ct değerleri. *p < 0.05, **p < 0.01 TRIzol grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: RNA/protein eş-ekstraksiyon protokolü ile geri kazanılan proteinlerin Western blot değerlendirmesi. (A) Sinaptik ve sinyal proteinlerinin doza bağımlı bant sinyallerini gösteren gradyan protein yüklemesi (15/30/45 µg). (B) Yükleme referansı olarak CBB toplam protein boyama ile ULK1 yüksek moleküler ağırlıklı protein tespiti. (C) İki farklı ekstraksiyon iş akışı arasında hedef proteinlerin eşit yüklemeli Western blot karşılaştırması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 0,5–7 yıl boyunca saklanmış serbest yüzen beyin kesitlerinin immünohistokimyasal ve immünofloresan boyamaları. (A) 200× ve 400× büyütmede yakalanmış parlak alan immünohistokimyasal boyama mikrografları. DCX ve AVP boyamaları fare doku örneklerinde, MAP2 ve NeuN boyamaları ise sıçan doku örneklerinde gerçekleştirilmiştir. (B) Sıçan doku örneklerinden elde edilen temsilci immünofloresan görüntüler. GFAP astrositleri, IBA-1 mikrogliaları etiketler ve FOSB nöronal aktiviteyi belirtir. Bu panelde gösterilen tüm immünofloresan boyama deneyleri, nöronal belirteç ekspresyonunu ve hücresel lokalizasyonu değerlendirmek için sıçan örnekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir, mikrograflar 200× büyütmededir.  Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Fare araştırmalarında, morfolojik analizler ve nükleik asit/protein analizleri, farklı hazırlama prosedürleri nedeniyle genellikle ayrı hayvan örnekleri gerektirir. Bu durum, hayvan kullanımını artırır ve histolojik ile moleküler veri setleri arasındaki karşılaştırılabilirliği azaltabilecek hayvanlar arası biyolojik varyasyona yol açar. Bu sınırlamaları gidermek için, histolojik ve moleküler verilerin aynı hayvandan elde edilmesini sağlayan bir iş akışı geliştirdik.

Bu iş akışının temel tasarımı, %0.9'luk saline ile transkardiyal perfüzyon sonrası beyin dokusunun hemisferik olarak tahsis edilmesidir^5,6. Bir hemisfer, immünohistokimya ve immünofloresan için %4'lük paraformaldehit ile fikse edilirken, kontralateral hemisfer daha sonraki RNA-protein ko-ekstraksiyonu, qPCR ve Western blotting işlemleri için −80 °C'de saklanır. Ancak, seçilen okumalar iki serebral hemisfer arasında tamamen karşılaştırılabilir olmayabilir. Kemirgen beyinlerinde yapısal ve fonksiyonel lateralizasyon belgelenmiştir ve bu tür hemisferik farklılıklar, analizler karşıt taraflarda gerçekleştirildiğinde değişkenliğe yol açabilir^7,8. Bu nedenle, araştırmacılar araştırma amaçları doğrultusunda tutarlı bir şekilde aynı serebral hemisferden doku seçmelidir.

Bu yöntemin öne çıkan bir avantajı, fikse edilmiş, yüzer beyin kesitlerinin uzun süreli korunmasıdır. %30 sakkaroz ile susuzlaştırmanın ardından, 30 µm koronal kesitler bir sakkaroz-etilen glikol-PVP koruma çözeltisinde saklanır. Önceki çalışmalar, sakkaroz-etilen glikol-PVP kriyoprotektan çözeltilerinin uzun süreli saklama sırasında doku morfolojisinin ve antijenisitenin korunmasına yardımcı olduğunu göstermiştir^9,10. Ancak, birkaç yıldır devam eden saklama sürelerini değerlendiren çok az çalışma yapılmıştır. Laboratuvar verilerimiz bu bulguları genişletmektedir: test edilen koşullar altında yedi yıla kadar saklanan temsili kesitler, tespit edilebilir immünohistokimyasal ve immünofloresan sinyalleri korumuştur. Bu gözlemler, yüzer beyin kesitlerinin retrospektif analizler ve takip deneyleri için birkaç yıl boyunca saklanmasının fizibilitesini desteklemektedir.

Özellikle bu iş akışı, tek bir dondurulmuş beyin hemisferinden gerçekleştirilen çift RNA-protein ko-ekstraksiyonu aracılığıyla başka bir temel avantaj sunmaktadır. Bu ko-ekstraksiyon protokolü, geleneksel tek hedefli ekstraksiyon yöntemlerine göre biraz daha düşük RNA ve protein miktarları verse de, elde edilen biyomalzemeler güçlü qPCR ve Western blot deteksiyonu için hâlâ yeterlidir. Kritik olarak, ko-ekstraksiyon, transkript ve protein bolluğunun özdeş doku örneklerinden quantify edilmesine olanak tanıyarak, ayrı örnek işlemeden kaynaklanan biyolojik varyasyonu ortadan kaldırır ve oldukça tutarlı, entegre moleküler profillendirme sağlar^11,12. Ayrıca bu yaklaşım, yalnızca yaklaşık 9–10 mg'lık küçük bir doku kütlesi gerektirdiğinden, örnek kullanılabilirliğinin sınırlı olduğu ayrı, bölgeye özgü beyin alt popülasyonlarının analizleri için oldukça uygundur.

Bu önemli avantajlarına rağmen, bu yöntemin kabul edilmesi gereken belirli kısıtlamaları da vardır. İlk olarak, nispeten düşük RNA ve protein verimleri, büyük ölçekli protein saflaştırma veya yüksek derinlikli RNA dizileme gibi büyük miktarlarda nükleik asit veya protein gerektiren deneyler için uygulanabilirliğini kısıtlayabilir. İkinci olarak, uzun süreli kesit saklama yedi yıla kadar etkili olsa da, bazı labil antijenlerin veya nükleik asitlerin kademeli bozunması uzun süreler boyunca hala gerçekleşebilir ve bu durum boyama yoğunluğunu veya moleküler tespit hassasiyetini tehlikeye atabilir. Üçüncü olarak, yöntem şu anda fare beyin dokusu için optimize edilmiştir ve doku bileşimi ile yapısal özelliklerin türler ve organlar arasında farklılık göstermesi nedeniyle, diğer dokulara veya alternatif hayvan modellerine uygulanması için modifikasyon gerektirebilir. Son olarak, %5–10 SDS; kütle spektrometrisi, enzim aktivite analizleri, protein–protein etkileşim çalışmaları^13,14 ve diğer SDS'ye duyarlı uygulamalarla etkileşime girebilir. Bu nedenle, ek deterjan giderme veya tampon değişimi prosedürleri gerekebilir.

Sonuç olarak, bu hemisferik tahsis iş akışı, hayvan kullanımını ve hayvanlar arası varyasyonu azaltırken aynı hayvandan eşleşmiş morfolojik ve moleküler analizlerin yapılmasını sağlar. Bu iş akışı, özellikle doku miktarının sınırlı olduğu durumlarda, eşleşmiş histolojik ve moleküler analizler gerektiren çalışmalarda faydalı olacaktır. Kesitlerin uzun süreli saklanabilme özelliği, retrospektif analizleri ve standartlaştırılmış örnek arşivlemeyi kolaylaştırabilir; küçük beyin bölgesi örneklerinin kullanımı ise bölgeye özgü araştırmaları destekler. Temel kısıtlamaları ise daha düşük RNA ve protein verimleri, potansiyel hemisferik asimetri, fare beyin dokusuyla sınırlı olması ve SDS'ye duyarlı uygulamalarla sınırlı uyumluluğudur. Gelecekteki çalışmalar biyomolekül geri kazanımını optimize etmeli, iş akışını diğer doku ve türlerde doğrulamalı ve ek moleküler hedeflerin uzun süreli stabilitesini değerlendirmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL RNaz içermeyen mikro santrifüj tüpleri	Axygen	MCT-150-C-S	Doku punch örneklerinin toplanması ve RNA/protein ekstraksiyon fraksiyonları.
15 mL konik santrifüj tüpleri	Biofilm	CFT010150	Fiksasyon, sükroz ile dehydrasyon ve solüsyon saklama.
24 kuyucuklu hücre kültür plakaları	NEST	702001	Serbest yüzen beyin kesitlerinin toplanması, boyanması ve uzun süreli saklanması.
%30'luk sakroz çözeltisi	Laboratuvarda hazırlanmıştır	Metin sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynağı giriniz.	Kriyoseksiyon öncesinde fikse edilmiş beyin hemisferlerinin kriyokoruması.
%4'lük paraformaldehit çözeltisi	Biosharp	BL539A	Morfoloji için belirlenen beyin yarımküresinin daldırma yöntemiyle fiksasyonu.
5× protein yükleme tamponu	Beyotime Biotechnology	DL101	SDS-PAGE için protein örneklerinin hazırlanması.
Agaroz	Solarbio	Kat: A8201	Agaroz jel elektroforezi ile RNA bütünlük değerlendirmesi.
Anti-doublekortin antikoru	Abcam	ab18723	Doublecortin immünohistokimyası için primer antikor.
Anti-ERK antikoru	Beyotime	AB2014	Total ERK Western blotting için primer antikor.
Anti-GFAP antikoru	Abcam	ab10062	Glial fibrilöz asidik protein immünofloresansı için primer antikor.
Anti-Iba1 antikoru	Wako	NCNP24	İyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül 1 immünofloresansı için primer antikor.
Anti-NeuN antikoru	Millipore	A60	Nöronal nükleer antijen boyaması için primer antikor.
Anti-NF-κB p65 antikoru	HUABIO	ET1603-12	NF- için primer antikorκB p65 Western blotting.
Anti-fosfo-ERK antikoru	Beyotime	ET1610-13	Fosforile ERK Western blotting için primer antikor.
Anti-PSD95 antikoru	HUABIO	ET1602-20	PSD95 Western blotting için primer antikor.
Anti-ULK1 antikoru	HUABIO	ET1704-63	ULK1 Western blotting için primer antikor.
Anti-β$\alpha$-tübulin antikoru	ABclonal	AC021	Western blotting için yükleme kontrolü primer antikoru.
Sönümleme önleyici floresan montaj ortamı	Beyotime	P0126-5	İmmünofloresan boyamalı kesitler için kapatma medyumu.
Biyotin-streptavidin peroksidaz saptama kiti	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	DAB immünohistokimyası için sekonder saptama sistemi.
Sığır serum albümini	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	İmmünboyama ve Western blotting için bloklama tamponu.
C57BL/6 fareler	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	4 haftalık C57BL/6 fareler	Eğer dahil edilmişse, fare beyin dokusu toplama işlemi için kullanılan deney hayvanları.
Kemilüminesan görüntüleme sistemi	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Western blot kemilüminesans sinyallerinin saptanması.
Konfokal lazer taramalı mikroskop	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	İmmünofloresan kesitler için görüntüleme.
Kriyoprotektan koruma çözeltisi	Laboratuvarda hazırlanmıştır	Girdi sağlanmadı. Lütfen çevirmek istediğiniz metni gönderin.	Serbest yüzen beyin kesitlerinin uzun süreli saklanması −20 °C.
Kriyostat	Leica	CM1950	Hazırlanması 30 μm koronal beyin kesitleri.
DAB kromojenik substrat kiti	Sigma	SLBP7387V	İmmünohistokimya için kromojenik geliştirme.
DAPI nükleer boyama solüsyonu	Coolaber	SL7100	İmmünofloresan için nükleer karşıt boyama.
Dijital ışık mikroskobu	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Model NE910+FL-900	DAB gelişiminin izlenmesi ve parlak alan boyalı kesitlerin görüntülenmesi.
DNaz I	Vazyme	R223-01	Ters transkripsiyon öncesinde kalıntı genomik DNA'nın uzaklaştırılması.
488-konjuge eşek anti-tavşan IgG	Thermo Fisher Scientific	A21206	İmmünofloresan için floresan ikincil antikor.
Donkey anti-rabbit IgG, 594-konjuge	Abcam	ab150076	İmmünofloresan için floresan ikincil antikor.
E.Z.N.A. DNA/RNA/Protein Kiti	Omega Bio-Tek	D3892-01
Elektroforez güç kaynağı	Bio-Rad	1645050	Agaroz jel elektroforezi ve SDS-PAGE için güç kaynağı.
Etilen glikol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Kriyoprotektan koruma solüsyonu bileşeni.
Gel görüntüleme sistemi	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	RNA kalite değerlendirmesi için agaroz jellerin görüntülenmesi.
Jelatin kaplı cam lamlar	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	DAB ile boyanmış serbest yüzen beyin kesitlerinin lam üzerine yerleştirilmesi.
Görüntü analiz yazılımı	Ulusal Sağlık Enstitüleri	ImageJ/Fiji	Western blot bantlarının densitometrik analizi ve görüntü işleme.
İzopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Organik/ara faz fraksiyonundan protein çöktürme.
Soğutmalı mikrosantrifüj	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	RNA/protein ekstraksiyonu ve yıkama basamakları sırasında santrifüjleme.
Minute Protein Ekstraksiyon Kiti	İcat etmek	MS-026
Nötr balsam montaj ortamı	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Şanghay, Çin	Katalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Dehidrate edilmiş DAB boyamalı kesitlerin lam üzerine kapatılması.
OCT gömme ortamı	Sakura	4583	Fikse edilmiş beyin hemisferlerinin kriyoseksiyonu için gömme ortamı.
Optik qPCR plakaları veya tüpleri	Axygen	PCR-0208-C	qPCR amplifikasyonu için reaksiyon kapları.
Parafilm	Amcor	PM996	Uzun süreli kesit saklama için çok kuyucuklu plakaların sızdırmaz hale getirilmesi.
Sodyum pentobarbital	Hualan Bio	57-33-0	Transkardiyak perfüzyon öncesi anestezik ajan.
Petri kapları	Biosharp	BS-90-D	Beynin buz üzerinde işlenmesi ve hemisfer ayrımı.
Fenol/guanidinyum RNA ekstraksiyon reaktifi	Sparklade	AC0101-B	RNA ekstraksiyon kontrol deneyleri için karşılaştırıcı reaktif.
Fosfataz inhibitör kokteyli	APExBIO	K1015-100	Protein ekstraksiyonu sırasında fosforilasyonun korunması.
Fosfat tamponlu salin	Biosharp	BL601A	Yıkama tamponu, sükroz çözeltisi çözücüsü ve kriyoprotektan çözücüsü.
Poliviniliden florür membran	Millipore	IPVH08100	Western blot transferi için membran.
Polivinilpirolidon K40	Sigma	9003-39-8	Kriyoprotektan koruma solüsyonu bileşeni.
Proteaz inhibitör kokteyli	Beyotime	P1045	Doku lizisiz sırasında protein degradasyonunun önlenmesi.
Protein ekstraksiyon kiti	İcat etmek	MS-026	Toplam protein ekstraksiyon kontrol deneyleri için karşılaştırıcı kit.
Gerçek zamanlı PCR sistemi	Amolarray	MA6000	Kantitatif PCR amplifikasyonu ve erime eğrisi analizi.
Sodyum dodekil sülfat	BioFroxx	3250GR500	Protein peleti çözünmesi ve SDS-PAGE örnek hazırlama.
Steril jilet uçları	Biosharp	BS-RB-11	Buz üzerinde hemisfer ayırma ve doku düzeltme.
Streptavidin-peroksidaz konjugatı	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	DAB immünohistokimyası için sinyal amplifikasyon/deteksiyon reaktifi.
Sakkaroz	Hushi	57-50-1	Kriyokoruma çözeltisi ve kriyokoruyucu saklama çözeltisi.
SYBR qPCR ana karışımı	Vazyme	Q711-02	Kantitatif PCR amplifikasyonu.
Transfer düzeneği	Bio-Rad	1703930	Proteinlerin SDS-PAGE jelinden membrana ıslak transferi.
Tween 20 içeren Tris-tamponlu salin	Laboratuvarda hazırlanmıştır	Metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni gönderiniz.	Western blot membran yıkama tamponu.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	İmmünboyama için beyin kesitlerinin permeabilizasyonu.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
UltraSensitive SP İmmünohistokimya Tespit Kiti (fare/tavşan primer antikorlar için)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	DAB immünohistokimyası için sekonder antikor/deteksiyon reaktifi.
Wistar sıçanı	Liaoning Changsheng Biotechology Co., LTD	280-320 g, erkek	Sıçan beyin dokusu toplama için deneysel hayvanlar, eğer dahil edilmişse.
Ksilen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Kapak camı kapatılmadan önce DAB boyalı lamların saydamlaştırılması.
Nötr balsam kaplama medyumu	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Şanghay, Çin	Katalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Dehidrate edilmiş DAB boyalı kesitlerin lamelyle kapatılması.
Streptavidin-peroksidaz konjugatı	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	DAB immünohistokimyası için sinyal amplifikasyon/deteksiyon reaktifi.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	İmmünboyama için beyin kesitlerinin permeabilizasyonu.
UltraHassas SP İmmünohistokimya Tespit Kiti (fare/tavşan primer antikorlar için)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	DAB immünohistokimyası için sekonder antikor/saptama reaktifi.
Ksilen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	DAB boyalı lamların kapatma öncesi şeffaflaştırılması.